eli simulein a i pisnin

ELISA – simulering af hiv-1 påvisning

BIOTEKNOLOGI · EKSPERIMENTER

GRUNDBOG I BIOTEKNOLOGI 2 – HTX • GYLDENDAL • WWW.BIOTEK.GYLDENDAL.DK 1/4

Kapitel 7 · Immunsystemet

FORMÅL At afprøve den immunologiske metode ELISA til påvisning af antistof mod hiv hos to fiktive testpersoner. Der er tale om et simuleringsforsøg, idet ingen af bestanddelene er fra humane kilder.

TEORI Hiv er et RNA-virus, som på overfladen har et glycoprotein, gp120. Glycoproteinet virker som et antigen, der kan provokere immunsystemet til at danne antistof mod det pågældende antigen. Antistoffet binder sig specifikt til det antigen, der har udløst antistofdannelsen, dvs. til gp120.

ELISA-testen kan benyttes til påvisning af antistof, som er dannet mod hiv, dvs. mod gp120. Til testen benyttes en mikrotiterplade, som tilsættes hiv-antigen, der binder sig til bunden og siderne i brøndene. Hvis der er antistofhiv i den blodprøve, der test-es, vil antistofhiv binde sig til antigenhiv. Antistofhiv-antigenhiv bindingen kan påvises ved hjælp af en farvereaktion. Et sekundært antistof med et bundet enzym tilsættes brønden. Det kaldes et enzymkonjugeret sekundært antistof, og det er dannet mod antistofhiv (det primære antistof). Hvis der er antistofhiv bundet til antigenhiv i brønden, vil det sekundære antistof binde sig til det primære antistof. Enzymet, der er bundet til denne sandwich af antigenhiv- antistofhiv-anti-antistofhiv, katalyserer en farvereaktion.

HYPOTESE Formuler hypoteser om den forventede farvereaktion i hver af brøndene.

TEG

NIN

GER

: JAK

OB

STRA

NDB

ERG




MATERIALER • Edvotek – EDVO-Kit 271, AIDS Kit 1: Simulation of HIV-1 Detection

Fælles materialer• Destilleret eller deioniseret vand• Anti-IgG-peroxidase konjugat (E) (sekundært antistof) (2° Ab)• Hydrogenperoxid, stabiliseret (F)• Aminosalicylsyre (peroxid co-substrat, dvs. hydrogendonor substrat for

peroxidasen) (G)• Phosphatpufferet saltopløsning (H)• Eppendorfrør• 1 mL automatpipette med spidser• 100 µL automatpipette med spidser• 2 plastikrør, 50 mL• Varmeskab, 37 °C

Alle glasvarer skal være rene, tørre og fri for sæberester.

Til hver gruppe• 1,4 mL “hiv-antigen” (mærket HIV)• 0,4 mL positiv kontrol (hiv-antistof) (+)• 0,4 mL “Serum fra donor 1” (DS1)• 0,4 mL “Serum fra donor 2” (DS2)• 25 mL fortyndet phosphatpufferet saltopløsning (PBS)• 1,4 mL Anti-IgG-peroxidase konjugat (sekundært antistof) (2° Ab)• 1,4 mL Peroxidase-enzym substrat (Substrat) (udleveres til punkt 13)• Mikrotiterplader• 5 engangs mikropipetter eller automatpipetter med spidser• Tomt bægerglas mærket “affald”

METODE Lærerforberedelse samme dag som eksperimentet:• Overfør 1,4 mL hiv antigen til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper.

Mærk rørene HIV.• Overfør 0,4 mL positiv kontrol til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper.

Mærk rørene +.• Overfør 0,4 mL donor serum 1 til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper.

Mærk rørene DS1.• Overfør 0,4 mL donor serum 2 til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper.

Mærk rørene DS2.• Phosphatpufferet saltopløsning (H) opløses i 270 mL vand, og opløsningen

mærkes PBS.




• Mærk 10 bægerglas med PBS, og kom 25 mL af PBS-opløsningen i hvert glas.• Anti-IgG-peroxidase konjugat (E) tilsættes 0,3 mL PBS, og indholdet blandes

omhyggeligt.• Overfør 15 mL PBS til et 50 mL plastikrør, og tilsæt hele indholdet af an-

ti-IgG-peroxidase konjugat blandet med PBS (fra punkt 3). Mærk røret 2°Ab, og bland indholdet.

• Overfør 1,4 mL fortyndet anti-IgG-peroxidase konjugat til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper. Mærk rørene 2°Ab.

• Peroxidasesubstratet må først fremstilles 15-30 minutter før den sidste inkubering, dvs. inden punkt 11 i elevvejledningen.

Overfør 13,5 mL PBS til et 50 mL plastikrør og tilsæt aminosalicylsyre (G). Luk røret og ryst indholdet omhyggeligt.

• Tilsæt 1,5 mL hydrogenperoxid (F), luk røret og bland indholdet.• Overfør 1,4 mL peroxidasesubstrat til et eppendorfrør til hver af de 10 grupper.

Mærk rørene Sub.

EKSPERIMENT Mærk mikrotiterpladen med initialer eller hold- nummer.

Mærk 5 mikropipetter på følgende måde: - , + , DS1 , DS2 , PBS

Tilsætning af reagenser til brøndeneBrug den rigtigt mærkede mikropipette eller auto-matpipette med ny spids, hver gang reagenser skal tilsættes til brøndene. Brøndene kan rumme ca. 0,2 mL. Væsken må ikke løbe over i nabobrøn-dene.

Fjernelse af væske og vask af brøndeBrug den passende mærkede mikropipette, når væske skal fjernes og brøndene “va-skes”. Eller brug automatpipette med ny spids. Det er vigtigt at skylle brøndene mel-lem hver tilsætning af antistof for at undgå falsk positive resultater.

• Brug pipetten mærket “PBS”, og tilsæt PBS til brøndene i alle rækker. Tilsæt PBS til hver brønd er næsten fuld. Det må ikke løbe over!

• Fjern al væsken fra brøndene i hver række med den korrekte mikropipette eller automatpipette. Væsken tømmes ud i bægerglasset mærket ”affald”.

A � � �

B � � �

C � � �

D � � �




Udførelse af ELISA-testen 1. Tilsæt 0,1 mL (100 µL) “HIV”-antigen til hver af de 12 brønde. 2. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. 3. Fjern al væske fra hver brønd med mikropipette/automatpipette. 4. Vask hver brønd omhyggeligt med PBS, som beskrevet ovenfor. 5. Tilsæt reagenser:

A: tilsæt 100 µL PBS til de tre brønde i række 1 (Negativ kontrol).B: tilsæt 100 µL “+” til de tre brønde i række 2 (Positiv kontrol).C: tilsæt 100 µL DS1 til de tre brønde i række 3.D: tilsæt 100 µL DS2 til de tre brønde i række 4.

6. Inkuber i varmeskab ved 37 °C i 15 minutter. 7. Fjern al væske fra hver brønd med mikropipette/automatpipette. 8. Vask hver brønd en gang med PBS, som beskrevet ovenfor. 9. Tilsæt 100 µL anti-IgG peroxidase konjugat (2° Ab) til alle 12 brønde.10. Inkuber i varmeskab ved 37 °C i 15 minutter.

Substratet, som skal bruges i trin 13 fremstilles nu!

11. Fjern al væske fra hver brønd med mikropipette/automatpipette.12. Vask hver brønd en gang med PBS, som beskrevet ovenfor.13. Tilsæt 100 µL substrat til alle 12 brønde.14. Inkuber i varmeskab ved 37 °C i 5 minutter.15. Tag pladerne ud og analyser resultatet.16. Hvis farven ikke er fuldt udviklet efter 5 minutter, inkuberes i varmeskab ved

37 °C i længere tid. Mikrotiterpladerne må dog ikke tørre ud.

RESULTATER • Observer resultatet efter 5 minutters inkubering eller længere, hvis farven ikke er fuldt udviklet.

• Tegn eller tag et foto af mikrotiterpladen, hvor eventuelle farvereaktioner kan ses.

DISKUSSION • Forklar, hvad der er formålet med række 1 og 2.• Forklar, hvorfor man normalt blokerer de bindingssteder i mikrotiter-brøndene,

som ikke er optaget af antigen, med et protein fx gelatine eller albumin.• Aflæs resultater på mikrotiterpladen, og gør rede for om de to “test-personer” er

hiv-smittede.• Forklar, hvorfor man tester for hiv-antistof og ikke for hiv-antigen, når man

udfører en hiv-test. Forklar herunder, hvorfor ELISA-testen er så følsom.• Hvad kan give et falsk positivt resultat i ELISA-testen?• Er et negativt resultat ensbetydende med, at testpersonen ikke er hiv-smittet?

KONKLUSION Hvad kan du konkludere ud fra resultaterne?Blev hypoteserne eftervist/afvist eller fungerede metoden ikke?

KILDER Lav en liste over alle anvendte kilder som fx bøger, artikler og internetkilder. Anfør fuldstændig reference som forlag, udgivelsesår og URL-adresse.

eli simulein a i pisnin

Documents