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TRANSCRIPT
Eléments de Toxico-protéomique
1
Olivier Laprévote Lab. de Toxicologie Faculté de Pharmacie Paris Descartes
Genome (tous les gènes): que pourrait il se passer
Proteome (toutes les protéines): ce qu’il se
passe
Transcriptome (tous les mRNA’s): Ce qui se passe probablement
Omics et fonction biologique
?
? ? Microarrays
(Affymetrix, Incyte)
Protéomique
Diagnostic Pharmacologie
Toxicologe
Genomique SNPs
Changement de structure protéique
(PTM) Protéine: changement
d’abondance
mRNA : changement d’abondance
Changement fonctionnel
Différence génomique
Les protéines sont responsables de la plupart des fonctions biologiques contrôlées.
Les interactions protéine-protéine contrôlent la plupart des processus cellulaires
Les maladies sont traitées en général au niveau des protéines
Les protéines sont des cibles pour les médicaments ou sont elles-mêmes des médicaments.
Le Protéome est le complément en protéine du génome La protéomique est l ’utilisation de mesures qualitatives et
quantitatives du niveau d’expression protéique pour caractériser des processus biologiques
7
Pourquoi la protéomique ?
Pourquoi la protéomique: les microarrays ne suffisent pas à mesurer les marqueurs pré-cliniques
60 lignées cellulaires humaines (Tew, et al.) Corrélation = 0.43
Protéines sériques humaines (Kawamoto, et al.) Corrélation nulle (hors albumine)
Levure (Gygi, et al.) Corrélation (sous partie) = 0.36
Les abondances Protéines/mRNA sont peu corrélées:
• Serum • Urine
Des échantillons importants ne contiennent pas de mRNA utile
Glutathione-associated enzymes in the human cell lines of the National Cancer Institute Drug Screening Program.
Tew KD et al., Mol. Pharmacol (1996 Jul) 50(1):149-59
Protéines vs mRNA pour les GST π dans 60 lignées cellulaires humaines
0.1
1.0
10.0
100.0
1000.0
0.1 1.0 10.0 100.0
GS
Tπ m
RN
A (n
mol
mR
NA
/mg
prot
ein)
Lung
Ovarian
CNS
Leukemia
Prostate
Renal
Melanoma
Breast
Colon
R=0.43
GSTπ Protein (µg GST/mg protein)
Les profils d’abondance en protéines sont affectées par :
Les perturbations “rapides” d’un état “normal” Etats pathologiques Effets de traitements (médicaments)
Thérapeutique Toxique
Les changements progressifs de l’état “normal” Différenciation (vers diférents types cellulaires) évolution des espèces
Les mécanismes des médicaments impliquent des changements dans la régulation des gènes qui se
retrouvent au niveau protéique
Liaison à Un récepteur
Transduction du signal
Inhibition enzymatique
Action du médicament
Événements nucléairesr
mRNA's Toxicologie
Feedback
Protéines
mRNA's Accumulation des précurseurs
Déficits en Produits
Pharmacologie
Toxicologie Proteins
Feedback
Pharmacologie
Événements nucléaires
La protéomique: un domaine évolutif de la biologie
gènes biologie
Préparation de l’échantillon
Électrophorèse 2D
Spectrométrie de masse
Protéomique structurale Protéomique fonctionnelle
quantification
Analyse d ’image
Expression haut-débit Fonction
protéique
Interactions protéine-protéine
Protéomique: défis
La protéomique est, de beaucoup, plus complexe que la génomique: - Dynamique d’expression (spatiale et dans le temps) - Molécules fragiles, en complexes - Large domaine dynamique: ratios de 1012 entre les protéines plasmatiques les plus et les moins exprimées - pas d’équivalent à la PCR - modifications post-traductionnelles - réseaux d’interactions
Pipeline analytique de la protéomique
échantillon Pré- fractionnement séparation traitement analyse identification
B i o - i n f o r ma t i q u e
Dissection de tissus
lyse cellulaire
Ultra- centrifugation LC préparative
Gels 1D-2D MDLC
coloration décoloration
imagerie analyse d’image
excision digestion
MS MS/MS
Recherche en banque de données
Technologies mises en œuvre en protéomique
- Technologie des gels 2D ou de séparations multiples (reproductibilité) - Technologie de la révélation et de l’imagerie - Spectrométrie de Masse à fin d’identification - Banques de données (protéines et génome) - Algorithmes de recherche en banques
Le défi en recherche protéomique consiste en l’automatisation et l’intégration de ces différentes technologies
Protéomique structurale vs. fonctionnelle
Protéomique structurale
Protéomique fonctionnelle
(identification /quantification De toutes les protéines)
Que font les protéines ? - fonction (activité) - structure 3D/fonction - interaction protéine-protéine - élucidation des voies biochimiques
La protéomique structurale: identification et caractérisation
échantillon séparation digestion Identification
-cellule saine -cellule malade -sérum, LCR -+/- drogue -cinétique
Protéomique structurale: objectifs Connaissance « académique » - quelle protéine est exprimée, où, et à quel niveau relatif ? - quelles modifications post-traductionnelles se sont produites ? Profil d’expression différentiel - quelles sont les différences observables sur un protéome... … sain vs. normal … avant et après traitement thérapeutique → biomarqueurs
Techniques: 1 Séparation grossière des protéines: Électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE)
pH4 pH7
Haut PM
Faible PM
IEF
SDS-PAGE
Séparation fine des protéines: Électrophorèse bidimensionnelle (2D-gels)
Annexin V
SMP-30 CK-I-19
Actin Actin Actin
Cholangiocytes Hepatocytes Unfract. Liver
Types cellulaires rares vs. prédominants dans une Différentiation protéomique Cholangiocyte/Hepatocyte
“Cholangiocyte specific rat liver proteins identified by establishment of a two-dimensional gel protein database and their role in cytoprotection”. Tietz et al. Electrophoresis, 19, 3207-3212 (1998).
Séparation fine des protéines: Électrophorèse bidimensionnelle (2D-gels) Un gel 2D est équivalent à des centaines voire des
milliers de tests protéiques réalisés en une seule fois Chaque spot correspond à un type de protéine distinct (défini par sa position) Chaque spot peut être quantifié pour établir l’abondance de la protéine correspondante
Identification des spots protéiques en spectrométrie de masse
Analyse du gel (imageur)
Excision des spots
Même gel: 200 spots Coloration à l’argent
Digestion en plaques 96 puits
0
10000
20000
30000
40000
Cou
nts
1000 1500 2000 2500 3000
709.
3633
864.
3529
977.
4588
98
3.52
67
1030
.111
10
82.4
95
1098
.507
1118
.55
1285
.751
13
54.7
59
1386
.802
14
30.7
32
1510
.856
15
58.8
05
1711
.753
1806
.876
18
20.8
8
1950
.002
19
87.0
52
2078
.046
2259
.114
23
21.2
2
2694
.231
Tp fr
agm
ent
MALDI-TOF LC-MS/MS + Sequest
Digestion sur gel (après excision des spots) des protéines
Spectrométrie de Masse
25mM NH 4 HCO 3 /50% ACN
Décoloration du gel Réduction Alkylation
(Iodoacétamide)
Digestion trypsique
Séchage au Speed Vac
Solution deiodoacetamide
à l'obscurité
Solution deTrypsine
Solution deDTT
56°C/1h 37°C/4H Surnageantconcentré
α-cyano/ échantillon
Empreintes peptidiques (MALDI) Peptide Map Fingerprinting (PMF)
Spectre MALDI d’un digestat protéique
696.0 973.4 1250.8 1528.2 1805.6 2083.0Mass (m /z)
1712.2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 R eflector Spec #1[B P = 1562.8, 1712]
1562.8336
1348.7311
1476.8306
781.9119982.4231 1272.7095841.4720 1584.8115 1877.0824717.8616
Digestion en ligne de protéines et identification
Objectifs: limiter au maximum la durée de l’étape de digestion et d’analyse par
spectrométrie de masse Eviter l’étape de réduction-alkylation des peptides Limiter le nombre d’étapes de manipulation de l’échantillon Optimiser le nombre et la nature des peptides au sein du milieu de
digestion Rendre compatible la méthode analytique avec les échanges
hydrogène deutérium Permettre le couplage en ligne de la digestion et de l’analyse par
spectrométrie de masse
Digestion en ligne de protéines par la pepsine immobilisée
Méthodologie: Injection de 26 μL d’une solution de pepsine à 20 μM dans
H2O/HCOOH, 98:2, v/v, pH 1, dans une ligne de 1 mètre (tube PEEK rouge, diam. 0,13 mm)
10 minutes d’attente Rinçage à l’eau distillée (retour à pH neutre)
Pourquoi la pepsine ? C’est un enzyme actif à pH acide, condition la plus favorable à
l’obtention de spectres electrospray Ruptures du côté C-terminal d’acides aminés hydrophobes (L)
ou aromatiques (W, F),
Spectres de masse de la myoglobine en solution dans eau/méthanol/acide acétique injectée au travers de la ligne de pepsine immobilisée Effet de la différence de potentiel à l’interface de la source d’ions
36 V
84 V
132 V
180 V
Détection sélective des peptides de hautes et faibles masses
Spectres de masse de la myoglobine en solution dans eau/acide acétique injectée au travers de la ligne de pepsine immobilisée Effet du temps de digestion
Détection sélective des peptides de hautes masses (digestion partielle) ou de faibles masses (digestion totale)
5 min
10 min
Identification en banque de données: -logiciel: MS-Fit -banque: Swiss-Prot
1 peptide non reconnu: clivage aspécifique
G. Marie, L. Serani et O. Laprévote
Anal. Chem., 72, 5423-5430 (2000)
Protéomique structurale: EXEMPLES • Mécanismes thérapeutiques et Toxiques de traitements hypocholestérolémiants
• Identifier les protéines impliquées par protéomique structurale • Comparer les mécanismes de drogues-ligands du PPAR (SAR)
• Identifier les protéines impliquées par protéomique structurale • Identifier le mécanisme d’action des dithiolthiones
• Trouver le mécanisme d’action par analogie à d’autres classes médicamenteuses
• Mécanisme de la néphrotoxicité de la cyclosporine A • Identification des protéines impliquées
• Identifier les modifications post-traductionnelles dues à l’action d’un agent toxique: le méthapyrilène
• Influence de la phosphorylation sur le protéome
Exemple: métabolisme du cholestérol Inhibiteurs de l’HMG CoA Reductase Effets thérapeutiques vs mécanismes de toxicité
Voie métabolique finement régulée impliquant un nombre réduit de protéines
Chol. ↓ par Lovastatin via inhibition de l’HMG CoA reductase (HMG: 3-hydroxy-3-méthyl glutarate)
Chol. ↓ par cholestyramine via sequestration des acides biliaires (rupture cycle entérohépatique)
Augmentation par diète riche en cholestérol (5%)
High Cholesterol (5%)
Control
Cholestyramine (1%)
Lovastatin (0.075%)
Lovastatin + Cholestyramine
Master 5 animals/group
Regulation de l’HMG-CoA Synthase cytosolique du foie par les traitements affectant le cholestérol sanguin
Effets des drogues hypocholestérolémiantes sur le protéome du foie de rat
21 Protein Spots AreAffected Through theCholesterol Pathway
6 Low Abundance Spots Are Strongly Induced
Cytosolic HMG CoA Synthase
Mitochondrial HMG CoA Synthase (fragment)
23kd Morphine- binding Protein (104)
PP strong- responder (367)
Proliférateurs du peroxisome SAR on PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor) Se lient au récepteur nucléaire PPARα Déclenchent l’induction du métabolisme des acides
gras Appartiennent à des classes structurales diverses Produisent des tumeurs du foie chez le rat Pas de génotoxicité apparente In Vivo
A collaboration with Eli Lilly
OC
HO CH2
H2C
CH3
CH2
H2C
CH2
CH2
C
HN
N
N
N
O
H3C
C
HO CH2
H2C
H2C
CH3
O
H3C OH2C
C
HN
N
N
N
NH
N
N
H3C CH3
Cl
S CH2
C
O
O
WY14643
LY171883
LY163443*
-
C
O
O
H2C
CH
H2C
CH2
H2C
CH3
CH2
H3CC
O
OCH2
CHCH2
H2CCH2
CH3
CH2
H3C
OCl
O
C
C
H3C CH3
O
O
C
C
H3C CH3
O
O
DEHP
Clofibric Acid
Nafenopin
-
-
A= Control B= LY163,443 C= LY171,883 D= DEHP E= Clofibric acid F= WY14,643 G= Nafenopin
Peroxisome Prolferators: 6 Compounds Compared Over 107 Selected Protein Spots The effects of peroxisome proliferators on protein abundances in mouse liver. Anderson, N.L., Esquer-Blasco, R., Richardson, F., Foxworthy, P. and Eacho, P. Toxicology and Applied Pharmacology, 137, 75-89, 1996.
AAA
AAA
AA
AA
AA
A A
A
B
B
B
BB
B
C
C
C
C
CCD
DD
DD DE
EE E
EE
FF
FF
F
F GG
GG
GG
Révélation des différences de mécanismes d’action par protéomique quantitative
Les variations d’expression de plus de 100 protéines permettent de révéler des similitudes et des différences de mécanismes
Chaque symbole représente le pattern protéique hépatique d’une souris individuelle
Dithiolethiones (inhibiteurs de la carcinogénèse chimique): Induction d’enzymes de Phase II Analogies mécanistiques entre classes
S S
N
H 3 C
S Oltipraz (parent)
S S
S
O
H 3 C Anethole Trithione
S S
S
1,2-Dithiole-3-thione
S
S S
1,3-Dithiole-2-thione
O C
C C
C O
CH 3
O
H 3 C
O
Dimethyl fumarate A collaboration with Division of Cancer Prevention and Control, Chemopreventive Investigational Drug Unit, US National Cancer Institute
o2 Group 15: Oltipraz (control) O2 Group 16: Oltipraz (442umol) a Group 17: ANTT (control) A Group 18: ANTT (442umol) m Group 19: DMF (control) M Group 20: DMF (442umol) r Group 21: 1,3-DT-2-T (control) R Group 22: 1,3-DT-2-T (442umol) w Group 23: 1,2-DT-3T (control) W Group 24: 1,2-DT-3-T (442umol)
o2
o2
o2
o2
o2 a a
a a a
m
m
m
m m
r r
r
r r r
w w
w
w w O2 O2 O2
O2
O2 A A
A A A
M
M M
M
R
R
R R
R
W
W
W
W
-4 -3 -2 -1 0 1 2
PC 2: Activité d’induction d’enzymes de phase II
-2
-1
0
1
2
3
4
PC 1
: Act
ivité
selo
n le
méc
anis
me
“R”
2 mécanismes sont distingués par PCA (Analyse en composantes principales)
PCA des données sur 81 spots
Controls
Chaque symbole correspond au profil d’expression d’un animal
o1 Group 1: Oltipraz 21 days in feed + 2 days recovery controls i Group 2: Ibuprofen 21day feed control f Group 3: DFMO 21day feed control h Group 4: 4-HPR 21day feed control cp Group 5: Carbenoxolone and Piroxicam 21day feed control gd Group 6: Ca glucarate and DHEA analogue 21day feed cntrl O1 Group 7: Oltipraz 21 days in feed + 2 days recvry 100mg/kg I Group 8: Ibuprofen 21day feed MTD
F Group 9: DFMO 21day feed MTD H Group 10: 4-HPR 21day feed MTD C Group 11: Carbenoxolone 21 day feed MTD P Group 12: Piroxicam 21 day feed MTD G Group 13: Ca glucarate 21day feed MTD D Group 14: DHEA analogue 21day feed MTD
o2 Group 15: Oltipraz (control) O2 Group 16: Oltipraz (442umol) a Group 17: ANTT (control) A Group 18: ANTT (442umol) m Group 19: DMF (control) M Group 20: DMF (442umol) r Group 21: 1,3-DT-2-T (control) R Group 22: 1,3-DT-2-T (442umol) w Group 23: 1,2-DT-3T (control) W Group 24: 1,2-DT-3-T (442umol)
o1 o1
o1 o1 o1
o1 o1
o1
i
i i i i
f
f
f
f f
h h
h h
h h
cp cp cp
cp cp
gd
gd
gd
gd
gd
O1 O1
O1 O1 O1
I I I
I
I
I I
I
I
F F
F
F
F F F
F
H
H H H
H H
H
H H H C C C
C
C
C
P
P
P
P
P P
P
G
G
G G G G
G G G G D D
D D
D
D
o2
o2
o2
o2
o2 a a
a a a
m
m
m
m m
r r
r
r r r
w w
w
w w O2 O2 O2
O2
O2 A A
A A A
M
M M
M
R
R
R R
R
W
W
W
W
-4 -3 -2 -1 0 1 2
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Le mécanisme R est analogue à celui du piroxicam
Principal Components Analysis of Data on 81 Spots
PC 1
: Act
ivité
selo
n le
méc
anis
me
“R”
PC 2: Activité d’induction d’enzymes de phase II
Cyclosporine: Marqueurs spécifiques de la Toxicité
Drogue immunosuppressive puissante Utilisée pour éviter les rejets de greffe Produit des effets adverses dans le rein
limitant les doses d’emploi (toxicité tubulaire, calcification rénale, dysfonction rénale)
Pathogenese toxique complexe
Effets sur le protéome rénal de la cyclosporine A Sous expression majeure du spot 75
CsA 15mg/kg/j 12 jours
CsA 50mg/kg/j 12 jours
Arrow Plot here!
Protéine Mitochondriale:
67 Cytochrome C oxidase
peptide II
Protéines cytosoliques:
75 Calbindin 28kD
96 Senescence marker
protein 30
109 a-2U-globulin
119 Tropomyosin
67 75
96
109
119
Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein calbindin-D 28kDa in rat kidney. Steiner, S., Aicher, L., Cordier, A., Raymackers, J., Meheus, L., Esquer-Blasco, R., and Anderson, N.L. Biochem. Pharmacol., 51, 253-258, 1996.
Rein contrôle: immunomarquege de la calbindin d28k
Rein de rat traité par la cyclosporine A: Dépôts de calcium
Effets histologiques de la cyclosporine A sur le rein de rat
Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein calbindin-D 28kDa in rat kidney. Steiner, S., Aicher, L., Cordier, A., Raymackers, J., Meheus, L., Esquer-Blasco, R., and Anderson, N.L. Biochem. Pharmacol., 51, 253-258, 1996.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Contrôle CsA FK-506 (tacro.)
Rapamycin (sirol.)
PSC-833 (inhib. PGP, MDR1)
% d
e la
cal
bind
ine
réna
le c
ontrô
le
10 jours 31 jours CsA, SDZ PSC 833: 50mg/kg/jour
FK-506, Rapamycin: 5mg/kg/jour
Effets des drogues sur le niveau de calbindin rénal
Methapyrilene:
Antagoniste du récepteur H1 à l’histamine Retiré du marché en raison de son hépatotoxicité Produit des tumeurs du foie chez le rat Pas de génotoxicité in vivo apparente Cause une prolifération des mitochondries
H 2 C
N
H 2 C
C H 2
N
CH 3
N
CH 3
S
Methapyrilene
Carcinogénicité hépatique non-génotoxique Mise en évidence de modifications protéiques covalentes
Pyrilamine
Le traitement au methapyrilène induit …
1,000ppm MPY Control
grp75
HSP60
F1 ATPase beta
Carbamyl phosphate synthase
Le traitement au methapyrilène induit une modification des charges de quatre enzymes mitochondriales majeures
1,000ppm MPY Control
grp75
HSP60
F1 ATPase beta
Carbamyl phosphate synthase
Forces de la protéomique quantitative:
Des marqueurs protéiques informatifs peuvent être trouvés pour caractériser: Des états pathologiques Les effets de traitements
Thérapeutiques Toxiques
L’analyse globale de marqueurs (patterns) permet de:
Classer les mécanismes d’action toxique et les états physiopathologiques
Obtenir une détection plus sensible et plus fiable que celle obtenue avec un seul marqueur
Protéomique fonctionnelle: EXEMPLES • Rechercher et identifier des enzymes de dépollution environnementale
• Criblage bio-guidé et identification d’une réductase • Identifier le mécanisme d’inhibition de la ribonucléotide réductase par les espèces réactives de l’azote
• Protéomique moléculaire • Caractériser les cytochromes P450
• vers le profilage des patients… • Modifications post-traductionnelles
• sur les CYP P 450 (phosphorylations) • Adduits covalents des OPs sur l’albumine humaine
Utilisation de la protéomique pour caractériser des enzymes de biodépollution actifs sur des toxiques environnementaux
Après un criblage de nombreuses souches bactériennes, une espèce, Bacillus subtilis patr. apparaît comme le seul micro-organisme capable de réduire de manière constitutive et efficace les deux groupements nitro du 3,5-Dinitro Trifluoro Benzène (DNBTF).
CF3
NO2O2N
CF3
NH2H2N
Patr, B. subtilis
3,5 DNBTF
Intérêt de la biodépollution
La réduction de groupements nitro est une étape clef dans la bio-dégradation des polluants aromatiques et hétérocycliques nitrés. Ex: explosifs (TNT), pesticides, etc.
La caractérisation d’une protéine catalysant la réduction de groupements nitro peut permettre la conception de bio-détecteurs pour des polluants aromatiques et hétérocycliques nitrés. Ex: délimitation des zones contaminées et localisation des mines anti-personnelles.
N H 2 O H O H
O H R R R
N H 3 , N 2 , H 2 O , O 2 , C O 2 . . .
N O 2
R
n i t r o r é d u c t i o n
d e s a m i n a t i o n h y d r o x y l a n t e
La réaction de double réduction peut servir à la conception d’agents anti-tumoraux, à la base d’une approche GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy) qui permet l’activation de molécules nitrées aromatiques (CB1954) comme drogue.
CB1954: S. aziridinyl-2,4 dinitrobenzomide
ADN
R-NO2
(Pro-drogue) R-NHOH
Nitroréductase
R-NO2 +
- Mort de la cellule
Intérêt thérapeutique ?
Objectif
Caractériser la (les) nitro-réductase(s) chez Bacillus subtilis et celle(s) de la souche patr capable(s) de catalyser la double réduction du 3,5 DNBTF.
Stratégie suivie:
1. Culture bactérienne;
2. Extraire la fraction protéique;
3. Fractionnement du mélange protéique
• QFF;
• Mono Q;
• Electrophorèses 1D et 2D;
• Identification des protéines d’intérêt par une approche protéomique.
Toutes les étapes de purifications sont suivies par un test d’activité pour vérifier la présence de la protéine d’intérêt: protéomique bio-guidée
CF3
NO2O2N
Bacillus Subtilis
H2N NH2
CF3
Bande Analysée
97 66
45 33
Identification: Mélange de Protéines
1. Beta-Glucosidase 53.2kDa/5.1pI 30% Cov 30 ppm Err 2. Nitrate reductase 55.4kDa/5.3 17% Cov 500 ppm Err beta chain 3. Protéines non identifiées ?
Echecs initiaux
699.0 1159.4 1619.8 2080.2 2540.6 3001.0 Mass (m/z)
1.7E+
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
1831.7407 1108.5413
1032.4594 1312.5945 955.4344 1389.6175
1046.5455 1672.9347 2466.2171 788.3309 1677.7485 1417.6249 2316.1364 1145.4915 1834.7398 853.4041 1516.7783
R-NO2 R-NH2 NO3- NO2
-Nitro-réductase Nitrate-réductase
?
Résultats suivants
5CP40monoQ300603A7001:1_UV1_280nm 5CP40monoQ300603A7001:1_Cond% 5CP40monoQ300603A7001:1_Conc 5CP40monoQ300603A7001:1_Fractions
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
mAU
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A9 A10 A11 A12 B12 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 Waste
Identification: Mélange de Protéines
1. Superoxide dismutase GSP24 25.33kDa/5.1pI 52% Cov 12 ppm Err 2. Protéines non identifiées ?
Après modification du protocole d’extraction puis 1D SDS-PAGE
Fraction B10
Fraction b10 Bacillus subtilis Bacillus patr
25µg 5µg 25µg 5µg
Bande analysée Bande analysée
Identification: Mélange de Protéines
1. Superoxide dismutase GSP24 25.33kDa/5.1pI 62%Cov 12 ppm 2. Nitro/Flavin-réductase 28.42kDa/5.8 69% Cov 20 ppm 3. Autres Protéines (identification réalisée, mais fonction sans relation
avec les nitroréductases)
Après modification du protocole: 2D SDS-PAGE
Bacillus subtilis Bacillus patr
2a 2b
Nitro-réductases de Bacillus patr
699.0 1259.4 1819.8 2380.2 2940.6 3501.0 Mass (m/z)
3199.7
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
1646.8003
2086.9883
917.4724 2069.9711
825.1334 1546.8864 1924.0770 1483.7836 2198.0886 877.0814 1066.1211 3175.6280 1907.9241 2744.4728 2460.3477
1450.0 1472.2 1494.4 1516.6 1538.8 1561.0
Mass (m/z)
552.4
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
1546.8864
1547.8877 1483.7836
1485.7897 1548.8804
1499.8122 1455.8007 1486.8233 1500.7895 1456.7817
1457.7778 1501.8079 1549.8940 1531.7667 1478.7912 1513.8716
699.0 1259.4 1819.8 2380.2 2940.6 3501.0 Mass (m/z)
8773.9
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
1646.8142
2086.0317
1455.7920 2070.0020 917.4722 1546.8752
1924.0806
1015.5498 2460.3319 1471.7915 2198.1317 1908.9588 2744.5619 1407.7875 3175.7366 1009.4835 2482.3293
1450.0 1472.2 1494.4 1516.6 1538.8 1561.0
Mass (m/z)
3445.8
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
1455.7920
1546.8752 1456.7936
1547.8822
1457.7943 1548.8805 1471.7915
1472.7881
1473.7980 1458.8005 1512.8220 1549.8810 1475.8140
Conclusion
Réduction de la complexité du mélange protéique indispensable pour l’identification des protéines d’intérêt par spectrométrie de masse.
La sous-unité de la nitrate réductase trouvée lors des premières analyses est un artefact: danger si couverture de séquence trop faible !
Identification de novo de deux nitro-réductases chez Bacillus patr.
P. Chaignon, S. Cortial, A. P. Ventura, P. Lopes, F. Halgand, O. Laprévote, J. Ouazzani Purification and identification of a Bacillus nitroreductase: potential use in 3,5-DNBTF biosensoring system. Enz. Microbial Tech., 39, 1499-1506 (2006)
Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)
La RNR: Elle intervient dans la biosynthèse de l’ADN Elle est inhibée par le monoxyde d’azote (et par l’anion peroxynitrite) Utilisation de donneurs de NO comme agents anticancéreux… Quels sont les mécanismes d’action des oxydes d’azote sur la RNR ? Via l’anion peroxynitrite (issu du couplage de NO et du radical anion superoxyde)
Action cytoxique des oxydes d’azote
Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)
Analyse à l’échelle moléculaire du mécanisme d’inhibition de la RNR par le peroxinitrite Structure: hétérotétramère de type α2 β2
La sous-unité β2 contient deux atomes de fer non hémiques (cluster Fe-O-Fe) et forme un dimère (M 87 kDa) Questions posées: après réaction avec l’anion peroxynitrite ... Modification chimique ? Nature de la réaction chimique ? Conservation de la structure quaternaire? Rendement global de réaction? Localisation des sites modifiés sur la séquence?
Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)
Séquence Homogénéité Structure quaternaire
ESI Cond ° dénaturante
ESI Cond °non-dénaturante
ESI Cond ° dénaturante
ESI Cond °non-dénaturante
Fer
Oxygène
digestion HPLC
Identification
MS/MS
SYTHIIR
Localisation
Stratégie Analytique
+ HOONO
Spectre ESI-MS du domaine Β2 de la RNR (Eau/MeOH/CH3COOH; 50:50:1)
Masse Calc. 43 386 Masse Mes. 43 392
m/z
0
50
100
1635.2
1887.7
2067.6
2285.2
2413.1
2553.5
2722.3 2894.3
3111.9
3350.4 3630.0
3962.6
0
50
100
43544.0
43392.0
Da
Spectre electrospray Conditions non-dénaturante (eau/bicarbonate d’ammonium 50 mM) M2(Fe-O-Fe)2 Masse Calc. 87 028,8 Masse Mes. 87 033,6
m/z 0
50
100
3107.8 3626.0
4352.3
4581.4
4836.0
5806.3 6216.5
%
0
50
100 87033.6
Da
Après addition de peroxynitrite…
Spectre electrospray Conditions non-dénaturante M2(Fe-O-Fe)2(NO2)2-3 Masse Mes. 87 134,7
m/z 0
50
100
3111.0 3630.9
4357.6
4586.8
4841.8 5809.7
0
50
100 87134.7
Da
Localisation de la modification chimique sur le peptide 121-127 LC-MS/MS
I I H Y-NO2 T R S
200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 0
50
100
175.1
223.2
288.3
316.3
401.3
538.3
571.3 639.4
734.4
821.4
847.4
x2.5 934.4
La structure quaternaire n’est pas affectée par le peroxynitrite
Les centres Fe-O-Fe sont conservés dans le site actif de l’enzyme et ne sont pas directement touchés par l’agent inhibant.
La nitration de la tyrosine 122 stabilise le phénol sous forme de radical, ce qui bloque le transfert électronique de la sous-unité R2 vers la sous-unité R1, la réduction des riboses et donc l’activité de l’enzyme.
Bilan: Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)
O. Guittet, P. Deccotignies, L. Serani, Y. Henry, P. Le Maréchal, O. Laprévote, M. Lepoivre Biochemistry, 39, 4640-4648 (2000)
MS/MS des peptides
Les fragmentations ont lieu principalement au niveau des liaisons peptidiques Les différences de m/z entre les ions appartenant à la même série permettent
d’obtenir la séquence Ces différences sont accrues d’un incrément de masse lorsqu’il y a modification
chimie ou post-traductionnelle Ex: + 80 (phosphate ou sulfate), + 42 (acétylation), + 14 (méthylation), -1 (déamidation)
Localisation de la modification chimique sur le peptide 121-127 LC-MS/MS
I I H Y-NO2 T R S
200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 0
50
100
175.1
223.2
288.3
316.3
401.3
538.3
571.3 639.4
734.4
821.4
847.4
x2.5 934.4
Caractérisation des cytochromes P450 par l’approche protéomique
Pourquoi les CYP ? Les CYP sont responsables du métabolisme oxydatif des xénobiotiques comme des composés endogènes Grande variabilité individuelle dans l’expression des isoformes Grande variabilité individuelle vis-à-vis de la TK-PK des drogues d’intérêt clinique Nécessité de la caractérisation des CYP en phase pré-clinique Pourquoi la spectrométrie de masse ? Techniques immunologiques (ELISA et WB) pas toujours spécifiques (57 isoformes !) CYP de structures proches difficiles à doser individuellement dans des mélanges Spectrométrie de masse – sensible mais plus spécifique Analyse de mélanges possibles grâce à séparation en amont (LC) et en aval (MS/MS) de la production des ions Quantification possible en mode MRM au sein de mélanges Caractérisation des PTMs
Objectif 1: Identifier des peptides spécifiques
(«protéotypiques ») des différents CYPs étudiés
Objectif 2: mettre au point une méthode de quantification
par spectrométrie de masse
77
Caractérisation des cytochromes P450 par l’approche protéomique
Stratégie Etude dans des tissus: Microsomes foie / cerveau
Gel SDS-PAGE, coloration par le bleu de Coomassie
Découpe des bandes de CYP
Digestion trypsique des bandes de CYP
MALDI-TOF/MS Nano LC-ESI-LTQ-Orbitrap
Recherche dans la base de données protéiques par Mascot ou Sequest
Identification des peptides spécifiques (« protéotypiques »), foie humain
78
Préparation des Microsomes de foie
Foies humains provenant de donneurs pour transplantation hépatique ou d’hépatectomie partielle et conservés à -80°C.
Microsomes préparés à 4°C par centrifugation et ultracentrifugation différentielle.
Conservés à -80°C en présence de glycérol. Glycérol éliminé par centrifugation à 100 000 x g puis
lavage dans un tampon pyrophosphate (100 mM, pH 7,4) et nouvelle centrifugation à 100 000 x g.
Culot re-suspendu dans du tampon phosphate de sodium (100mM,pH 7,4).
79
Purification des CYP (Gel SDS-PAGE)
Séparation électrophorétique des protéines microsomales (20 μg par ligne de 4 échantillons différents)
Gel: Tris-glycine 4-20%
Coloration: bleu de Coomassie
Exemple d’un PMF de CYP
629.0 1305.8 1982.6 2659.4 3336.2 4013.0Mass (m /z)
1.5E +4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 R eflector Spec #1[B P = 1685.8, 15375]
1685.8295
749.3378
1498.7352 1917.9642
1629.7874877.4542
1478.6006 1854.06011097.46192604.32501361.6731 2981.4053
809.4188 1444.2125 2572.3538634.2385 1000.4865 1958.9756 3453.66532593.19311581.7815 3038.3855
81
Identification des CYP de 2 donneurs
CYP 450 du FH4 couverture en pourcentage
2D6 38,03 3A4 37,97 4A11 35,45 2C8 33,88 1A1 25,39 2 E1 25,15 8B1 24,75 4F2 22,31 3A5 21,31 1A2 18,45 4F3 15,77 4F11 15,65 2C9 15,1 2C19 14,08 4F12 12,4 2A6 12,15
2C18 10,82 51A1 8,15 2B6 5,7 2F1 2,65 2j2 2,59 7B1 1,78
CYP 450 du FH5 couverture en pourcentage
3A4 78,73 4A11 58,13 2 E1 57,61 2C8 54,29 2D6 52,52 2B6 44,6 1A1 43,55 2A6 41,5 8B1 41,12 3A7 40,76 2C9 29,18
2C19 24,29 2A7 22,27
2A13 20,24 2F2 18,27
2C18 14,29 51A1 14,12 4F11 8,21 2F1 2,65 4V2 2,29 84
Identification des peptides spécifiques de chaque CYP
Comparer chaque séquence peptidique détectée à l’ensemble des séquences protéiques et nucléiques présentes dans les banques de données.
Contraintes:
Eliminer les peptides dont les modifications post-traductionnelles sont possibles telles que oxydation des méthionines (modification variable) carboxy-amido-méthylation des cystéines (modification fixe)
Eliminer les peptides issus d’erreur de site de clivage enzymatique (miss-cleavages)
85
CYP Peptides spécifiques [M+2H]²+ cyp1A1 LWVNPSEFLPER 743,888
SHLPYMEAFILETFR 927,466 YLPNPSLNAFK 632,34
cyp1A2 VDLTPIYGLTMK 675,871 ASGNLIPQEK 528,788 DTTLNGFYIPK 634,83 IGSTPVLVLSR 571,351
TVQEHYQDFDK 705,32 YLPNPALQR 536,301
cyp27A ATGAPGAGPGVR 505.773 FFFQLFVQGYALQLHQLQVLYK 1365,744
VVLAPETGELK 578.335 cyp2B6 DLIDTYLLHMEK 745,882
NLQEINAYIGHSVEK 857,942 FHYQDQEFLK 677,825
GYGVIFANGNR 584,299 IAMVDPFFR 548,286
TEAFIPFSLGK 605,329 cyp2A6 GYGVVFSNGER 592,788 cyp2C8 EHQASLDVNNPR 690,337
DQNFLTLMK 555,287 VQEEIDHVIGR 647,841
cyp2C19 EHQESMDINNPR 735,326 NLAFMESDILEK 705,353
cyp2D6 AFLTQLDELLTEHR 843,446 DLTEAFLAEMEK 698,837
EVLNAVPVLLHIPALAGK 927,564 FGDIVPLGVTHMTSR 815,425 GNPESSFNDENLR 739,829
DIEVQGFRIPK 651,364 LLDLAQEGLK 550,322
MTWDPAQPPR 599,787
cyp2E1 FGPVFTLYVGSQR 735,891 FITLVPSNLPHEATR 847,965
GDLPAFHAHR 560,786 GIIFNNGPTWK 623,833
cyp2J2 VIGQGQQPSTAAR 656,852 cyp3A4 GVVVMIPSYALHR 721,403 cyp3A5 DVEINGVFIPK 615,84 cyp3A7 FNPLDPFVLSIK 695,392
cyp4A11 VWPNPEVFDPFR 751,875 cyp4F2 HVTQDIVLPDGR 675,362
SVINASAAIAPK 571,332 cyp4F3 WQLLASEGSAR 609,317
cyp4F11 ILPTHTEPR 532,298 cyp4F12 SITNASAAIAPK 572,322
FLPDHTEPR 556,28 LVHDFTDAVIR 643,349
cyp4V2 SDRPATVEDLKK 679,867 cyp51A1 GVAYDVPNPVFLEQK 838,438
IDDILQTLLDATYK 811,438 NEDLNAEDVYSR 712,818
FAYVPFGAGR 542,782 YLQDNPASGEK 611,291
cyp8B1 GTVPWLGHAMAFR 721,872 SVQGDHEMIHSASTK 813,881 WGFGTMQPSHDVR 759,351
EEATQVLGEAR 601,804 FVYSLLWPR 590,829 LVHEDYTLK 559,298
MLSVSHSQEK 573,285 MSSGQEYLFR 609,285
Réductase TYEHFNAMGK 599,271 86
Identification des peptides spécifiques de chaque CYP
Ajout d’un peptide étalon
- quantité connue - Même séquence - alourdi par un
isotope stable 4 Méthodes : AQUA « absolute
quantification » QConCat Marquage chimique
(Chemical labelling)
PSAQ Anal Bioanal Chem Langenfeld et al, 2008
87
Quantification des CYPs
Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine
Dichlorvos C4H7Cl2O4P
Masse monoisotopique : 220,9532
Masse de l’adduit :
108
Chlorpyriphos C9H11Cl3NO3PS
Masse monoisotopique : 349,9355
Masse de l’adduit :
152
1744.0 1771.2 1798.4 1825.6 1852.8 1880.0Mass (m/z)
344.8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
<<HSA+dichlorvos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2229.9, 592]
1853.80
1839.78
1745.81
1805.82 1867.791824.851770.69 1798.741818.731754.77 1827.82 1837.85 1850.81 1861.73
1744.0 1771.2 1798.4 1825.6 1852.8 1880.0Mass (m/z)
713.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1109.5, 1423]1745.85
1798.77 1805.88 1829.971767.81 1818.781775.76
m/z 1745
m/z 1853Δm = 108 umaHSA+Dichlorvos
HSA non modifiée
Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine
Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine
1712.0 1737.4 1762.8 1788.2 1813.6 1839.0Mass (m/z)
129.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
<<HSA+dichlorvos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2229.9, 592]
1726.71
1745.81
1805.821824.851770.69 1798.74
1767.77 1818.731754.77 1827.821821.81
1712.0 1737.4 1762.8 1788.2 1813.6 1839.0Mass (m/z)
713.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1109.5, 1423]1745.85
1798.77 1805.88 1829.971767.81 1818.781726.751716.89 1735.66 1775.76
m/z 1717
HSA non modifiée
HSA+Dichlorvos
m/z 1825Δm = 108 uma
Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine
1707.0 1741.8 1776.6 1811.4 1846.2 1881.0Mass (m/z)
3883.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
<<HSA+chlorpyrifos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2230.0, 12316]1830.03
1716.95
1868.95
1745.911798.821767.83
1805.90 1858.051744.98 1820.821792.76
1707.0 1741.8 1776.6 1811.4 1846.2 1881.0Mass (m/z)
1328.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1746.9, 1328]
1745.93
1805.961830.071767.87 1798.841716.98 1728.97 1818.851775.82
HSA non modifiée
HSA+Chlorpyriphosm/z 1717 m/z 1869
Δm = 152 uma
Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine
b4+
b6+b5
+
b7+
244 410 576 742 908 1074Mass (m/z)
87.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
<<ms2_1717_2kV_2>> 4700 MS/MS Precursor 1717 Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>SM5[BP = 858.5, 87]858.53
759.45 875.56
842.47648.38 776.48325.17847.55330.19257.19 520.28412.20 833.52
665.38
244 410 576 742 908 1074Mass (m/z)
49.9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
4700 MS/MS Precursor 1824 Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>SM5[BP = 1731.1, 87]966.55
984.58
983.56
496.30867.44
955.58742.37 884.49
513.22 938.55611.33363.15 860.49325.15614.29 838.51
b2+
b4+
b5+
b6+
b7+
Δm = 108 uma
Δm = 108 uma
Δm = 108 uma
Δm = 108 uma
VRYTKKVPQVSTPTL
Localisation de l’adduit sur la Tyrosine 411 de l’albumine (peptide 1717)