Aus dem Institut f u r Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierarztlichen Hochscbule Hannover

Direktor: Professor Dr. Dr. h. c. K. Wagener

Elektronenrnikroskopische Befunde an Lymphozyten und Lymphoidzellen des peripherischen Blutes bei der Leukose

des Rindes Von

K.-W. KNOCKE

Mit 7 Abbildungen

(Eingegangm am 22. November 1963)

Die von GOTZE, ROSENBERGER und ZIEGENHAGEN (1956 a u. b) auf Grund ihrer epidemiologischen Untersuchungen und ihrer Obertragungsversuche er- hobene Folgerung, dai3 fur die Leukose des Rindes ein ubertragbares Agens als Ursache so gut wie sicher geworden sei, bedarf noch immer der Bestatigung im Sinne der drei Henle-Koch'schen Postulate. Eine Isolierung, Ziichtung und Ruckubertragung des ursachlichen Agens ist bislang nicht gelungen. Auch die Ziichtungs- und Ubertragungsversuche von MONTEMAGNO, PAPARELLO und CATELLANI (1957) bediirfen noch der Bestatigung. Von BINDRICH (1963) wurde uber vorlaufige Ergebnisse virologischer Untersuchungen berichtet, die die Zuchtbarkeit eines ubertragbaren Agens zu bestatigen scheinen. Zur endgultigen Klarung sind noch die Ergebnisse der Obertragungsversuche von seinem Kultuy- material auf Rinder abzuwarten.

Zur Diagnostik der Leukose des Rindes hat sich der von GOTZE und Mit- arbeitern (1953 u. 1954) ausgearbeitete Leukoseschlussel, der auf einer quantita- tiven Beurteilung der weii3en Blutkorperchen des peripherischen Blutes beruht, in langjahriger Anwendung bewahrt. Es hat auch nicht an Versuchen gefehlt, mit Hilfe qualitativer Blutuntersuchungsmethoden die Aussagekrafk bei der Leukosediagnostik zu verstarken. ZIEGENHAGEN und DOHMEN (1955) setzten sich mit dem Wert der morphologischen Beurteilung der Leukozyten fur die Diagnostik der Rinderleukose kritisch auseinander. Sie kamen dabei unter Aus- wertung der vorhandenen Literatur zu dem Schlui3, dai3 weder Lymphoido- zyten, Spindelzellen, Riederzellen noch Paralymphoblasten als spezifische Tumor- oder Leukosezellen angesehen werden konnen und qualitative Befunde an den lymphozytaren Elementen des Blutes den ,,Leukoseschlussel" manchmal erganzen, aber nicht ersetzen konnen. Qualitative Untersuchungen der weiflen Blutkorperchen vom Rinde wurden bislang nur an gefarbten Blutausstrich- praparaten lichtmikroskopisch durchgefuhrt, wenige Untersuchungen auch fluoreszenzmikroskopisch an Nativblut (BOCKENFORDE 1956). Diese licht- mikroskopischen Untersuchungen konnten nur Veranderungen uber 200 mp, die noch dazu farberisch zu differenzieren waren, sichtbar machen. Elek-

Zbl. Vet. Med., Reihe B, Bd. 11, Heft 1 1

2 XNOCKE

trorienmikroskopische Untersuchungen des peripherischen Blutes von Rindern sind meines Wissens im Zusammenhang mit der Leukose des Rindes bislang nicht durchgefuhrt worden. Vergleichbare elektronenmikroskopische Unter- suchungen erfolgten dagegen sehr zahlreich an Blutzellen des Menschen, wo- bei insbesondere leukotische Veranderungen untersucht wurden (zahlreiche Literaturangaben bei POLLI u. a. 1961).

Da die Praparationsmethoden bei den licht- und elektronenmikroskopi- schen Untersuchungen sehr verschieden sind, kijiinen Vergleiche der Ergebnisse nur beschrankt angestellt werden. Im ersteren Fall werden die Blutkorperchen nach Ausstrich und Antrocknung fixiert und gefarbt, wahrend im letztercn Fall die Leukozyten nach Fixation und Einbettung als Ultradunnschnitte unter- sucht werden, die jeweils nur etwa den hundertsten Teil des weiflen Blut- korperchens je Schnitt erscheinen lassen. Aus den verschiedenen Anschnittebenen ergeben sich dabei schon so unterschiedliche Erscheinungsbilder, wie sie bei der Untersuchung eines gefarbten Blutausstriches im Lichtmikroskop niemals zu erwarten sind, da sich die einzelnen Arten der Leukozyten und ihre Entwick- lungsformen in verhfltnismaflig gleichartigen Formen zeigen.

T a b e l l e 1

19600 3 8 89

1,11 683600 100

In dieser eigenen Arbeit sol1 uber Befunde berichtet werden, die bei der Untersuchung des Blutes von achtzehn an Leukose erkrankten Rindern sowie von elf Kontrollrindern erhoben wurden. Da die Leukose des Rindes, mit sehr seltenen Ausnahmen, unter dem klinischen Bild einer leukamischen oder aleu- kamischen Lymphadenose verlaufi, wurden nur die lymphatischen Elemente, Lymphozyten und Lymphoidzellen, einer eingehenden elektronenmikroskopi- schen Untersuchung unterzogen.

Elektronenmikroskopische Befunde an Lymphozyten 3

Lfd NC

Material und Methode Von den untersuchten Tieren waren siebzehn an Leukose erkrankte

Patienten und eins ein Versuchstier der Klinik fur Rinderkrankheiten der hie- sigen Hochschule (Direktor: Professor Dr. G. ROSENBERGER). Als Kontroll- rinder wurden institutseigene Versuchstiere sowie Patienten der Klinik fur Rinderkrankheiten benutzt, die auf Grund der hamatologischen und klinischen Untersuchung frei von Anzeichen einer leukotischen Erkrankung waren. Die hamatologischen Daten und die klinischen Diagnosen sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.

T a b e l l e 2

Klin. Befund, Diagnose

1

2

3

Blutspender 11,lB 8860 3 1 20 70 6

Tb - Versuchstier 13,30 7700 13 84 3

Brucellose-Versuchstier 6.90 7700 7 2 18 69 4

Das aus der Vena jugularis entnommene Blut wurde in Ammoniumchlorid- losung hamolysiert, die gewaschenen Leukozyten wurden in Osmiumtetroxyd fixiert und nach einer Agarvoreinbettung in Vestopal eingebettet (KNOCKE 1963). Alle Ultradiinnschnitte wurden in Uranylazetat nachkontrastiert. Zur Herstellung der Ultradunnschnitte wurde ein Leitz-Ultramikrotom und fur die elektronenmikroskopischen Untersuchungen und Aufnahmen ein Philips- Elektronenmikroskop EM 100 benutzt. Die auf Agfa-Agepe FF 35 mm Film aufgenommenen Negative wurden funf- bis zehnmal nachvergrofiert.

Ergebnisse Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung der lymphatischen Zel-

len des peripherischen Blutes von achtzehn an tumoroser Leukose erkrankten Rindern wurden folgende Befunde erhoben. In zahlreichen Kernen dieser Zellen waren bei allen achtzehn Rindern ,,Pseudoeinschliisse" in Kernrand- nahe zu beobachten. Der Kern war im Bereich dieser Einschliisse ins Zytoplasma hinein ausgebuchtet. Eine doppelte Membran kleidete die Einschliisse aus, die mit einem elektronenoptisch weniger dichtem Material als der Kern angefullt waren. An der dem Zytoplasma zugewandten Seite waren die Einschlusse nur von einem schmalen Saum Karioplasma begrenzt. Einige dieser Einschliisse lagen vom Kern abgetrennt im Zytoplasma und wurden von einem Ring aus Karioplasma mit einem zytoplasmatischen Inhalt gebildet (Abb. 3). An meh- reren Serienschnitten konnte festgestellt werden, dafi diese randstandigen ,,Kerneinschlusse" durch fingerformige Einstulpungen des Zytoplasnias unter Zuriickdrangung der Kernmembran gebildet wurden. Dabei traten auch zu- weilen Plasmaorganellen mit in die Einstulpungen ein. Die im Zytoplasma ge-

l'

4 KNOCKE

Abb. 1. Lymphoidzelle eines Leukose-Rindes mit zwei randstandigen Kerninvaginationen und darin zytoplasniatischen Einschlussen. Vergr.: 20 000 : 1

legenen Einschliisse mit uinhiillender Kernsubstanz wurden als langere Kern- ausstulpungen gedeutet, in die sich eine Zytoplasmaeinstulpung eingeschoben hat. Ihre Entstehung sol1 in Skizze 1 veranschaulicht werden.

Wahrend die Mehrzahl dieser Einschlusse durch Kernwandinvaginationen und Zytoplasmaeinstiilpungen gebildet wurden, ist bei einigen (Abb. 5 u. 6 ) der Inhalt nicht sicher als zytoplasmatischer Anteil erkennbar. Eine sichere Deutung dieser letzteren Befunde ist aus dem bisher untersuchten Material nicht moglich. Es kann jedenfalls nicht ausgeschlossen werden, dafi hier viel- leicht Ausschleusungsvorgange aus dem Kern im Schnitt getroffen wurden.

Weder in den Kernveranderungen, noch an anderen Stellen der Lympho- zyten oder Lymphoidzellen der an tumoroser Leukose erkrankten Rinder wur- den Partikel angetroffen, die auf Grund ihrer Form, Grofie und Anordnung als Virus gedeutet werden konnten.

Bei keinem der elf nicht an Leukose erkrankten Kontrollrinder wurden ahnliche Kernveranderungen wie die oben beschriebenen an den Lymphozyteii des peripherischen Blutes festgestellt. Obwohl in den Ultradunnschnitten mehr- fach Kerneinbuchtungen angeschnitten waren, die weit iiber die Kernmitte hin- ausreichten, wurden keine kernrandnahen ,,Pseudoeinschliisse" angetroffen.

Diese Untersuchungen waren auf Grund der Annahme, dai3 die Leukose des Rindes durch ein ubertragbares Agens, von Virusnatur verursacht werde,

Elektronenmikroskopische Befunde an Lymphozyten 5

darauf abgestellt, Veranderungen an den Lymphozyten oder Lymphoidzellen des peripherischen Blutes oder virusahnliche Elemente in ihnen aufzufinden, die dieser Theorie als Stutze dienen konnten. Aus den bisherigen Untersuchungen ergaben sich hierfur jedoch keine Anhaltspunkte. Als einzige morphologische Unterschiede zu den Kontrolltieren wurden bei den an tumoroser Leukose er- krankten Rindern an den Kernen der Lymphozyten oder Lymphoidzellen Kernwandinvaginationen mit Zytoplasmaeinstulpungen in Kernrandnahe fest- gestellt.

Vergleichende Auswertung der Ergebnisse Einstulpungen der Kernmembran und dadurch in Dunnschnitten vor-

getauschte Kerneinschlusse ergaben sich auch durch elektronenmikroskopische Untersuchung anderer Tumorzellen bei anderen Tierarten. SCHULZ (1 957) be- obachtete in Zellen von ubertragbaren Mammakarzinomen der Ratte in un- mittelbarer Nahe der Nukleolen schmale in den Zellkern vorgestulpte Kanale des Zytoplasmas, deren Bedeutung er in der Schafiung einer engen Verbindung von Nukleolen und Zytoplasma sah. SCHULZ erorterte die Moglichkeit, dai3 von den Nukleolen Ribonukleinsaure in das Zytoplasma abgegeben werdeii konne. Gleiche Zytoplasmakanale in Zellkernen fanden WESSEL und BERNHARD (1957) in Ehrlich- und Yoshida-Ascitestumorzellen. LEDUC und WILSON (1 959) beobachteten ,,Kerneinschlusse" in Riesenzellen des ubertragbaren Mause- hepatoms und in Leberzellen von Mausen, die mit einer bentonithaltigen Nahrung gefuttert waren. Diese Kerneinschlusse wurden durch Einstulpungen der Kern- membran gebildet und enthielten zytoplasmatische Bestandteile. Bei diesen Kerneinfaltungen wurde vermutet, dai3 von der Zelle der Versuch unter- nommen wird, das normale Kernoberflachen/Kernvolumen-Verhaltnis beizu- behalten. Bei einem plasmazellularen Knochensarkom fanden FRUHLING und PORTE (195 8) intranukleare Vakuolen, die zytoplasmatische Anteile, zum Teil ganze Mitochondrien enthielten. Diese Vakuolen waren durch kleine Kernin- vaginationen bedingt. Low und FREEMAN (1958) weisen besonders auf die tief- eingebuchteten und vielfach gelappten Kerne der Lymphozyten bei der lym- phatischen Leukose des Menschen hin. Ebenfalls bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen der Leukozyten von Menschen kamen POLLI, LANZAVECCHIA, JEAN, LE COULTRE und POGGI LONGOSTREVI (1961) an Leukosezellen zu ahn- lichen Feststellungen. Die Kerne zeigten tiefe Einbuchtungen und waren teil- weise nur noch durch schmale Brucken in ihren Teilen verbunden. In Abb. 4

n

Schnit t A

Skizze 1

v Schnit t 8

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dieser Arbeit sind auch intranukleare randstandige ,,Einschliisse" zu erkennen. BERNHARD (1961) kommt bei der kritischen Betrachtung der Frage, ob an der Einzelzelle typische Merlrmale fur die Umbildung zur Geschwulstzelle mit den heutigen elektronenmikroskopischell Praparationsmethoden festzustellen sind, zu dem Schlufl, dai3 zwar Anhaltspunkte vorhanden seien, eine Sicherheit aber

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Abb. 6. Ausschnitt aus einer Lymphoidzelle eines Leukose-Rindes niit kernrandstandigeln Einschld ungeklarter Substanz. Vergr.: 46 667 : 1':')

Die Bedeutung und Funktion der in dieser Arbeit an den Kernen der Lymphozyten oder Lymphoidzellen an tumoroser Leukose erkrankter Rinder

stgestellten Kernveranderungen konnten somit nicht eindeutig geklart wer- f en. Gewisse Beziehungen zur Leukose der Rinder sind offenbar vorhanden, da ahnliche Veranderungen bei gesunden anderweitig erkrankten Kontroll- rindern nicht gefunden wurden.

Zusammenfassung Lymphozyten oder Lymphoidzellen des peripherischen Blutes von acht-

zehn an tumoroser Leukose erkrankten Rindern sowie von elf gesunden und anderweitig erkrankten Kontrollrindern wurden elektronenmikroskopisch untersucht. Bei den an Leukose erkrankten Rindern wurden an den Kernen der lymphatischen Zellen Kernwandinvaginationen niit Zytoplasinaeinstulpungen in Kernrandnahe beobachtet, die in Dunnschnitten als Einschlusse erschienen. Bei einem Teil dieser Veranderungen konnte nicht geklart werden, ob es sich urn zytoplasmatische Anteile in den Einschlussen handelte. Die Kernwand-

") Siehe Funnote auf Seite 7.

Elektronenmikroskopische Befunde an Lymphozyten 9

Abb. 7. Lymphozyt mit Kerneinbuchtung eines Kontroll-Rindes. Vergr.: 20 000 : 1

invaginationen haben Ahnlichkeit init den bei anderen Tumorzellen anderer Tierarten beobachteten Kernveranderungen.

Summary Electron-microscope studies on lymphocytes and lymphoid cells in the peripheral

blood in bovine leucosis Lymphocytes or lymphoid cells of the peripheral blood of 18 cattle with

bovine leucosis and 11 cattle which were either healthy or suffering from other diseases were examined under the electron-microscope. In the cattle with leu- cosis the nuclei of lymphatic cells showed invaginations of the nuclear mem- brane with projections of the cytoplasm in the region of the nucleus which in thin sections appeared as inclusions. In some instances i t was not clear whether these inclusions contained cytoplasmic material. The invaginations of the nuclear membrane were similar to the nuclear changes observed in other tumour cells in various species.

Resume Observations faites au microscope Clectronique sur les lymphocytes et cellules

lymphoides du sang periphirique lors de leucose des bovides Les lymphocytes et cellules lymphoi'des du sang pkriphdrique de 18 bo-

vidks atteints de leucose tumorale ainsi que de 11 bovidks de contrble sains ou

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souffrant de lksions d’autre nature, ont k t k examinks au microscope klectro- nique. Chez les animaux atteints de leucose, on observait, sur les noyaux des cellules lymphatiques, des invaginations de la paroi nuclkaire avec des intro- versions du cytoplasme prks de l’enveloppe du noyau qui, en coupes fines paraissaient &re enclavkes. 11 n’a, pour un certain nombre de ces observations, pas pu &re prkcisk si les enclaves ktaient effectivement faites de cytoplasme. Lcs invaginations des parois nuclkaires ressemblent aux modifications de noyaux que l’on observe chez d’autres espkces aniinales pour d’autre cellules tumorales.

Resumen Hallazgos con el microscopio electr6nico en linfocitos y cilulas linfoideas de la

sangre perifkrica en la leucosis bovina Los linfocitos y cklulas linfoideas de la sangre perifkrica de 18 vacas en-

fermas de leucosis tumoral, asl como de 11 vacas de control sanas y con otras enfermedades, se examinaron recurriendo a1 microscopio electrbnico. En las vacas enfermas de leucosis se observaron en 10s ndcleos de las cklulas linfiticas unas invaginaciones de la pared nuclear con arremangos citoplasmiticos en las proximidades de 10s bordes nucleares, que en cortes delgados aparecian como inclusiones. En una parte de estas alteraciones no se pudo aclarar si en las in- clusiones se trataba de partes citoplasmiticas. Las invaginaciones de la pared nuclear tienen cierta seinejanza con las alteraciones nucleares observadas en otras cklulas tumorales de diversas especies animales.

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Anschrifi des Vcrfassers: Dr. K.-W. Knocke, 3 Hannover, Bischofsholer Danim 15.