MODUL BIOLOGI MOLEKULERLAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI IIIELEKTROFORESIS

Kelompok 2

Puspa Negara FAA 113 013Nurul Hidayanti MaharaniFAA 113 014Efraim Said SudartoFAA 113 015Dian Triyeni AsiFAA 113 016Sheren Vinera LinsFAA 113 017Feromiya OksaFAA 113 018Sofia Eugenia ManginteFAA 113 019Mira ApriliaFAA 113 020Ismi SholihahFAA 113 021Widi Cahya UtamiFAA 113 022Pipin Septiana FAA 113 023

FASILITATOR/TUTOR:Fatmaria,S.FARM.,APT

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS PALANGKA RAYA2014

I. Pendahuluan

1.1 Latar BelakangDNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar tekni kini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik didalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immune - blotting yang merupakan metode metode karakterisasi lebih lanjut.Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makro molekul( seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.Molekul DNA atau suatu fragmen DNA yang telah di amplifikasikan dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau besarnya pasangan basany6a melalui Gel elektroforesis. Deteksi fragmen DNA tersebut dapat dilakukan dengan cara mewarnai gel dengan suatu zat yang dapat meng-interkalasi rantai ganda DNA yaitu, misalnya ethidiumbromida. Metoda pemisahan atau reparasi DNA secara luar digunakan untuk tujuan analisis molekul DNA atau tujuan preparative.

1.2 Tujuan Praktikum Melakukan elektroforesis DNA hasil isolasi dari darah vena dan hasil amplifikasi dengan gel agarosa. Melakukan analisis hasil elektroforesis total DNA genom manusia dan hasil amplifikasi fragmen gen dengan metode PCR.

II. Dasar TeoriElektroforesisi DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran9berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa(bp) Elektroforesis gel agarosa besarnya digunakan untuk analisis ukuran dan konpormasi sampel DNA, kualifikasi DNA, pemisahan dan ekstrasi fragmen DNA.Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel melalui kutub positif(anoda). Makin besar ukuran molekulnya makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar(DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.vasualisasi selanjutnya DNA dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah lebih dahulu gel dalam pembuatnya ditambahkan larutan etidiumbromida atau dengan paparan di atas sinar ultraviolet.

III. Metodologi Praktikum3.1 Waktu Dan TempatPraktikum Gel Elektroforesis DNA ini berlangsung pada hari senin, tanggal 2 Mei 2014 pukul 11.30 -14.00 WIB diruang praktikum Fakultas Kedokteran Universitas Palangka Raya.3.2 Alat Dan Bahan1. Alat Satu set alat elektroforesis DNA berikut power supply, terdiri dari : Chamber elecktroforesis Tray elecktroforesis Sisir Power supply2. Bahan Larutan hasi; isolasi DNA darah vena Larutan hasil PCR (produk PCR ) Larutan TAE 1X ( tris-base, glacical acetic acid dan EDTA) Marker DNA + loading dye Ethidiumbromida3.3 Cara Kerjaa. Timbang bubuk agarosa untuk membuat 1,5% gel agarosa dalam larutan TBE ( catatan :1,5% untuk DNA yang panjangnya 300-10000bp).b. Masak larutan agarosa tersebut sampai mendidih dan larut semua.c. Biarkan larutan tersebut dingin sampai kira-kira 70oC kemudian masukan 5ul 0,1% ethidiumbromida.d. Tuang larutan agarosa ke dalam tray elektroforesis yang telah disiapkan terlebih dahulu dan dipasangi sisir.e. Biarkan agarosa dingin dan mengeras.f. Sementara menunggu sampai mengeras siapkan larutan untuk maker DNA dengan larutan loading dye dengan komposisi, 2ul loading dye + 3ul larutan marker DNA + 3ul ddH2Og. Setelah gel agarosa mengeras, pasang tray berikut beserta isinya kedalam chamber. Elektroforesis, ambil atau cabut sisir pada gel, kemudian tuang larutan TAE sampai melebihi permukaan gel.h. Masukan larutan DNA hasil PCR kedalam struktur yang terbentuk dari sisir yang telah terangkat, secara hati-hati dan perlahan-lahan.i. Hubungkan alat elektroforesis tersebut dengan power suplly yang telah diatur dengan voltage 90 volt selama 1 jam.j. Amati pita-pita (bands) yang terbentuk dengan menggunakan UV transluminator, dan apabila diperlukan dapat difoto dengan kamera .

Gambar skematik proses elektroforesis(sumber : buku pedoman praktikum modul biomol)IV. Hasil Gambar hasil pengamatan gel agarosa

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

V. Pembahasan

Praktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gelagarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi elektroforesis gelaga rosa menunjukkan pergerakan kearah positif. Halini sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negative pada pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik dikedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektro foresis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memilik solusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dinginakan membentuk gelatinyang padat .Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai .Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media . Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).Larutan DNA yang bermuatan negative dimasukkan kedalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan dikutup negatif, apa bila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif.Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecilakan bermigrasi lebih cepat disbanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidiumbromida yang akan masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bias diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar.Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNAmarker) yang telah diketahui ukurannya.Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan sinar ultra violet setelah terlebih dahu lugel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidiumbromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromide sebelum dipaparkan diatas sinar ultraviolet. Elek troforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis dan pewarnaan laboratories dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat sensitif dan tidak memerlukan radio isotop atau ultra sentrifugasi. Selanjutnya, untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands - DNA pada gel agarosa digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalatingagent etidiumbromide (EtBr). Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit. Hanya sedikit DNA dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator.Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu : Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalamarutan sebagai penghantar listrik. Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

Etidiumbromida sebagai pewarna DNAyang akan menyisip disela-sela basa nukleotida. UV transiluminator untuk visualisasi DNA didalam gel agarosa Aquades sebagai pelarut Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa TAE: Tribase sebagai buffer sesuai dengan ph Asam asetat glasial sebagai elektrolit EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DA Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran gel agarosa Tangki elektroforesis untuk running DNA Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye Kertas parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNAHubungan antara berat molekul DNA dengan kerapatan agarosa terhadap laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk kerangka-kerangka atau lubang lubang yang kompleks untuk dilewati molekul DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju migrasinya, sebaliknya makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat dipisahkan. Jika sumuran gel agarosa menyentuh dasar tempat pembuatan gel agarosa maka DNA tidak dapat melakukan migrasi.DNA gel elektroforesis adalah teknik biologi eksperimental penting dan sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar dimedia poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing - masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel.

VI. Kesimpulan

1. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis..2. Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran(berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.3. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA1. Buku pedoman Modul Biologi Molekuler. Fakultas kedokteran Universitas Palangka Raya.2014.2. Murray.RK.Granner.DK.,Rodwell.vw. Brahim. Biokimia Harper.Ed 27.Jakarta.EGC.2009.3. Yuwono T. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.2005.4. Khopkar SM. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.2002.5. Yepyhardi. 2009.Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular. Sciencebiotech.net[web].http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular

LAMPIRAN

Gambar alat elektroforesis beserta power suplly

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV