Isolat bakteri yang telah diinkubasi selama 24 jam akan menunjukan zona bening

disekitar cakram antibiotik. Zona bening kemudian diukur menggunakan jangka sorong.

Angka rerata yang didapat kemudian dibandungkan dengan ketentuan sensitif, intermediet,

atau resisten yang dikeluarkan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards

(Cappuccino & Sherman, 2005; Johnson, 1998).

Antibiotik merupakan suatu substansi yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup

yang dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau membunuh organisme lainnya.

(Pelczar & Chan, 2006). Hasil uji dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti konsentrasi

antibiotik, derajat keasaman, kedalaman medium, kekeruhan inokulum, waktu inkubasi dan

temperatur (Johnson, 1998).

1. Identifikasi Molekuler Menggunakan Sikuen Parsial Gen 16S rRNA Bakteri

Analisis sikuen 16S rRNA merupakan metode yang biasa digunakan untuk

mengindentifikasi bakteri dalam bidang molekuler (Case et al., 2006; Amann et al., 1995).

Total Genom bakteri isolate A4 dan B2 berhasil diisolasi menggunakan protokol standar kit

FERMENTAS yang telah mengalami beberapa modifikasi. Hasil isolasi DNA diamplifikasi

menggunakan mesin PCR. Ampilifikasi gen 16S rRNA dilakukan pada dua sampel DNA

bakteri, yaitu isolat A4 dan B2. Selama proses amplifikasi berlangsung primer 63F dan

1387R mengamplifikasi DNA template dan produk yang dihasilkan berukuran 1300 pb

(Marchesi et al., 1998:795). Produk dari proses amplifikasi dinamakan amplikon dan dapat

divisualisasikan dengan menggunakan alat elektroforesis. Hasil elektroforesis DNA isolat A4

dan B2 dapat dilihat pada Gambar 4.14.

Gambar 4.14 Hasil elektroforesis DNA isolat A3 dan B2, M=DNA marker 1kb ladder (NEB Product U.S.A).

Dapat dilihat pada foto, hasil pita yang didapatkan agak tipis. Hal ini dapat

disebabkan oleh berbagai macam hal. Salah satunya karena DNA yang terambil sedikit atau

kondisi mesin PCR yang kurang baik. Menurut Marchesi et al. (1998), kondisi reaksi PCR

yang sesuai untuk mengaplifikasi gen 16S rRNA akan memberikan hasil pita DNA tunggal

dan tegas pada elektroforegram hasil PCR. Kedua isolat bakteri telah diamplifikasi beberapa

kali dan tetap menghasilkan pita yang tipis.

2. Sikuen Gen 16S rRNA Isolat A3 dan B2

Primer 63F digunakan untuk mensikuen gen 16S rRNA dari satu arah ujung forward. Hasil elektroforegram sikuensing parsial gen 16S rRNA isolate bakteri A3 dapat dilihat pada Gambar 4.15 Dan hasil elektroforegram sikuensing isolate bakteri B2 dapat dilihat pada

M(+)

(-) (+)

(-)

M A2 B3(+)(-)