elisa
DESCRIPTION
Elisa testTRANSCRIPT
TEHNICA
IMUNOENZIMATICA
CE ESTE TEHNICA IMUNOENZIMATICA?
ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Metoda de detectare a unor molecule (proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul complexelor antigen-anticorp conjugate cu o enzima
Foarte sensibila (pg/ml) Cantitativa sau calitativa Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime
PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI
Plasmocite producatoare de Ac
Antigen
Fuzionarea celulelor HIBRIDOM Mielom
Anticorpii monoclonali sunt purificati
Clonele dorite se cultiva sau se congeleaza
Testarea clonelor
Hibridoamele se separa si se cultiva
Cultivarea hibridoamelor
Mentinerea hibridoamelor in soareci
ENZIMELE
Enzime=catalizatori biochimici, compusi care maresc viteza reactiilor chimice ce se desfasoara in sistemele biologice, fara sa se consume in cursul lor
Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima Enzime utilizate:
Peroxidaza Fosfataza alcalina Glucozoxidaza G6PH
ENZIMELE
Substraturi: substante cromogene, care formeaza produsi de reactie colorati (cromofore)
Enzima + substrat cromofor citire la spectrofotometru
PROBE BIOLOGICE
Ser Plasma Urina Scaun Lichid sinovial LCR Lichid de lavaj bronsic
PLACA PENTRU ELISA
96 godeuri Plastic pe care adera usor proteinele
TIPURI DE ELISA
ELISA necompetitiva “sandwich”
ELISA competititiva
ELISA indirecta (dozarea Ac)
ELISA “SANDWICH”
Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici sau diferiti)
Ac primar (Ac1): Imobilizat in faza solida in godeurile placii Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac2): Marcat enzimatic
ELISA “SANDWICH”
1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu Ac1 fixat
2. Se incubeaza complexe Ag-Ac1
3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)4. Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)5. Se incubeaza complexe Ac1-Ag-Ac2
6. Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)7. Se adauga substratul colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ag din proba8. Se citeste la spectrofotometru
ELISA “SANDWICH”
ELISA COMPETITIVA
Ac primar (Ac1): Specific pentru Ag de determinat Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac2): Specific pentru Fc al Ac1 Marcat enzimatic
ELISA COMPETITIVA
1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate cunoscuta de Ac1, in solutie
2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag fixat
3. 2 situatii: Exces de Ag Exces de Ac1
ELISA COMPETITIVA
Exces de Ag: Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
nu se formeaza complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere Se pipeteaza Ac2 in godeuri nu se formeaza
complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt) Se adauga substratul nu apare nicio reactie
incolor
ELISA COMPETITIVA
Exces de Ac1 : Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ac1 liberi Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere Se pipeteaza Ac2 in godeuri complexe Ag-
Ac1-Ac2 fixe Se spala Ac2 liber Se adauga substratul colorarea mediului de
reactie i.p. cantitatea de Ag din proba Se citeste la spectrofotometru
ELISA COMPETITIVA
ELISA INDIRECTA
Dozarea Ac Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat Ac primar (Ac1):
=Ac de determinat Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac2): Specific pentru Fc al Ac1 Marcat enzimatic
ELISA INDIRECTA
Se pipeteaza proba (cu Ac1) in godeurile cu Ag fixat
Se incubeaza complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ac1 liber Se pipeteaza Ac2 Se incubeaza complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe Se spala Ac2 liber Se adauga substratul colorarea mediului de
reactie ~ cantitatea de Ac1 din proba Se citeste la spectrofotometru
ELISA INDIRECTA
ELISA
AVANTAJE
Sensibila Reproductibila Cantitati mici de reactivi (ieftina) Determina si Ag, si Ac Automata (rapida) Noniradianta
APLICATII
Hormoni Markeri tumorali Droguri, medicamente Citokine Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare Ac (HIV!)
TEST HIV
TEST DE SARCINA