ELECTROFORESIS

Los procedimientos electroforéticos se basan en la

migración de iones bajo la acción de un campo

eléctrico

La separación se logra por las distintas velocidades

de migración de las partículas cargadas

ELECTROFORESIS

Electroforesis clásica

Electroforesis capilar

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CLÁSICA

libre de transportador

con transportador

Muestra en

buffer

buffer buffer

+ -

+ - buffer

diafragma

filtro de papel DV ~ 100 V

TISELIUS 1937

albúmina

a1 a2

b

g

globulinas

a1 a2 b g albúmina

Electroferograma de proteínas del suero

ELECTROFORESIS CLÁSICA

Comprende una familia de técnicas que

emplean como celda capilares que

contienen amortiguadores donde ocurre la

separación electroforética de los

componentes de la muestra

ELECTROFORESIS CAPILAR

CARACTERÍSTICAS GENERALES

Alta eficiencia

Muy bajo volumen de muestra (útil para muestras valiosas)

Poca cantidad de reactivos (económica)

Aplicable a un amplio grupo de compuestos

Incluida dentro de los métodos modernos de detección

Emplea tubo capilar para la separación

Utiliza campo eléctrico muy alto (~60 kV/m)

ELECTROFORESIS CAPILAR

VENTAJAS

CÁTODO

(–) ÁNODO

(+)

D

FUENTE

DE ALTO

VOLTAJE

RESERVORIO

CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA

ELECTROFORESIS CAPILAR

CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA

ELECTROFORESIS CAPILAR

FENÓMENOS

ELECTROCINÉTICOS

Migración electroforética

Electroendoósmosis

(electroósmosis)

PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN

ELECTROFORESIS CAPILAR

Electroendoósmosis

SÍLICA

FUNDIDA

LUZ DEL

CAPILAR, 20-200m

CUBIERTA DE

POLIIMIDA

Pared

del

capilar

capa de

Stern

capa

difusa

CÁTODO (-)

F.E.O

Distribución de cargas en capilar de sílica y flujo

electroosmótico resultante

Si-OH Si-O- + H+

ÁNODO (+)

Velocidad electroosmótica

veo = eo E eo = veo

E

= Ld/teo

DV/L =

Ld L

DV teo

dq eo =

√

eo = e

4p

La es igual para todas las especies dentro del capilar eo

movilidad

electroosmótica

campo eléctrico

Unidades

v: longitud/tiempo (ej: cm/s)

eo : superficie/potencial.tiempo (ej: cm2/V.s)

E: potencial/longitud (ej: V/m)

: masa/longitud.tiempo (ej: kg/m.s)

vef = ef E ef = vef

E

= Ld/tef

DV/L =

Ld L

DV tef

movilidad

electroforética

q ef = 6pr f

= q

La depende de la carga y radio del analito ef

campo eléctrico

coeficiente de fricción

Velocidad electroforética

vneta = (eo+ ef) E

vneta = veo + vef

vneta = ap E

ap

Velocidad neta

Velocidades en presencia de F.E.O.

eo

electrodo –

neta = eo+ef

electrodo +

ef

+ +

+ +

+ +

+ N

N

N

N

+ +

+

Migración diferencial de los analitos según su

relación carga/radio

P

Flujo hidrodinámico: inducido por presión

+ –

Flujo electroosmótico

Perfiles de flujo para líquidos

Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos

Flujo laminar F.E.O

EC HPLC

perfil plano perfil parabólico

Perfiles de flujo para líquidos

Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos

Flujo electroosmótico Flujo laminar

H = A + B/ + C x x

B = 2 Dt

Otras causas:

Longitud finita de la muestra sembrada

Calentamiento por efecto Joule

Dispersión por asimetría

Efecto “stacking” (apilamiento)

Dispersión debida a la detección

coeficiente de difusión

tiempo migración

Causas de ensanchamiento de las bandas

Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos

Dispersión total

s2 = s2D + s2

I + s2T + s2

A + s2stac + s2

D

Si consideramos a la difusión longitudinal como la principal

causa de ensanchamiento:

s2 = 2 Dt = 2 DL/vneta

vneta = ap E = ap DV/L

s2 = 2 DL2/ ap DV

Número de platos teóricos: N = L2/s2

Sustituyendo: N = ap DV/2D

RESOLUCIÓN

R = = ap(a)

ap(b)

[ap(a) ap(b)]/ +

N 2

Dap

ap

N

DV

R = Dap

ap

ap DV/2D

Dap

ap D

R =

0.707 ap

N = ap DV/2D recordando que:

Fuente de potencial

Columnas

Recipientes de electrolito

Termostatización

Detectores

Equipo de electroforesis capilar

D

FAV

10 – 30 kV

i = 500 – 1000 A

Pt Pt

ánodo cátodo

dH/dt = k E2/L2

Sílice fundida/poliimida, vidrio Pirex, teflón

50 cm longitud y 50 m d.i.

Detector Z

Inyección de la muestra

Hidrodinámica (gradiente de presión entre extremos del capilar)

w = dgr4 hCti /8L

ley de Poiesuille

w = r4 PCti /8L

cantidad de muestra inyectada

h

Flujo

gravitatorio

(sifón)

radio del

capilar

diferencia de presión

densidad aceleración

gravedad

diferencia de altura

vacío

presión

Cantidad de soluto inyectada

voltaje inyección

w = r2 V t C

L

longitud capilar

tiempo inyección

concentración

radio

capilar

movilidad analito

Inyección de la muestra

Electrocinética (diferencia de potencial entre extremos del capilar)

Técnicas de detección en EC

Fluorescencia

Disponible en algunos instrumentos

comerciales

Muy sensible

Se requiere fluoróforo o derivatización pre o

post columna

Fluorescencia

inducida por

láser

Muy sensible

Longitudes de onda disponibles limitadas

Precio elevado

UV-visible Universal

Disponible comercialmente

Amplia información espectral con detector de

diodos en línea

Potenciometría

Se requiere electrodo selectivo de iones

Se debe aislar el detector de la FAV

Sensible siempre que no hayan iones

interferentes

Conductividad Universal

Bajo costo pero poco sensible

Se debe aislar el detector de la FAV

Amperometría

Muy sensible pero solo utilizable con analitos

electroactivos

Altamente específico

Se debe aislar el detector de la FAV

Técnicas de detección en EC

Espectrometría

de masas

Precio muy elevado

Interfaz EC-EM complicada

Sensible y con información estructural

Otras técnicas

Índice de refracción, absorbancia termoóptica,

dicroismo circular, Raman

Técnicas de detección en EC

Electroforesis capilar de zona

Cromatografía electrocinética micelar

Electroforesis capilar en gel

Electrocromatografía capilar

Enfoque isoelectrónico capilar

Isotacoforesis capilar

Modos de aplicación

MODOS DE APLICACIÓN

USO EN

QUÍMICA

ANALÍTICA

Electroforesis capilar de zona (CZE) Capilar lleno de electrolito de fondo y aplicación de campo eléctrico

Mecanismo: separación de analitos según su movilidad en solución

MODOS DE APLICACIÓN

MODOS DE APLICACIÓN

El pH del buffer de fondo es la clave de la separación ya que determina

el grado de ionización y por lo tanto la movilidad relativa de los

diferentes analitos. Debe tener también baja absortividad a la longitud

de onda de detección y baja movilidad electroforética para minimizar el

paso de corriente.

MODOS DE APLICACIÓN

S S

S S

S S

S S

S S

S

Cromatografía electrocinética micelar (MEKC) Capilar lleno de electrolito de fondo que contiene tensioactivo.

Mecanismo: interacciones hidrofóbicas/iónicas de analitos con micelas

Electrocromatografía capilar Capilar funcionalizado con fase estacionaria

Mecanismo: interacciones diferenciales de un analito en dos fases

MODOS DE APLICACIÓN

Electroforesis capilar en gel Capilar relleno con gel que actúa como tamiz molecular

Mecanismo: diferencia de tamaños y carga

Enfoque isoeléctrico capilar (isoelectroenfoque)

Capilar lleno de distintos buffers. Un extremo del capilar sumergido en solución

ácida y el otro en solución alcalina. Se genera gradiente de pH a lo largo del

capilar. Mecanismo: los analitos migran hasta alcanzar el pH donde son neutros

(punto isoeléctrico). Una vez completada la focalización se alcanza un estado

estacionario (no fluye corriente en el capilar). Para la detección, las zonas son

movilizadas hacia el detector por aplicación de presión al capilar o adición de sal

a uno de los reservorios

MODOS DE APLICACIÓN

MODOS DE APLICACIÓN

Isotacoforesis capilar

Mecanismo: separación en el interior de la zona delimitada por dos buffers

Se usan dos buffers con distinta movilidad. Se separan aniones o cationes,

no ambos. Ej: para separar aniones se elige un “electrolito lider o frontal”

cuya forma aniónica posee la mayor movilidad, mientras que el anión del

“electrolito terminal” es el más lento. Al aplicar el E los aniones comienzan a

migrar al ánodo. El anión lider es el que se mueve más rápidamente, con los

demás aniones siguiéndolo detrás. Los analitos se separan en zonas

determinadas por sus movilidades, con el anión más rápido del analito

moviéndose detrás del electrolito lider.

Significa electroforésis a velocidad uniforme. Esto quiere decir que el tiempo de

recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforética es independiente de la

velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.

Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder en un

extremo, de gran movilidad, y debe ser mayor que la de los componentes a

separar. Luego se introduce la muestra seguido del electrolito terminal o cola,

cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la

muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del

conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los

componentes de la muestra.

En ITP las bandas están siempre en contacto con la zona adyacente. Esta

característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del

sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.

ITP puede ser usada para determinar cationes y aniones. Se requiere

usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.

Los Isotacoferogramas pueden mostrar diferencias en el orden de migración en

presencia o no de EOF.

La detección en ITP es usualmente con detectores de "bulk property" de la

solución electrolítica. Se ha utilizado detección de conductividad . También se

han utilizado detectores térmicos (medida del calor de Joule producido dentro de

cada zona) o detectores que miden la caída de voltaje de cada zona.

Isotacoforesis capilar

Equipos de electroforesis capilar

Detección de aminas halucinogénicas (hidromorfona, morfina y codeína) en sangre

total por EC (nalorfina= estándar interno). Condiciones de separación: capilar 70 cm (60 cm del detector) × 75 um de sílice fundida conteniendo 0.4% de β-CD en

100 nM de fosfato pH = 2.38 a 21 kV; 25 °C, inyección a 10 kV durante 16 s;

detección a 200 nm. La recta muestra la respuesta lineal para hidromorfona.

Ejemplos de electroferogramas

.

Controles de calidad para

drogas básicas en sangre total.

Condiciones de separación:

capilar de 60 cm (50 cm del detector) × 75 mm de sílica

fundida conteniendo 100 nM

fosfato pH= 2.38, a 18 kV, 25 °C,

inyección a 10 kV por 8–16 s,

detección a 200 nm. a) control

de calidad de muestra en agua

pura; b) control de calidad del

extracto, 10 ng de cada droga

en sangre porcina; c) control de

calida del blanco con 50 ng/mL

de estandar interno adicionado