elisa: quantificação de proteínas e moléculas
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Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura. Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA. Sistema Híbrido-Simples. Sistema Híbrido-Simples. Sistema Híbrido-Simples. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
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Sistema Duplo-Híbrido de Levedura
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Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA
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Sistema Híbrido-Simples
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Sistema Híbrido-Simples
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Sistema Híbrido-Simples
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Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe 103675 chloramphenicol: [active] 100mM, Sigmaanisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789
2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM,
1. Reagents interacting with DNA*(a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards(b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes
Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide(c) Intertwining agents Distamycin, Netropsin2. Analogues of bases, Acyclovir ,Adenine /3‑1‑D‑arabinoside, Amethopterin
Aminopterin, 2‑aminopurine, Aphidicolin, 8‑azaguanine, Azaserine6‑azauracil, 2'azido‑2'‑deoxynucleosides, 5‑bromodeoxycytidineCytosine /3‑1‑D‑arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides5‑fluorodeoxycytidine, 5‑fluorodeoxyuridine, 5‑fluorouracil, Hydroxyurea6‑mercaptopurine
3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid
4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine
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GFP: green fluorescent protein
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Microscopia confocal: estudo das células vivas
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Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizandoA actina fundida a proteína gfp
Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo
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Invaginações e dinâmica do núcleo
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Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmáticoNas plantas transgênicas expressando gfp
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Luciferinas
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Luciferinas
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Luciferinas
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Luciferinas
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Luciferinas
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Promotor da GA20 ox fundido
ao gene da luciferina
Pulverização comluciferina
Planta transgênica
Câmera CCDpara fluorescencia:::superimposição de
imagens
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Luciferinas: uso simultâneo de diferentes
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Luciferinas: Uso
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Luciferinas: Uso
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Luciferinas: Uso
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Aequoporina:
Estudo das alterações na Concentração de cálcioIn vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo
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Frio: “manchas” de aumento de calcioem resposta a baixas temperaturas
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Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular
Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a tera fluorescência no mesmo comprimento de onda
2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados
Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+:
Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)
Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+:
Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano)
Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo apósadição do fluoróforo
Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômatoFluoróforo indo-1
Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade
Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastosda camada de aleurona da cevada
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Estudo da expressão diferencial dos genes:
Confecção de Bibliotecas de Subtração
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Checando a eficiênciada subtração
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Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico
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Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Mapeamento de genesEstudo da estrutura do cromossomaEstudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.
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Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged)
NucleotídeosQueladoresMensageiros secundáriosPeptídeos
Canais de Ca2+ queRespondem ao IP3 no estômato, pólem, etc.
Manipulação de cálcioEnjaulado: calcio controla
a orientação de crescimentodo tubo polínico
(crescimento só no ápice)
Efeito da liberação do ABA “enjaulado” após microinjeção em células-guarda
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Formas de enjaular um peptídeo ou proteína
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Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis
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Phiscomitrella
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Phiscomitrella
![Page 42: Elisa: quantificação de proteínas e moléculas](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062409/56814d6d550346895dbabcb8/html5/thumbnails/42.jpg)
Phiscomitrella
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Phiscomitrella
GFP-talina
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Estudo da Estrutura de um promotor
1) Análise por deleção
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Estudo da Estrutura de um promotor
2) Análise por mutagênese
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Estudo da Estrutura de um promotor
3) Análise por transativação
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