ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK

ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA

Dr. Kremmer Tibor

IX.

KIRÁLIS, ZÁRVÁNY-KOMPLEX KROMATOGRÁFIA

KROMATOFOKUSZÁLÁS

IMMOBILIZÁLT FÉMION AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

KIRÁLIS

ZÁRVÁNY - KOMPLEX

KROMATOGRÁFIA

Glicerinaldehid Enantiomerek

A

KIRALITÁS

ELVE

ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA

KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL

KÖZVETETT MÓDSZEREK

SZÁRMAZÉK KÉPZÉS KOVALENS KÖTÉSSEL, KIRÁLIS VEGYÜLETTEL

ELVÁLASZTÁS NORMÁL, VAGY FORDÍTOTT FÁZISON FIZIKAI-KÉMIAI TULAJDONSÁGOK ELTÉRÉSE ALAPJÁN

Pl. MARFEY – REAGENS (1-FLUORO-2,4 DINITROFENIL 5 L-ALANIN

ELŐNYÖK KÖVETELMÉNYEK

REAKCIÓ SEBESSÉG NEM BEFOLYÁSOL, KROMATOGRÁFIA KÖRÜLMÉNYEIVEL JÓLOPTIMÁLHATÓ, SZELEKTIVITÁS, DETEKTÁLÁSNÖVELHETŐ, MINTA ELŐTISZTÍTHATÓ, ANTIPÓDOK KÜLÖN ALKALMAZHATÓK

REAGENS OPTIKAI TISZTASÁGA, KROMOFOR CSOPORT IGÉNYE, MINDKÉT ANTIPÓD KELL,REPRODUKÁLHATÓ-KVANTITATÍV REAKCIÓ,STABIL, EGYSÉGES SZÁRMAZÉK-TERMÉK

ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA

KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL

KÖZVETLEN MÓDSZEREK

KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA

CIKLODEXTRINEK - KORONAÉTEREK KOMPLEX - IONPÁR KÉPZŐK EGYÉB LIGANDUMOK

AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN (dinamikus módszerek)

AZ ÁLLÓ FÁZISON KÖTVE – KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK (sztatikus módszerek)

KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA

KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA

AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN

ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONA ÉTEREK

TERNER KOMPLEXEK (FÉMION – KIS LIGANDUM - ENANTIOMER)

DIASZTEREOMER – IONPÁR KÉPZŐ KOMPLEXEK AZ ÁLLÓ FÁZIS FÁZIS FELÜLETÉN KIRÁLIS ELLENIONNAL (KÁMFOR SZULFONSAV, KININ-KINIDIN, PIRROLIDIN KARBONSAVAK)

KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA

KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA

AZ ÁLLÓ FÁZISBAN

KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK

ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK(KOVALENSEN KÖTÖTT CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONAÉTEREK)

PIRKLE-TIPUSÚ FÁZISOK (3,5-DINITRO-BENZIL l-AMINOSAV)

CELLULÓZ ALAPÚ FÁZISOK (ACETÁT, KARBAMÁT, IZOTIOCIANÁT,BENZOÁT ÉSZTEREK)

MAKROCIKLUSOS GLIKOPEPTIDEK (VANCOMYCIN)

FORDÍTOTT (REVERSED) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIÁS FÁZISOK -MAKROMOLEKULÁRIS KÖTÖTT LIGANDUMOK(ALBUMIN, AGP, OVOMUKOID, AVIDIN, KIMOTRIPSZIN, STB.)

LIGANDUM CSERE ELVÉN ALAPULÓ FÁZISOK

ZÁRVÁNY-KOMPLEX KÉPZŐK A KIRÁLIS KROMATOGRÁFIÁBAN

KORONA ÉTEREK CIKLODEXTRINEK

A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK 3 PONTOS SZABÁLYA

A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK TIPUSAI

DIPOL – DIPOL

- (SAV-BÁZIS)

H – DONOR, AKCEPTORTÉRIGÉNY GÁTLÁS ZÁRVÁNY KÉPZŐDÉS

KOMPLEX KÉPZÉS,

LIGANDUM CSERE,KIRÁLIS KÖRNYEZET (HELIX)AROMÁS GYŰRŰ HATÁSOK,MEREV MOLEKULA SZERKEZET

CIKLODEXTRINEK (CD)

-CD β-CD -CD

Molekula összetétel C36H60O30 C12H70O35 C48H80O40

n (glukóz egység) 6 7 8

Molekula tömeg (g/mol) 972.86 1135.01 I297.15

Specifikus optikai rotáció (g/mol)

150.5 162. 5 177.4

Oldékonyság vizben (súly %, 25OC)

14.50 1.85 23.20

Üregátmérő (Å) 4.7 6.0 7.5

Üregtérfogat (A3) 174 262 427

Üregtérfogat /g (ml) 0.10 0.14 0.20

Víz ekvalens az üregben 6 11 17

pK3 a hidroxil csoportokra 12.33 12.20 12.08

Zárvány vegyület Benzol Naftalin Antracén

A CIKLODEXTRINEK SZERKEZETE

HIDROFÓB ÜREGRÖGZÍTETT MÁSODLAGOS(C2-C3) HIDROXIL CSOPORTOK

ROTÁLHATÓ PRIMER (C6)HIDROXIL CSOPORTOK

A ciklodextrinek térbeli modellje

GABA-RECEPTOR SPECIFIKUS ANALOG VEGYÜLET (rac-NSC 382) enantiomerek (R, S) elválasztása CELLULÓZ-p-METIL BENZOESAV ÉSZTER OSZLOPON (CHIRALCEL OJ, DAICEL)

MolnárT, Visy J et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008)

Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon(0,01M foszfát puffer, pH: 7,0 2% ACN)

Fitos I, Visy J, Simonyi M. J. Biochem. Biophys. Methods (2002)

rac-Oxazepam és rac-oxazepam hemiszukcinát enantiomerek elválasztásaChiral-AGP oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH:7,0 5% ACN)

Fitos I, Visy J. et al. J Chromatogr. (1995)

KÜLÖNBÖZŐ HIDANTOIN ÉS BARBITURÁT SZÁRMAZÉKOK KIRÁLIS ELVÁLASZTÁSA ChiraSep DN BP6 OSZLOPON (HEXÁN-2-PrOH-ACN)

KROMATOFOKUSZÁLÁS

CHROMATOFOCUSING

KROMATOFOKUSZÁLÁS

KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS

IZOELEKTROMOS PONT (pI) ALAPJÁN

pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA

IONCSERE ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA

GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA

SLUYTERMAN (1977)

KROMATOFOKUSZÁLÁSGRADIENS KÉPZÉS

(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS)

BA

pH

V

B > A

KROMATOFOKUSZÁLÁS - pH-GRADIENS KÉPZÉS

KROMATOFOKUSZÁLÁS

A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI

IONCSERÉLŐ - GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETBE VEZETETT pH GRADIENS

IONOS (IONCSERÉLŐ) TÖLTETEN AMFOLITTAL KIALAKÍTOTT pH GRADIENS

INERS HORDOZÓN (GÉLSZEMCSE) KOVALENS KÖTÉSSEL RÖGZÍTETT

(IMMOBILIZÁLT) pH GRADIENS

KROMATOFOKUSZÁLÁS

IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN

ELŐFELTÉTELEK

AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ

(POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN

A FEHÉRJÉK BIZTOSAN KIZÁRÓDJANAK A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL

A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK

A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN

++

+

+

++

++

++

+

+ +

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1

pI

5,0

4,9(3X)

+ +++

++

++

++

+

+ +

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2

pI

5,0

4,9

(3X)

0 0 0

+

++

++

++ ++ +pH

Áramlás iránya

4

5

6

7KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3

pI

5,0

4,9

- - -

+

++

++

++

00 0

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7

KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4

pI

5,0

4,9

0 0 0

+

++

++

++

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7

KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5

pI

5,0

4,9

- - -

+

++

++

++

00 0

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7

KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6

pI

5,0

4,9

0 0 0

+

++

++

++

-- -

pH

Áramlás iránya

4

5

6

7

KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7

pI

5,0

4,9

KROMATOFOKUSZÁLÁS

IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN

ELŐFELTÉTELEK

A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN

LEGYEN

AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ

(POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN

A FEHÉRJE BIZTOSAN KIZÁRÓDJON A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL

A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS

PONTJÁNAK

KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐN AMFOLITTAL

MULTIFUNKCIÓS ANIONCSERÉLŐ OSZLOP EGYENSÚLYBA HOZVA

pH = 7 PUFFERREL

ELÚCIÓ (MINTA FELVITEL)

MEGFELELŐ pI - TARTOMÁNYÚ

AMFOLITOT

(AMFOTER POLIELEKTROLIT)

TARTALMAZÓ

pH = 4,2 PUFFERREL

AZ ELUCIÓ SORÁN AZ AMFOLIT MEGTITRÁLJA AZ IONCSERÉLŐT ÉS pH-GRADIENST HOZ LÉTRE,

AMELYBEN A FEHÉRJE MOLEKULÁK pI ÉRTÉKÜKNEK

MEGFELELŐEN KÖTÖDNEK ÉS KÜLÖNBÖZŐ RETENCIÓVAL

OLDÓDNAK LE

REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL(Cytochrom C – Ribonuclease – Lentil-lectin)

L – Aminosav oxidáz izoenzimek elválasztása kromatofokuszálással Mono P oszlopon

HAEMOGLOBIN

VARIÁNSOK

ELVÁLASZTÁSA

KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

IZOM FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

TOJÁS FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

IMMOBILIZÁLT FÉM ION(KELÁT - KOMPLEX)

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

IMAC

IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY

IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT-KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

IMAC