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T h e EMBO J o u r n a l v o l . 1 0 n o . 1 3 p p . 4 0 8 1 - 4 0 8 8 , 1 9 9 1

S a c c h a r o m y c e s cerevisiae a- and a o - a g g l u t i n i n :c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i r m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n

C o r i n n a C a p p e l l a r o , K a r i n H a u s e r ,V l a d i m i r M r s a , M a n f r e d W a t z e l e ,G a b r i e l e W a t z e l e , C l a u d i a G r u b e r andWidmar T a n n e rL e h r s t u h l f u r Z e l l b i o l o g i e u n d P f l a n z e n p h y s i o l o g i e , U n i v e r s i t a tR e g e n s b u r g , U n i v e r s i t a t s s t r a s s e 3 1 , 8 4 0 0 R e g e n s b u r g , FRGC o m m u n i c a t e d b y W . T a n n e rAn 0 - g l y c o s y l a t e d p r o t e i n o f 1 8 kDa r e s p o n s i b l e f o rm a t i n g t y p e s p e c i f i c a g g l u t i n a t i o n h a s b e e n i s o l a t e d fromS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a c e l l s , p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t ya n d v i a p e p t i d e sequences t h e gene was c l o n e d b y PCR.An open r e a d i n g f r a m e c o d e s f o r a p r o t e i n o f 6 9 a m i n oa c i d s . A minimum o f f i v e s e r i n e a n d f i v e t h r e o n i n er e s i d u e s o f t h e m a t u r e p r o t e i n ar e g l y c o s y l a t e d . aA g g l u t i n i n i s a h i g h l y N - g l y c o s y l a t e d p r o t e i n o f - 2 5 0k D a . B o t h p u r i f i e d a g g l u t i n i n s f o r m a s p e c i f i c 1 : 1c o m p l e x i n v i t r o . P r e t r e a t m e n t o f a - a g g l u t i n i n , b u t n o to f a - a g g l u t i n i n , w i t h d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ( D E P C )p r e v e n t s f o r m a t i o n o f t h e c o m p l e x ; t r e a t m e n t o f aa g g l u t i n i n i n t h e presence o f a - a g g l u t i n i n p r o t e c t s t h ef o r m e r f r o m DEPC i n a c t i v a t i o n . By c a r b o x y t e r m i n a ls h o r t e n i n g o f t h e a - a g g l u t i n i n gene a n d b y r e p l a c i n g t h r e eo f i t s e i g h t h i s t i d y l r e s i d u e s b y a r g i n i n e , t h e a c t i v e r e g i o no f a - a g g l u t i n i n f o r i n t e r a c t i o n w i t h a - a g g l u t i n i n h a s b e e nd e f i n e d . N e i t h e r t h e N - no r t h e 0 - l i n k e d s a c c h a r i d e s o ft h e t w o a g g l u t i n i n s seem t o b e e s s e n t i a l f o r t h e i ri n t e r a c t i o n .K e y w o r d s : DNA sequence o f a - a g g l u t i n i n / p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n / d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e i n h i b i t i o n

I n t r o d u c t i o nH a p l o i d S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e c e l l s s y n t h e s i z e i n d u c i b l em a t i n g t y p e s p e c i f i c a g g l u t i n i n s B e t z e t a l . , 1 9 7 8 ;F e h r e n b a c h e r e t a l . , 1 9 7 8 ; D o i e t a l . , 1 9 7 9 ) . M a t i n g t y p ea c e l l s f o r e x a m p l e , when t r e a t e d w i t h a c t o r , i n c r e a s et h e amount o f an 0 - g l y c o s y l a t e d c e l l s u r f a c e m o l e c u l e o f1 8 kDa a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t b y 3 0 - f o l d O r l e a n e t a l . ,1 9 8 6 ) . T h i s p r o t e i n ca n b e r e l e a s e d f r o m i n t a c t a c e l l s b ySH c o m p o u n d s . The s o l u b i l i z e d p r o t e i n h a s b e e n p u r i f i e dt o h o m o g e n e i t y ; i t i n h i b i t s a g g l u t i n a t i o n o f a w i t h e l l sa t a c o n c e n t r a t i o n o f 4 x 1 0 - M ( W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) .G e n e t i c a n a l y s i s o f a c e l l s s h o w e d t h a t a g g l u t i n a t i o n -n e g a t i v e m u t a n t s c o n s i s t e d o f t wo c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s( R o y e t a l . , 1 9 9 1 ) . The AGA] g e n e e n c o d e s an u n u s u a l7 3 kDa p r o t e i n c o n s i s t i n g t o > 5 0 o f s e r i n e a n d t h r e o n i n er e s i d u e s ; i t c o n s t i t u t e s t h e c e l l s u r f a c e a t t a c h m e n t s u b u n i tf o r t h e a - a g g l u t i n i n b i n d i n g f r a g m e n t ( R o y e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h egene o f t h e l a t t e r ( A G A 2 ) h a s b e e n c l o n e d a n d s e q u e n c e d ;t h e r e s u l t s are r e p o r t e d h e r e i n .T h e a - a g g l u t i n i n h a s b e e n p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y ( H a u s e r

O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s

a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) a n d t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e h a s b e e nc l o n e d a n d s eq u en ce d ( L i p k e e t a l . , 1 9 8 9 ; H a u s e r a n dT a n n e r , 1 9 8 9 ) . I t i n c r e a s e s t h e e f f i c i e n c y o f c o n j u g a t i o n i nl i q u i d c u l t u r e b y a f a c t o r o f 1 0 5 , a l t h o u g h t h e p r o t e i n i s n o te s s e n t i a l f o r c o n j u g a t i o n a s s u c h ( L i p k e e t a l . , 1 9 8 9 ) .T h u s t h e c o m p o n e n t s o f S . c e r e v i s i a e r e s p o n s i b l e f o rm a t i n g t y p e r e c o g n i t i o n a n d a g g l u t i n a t i o n a r e f a i r l y w e l ld e f i n e d b o t h a s g e n e s a n d a s h i g h l y g l y c o s y l a t e d c e l l s u r f a c ep r o t e i n s . I t i s p o s s i b l e , t h e r e f o r e , t o s t u d y t h i s c e l l - c e l li n t e r a c t i o n a t t h e m o l e c u l a r l e v e l . B e s i d e s t h e DNA s e q u e n c eo f t h e a - a g g l u t i n i n b i n d i n g f r a g m e n t , we r e p o r t t h e i n v i t r of o r m a t i o n o f a s p e c i f i c 1 : 1 c o m p l e x o f t h e t w o d e g l y c o s y l a t e da g g l u t i n i n p r o t e i n s a n d p r e s e n t e v i d e n c e t h a t H i s 2 7 3 o f a -a g g l u t i n i n i s e s s e n t i a l f o r t h e p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n .R e s u l t sP u r i f i c a t i o n o f a - a g g l u t i n i n a n d p r e p a r a t i o n o f t r y p t i cp e p t i d e sS . c e r e v i s i a e s t r a i n 4 2 7 7 - 7 ( M A T a , b a r 1 - 1 ) w a s g r o w n i nYP D m e d i u m t o a n O D 5 7 8 v a l u e o f 5 ; t h e n 4 0 p i g / l o f etf a c t o r w a s a d d e d a n d t h e i n c u b a t i o n c o n t i n u e d f o r 2 h . a -A g g l u t i n i n w a s r e l e a s e d b y t r e a t i n g i n t a c t c e l l s o f a 1 0 1c u l t u r e w i t h DT T a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y W a t z e l e e t a l . ,1 9 8 8 ) . T h e p u r i f i c a t i o n w a s a l s o c a r r i e d o u t a s b e f o r e e x c e p tt h a t t h e HPLC s i z i n g c o l u m n w a s r e p l a c e d b y a n i o ne x c h a n g e c o l u m n ( M o n o Q , s e e M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ) . T h ep r o t e i n o b t a i n e d i n t h i s w a y w a s s h o w n t o b e p u r e b y s i l v e rs t a i n i n g o n SDS-PAGE F i g u r e l a ) .T h e N - t e r m i n a l s e q u e n c e o f t w o d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s i sg i v e n i n T a b l e I . I n a d d i t i o n a n u m b e r o f t r y p t i c p e p t i d e ss e p a r a t e d o n R P - 3 0 4 a n d R P - 1 8 c o l u m n s w e r e s e q u e n c e d ;f o u r p e p t i d e s y i e l d e d i n f o r m a t i o n T a b l e I . To r e m o v e 0 -l i n k e d m a n n o s y l r e s i d u e s O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ; W a t z e l ee t a l . , 1 9 8 8 ) p e p t i d e s 2 a n d 4 w e r e t r e a t e d w i t h a x -m a n n o s i d a s e a n d p a r t i a l l y d e m a n o s y l a t e d a s c a n b e s e e n b yc o m p a r i n g p o s i t i o n s 3 a n d 6 o f p e p t i d e s 1 a n d 2 .C l o n i n g o f t h e a - a g g l u t i n i n g e n e A G A 2 ) a n d i t ss e q u e n c eA c c o r d i n g t o p e p t i d e 3 t h e f o l l o w i n g 2 7 b p a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e w a s s y n t h e s i z e d : 5 ' - T T T GT A GT A T T CGAA NAC NC C T T G C A T . T h i s n u c l e o t i d e h y b r i d i z e d t oa n a f a c t o r i n d u c i b l e 0 . 5 k b R NA d a t a n o t s h o w n ) . Ap o s i t i v e 1 0 0 b p s i g n a l w a s o b t a i n e d b y PCR u s i n g t h e a b o v eo l i g o n u c l e o t i d e a n d t h e f o l l o w i n g o l i g o n u c l e o t i d e c o n c e i v e df r o m t h e N - t e r m i n u s 5 ' - G A G T TG GAA T CG AT T TCTGAA/G CAA/G A T T / C / A C C . T h i s PCR s i g n a l w aso b t a i n e d o n l y w i t h mRNA f r o m a f a c t o r t r e a t e d a c e l l s . I na d d i t i o n a PCR b a n d o f 3 5 0 b p was o b t a i n e d , w h e n t h eo l i g o n u c l e o t i d e c o r r e s p o n d i n g t o t h e N - t e r m i n u s w as u s e dt o g e t h e r w i t h o l i g o d T ) . When t h e 3 5 0 b p p i e c e w ass u b c l o n e d i n P I C 2 0 H a n d s e q u e n c e d , t h e s e q u e n c e c o n t a i n e da l l t h e p e p t i d e s e q u e n c e i n f o r m a t i o n o f T a b l e I e x c e p t t w o

4 0 8 1

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C . C a p p e l l a r o e t a l .errors a t t h e C - t e r m i n a l e n d ( a m i n o a c i d s 6 6 a n d 6 7 ; s e eF i g u r e 2 ) . A l s o t h e N o r t h e r n a n a l y s i s y i e l d e d a m a t i n g t y p es p e c i f i c a n d s t r o n g l y i n d u c i b l e s i g n a l c o r r e s p o n d i n g t o a5 0 0 b p mRNA F i g u r e l b ) .T h e f u l l sequence i n c l u d i n g t h e s i g n a l p e p t i d e w as o b t a i n e db y c a r r y i n g o u t PCR w i t h 3 - p o l y A ) e x t e n d e d DNAf r a g m e n t s o b t a i n e d b y c u t t i n g t o t a l y e a s t DNA b y A l u I a n da t t a c h i n g o l i g o A ) a t t h e 3 ' - e n d s o f i t s e e M a t e r i a l s a n dm et ho d s ). F i g u r e 2 s h o w s t h e f u l l sequence o f a - a g g l u t i n i n .T h e sequences c o r r e s p o n d i n g t o t h o s e g a i n e d f r o m p e p t i d es e q u e n c i n g a r e u n d e r l i n e d . T h e 1 8 a m i n o a c i d s i g n a l p e p t i d ec o n t a i n s t h e t y p i c a l p o s i t i v e c h a r g e ( A r g i n p o s i t i o n - 1 4 ) ,f o l l o w e d b y 1 3 u n c h a r g e d a m i n o a c i d s n i n e o f w h i c h arel i p o p h i l i c ) a n d a t y p i c a l s p l i t t i n g c o n f i g u r a t i o n w i t h V a t -3a n d A a t -1 H e i j n e , 1 9 8 5 ) . U n f o r t u n a t e l y t h e sequencea v a i l a b l e d o e s n o t c o n t a i n a s t o p c o d o n i n f r o n t o f t h e ATG,l e a v i n g open t h e u n l i k e l y p o s s i b i l i t y t h a t t h e s i g n a l p e p t i d emay b e c o n s i d e r a b l y l o n g e r .

S o u t h e r n a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d t h a t o n l y o ne copy o f t h ea - a g g l u t i n i n gene ( A G A 2 ) i s p r e s e n t i n t h e h a p l o i d genome d a t a n o t s h o w n ) . When t h e gene w as d i s r u p t e d w i t h a URA3

. . . . . . . .

F i g . 1 . a ) S i l v e r - s t a i n e d SDS-PAGE o f p u r i f i e d a - a g g l u t i n i n b i n d i n gf r a g m e n t . L a n e 1 , i n t a c t a - a g g l u t i n i n ; l a n e 2 , a - a g g l u t i n i nd e g l y c o s y l a t e d b y HF t h e f a s t e r r u n n i n g m a t e r i a l may b e a p r o t e i nb r e a k d o w n p r o d u c t ) ; l a n e 3 , l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r e s t a i n e d s t a n d a r d si n s u l i n A a n d B c h a i n s 2 a n d 3 k D a ) , b o v i n e t r y p s i n i n h i b i t o r 6 k D a ) , l y s o z y m e 1 5 . 5 k D a ) , , B - l a c t o g l o b u l i n 1 9 k D a ) , c a r b o n i ca n h y d r a s e 3 0 k D a ) , o v a l b u m i n 4 6 k D a ) . b ) N o r t h e r n a n a l y s i s u s i n gt h e 3 5 0 b p PCR b a n d s u b c l o n e d i n P I C 2 0 H . a a n d a, t o t a l RNA 5 0 u g ) f r o m a a n d a c e l l s ; a i a n d c x ; , t o t a l R NA 5 0 u t g f r o m a a n dc e l l s t r e a t e d f o r 2 0 m i n w i t h p h e r o m o n e .

c o n s t r u c t s e e M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ) , t h e s e c e l l s n o l o n g e rp r o d u c e d t h e c e l l s u r f a c e a n t i g e n a s s h o w n b y i m m u n o b l o t so f c e l l s u r f a c e e x t r a c t s a n d t h e c e l l s no l o n g e r a g g l u t i n a t e dw i t h a - c e l l s d a t a n o t s h o w n ) .T h e a - a g g l u t i n i n : s i z e a n d g l y c o s y l a t i o nU s i n g l o w m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s y i e l d e d v a l u e s o f 1 8a n d 7 kDa f o r t h e g l y c o s y l a t e d a n d t h e d e g l y c o s y l a t e d f o r m ,r e s p e c t i v e l y F i g u r e l a ) . T h e v a l u e s p u b l i s h e d p r e v i o u s l y( W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) were t o o l a r g e . T h e sequence c o d e sf o r a 7 . 4 8 kDa p r o t e i n , 6 9 a m i n o a c i d s l o n g w i t h o u t t h es i g n a l p e p t i d e .

T w e n t y - o n e o f t h e 6 9 a m i n o a c i d s a r e s e r i n e / t h r e o n i n er e s i d u e s , a t l e a s t 1 0 o f w h i c h are g l y c o s y l a t e d , b a s e d o n t h eappearance o f X i n t h e p e p t i d e s e q u e n c e w h e r e t h e DNAsequence p r e d i c t s a S e r o r T h r r e s i d u e . N o n - g l y c o s y l a t e dh y d r o x y a m i n o a c i d s l i k e S 5 2 , S 5 5 , T 5 6 , S 5 8 , a n d T 6 5 wered e t e c t e d i n p a r t i a l l y d e m a n n o s y l a t e d p e p t i d e s ; t h u s t h e y m ayvery well b e g l y c o s y l a t e d i n t h e i n t a c t p r o t e i n .T h e a m i n o a c i d s S 1 7 , T 1 8 a n d S 2 3 a r e t h e o n l y h y d r o x ya m i n o a c i d s r e c o v e r e d u n g l y c o s y l a t e d d u r i n g N - t e r m i n a ls e q u e n c i n g . T h e y may n o t , h o w e v e r , b e u n m o d i f i ed w i t h i ne a c h i n d i v i d u a l m o l e c u l e , s i n c e a c e r t a i n d e g r e e o f m o l e c u l a rh e t e r o g e n e i t y h a s t o b e d e d u c e d f r o m t h e d i f f u s e r u n n i n gb e h a v i o u r o n SDS g e l s . O n l y S 1 7 most l i k e l y i s n o tg l y c o s y l a t e d a t a l l , s i n c e i t h a s b e e n s h o w n i n v i t r o t h a tm a n n o s y l t r a n s f e r t o h y d r o x y a m i n o a c i d s n e x t t o a c i d i ca m i n o a c i d s i s n o t c a t a l y s e d b y t h e m a n n o s y l t r a n s f e r a s e S t r a h l - B o l s i n g e r a n d T a n n e r , 1 9 9 1 ) . T h e p r o t e i n d o e s n o tc o n t a i n an y p o t e n t i a l N - g l y c o s y l a t i o n s i t e s i n a c c o r d a n c e w i t hp r e v i o u s r e s u l t s w i t h t u n i c a m y c i n O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ) .T h e p h e r o m o n e i n d u c e d a g g l u t i n i n s r e a c t w i t h e a c ho t h e rI n v i v o o b s e r v a t i o n . T h a t t h e t w o m a t i n g t y p e s p e c i f i ca g g l u t i n i n s i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r a n d n o t w i t h a w a l lc o m p o n e n t c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d a t t h e s u r f a c e o f t h ep a r t n e r c e l l , h a s g e n e r a l l y b e e n a s s u m e d ( H a g i y a e t a l . ,1 9 7 7 ; B e t z e t a l . , 1 9 7 8 ; T e r r a n c e a n d L i p k e , 1 9 8 1 ) . I t h a st o b e i n f e r r e d f r o m t h e l a c k o f a g g l u t i n a t i o n o f p h e r o m o n et r e a t e d c e l l s w i t h c o n t r o l c e l l s F i g u r e 3 ) . When b o t h m a t i n gt y p e s a r e p r e t r e a t e d w i t h p h e r o m o n e , t h e f o r m a t i o n o fa g g l u t i n a t e s ca n b e seen w i t h i n 2-5 m i n a n d t h i s i si n d e p e n d e n t o f w h e t h e r c y c l o h e x i m i d e i s i n c l u d e d i n t h ei n c u b a t i o n or n o t . C e l l s n o t p r e t r e a t e d w i t h p h e r o m o n e s h o ws t r o n g a g g l u t i n a t i o n a f t e r 30-40 m i n , b u t d o n o t d o so i nt h e presence o f c y c l o h e x i m i d e ; t h e a g g l u t i n i n s h a v e f i r s t t ob e s y n t h e s i z e d a n d e x p o s e d a t t h e c e l l s u r f a c e B e t z e t a l . ,

T a b l e I . N - t e r m i n a l a n d p e p t i d e s e q u e n c e s o b t a i n e d f r o m p u r i f i e d a - a g g l u t i n i nN - t e r m i n u s

S a m p l e I Q/AE L X X I X E Q I P X P D ) L E aS a m p l e 2 X E L E S I S ) E Q I P X G/PX L E S T P Y X L S

T r y p t i c p e p t i d e sP e p t i d e I X V X F V X N N X S HP e p t i d e 2 X V T F V S N Y G S H P S T X S K G S bP e p t i d e 3 A M Q G V F E Y Y KP e p t i d e 4 X X P I N ) T G T Vba T h e N - t e r m i n u s o f s a m pl e 1 w a s s e q u e n c e d b y D r J . H o p p e , W u r z b u r g ; a l l o t h e r s e q u e n c e s w e r e o b t a i n e d b y D r R . D e u t z m a n n , R e g e n s b u r g .b T h e s e p e p t i d e s w e r e p a r t i a l l y d e m a n n o s y l a t e d w i t h a - m a n n o s i d a s e .4 082

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3/8

S . ce r ev i s ia e a - a a g g l u t i n i n i n t e r a c t i o n

1 9 7 8 ) . When o n l y o n e m a t i n g t y p e i s p r e t r e a t e d w i t hp h e r o m o n e w e l l s 2 a n d 3 ) t h e m i x e d p o p u l a t i o n b e h a v e sa s t h e u n t r e a t e d c o n t r o l w e l l 4 ) ; t h e s l i g h t d i f f e r e n c e i n t i m ei s m o s t l i k e l y d u e t o t h e i n c r e a s e d p h e r o m o n e p r o d u c t i o no f t h e p r e t r e a t e d c e l l t y p e S t r a z d i s a n d M a c K a y , 1 9 8 3 ;A c h s t e t t e r , 1 9 8 9 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e t w oi n d u c i b l e a g g l u t i n i n s i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r .1 : 1 c o m p l e x f o r m a t i o n i n v i t r o . T o i n v e s t i g a t e t h i s q u e s t i o nf u r t h e r i t w a s t r i e d w h e t h e r t h e t w o p u r i f i e d p r o t e i n s r e a c tw i t h e a c h o t h e r i n v i t r o . T h e a - a g g l u t i n i n h a s b e e n s h o w nt o c o n s i s t o f a p r o t e i n m o i e t y 6 3 1 a m i n o a c i d s l o n g w i t ha m o l e c u l a r w e i g h t o f 6 8 . 2 k D a . M a x i m a l l y 1 2 N - l i n k e ds a c c h a r i d e c h a i n s i n c r e a s e t h e a p p a r e n t M , b y 2 0 0 k D a a se s t i m a t e d f r o m SDS -PAGE ( H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) .T h e p u r i f i e d g l y c o p r o t e i n y i e l d s u p t o s i x p e p t i d e s a f t e rd e g l y c o s y l a t i o n , w h i c h p o s s e s s i d e n t i c a l N - t e r m i n i a n d a r e

a l l b i o l o g i c a l l y a c t i v e ( H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) . T h eb i o l o g i c a l l y a c t i v e p a r t o f a - a g g l u t i n i n c o n s i s t s o f t h e 6 9a m i n o a c i d p r o t e i n , w h i c h i n i t s g l y c o s y l a t e d f o r m h a s am o l ec u l a r w ei g ht o f - 1 8 k D a F i g u r e l a ) . T h a t t h e s e t w op r o t e i n s a r e t h e t w o m a t i n g t y p e s p e c i f i c a g g l u t i n i n s i s b a s e do n t h e o b s e r v a t i o n s i t h a t b o t h t h e s e p r o t e i n s i n h i b i t t h ea g g l u t i n a t i o n o f a w i t h a t c e l l s O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ; H a u s e ra n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) ; i i t h a t t h e d i s r u p t i o n o f t h e c o r r e s -p o n d i n g g e n e s y i e l d s n o n - a g g l u t i n a t i n g m u t a n t s L i p k e e t a l . ,1 9 8 9 ; a n d s e e a b o v e ) ; i i i t h a t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s o b t a i n e da g a i n s t b o t h p r o t e i n s i n h i b i t a g g l u t i n a t i o n ( M . W a t z e l e a n dK . H a u s e r , u n p u b l i s h e d ) ; a n d i v ) t h a t t h e a n t i b o d i e s r e a c tw i t h S . c e r e v i s i a e z y g o t e s i n t h e p r e d i c t e d m a t i n g t y p es p e c i f i c m a n n e r , w h e r e a s t h e n e w d i p l o i d z y g o t e b u d n ol o n g e r r e a c t s w i t h e i t h e r a n t i b o d y F i g u r e 4 ) .When p u r i f i e d d e g l y c o s y l a t e d a - a g g l u t i n i n i s i n c u b a t e dw i t h a - a g g l u t i n i n , c r o s s l i n k e d w i t h g l u t a r a l d e h y d e , t h e n

CTCAACAGTCACTTGTGTGCCAAAATATTATACCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGM 1CAGTTACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCACAGGAACTG

2 Q L L R C F S I F S V I A S V L A Q E L 21ACAACTATATGCGAGCAAATCCCCTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCA

22 T T I C E Q I P S P T L E S T P Y S L S _ 4 1ACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGAGTTTTTGAATATTACAAATCA

4 2 T T T I L A N G K L A M Q G V F E Y Y K , I 6 1GTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACAACTAGCAAAGGCAGCCCCATA

62 V T F V S N C G S H P S T T S K G S P I 81AACACACAGTATGTTTTTTGAGCCTTCCCCCCCAAGTTTCCATTTCATCGTTCGTGACAC

82 N T Q Y V F 10 1TTATAAACTAGTGTAAGATTATTTACCTATATATAATTTGATAATAATAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

F i g , 2 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e AGA2 g e n e . T h e s e q u e n c e d p e p t i d e s T a b l e I a r e u n d e r l i n e d .x -

x

T1

i n

. - x i m i d e

< 5 m i rF i g . 3 . A g g l u t i n a t i o n t e s t o f a a n d c a c e l l s X 2 1 8 0 ) p r e t r e a t e d o r n o t p r e t r e a t e d w i t h a a n d a f a c t o r r e s p e c t i v e l y : a i n d a i n d , c e l l s p r e t r e a t e d w i t h t h ec o r r e s p o n d i n g m a t i n g p h e r o m o n e 1 0 A g / m l o f a f a c t o r a n d 1 0 u n i t s / m l o f a f a c t o r ) f o r 9 0 m i n ; a a n d a , c e l l s n o t p r e t r e a t e d . T h e t i m e s i n d i c a t e dc o r r e s p o n d t o t h e t i m e r e q u i r e d u n t i l t h e f i r s t l a r g e a g g l u t i n a t e s c o u l d b e s e e n . W h e r e i n d i c a t e d c y c l o h e x i m i d e a r e p r e s e n t 1 0 y g / m l ) ; o t h e rc o n d i t i o n s s e e M a t e r i a l s a n d m e t h o d s .

4083

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C . C a p p e l l a r o e t a l .s e p a r a t e d o n SDS -PAGE a n d a n i m m u n o - b l o t p r e p a r e dw i t h a n t i - a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y , t h e p i c t u r e s h o w n i nF i g u re 5 a i s o b t a i n e d . W h e r e a s i n a l l c o n t r o l s i m m u n o -p o s i t i v e m a t e r i a l i s v i s i b l e o n l y s l i g h t l y a b o v e 1 8 k D a , t w oa d d i t i o n a l b a n d s o f - 7 7 a n d 9 2 k D a a r e v i s i b l e i n t h ee x p e r i m e n t a l s a m p l e F i g u r e 5 a , r i g h t . T h e t w o m a j o rp e p t i d e s o f d e g l y c o s y l a t e d a - a g g l u t i n i n r u n a t 7 2 a n d 5 7 k D a s e e s i l v e r - s t a i n e d SDS -PAGE; F i g u r e S b , l e f t a n d t w on e w b a n d s a r e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f a - a g g l u t i n i n F i g u r e S b , r i g h t , a r r o w h e a d s ) ; t h e l a t t e r t w o b a n d s r e a c t

F i g . 4 . Y e a s t z y g o t e s s t a i n e d w i t h F I T C l a b e l l e d a n t i - a - a g g l u t i n i na n t i b o d y a n d r h o d a m i n e l a b e l l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s ta n t i - c a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y s e e M a t e r i a l a n d m e t h o d s ) . T h e b u dr e p r e s e n t i n g t h e f i r s t d i p l o i d o f f s p r i n g c o n t a i n s n e i t h e r a - n o r a -a g g l u t i n i n .

w i t h t h e a n t i - a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y . T h e 2 0 k D a l a r g e r newb a n d s a r e t h e 1 : 1 c o m p l e x o f b o t h a g g l u t i n i n s . T h e s a m er e s u l t i s o b t a i n e d w i t h c r u d e e x t r a c t s f r o m a a n d o a c e l l s d a t an o t s h o w n ) ; t h i s s h o w s t h e s p e c i f i c i t y o f t h e i n t e r a c t i o n a n da l s o t h a t g l u t a r a l d e h y d e c r o s s l i n k i n g d o e s n o t g i v e r i s e t oa d d i t i o n a l n o n - s p e c i f i c p r o t e i n - p r o t e i n c o m p l e x e s .T h e f o r m a t i o n o f t h e a -a - a g g l u t i n i n c o m p l e x i si n h i b i t e d b y d i e t h y l p y r o c a r b o n a t eWhen t h e o a - a g g l u t i n i n w a s p r e t r e a t e d f o r 1 0 m i n w i t h t h eh i s t i d y l m o d i f y i n g a g e n t d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ( D E P C ) M i l e s , 1 9 7 7 ) b e f o r e a d d i t i o n o f a - a g g l u t i n i n a n d c r o s s -l i n k i n g , t h e i n v i t r o c o m p l e x w a s n o l o n g e r f o r m e d F i g u r e 6 . P r e t r e a t m e n t o f a - a g g l u t i n i n i n t h e s a m e w a y d i dn o t p r e v e n t c o m p l e x f o r m a t i o n . When t h e a t - a g g l u t i n i n w a st r e a t e d w i t h DEPC i n t h e p r e s e n c e o f a - a g g l u t i n i n , t h ec o m p l e x w a s f o r m e d F i g u r e 6 , i n d i c a t i n g t h a t a - a g g l u t i n i na s s u b s t r a t e o f t h e a o - a g g l u t i n i n p r o t e c t e d t h e a c t i v e s i t eo f t h e l a t t e r f r o m t h e a c t i o n o f D E P C . When a n a l o g o u se x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t w i t h N - e t h y l m a l e i m i d e ( N E M )n o i n h i b i t o r y a c t i o n w a s o b s e r v e d .I d e n t i f i c a t i o n o f t h e c r i t i c a l h i s t i d y l r e s i d u e s w i t h i n t h ea - a g g l u t i n i nT h e p r o t e i n s e q u e n c e d e d u c e d f r o m t h e a o - a g g l u t i n i n g e n ec o n t a i n s e i g h t h i s t i d y l r e s i d u e s ( H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ;L i p k e e t a l . , 1 9 8 9 ) . C a r b o x y t e r m i n a l d e l e t i o n s u p t o o n et h i r d o f t h e g e n e s t i l l r e s u l t e d i n b i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o t e i n F i g u r e 7 . When o n l y t h e N - t e r m i n a l o n e t h i r d w a se x p r e s s e d n o b i o l o g i c a l l y a c t i v e e x t r a c t w a s o b t a i n e da n y m o r e . L i p k e e t a l . 1 9 8 9 ) c o n c l u d e d f r o m a n i n h i b i t o r ya n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t a f u s i o n p r o t e i n t h a t t h e r e g i o nb e t w e e n a m i n o a c i d s 1 2 8 a n d 3 5 6 i s i m p o r t a n t f o r a g g l u t i n a -t i o n . F r o m b o t h t h e s e o b s e r v a t i o n s i t w a s e x p e c t e d t h a t e i t h e rt h e h i s t i d y l r e s i d u e 1 6 4 , 1 7 8 o r 2 7 3 p a r t i c i p a t e s i n t h ei n t e r a c t i o n w i t h a - a g g l u t i n i n . B y s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i st h r e e m u t a n t s w e r e c o n s t r u c t e d , e a c h w i t h o n e o f t h e t h r e eh i s t i d i n e s r e p l a c e d b y a r g i n i n e . O n l y t h e r e p l a c e m e n t o f

c : 1

k8 k d o s_ix J

Cko

F i g . 5 . C o m p l e x f o r m a t i o n o f a - a n d a - a g g l u t i n i n i n v i t r o . a ) A n t i - a - a g g l u t i n i n i m m u n o b l o t o f a - a g g l u t i n i n c r o s s l i n k e d t o d e g l y c o s y l a t e d o a - a g g l u t i n i nw i t h g l u t a r a l d e h y d e a + o a + g l ) ; t h e o t h e r f o u r l a n e s a r e c o n t r o l s . b ) S i l v e r - s t a i n e d SDS-PAGE o f d e g l y c o s y l a t e d c e - a g g l u t i n i n a ) a n d t h e s a m em a t e r i a l a f t e r c r o s s l i n k i n g t o a - a g g l u t i n i n a + a ) . T h e t w o n e w b a n d s a r r o w h e a d s ) a r e i d e n t i c a l w i t h t h e i m m u n o - p o s i t i v e d o u b l e b a n d i n p a n e l a . c ) A n t i - a - a g g l u t i n i n i m m u n o b l o t : a + a , a - a g g l u t i n i n c r o s s l i n k e d t o d e g l y c o s y l a t e d a - a g g l u t i n i n ; a H F ) , d e g l y c o s y l a t e d a - a g g l u t i n i n a ( H F ) + a ,b o t h d e g l y c o s y l a t e d a g g l u t i n i n s c r o s s l i n k e d .4084

; PL M k , .A m a , Me -i8 k , , j

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5/8

S . c e r e v i s i a e a - a a g g l u t i n i n i n t e r a c t i o n

a a

F i g . 6 . I n h i b i t i o n o f a - a n d c a - a g g l u t i n i n i n t e r a c t i o n b y D E P C ;i m m u n o b l o t w i t h a n t i - a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y . L a n e s f r o m l e f t t o r i g h t : a+ a z , c o n t r o l ; a I D + a , a - a g g l u t i n i n p r e t r e a t e d w i t h D E P C ; a + a I / D ,c e - a g g l u t i n i n p r e t r e a t e d w i t h D E P C ; a I D , a - a n d a - a g g l u t i n i n t o g e t h e rt r e a t e d w i t h D E P C . O t h e r c o n d i t i o n s a s i n F i g u r e 5 a n dM a t e r i a l s a n d m e t h o d s .

H i s 2 7 3 g a v e r i s e t o a n a l m o s t i n a c t i v e p r o t e i n , w h e r e a s t h eo t h e r t w o m u t a n t s b e h a v e d l i k e w i l d - t y p e F i g u r e 7 ) .T h e r e f o r e , t h e r e g i o n NVNTIDHALEFQY a r o u n d H 2 7 3i s a l i k e l y s i t e f o r d i r e c t l y b i n d i n g t o a - a g g l u t i n i n .T h e r o l e o f c a r b o h y d r a t es i n t h e a g g l u t i n i n i n t e r a c t i o nA s p o i n t e d o u t p r e v i o u s l y a l r e a d y T e r r a n c e e t a l . , 1 9 8 7 ;H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) t h e N - l i n k e d c a r b o h y d r a t em o i e t i e s o f a - a g g l u t i n i n , w h i c h a m o u n t t o m o r e t h a n t w ot h i r d s o f t h e m o l e c u l a r m a s s o f t h e i n t a c t g l y c o p r o t e i n , a r en o t n e c e s s a r y f o r b i o l o g i c a l a c t i v i t y . I n a d d i t i o n t h e c x -a g g l u t i n i n d o e s n o t s e e m t o p o s s e s s 0 - l i n k e d s a c c h a r i d e s( K . H a u s e r , u n p u b l i s h e d ) . T h e a - a g g l u t i n i n o n t h e o t h e r h a n dc o n t a i n s 2 9 % b y w e i g h t o f 0 - l i n k e d s h o r t o l i g o s a c c h a r i d e sc o n s i s t i n g o f m a n n o s y l r e s i d u e s o n l y W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) .A r e t h e y r e q u i r e d f o r t h e s p e c i f i c i n t e r a c t i o n o f t h e t w oa g g l u t i n i n s ? S i n c e m i l d p e r i o d a t e t r e a t m e n t o f a - a g g l u t i n i np a r t i a l l y d e s t r o y e d i t s a b i l i t y t o i n h i b i t a a n d o x c e l la g g l u t i n a t i o n , a p o s s i b l e r o l e o f t h e s u g a r s h a d b e e np o s t u l a t e d W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) . When HF t r e a t e d a -a g g l u t i n i n , h o w e v e r , w a s t e s t e d b y t h e i n v i t r o c o m p l e xf o r m a t i o n d e s c r i b e d a b o v e , i t s t i l l r e a c t e d w i t h c a - a g g l u t i n i n F i g u r e 5 c ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e s u g a r s

ves t e o g i c a l* i . v l v t

N

4 6 ?

C

p . .?

.2 N

F i g . 7 . A G a l - m u t a n t a n a l y s i s . C - t e r m i n a l d e l e t i o n s a n d s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f t h e A G o a l g e n e w e r e m a d e a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dm e t h o d s . B o t h t y p e s o f m u t a t e d DNA w e r e t r a n s f o r m e d i n t o a n A G a I d i s r u p t e d MATa s t r a i n (DBY 7 4 6 - 3 ) a n d t h e t r a n s f o r m a n t s w e r e a n a l y s e d .A l l t r a n s f o r m a n t s e x p r e s s t h e A G a l g e n e p r o d u c t i n t h e c o r r e s p o n d i n g s i z e a s t e s t e d b y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s . B i o l o g i c a l a c t i v i t y w a s m e a s u r e d a sd e s c r i b e d b y H a u s e r a n d T a n n e r 1 9 8 9 ) . M u t a n t s 1 2 a n d 6 1 d o n o t a g g l u t i n a t e , b u t w h e r e a s t h e g e n e p r o d u c t o f m u t a n t 1 2 h a s b i o l o g i c a l a c t i v i t y ,t h a t o f m u t a n t 6 1 h a s n o t , s i n c e t h e p r o t e i n o f m u t a n t 6 1 was o n l y d e t e c t e d i n m e m b r a n e f r a c t i o n s , h o w e v e r , i t w a s n o t s u r e w h e t h e r a s u f f i c i e n ta m o u n t o f i t w a s s o l u b i l i z e d p l u s s t a y e d i n s o l u t i o n d u r i n g t h e a g g l u t i n a t i o n t e s t . M u t a n t s H I a n d H2 s h o w w i l d - t y p e a g g l u t i n a t i o n a b i l i t y , b u tm u t a n t H3 o n l y a g g l u t i n a t e s w e a k l y a f t e r a 1 0 - f o l d l o n g e r i n c u b a t i o n t i m e t h a n H I a n d H2 m u t a n t s . T h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e i s o l a t e d H3 g e n ep r o d u c t w a s n o l o n g e r d e t e c t a b l e . W T , w i l d - t y p e ; 5 7 , 1 2 a n d 6 1 , C - t e r m i n a l d e l e t e d m u t a n t s ; H 1 , H2 a n d H 3 , s i t e d i r e c t e d m u t a n t s ; t h e h i s t i d i n e si n d i c a t e d a r e e x c h a n g e d b y a r g i n i n e s s e e M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ) . R e s t r i c t i o n s i t e s : B , B a m H I ; P , P v u I I ; S , S a c l .

4085

hwP

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6/8

C . C a p p e l l a r o e t a l ..r W 0 0. X W .

F i g . 8 . a ) 0 - g l y c o s y l a t i o n p a t t e r n s o f a - a g g l u t i n i n a n d r e g i o n a s s u m e dt o i n t e r a c t w i t h c a - a g g l u t i n i n . C l o s e d s y m b o l s , S e r / T h r m a n n o s y l a t e d ;open s y m b o l s , p o t e n t i a l 0 - g l y c o s y l a t i o n s i t e s s e e D i s c u s s i o n ) . b )R e s t r i c t i o n map o f c l o n e 11 i s o l a t e d p r e v i o u s l y ( H a u s e r a n d T a n n e r ,1 9 8 9 ) . B g , B g l I I ; B , B a m H I ; H , H i n d I I I ; N , N - t e r m i n u s ; C , C -t e r m i n u s .were r e m o v e d w i t h c e - m a n n o s i d a s e or b y f - e l i m i n a t i o n u n d e rc o n d i t i o n s w h e r e most o f t h e p r o t e i n r e m a i n e d i n t a c t d a t an o t s h o w n ) . a - A g g l u t i n i n d e m a n n o s y l a t e d i n v a r i o u s waysa l s o s t i l l i n h i b i t s t h e a g g l u t i n a t i o n o f a w i t h e l l s d a t an o t s h o w n ) . H o w e v e r , i n t h e w h o l e c e l l t e s t a 5 - f o l d h i g h e rc o n c e n t r a t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t e - f r e e a - a g g l u t i n i n h a d t ob e u s e d t o a c h i e v e t h e same l o n g l a s t i n g d e g r e e o f i n h i b i t i o n t h e i n h i b i t i o n w i t h a - a g g l u t i n i n n o r m a l l y f a d e s away a f t e rs e v e r a l h o u r s ) . I t i s a s s u m e d , t h e r e f o r e , t h a t S . c e r e v i s i a em a t i n g t y p e r e c o g n i t i o n a n d a g g l u t i n a t i o n i s b r o u g h t a b o u tb y a p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n , b u t t h a t t h e c o m p l e xf o r m e d b e t w e e n t h e t wo a g g l u t i n i n s i s s t a b i l i z e d i n s o m e w ayb y t h e 0 - l i n k e d sugars o f a - a g g l u t i n i n .

D i s c u s s i o nT h e S . c e r e v i s i a e a c e l l a g g l u t i n i n c o n s i s t s o f tw o c o m -p o n e n t s : t h e 7 . 5 kDa b i n d i n g f r a g m e n t , t h e gene p r o d u c to f AGA2 d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r , a n d a 7 2 5 a m i n o a c i d l a r g ec e l l w a l l p r o t e i n c o n s t i t u t i n g t h e a t t a c h m e n t s i t e o f t h eb i n d i n g f r a g m e n t . T h e gene f o r t h e a t t a c h m e n t s u b u n i t AGA]h a s b e e n c l o n e d a n d s e q u e n c e d b y R o y e t a l . 1 9 9 1 ) . T h ec y s t e i n o f p o s i t i o n 7 o r t h a t o f p o s i t i o n 5 0 o r b o t h ) o f t h eb i n d i n g f r a g m e n t s h o u l d f o r m t h e S S l i n k t o t h e a t t a c h m e n tp r o t e i n , s i n c e t h e b i n d i n g f r a g m e n t i s e a s i l y r e m o v e d f r o mi n t a c t c e l l s b y SH r e a g e n t s O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ) .I n a n u m b e r o f d i f f e r e n t y e a s t s p e c i e s a n a l o g o u s a g g l u t i n a -t i o n s y s t e m s h a v e b e e n d e s c r i b e d C r a n d a l l a n d B r o c k , 1 9 6 8 ;Y e n a n d B a l l o u , 1 9 7 4 ; B u r k e e t a l . , 1 9 8 0 ; P i e r c e a n d B a l l o u ,1 9 8 3 ) . I n e a c h s p e c i e s t h e r e e x i s t s a s m a l l f r a g m e n t , S H -b o u n d t o t h e c e l l s u r f a c e , w h i c h r e s e m b l e s t h e S . c e r e v i s i a ea - a g g l u t i n i n b i n d i n g f r a g m e n t , a n d a l a r g e g l y c o p r o t e i n ont h e p a r t n e r c e l l , r e s e m b l i n g t h e S . c e r e v i s i a e o a - a g g l u t i n i n .T h e a - a g g l u t i n i n b i n d i n g f r a g m e n t s h o w s a n u m b e r o fu n u s u a l f e a t u r e s . T h u s i t r e t a i n s i t s f u l l b i o l o g i c a l a c t i v i t y4 08 6

a f t e r b o i l i n g O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ; S i j m o n s e t a l . , 1 9 8 7 ) a n da l s o a f t e r s e p a r a t i o n o n S D S -PAGE W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) .T h e p r o t e i n i s h i g h l y 0 - g l y c o s y l a t e d w i t h o n e t o t h r e em a n n o s y l r e s i d u e s a t t a c h e d t o s e r i n e a n d t h r e o n i n e r e s i d u e s W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 . T e n h y d r o x y a m i n o a c i d s w e r e s h o w nt o b e l i n k e d t o s u g a r s b y p e p t i d e s e q u e n c i n g . H o w e v e r ,a n o t h e r 1 0 r e s i d u e s a r e p o t e n t i a l s u g a r a t t a c h m e n t s i t e s ; t h e ywere e i t h e r n o t s e q u e n c e d a s p e p t i d e s o r f o u n d n o n -g l y c o s y l a t e d d u e t o p a r t i a l d e m a n n o s y l a t i o n d u r i n g p e p t i d ep r e p a r a t i o n . I t s e e m s s a f e t o a s s u m e , t h e r e f o r e , t h a t av a r i a b l e a m o u n t o f 1 0 - 2 0 s i t e s a r e m o d i f i e d i n e a c hi n d i v i d u a l m o l e c u l e , t h u s g i v i n g r i s e t o t h e t y p i c a l d i f f u s eb a n d on S D S - g e l .T h e t w o g l y c o s y l a t e d c e l l s u r f a c e p r o t e i n s r e s p o n s i b l e f o rs e x u a l a g g l u t i n a t i o n a r e h i g h l y i n d u c e d b y t h e m a t i n gp h e r o m o n e p e p t i d e s a t l e a s t i n a a n d a c e l l s o f t h e s t r a i nX 2 1 8 0 a n d i n a c e l l s o f t h e s t r a i n 4 2 7 7 - 7 . T h e i n t e r a c t i o no f t h e t w o p u r i f i e d p r o t e i n s h a s b e e n a c h i e v e d i n v i t r o g i v i n gr i s e t o a o n e - t o - o n e c o m p l e x . T h e s u g a r s o f t h e a - a g g l u t i n i n( - 2 0 0 k D a ) a r e n o t r e q u i r e d f o r b i n d i n g t h e a - a g g l u t i n i n T e r r a n c e e t a l , , 1 9 8 7 ; H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) . A l s ot h e 0 - l i n k e d s h o r t m a n n o s y l o l i g o s a c c h a r i d e s o f t h ea - a g g l u t i n i n a r e n o t r e q u i r e d f o r i n t e r a c t i o n w i t h t h ec - a g g l u t i n i n F i g u r e S c ; t h e c o m p l e x f o r m e d w i t h s u g a r -f r e e a - a g g l u t i n i n , h o w e v e r , s e e m s t o b e l e s s s t a b l e , a s j u d g e df r o m w h o l e c e l l e x p e r i m e n t s . 0 - g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s o f t e nseem t o c o n s t i t u t e r a t h e r s t i f f r o d s J e n t o f t , 1 9 9 0 ) a n d i t m a yv e r y w e l l b e , t h e r e f o r e , t h a t t h e a - a g g l u t i n i n b e c o m e s m o r ef l e x i b l e a f t e r d e g l y c o s y l a t i o n , l e a d i n g t o a d e s t a b i l i z a t i o n o ft h e a - a - a g g l u t i n i n c o m p l e x .A s d e m o n s t r a t e d i n t h i s p a p e r t h e h i s t i d y l r e s i d u e 2 7 3 o fc e - a g g l u t i n i n i s e s s e n t i a l f o r b i n d i n g . I t s e e m s u n l i k e l y t h a tt h e d e f a u l t o f t h e c o r r e s p o n d i n g m u t a n t i s d u e t o a n i n d i r e c t ,e . g . c o n f o r m a t i o n a l e f f e c t , s i n c e t h e i n v i t r o i n t e r a c t i o n o ft h e t w o p r o t e i n s i s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y DEPC a n d t h ep r e s e n c e o f a - a g g l u t i n i n r e s u l t s i n a s u b s t r a t e - l i k e p r o t e c t i o na g a i n s t t h i s i n h i b i t o r F i g u r e 6 . T h e pH o p t i m u m f o ra g g l u t i n a t i o n o f a w i t h a c e l l s i s 5 . 5 - 6 . 5 K . H a u s e r ,u n p u b l i s h e d ) , w h i c h w o u l d a g r e e w i t h a p r o t o n a t e d h i s t i d y lr e s i d u e t a k i n g p a r t i n t h e b i n d i n g o f a - a g g l u t i n i n .T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f a - a g g l u t i n i n o b t a i n e d f r o mt h e p e p t i d e s a n d i n c l u d i n g t h e p a r t p r e d i c t e d f r o m t h e DNAs e q u e n c e , s h o w s a 1 6 a m i n o a c i d c e n t r a l n o n - g l y c o s y l a t e ds t r e t c h J 2 7 - K 4 2 , F i g u r e 8 a ) . S i n c e t h e a - a g g l u t i n i n b i n d st o a - a g g l u t i n i n b y p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n , i t i s t e m p t i n gt o s p e c u l a t e t h a t t h e a - a g g l u t i n i n r e c o g n i z e s t h e o n l y s u g a r -f r e e s e q u e n c e o f t h e a - a g g l u t i n i n . T h i s r e g i o n p o s s e s s e s ap a i r o f c h a r g e s . . E X X K . . , w h i c h m a y i n t e r a c t w i t h t h eo p p o s i t e p a i r H273XXE i n c e - a g g l u t i n i n F i g u r e 8 a ) . F o r t h eh o m o p h i l i c i n t e r a c t i o n o f t h e D i c t y o s t e l i u m a g g l u t i n i n a l s ot w o p a i r s o f c h a r g e d a m i n o a c i d s a r e t h o u g h t t o b e i m p o r t a n t( K a m b o j e t a l . , 1 9 8 9 ) . F u t u r e e x p e r i m e n t s w i t h s y n t h e t i cp e p t i d e s a n d s p e c i f i c m u t a t i o n s i n a - a g g l u t i n i n w i l l s u p p o r to r d i s m i s s o u r h y p o t h e s i s .M a t e r i a l s a n d m e t h o d sY e a s t a n d E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s , m e d i a , g r o w t h c o n d i t i o n sS . c e r e v i s i a e X2 1 8 0 - l A ( M A T a ) , X 2 1 8 0 - 1 B ( M A T a ) , 4 2 7 7 - 7 ( M A T a ,b a r ] - i ) C h a n a n d O t t e , 1 9 8 2 ) , DBY 7 4 6 ( M A T c a , H i s 3 - A s i l e u 2 - 3 ,l e u 2 - 1 1 2 , u r a 3 - 5 2 , t r p l - 2 8 9 ) a n d DBY 7 4 7 ( M A T a , h i s 3 - A , l e u 2 - 3 ,l e u 2 - 1 1 2 , u r a 3 - 5 2 , t r p l - 2 8 9 ) B o t s t e i n e t a l . , 1 9 7 9 ) w e r e g r o w n i n YP Dm e d i u m 1 % y e a s t e x t r a c t , 2 % b a c t o p e p t o n e , 2 % g l u c o s e ) o v e r n i g h t a t2 9 C . A m i n i m a l m e d i u m 0 . 6 7 y e a s t n i t r o g e n b a s e w i t h o u t a m i n o a c i d s

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7/8

S . c e r e v i s i a e a a a g g l u t i n i n i n t e r a c t i o n D i f c o ) w a s u s e d a n d s u p p l e m e n t e d w i t h 2 0 m g / l h i s t i d i n e , 3 0 m g / l l e u c i n e ,2 0 m g / l u r a c i l , 2 0 m g / l t r y p t o p h a n a n d 2% g l u c o s e .B M H 7 1 / 1 8 ( M e s s i n g e t a l . , 1 9 7 7 ) a n d J M 1 0 9 Y a n i s c h - P e r r o n e t a l . ,1 9 8 5 ) w e r e s e l e c t e d f o r F p l a s m i d i n m i n i m a l m e d i u m M9 M a n i a t i s e t a l . ,1 9 8 2 ) . F o r t r a n s f o r m a t i o n a n d p l a s m i d p r e p a r a t i o n c e l l s w e r e g r o w n i n L B .I n d u c ti o n o f y ea st c e l l s b y p h e r o m o n e t e s t e r s t r a i n s )S . c e r e v i s i a e 4 2 7 7 - 7 ( M A T a ) w a s g r o w n i n YP D t o O C 5 7 8 = 2 . 5 . T h e ns y n t h e t i c a f a c t o r ( B a c h e m , B u b e n d o r f , S w i t z e r l a n d ) w a s a d d e d t o a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 1 0 n M . A f t e r 2 h o f s h a k i n g a t 3 0 C i n d u c t i o n w a s s t o p p e db y a d d i n g p - d i n i t r o p h e n o l 1 m M ) . S . c e r e v i s i a e a c e l l s ( X 2 1 8 0 - l B a n dDBY 7 4 6 ) w e r e i n d u c e d w i t h a - m e d i u m : 5 0 m l o f a n o v e r n i g h t c u l t u r e o fa c e l l s w i t h a n O D 5 7 8 = 2 . 0 w e r e c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n 5 0 m la - m e d i u m . T h i s m e d i u m w a s o b t a i n e d b y r em o v i n g X 2 1 8 0 - 1 A c e l l s o f a no v e r n i g h t c u l t u r e O D 5 7 8 = 2 . 0 ) b y c e n t r i f u g a t i o n a n d f i l t r a t i o n n i t r o c e l l u l o s e , p o r e s i z e 0 . 4 5 p m ) . T h e a c e l l s w e r e g r o w n i n t h i s m e d i u mf o r 9 0 m i n a t 3 0 C . I n d u c t i o n w a s s t o p p e d b y c y c l o h e x i m i d e 2 0 p g / m n .C e l l s p r e p a r e d i n t h i s w a y w e r e k e p t i n t h e r e f r i g e r a t o r a n d c o u l d b e u s e da s t e s t e r s t r a i n s f o r 2-3 w e e k s .I n v i v o a s s a y f o r a g g l u t i n i n a c t i v i t y a n d a g g l u t i n a t i o n a s s a yB i o l o g i c a l a c t i v i t y o f a g g l u t i n i n s w a s a s s a y e d b y t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i ta g g r e g a t i o n o f p h e r o m o n e i n d u c e d MATa a n d MATa c e l l s a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ; H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) .T h e a g g l u t i n a t i o n a b i l i t y o f M A T c a c e l l s w a s a s s a y e d b y m i x i n g 5 0 p li n d u c e d 4 2 7 7 - 7 ( M A T a ) c e l l s 7 . 5 x 1 0 6 c e l l s , 5 0 p l i n d u c e d a c e l l s 7 . 5 x 1 0 6 c e l l s ) a n d 1 5 0 p l a s s a y b u f f e r 1 0 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e ,pH 6 . 3 ) i n a f l a t b o t t o m m i c r o t i t e r p l a t e 1 5 x 1 7 mm w e l l s ) . T h e m i x t u r ew a s g e n t l y s h a k e n a n d a g g l u t i n a t i o n o b s e r v e d . Q u a n t i t a t i v e a s s a y s f o ri n h i b i t o r y a c t i v i t y o f e x t r a c t e d a g g l u t i n i n s w e r e c a r r i e d o u t b y 1 : 2 d i l u t i o ns e r i e s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y O r l e a n e t a l . , 1 9 8 6 ) .P u r i f i c a t i o n o f a g g l u t i n i n sa - A g g l u t i n i n w a s e x t r a c t e d a n d p u r i f i e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y H a u s e ra n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) . a - A g g l u t i n i n w a s p u r i f i e d a c c o r d i n g t o W a t z e l e e t a l . 1 9 8 8 ) w i t h m o d i f i c a t i o n s . T h e HPLC g e l f i l t r a t i o n s t e p w a s r e p l a c e d b yi o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( M o n o Q - F P L C HR 5 / 5 . T h e s a m p l e wasa p p l i e d t o t h e c o l u m n i n 2 5 mM T r i s - H C I b u f f e r p H 9 . 0 a n d e l u t e d w i t ha l i n e a r g r a d i e n t o f N a C I 2 5 mM T r i s - H C I , p H 9 . 0 , 1 M N a C I ) . P r o t e i n so n SDS-PAGE L a e m m l i , 1 9 7 0 ) w e r e d e t e c t e d b y s i l v e r s t a i n i n g M o r r i s s e y , 1 9 8 1 ) .D e g l y c o s y l a t i o n o f a g g l u t i n i n sD i g e s t i o n o f c a - a g g l u t i n i n w i t h e n d o g l y c o s i d a s e F B o e h r i n g e r , M a n n h e i m )w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ) . 0 -g l y c o s i d i c a l l y l i n k e d s u g a r s o f a - a g g l u t i n i n w e r e r e m o v e d b y a n h y d r o u sHF c l e a v a g e ( M o r t a n d L a m p o r t , 1 9 7 7 ) . T h e s a m p l e w a s d r i e d o v e r P 2 0 5a n d t h e n t r e a t e d w i t h HF f o r 1 h a t 0 C . HF w a s r e m o v e d i n a N 2 s t r e a ma n d t h e r e s u l t i n g p e l l e t w a s n e u t r a l i z e d w i t h a s a t u r a t e d N a 2 C O 3 s o l u t i o n .a - M a n n o s i d a s e d i g e s t . D i g e s t i o n w a s c a r r i e d o u t i n a d i a l y s i s c u p 5 0 mMs o d i u m c i t r a t e , p H 4 . 3 ) f o r 5 8 h a t room t e m p e r a t u r e . E n z y m e S i g m a ,M u c h e n ) w a s a d d e d f o u r t i m e s ( - 1 0 0 m U / A g p r o t e i n .N o r t h e r n a n a l y s i sRNA w a s i s o l a t e d f o l l o w i n g t h e m e t h o d o f D o m d e y e t a l . 1 9 8 4 ) . T o t a lR NA 5 0 A g ) w a s e l e c t r o p h o r e s e d o n 0 . 8 f o r m a l d e h y d e - a g a r o s e g e l sa n d t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e M a n i a t i s e t a l . , 1 9 8 2 ) . O l i g o n u c l e o t i d e sa n d DNA p r o b e s w e r e l a b e l l e d w i t h 3 2 p M a n i a t i s e t a l . , 1 9 8 2 ) .C l o n i n g o f C - t e r m i n a l p a r t o f AGA2RNA w a s i s o l a t e d f r o m a f a c t o r i n d u c e d a c e l l s a s i n d i c a t e d a b o v e a n dt r a n s c r i b e d i n t o cDNA M a n i a t i s e t a l . , 1 9 8 2 . T w o o l i g o n u c l e o t i d e s weres y n t h e s i z e d T I B M O L B I O L , B e r l i n : t h e f i r s t one d e d u c e d f r o m t h e N -t e r m i n a l s e q u e n c e o f t h e m a t u r e p r o t e i n , t h e o t h e r o ne d i r e c t e d a g a i n s t t h ep o l y A ) t a i l [ o l i g o d T ) ] . F o r PCR 5 n g cDNA a n d 0 . 7 pM p r i m e r wereu s e d a n d b u f f e r s a n d c o n c e n t r a t i o n s were a s i n d i c a t e d i n P e r k i n E l m e r C e t u sG e n e A m p T M DNA a m p l i f i c a t i o n k i t . T h e c y c l i n g p r o c e d u r e w as m o d i f i e db y a 5 0 C s t e p a f t e r a n n e a l i n g a n d t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e w as i n c r e a s e da f t e r t h e f i r s t e i g h t c y c l e s f o r a f u r t h e r 3 2 c y c l e s f r o m 3 8 t o 4 3 C( p r o g r a m m e : 4 0 s , 9 5 C ; 1 m i n , 3 9 / 4 3 C ; 4 0 s , 5 0 C ; 1 . 5 m i n , 7 2 C .T h e r e s u l t i n g 3 5 0 b p f r a g m e n t was c l o n e d i n t h e C l a I s i t e o f P I C 2 0 H M a r s he t a l . , 1 9 8 4 ) .C l o n i n g o f N - t e r m i n a l p a r t o f AGA2G e n o m i c y e a s t DNA C r y e r et a l . , 1 9 7 5 ) w as d i g e s t e d w i t h A l u I a n dp o l y a d e n y l a t e d w i t h dATP a d d i t i o n c a t a l y s e d b y t h e t e r m i n a l t r a n s f e r a s ek i t B o e h r i n g e r , M a n n h e i m ) .

F o r PCR t h r e e o l i g o n u c l e o t i d e s were d e s i g n e d : two o f t h e m weren e i g h b o u r i n g s e q u e n c e s o f t h e k n o w n cDNA s e q u e n c e 0 1 : 5 ' C A A C T -CGAGAACCGCAATTACTGACAAAC-3' a n d 0 2 : 5'-GCGGATCCCG-T T G G C C A A A A T A G T A G T C G T T - 3 ' ) . T h e t h i r d one w as o l i g o d T 3 0 . A l lo l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n e d r e s t r i c t i o n s i t e s a t t h e i r 5 - e n d s . W i t h t h e s eo l i g o n u c l e o t i d e s a n e s t e d p r i m e d PCR w as p e r f o r m e d L e u , 1 9 9 0 : 1 / 1 0 0o f t h e f i r s t r o u n d 4 0 s , 9 5 C ; 1 m i n , 3 9 C ; 1 . 5 m i n , 7 2 C ; 2 0 c y c l e sw as r e - a m p l i f i e d 4 0 s , 9 5 C ; 1 . 5 m i n , 5 3 C ; 2 m i n , 7 2 C ; 2 5 c y c l e s .T h e b a n d o b t a i n e d w as c l o n e d i n PUC18 u s i n g J M 1 0 9 .S e q u e n c i n gDNA s e q u e n c i n g w as c a r r i e d o u t b y t h e d i d e o x y m e t h o d S a n g e r et a l . ,1 9 7 7 ) u s i n g t h e T 7 p o l y m e r a s e k i t U S B i o c h e m i c a l , C l e v e l a n d , O H ) ; a tl e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t PCR r e a c t i o n s were s e q u e n c e d .G e n e d i s r u p t i o n sA G c a l . T h e B g l l l - H i n d l I f r a g m e n t o f c l o n e 1 1 H a u s e r a n d T a n n e r , 1 9 8 9 ;s e e F i g u r e 8 b ) c o n t a i n i n g t h e A G a J I g e n e w as s u b c l o n e d i n t o p U C 1 9 . T h er e s u l t i n g p l a s m i d w as p H B 1 5 . T h e U R A 3 - c o n t a i n i n g H i n d U f r a g m e n t f r o mY E p 2 4 w as s u b c l o n e d i n t o B a m H I c l e a v e d p H B 1 5 ; t h e U R A 3 f r a g m e n t a n dp H B 1 5 were b l u n t e d p r e v i o u s l y b y t h e K l e n o w f r a g m e n t . T h e r e s u l t i n gp l a s m i d w as p H B u r a l l . T h e K p n I - H i n d I l - a g a l : : U R A 3 f r a g m e n t o fp H B u r a l l w as u s e d t o m a k e a g e n e d i s r u p t i o n i n DBY 7 4 6 b y t h e t e c h n i q u eo f R o t h s t e i n 1 9 8 3 . T h e d i s r u p t i o n s were t e s t e d b y S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s ,W e s t e r n b l o t a n a l y s i s a n d a g g l u t i n a t i o n t e s t d a t a n o t s h o w n ) . T h i s d i s r u p t i o nm u t a n t w as c a l l e d DBY 7 4 6 - 3 .A G A 2 : T h e g e n e f r a g m e n t o b t a i n e d b y PCR w i t h cDNA i n P I C 2 0 H w asp a r t i a l l y d i g e s t e d w i t h S s p I . I n a b l u n t e n d l i g a t i o n t h e U R A 3 g e n e H i n d I I If r a g m e n t ) o f Y E p 2 4 w as i n s e r t e d R o t h s t e i n , 1 9 8 3 ) a n d t h e i s o l a t e d l i n e a rc o n s t r u c t i n t r o d u c e d i n t o a ura- D B Y 7 4 7 s t r a i n . T h e m u t a t i o n w as c h e c k e db y an i n v i v o t e s t f o r a g g l u t i n a t i o n , b y i m m u n o - a n d S o u t h e r n b l o t s .S i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i sS i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s w as c a r r i e d o u t w i t h s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e sa n d PCR u s i n g t h e m e t h o d o f Ho e t a l . 1 9 8 9 . T h r e e m u t a n t s werec o n s t r u c t e d , e a c h w i t h o ne h i s t i d i n e r e p l a c e d b y a r g i n i n e . E v e r y r e p l a c e m e n tr e s u l t e d i n o ne n u c l e o t i d e e x c h a n g e : H i s 1 6 4 CACA r g C G C , H i s 1 7 8CAT A r g C G T , H i s 2 7 3 CAT A r g C G T . T h e B g l l - H i n d I H f r a g m e n to f c l o n e 1 1 F i g u r e 8 b ) w as c l o n e d i n t o Y E p 3 5 1 c o n t a i n i n g L E U 2 H i l le t a l . , 1 9 8 6 . T h e r e s u l t i n g p l a s m i d w as p M G 3 1 7 . M u t a g e n e s i s w as c a r r i e do u t w i t h t h e i n t e r n a l BamHI f r a g m e n t o f t h e A G c I g e n e w h i c h w as c l o n e di n t o p U C 1 8 , u s i n g t h e m u t a t i n g o l i g o n u c l e o t i d e s a n d t h e p U C / M 1 3 P r o m e g a ) f o r w a r d p r i m e r 2 4 m e r ) a n d r e v e r s e p r i m e r 2 2 m e r ) as p r i m e r sf o r P C R . T h e m u t a t e d PCR f r a g m e n t s were s e q u e n c e d a n d l i g a t e d b a c ki n t o BamHI c l e a v e d p M G 3 1 7 . M u t a t e d p l a s m i d s were d e t e c t e d b y S o u t h e r nb l o t a n a l y s i s w i t h t h e o l i g o n u c l e o t i d e s u s e d f o r m u t a t i n g as p r o b e s a n d b ys e q u e n c i n g . T h e y were t r a n s f o r m e d i n t o DBY 7 4 6 - 3 . L e u + t r a n s f o r m a n t swere t e s t e d f o r a g g l u t i n a t i o n a n d b y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s .C - t e r m i n a l d e l e t i o n sT h e P v u l l a n d S a c I s i t e s near t h e 3 - e n d o f t h e c o d i n g s e q u e n c e F i g u r e 7o f t h e A G a i 1 g e n e were u s e d t o m a k e d e l e t i o n s i n t h e N - t e r m i n a l d i r e c t i o nw i t h e x o n u c l e a s e I I I H e n i k o f f , 1 9 8 4 . T h e d e l e t e d f r a g m e n t s were c l o n e di n t o Y E p 3 5 1 a n d t r a n s f o r m e d i n t o DBY 7 4 6 - 3 . L e u + t r a n s f o r m a n t s weret e s t e d f o r a g g l u t i n a t i o n , f o r a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f e x t r a c t s a n db y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s .A n t i b o d y p r e p a r a t i o nA n t i b o d i e s were o b t a i n e d f r o m New Z e e l a n d r a b b i t s a s d e s c r i b e d b y H u r na n d C h a n t l e r 1 9 8 0 . P u r i f i e d a - a g g l u t i n i n w as d e g l y c o s y l a t e d b ye n d o g l u c o s i d a s e F a n d r e p u r i f i e d once m o r e b y s e p a r a t i n g t h e p r o d u c t s o nan LKB U l t r o P a c TSK G 2 0 0 0 SW c o l u m n . T h e a c t i v e f r a c t i o n s were p o o l e da n d u s e d f o r i m m u n i z a t i o n . T h e a n t i b o d i e s were p r e a d s o r b e d o n t o a c e l l sb e f o r e u s e . A n t i - a - a n t i b x x y w as r a i s e d a s d e s c r i b e d b y W a t z e l e e t a d 1 9 8 8 .A n t i b o d y a g a i n s t d e g l y c o s y l a t e d a - a g g l u t i n i n w as o b t a i n e d b y d e g l y c o s y l a t i n gp u r i f i e d a - a g g l u t i n i n b y HF c l e a v a g e a s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r . A f t e rs e p a r a t i o n b y 1 5 SDS -PAGE t h e p r o t e i n w as e l u t e d , d i a l y s e d a n di n j e c t e d . T h e a n t i b o d y w as p r e a d s o r b e d t o a - c e l l s b e f o r e u s e .S t a i n i n g o f y e a s t c e l l s w i t h f l u o r e s c i n g a n t i b o d yA n t i - a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y w as l a b e l l e d w i t h F I T C f o l l o w i n g t h e m e t h o do f H u r n a n d C h a n t l e r 1 9 8 0 . S t a i n i n g o f z y g o t e s w as c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e db y W a t z e l e et a l . 1 9 8 8 ) w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . C e l l s 3 x 1 0 7 o f t h e z y g o t e m i x t u r e ( 3 0 - 4 0 z y g o t e s were c e n t r i f u g e d a n d w a s h e d t h r e et i m e s w i t h P B S . T h e n t h e c e l l s were i n c u b a t e d : i ) 2 0 u l P B S 1 I L a n t i -a - a g g l u t i n i n s e r u m ; 3 x w a s h w i t h P B S . i i ) 1 0 p l P B S + 1 A l r h o d a m i n e T R I T C ) l a b e l l e d a n t i - r a b b i t I g G S i g m a ; 3 x w a s h w i t h P B S . i i i ) 1 0 m l4 087

8/13/2019 emboj00111-0098

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C . C a p p e l l a r o e t a l .PBS + 2 0 y 1 p r e s e r u m ; 2 x w a s h w i t h P B S ; i v 3 0 y I F I T C l a b e l l e d a n t i -a - a g g l u t i n i n a n t i b o d y s e e a b o v e ) ; 3 x w a s h w i t h P B S . A l l i n c u b a t i o n s w e r ec a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d i n d a r k n e s s i n a n E p p e n d o r f s h a k e rf o r 4 5 m i n . A f t e r t h e l a s t w a s h i n g s t e p t h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 2 0 1 lH2 0 c o n t a i n i n g 1 m g / m l p - p h e n y l e n e d i a m i n e a n d k e p t i n d a r k n e s s a n d o ni c e . P h o t o g r a p h s A g f a RS 1 0 0 0 f i l m ) w e r e t a k e n u s i n g a f l u o r e s c e n c e p h a s em i c r o s c o p e Z e i s s S t a n d a r d 1 6 w i th o b j e c t i v e N e o f l u a r 1 0 0 / 1 . 3 ) . T h e f i l mw a s e x p o s e d t w i c e , f i r s t f o r F I T C w i t h e x c i t a t i o n l i g h t o f 4 5 0 - 4 9 0 nma n d l i g h t e m i s s i o n >520 n m a n d s e c o n d f o r TRITC w i t h e x c i t a t i o n l i g h to f 5 6 0 - 5 8 0 nm a n d l i g h t e m i s s i o n >590 n m .G l u t a r a l d e h y d e c r o s s l i n k i n g a n d W e s t e r n a n a l y s i sB o t h a g g l u t i n i n s p u r i f i e d o r c r u d e e x t r a c t s ) w e r e d i a l y s e d a g a i n s t 5 0 mMs o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r pH 6 . 3 . c a - a g g l u t i n i n ( 2 5 - 3 0 U ) a n d 5-25 Ua - a g g l u t i n i n f o r d e f i n i t i o n o f u n i t s s e e W a t z e l e e t a l . , 1 9 8 8 ) w e r e m i x e di n a v o l u m e o f 3 0 t a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e . T h e ng l u t a r a l d e h y d e w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 . A f t e r 3 0 m i nc r o s s l i n k i n g w a s s t o p p e d b y a d d i n g a n e x c e s s o f l y s i n e o r 6 x c o n c e n t r a t e dL a e m m l i s a m p l e b u f f e r . A f t e r S D S - g e l e l e c t r o p h o r e s i s p r o t e i n s w e r e t r a n s -f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e ( D u n n , 1 9 8 6 ) a n d i n c u b a t e d w i t h a n t i - a - a n t i b o d i e s .B o u n d a n t i - a - a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o u p l e d t oa n t i - r a b b i t a n t i b o d i e s T u r n e r , 1 9 8 6 ) .D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e t r e a t m e n tD i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ( D E P C ) S i g m a , M u n c h e n ) w a s d i l u t e d i n e t h a n o lj u s t b e f o r e u s e a n d a d d e d t o t h e s a m p l e 0 . 3 y g a - o r / a n d 1 . 5 j ga - a g g l u t i n i n i n 3 0 , t l s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , 5 0 mM, pH 6 . 3 ) t o g i v ea f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 5 m M. A f t e r 1 0 m i n DEPC w a s n e u t r a l i z e d w i t ha n e x c e s s o f h i s t i d i n e o r r e m o v e d b y S p e e d V a c e v a p o r a t i o n . T h e t r e a t e dp r o t e i n s w e r e r e s u s p e n d e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g t h e p a r t n e r a g g l u t i n i no r o n l y b u f f e r a n d c r o s s l i n k e d a s i n d i c a t e d a b o v e .A c k n o w l e d g e m e n t sW e a r e g r a t e f u l t o D r s R . D e u t z m a n n , R e g e n s b u r g , a n d J . H o p p e , W u r z b u r g ,f o r s e q u e n c i n g p e p t i d e s a n d t o D r s W . D u n t z e a n d R . B e t z , B o c h u m , f o rp u r i f i e d a f a c t o r . T h i s w o r k h a s b e e n s u p p o r t e d b y t h e D e u t s c h eF o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t ( S F B 4 3 ) a n d b y t h e F o n d s d er C h e m i s c h e nI n d u s t r i e .

L i p k e , P . N . , W o j c i e c h o w i c z , D . a n d K u r j a n , J . 1 9 8 9 ) M o l . C e l l . B i o l . , 9 ,3 1 5 5 - 3 1 6 5 .M a n i a t i s , T . , F r i t s c h , E . F . a n d S a m b r o o k , J . 1 9 8 2 ) M o l e c u l a r C l o n i n g . AL a b o r a t o r y M a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n gH a r b o r , N Y .M a r c h , J . L . , E r f l e , M . a n d W y k e s , E . J . 1 9 8 4 ) G e n e , 3 2 , 4 8 1 - 4 8 5 .M e s s i n g , J . , G r o n e n b o r n , B . , M u l l e r - H i l l , B . a n d H o f s c h n e i d e r , H . P . 1 9 7 7 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 4 , 3 6 4 2 - 3 6 4 6 .M i l e s , E . W . 1 9 7 7 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 4 7 , 4 3 1 - 4 4 2 .M o r r i s s e y , J . H . 1 9 8 1 ) A n a l . B i o c h e m . , 1 1 7 , 3 0 7 - 3 1 0 .M o r t , A . J . a n d L a m p o r t , D . T . A . 1 9 7 7 ) A n a l . B i o c h e m . , 8 2 , 2 8 9 - 3 0 9 .O r l e a n , P . , A m m e r , H . , W a t z e l e , M . a n d T a n n e r , W . 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A , 8 3 , 6 2 6 3 - 6 2 6 6 .P i e r c e , M . a n d B a l l o u , C . E . 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 8 , 3 5 7 6 - 3 5 8 2 .R o t h s t e i n , R . J . 1 9 8 3 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 1 0 1 , 2 0 2 2 1 1 .R o y , A . , L u , C . F . , M a r y k w a s , D . L . , L i p k e , P . a n d K u r j a n , J . 1 9 9 1 ) M o l .C e l l . B i o l . , 1 1 , 4 1 9 6 - 4 2 0 6 .S a n g e r , F . , N i c k l e n , S . a n d C o u l s o n , A . R . 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A ,7 4 , 5 4 6 3 - 5 4 6 7 .S i j m o n s , P . C . , N e d e r b r a f t , A . J . A . , K l i s , F . M . a n d V a n D en E n d e , H . 1 9 8 7 )A r c h . M i c r o b i o l . , 1 4 8 , 2 0 0 - 2 1 2 .S t r a h l - B o l s i n g e r , S . a n d T a n n e r , W . 1 9 9 1 ) E u r . J . B i o c h e m . , 1 , 1 8 5 - 1 9 0 .S t r a z d i s , J . R . a n d M a c K a y , V . L . 1 9 8 3 ) N a t u r e , 3 0 5 , 5 4 3 - 5 4 5 .T e r r a n c e , K . a n d L i p k e , P . N . 1 9 8 1 ) J . B a c t e r i o l . , 1 4 8 , 8 8 9 - 8 9 6 .T e r r a n c e , K . , H e l l e r , P . , W u , Y . - S . a n d L i p k e , P . N . 1 9 8 7 ) J . B a c t e r i o l . ,1 6 9 , 4 7 5 - 4 8 2 .T u r n e r , B . M . 1 9 8 6 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 1 2 1 , 8 4 8 - 8 5 5 .W a t z e l e , M . , K l i s , F . a n d T a n n e r , W . 1 9 8 8 ) EMBO J . , 7 , 1 4 8 3 - 1 4 8 8 .Y a n i s c h - P e r r o n , C . , V i e i r a , J . a n d M e s s i n g , J . 1 9 8 5 ) G e n e , 3 3 , 1 0 3 - 1 1 9 .Y e n , P . H . a n d B a l l o u , C . E . 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y , 1 3 , 2 4 2 8 - 2 4 3 7 .R e c e i v e d o n J u l y 8 , 1 9 9 1 ; r e v i s e d o n S e p t e m b e r 1 8 , 1 9 9 1N o t e a d d e d i n p r o o fT h e s e q u e n c e d a t a r e p o r t e d h e r e a r e a v a i l a b l e f r o m t h e E M B L / G e n B a n k /DDBJ d a t a b a s e s u n d e r a c c e s s i o n n u m b e r X 6 2 8 7 7 .

R e f e r e n c e sA c h s t e t t e r , T . 1 9 8 9 ) M o l . C e l l . B i o l . , 9 , 4 5 0 7 - 4 5 1 4 .B e t z , R . , D u n t z e , W . a n d M a n n e y , T . R . 1 9 7 8 ) FEMS M i c r o b i o l L e t t . , 4 ,1 0 7 - 1 1 0 .B o t s t e i n , D . , F a l c o , S . C . , S t e w a r d , S . E . , B r e n n a n , M . , S c h e r e r , S . ,S t i n c h c o m b , D . T . , S t r u h l , K . a n d D a v i s , R . W . ( 1 9 7 9 ) G e n e , 8 , 1 7 - 2 4 .B u r k e , D . , M e n d o n , a - P r e v i a t o , L . a n d B a l l o u , C . E . 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U S A , 7 7 , 3 1 8 - 3 2 2 .C h a n , R . K . a n d O t t e , C . A . 1 9 8 2 ) M o l . C e l l . B i o l . , 2 , 1 1 - 2 0 .C r a n d a l l , M . a n d B r o c k , T . D . ( 1 9 6 8 ) B a c t e r i o l . R e v . , 3 2 , 1 3 9 - 1 6 3 .C r y e r , D . R . , E c c l e s h a l l , R . a n d M a r m u r , J . 1 9 7 5 ) I n P r e s c o t t , D . M . e d . ) ,M e t h o d s i n C e l l B i o l o g y . A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k , V o l . 1 2 , pp .3 9 - 4 4 .D o i , S . , S u z u k i , Y . a n d Y o s h i m u r a , M . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m . B i o p h v s . R e s .C o m m u n . , 9 1 , 8 4 9 - 8 5 3 .D o m d e y , H . , A p o s t o l , B . , L i n , R . - J . , N e w m a n , A . , B r o d y , E . a n d A b e l s o n , J . 1 9 8 4 ) C e l l , 3 9 , 6 1 1 - 6 2 1 .D u n n , S . D . 1 9 8 6 ) A n a l . B i o c h e m . , 1 5 7 , 1 4 4 - 1 5 3 .F e h r e n b a c h e r , G . , P e r r y , K . a n d T h o r n e r , J . ( 1 9 7 8 ) J . B a c t e r i o l . , 1 3 4 ,8 9 3 - 9 0 1 .H a g i y a , M . , Y o s h i d a , K . a n d Y a n a g i s h i m a , N . ( 1 9 7 7 ) E x p . C e l l R e s . , 1 0 4 ,2 6 3 - 2 7 2 .H a u s e r , K . a n d T a n n e r , W . ( 1 9 8 9 ) FEBS L e t t . , 2 5 5 , 290-294.H e i j n e , G . vo n 1 9 8 5 ) J . M o l . B i o l . , 1 8 4 , 9 9 - 1 0 5 .H e n i k o f f , S . 1 9 8 4 ) G e n e , 2 8 3 5 1 - 3 5 9 .H i l l , J . E . , M e y e r s , A . M . , K o e m e r , T . J . a n d T z a g o l o f f , A . ( 1 9 8 6 ) Y e a s t , 2 ,1 6 3 - 1 6 7 .H o , S . N . , H u n t , H . D . , H o r t o n , R . M . , P u l l e n , J . K . a n d P e a s e , L . R . ( 1 9 8 9 )G e n e , 7 7 , 5 1 - 5 9 .H u r n , B . A . L . a n d C h a n t l e r , S . M . ( 1 9 8 0 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 7 0 , 104-142.J e n t o f t , N . 1 9 9 0 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . , 1 5 , 2 9 1 - 2 9 4 .K a m b o j , R . K . , G a r i e p y , J . a n d S i u , C . - H . ( 1 9 8 9 ) C e l l , 5 9 , 615-625.L a e m m l i , U . K . 1 9 7 0 ) N a t u r e, 2 27 , 6 8 0 - 6 8 5 .L e u , T . M . J . ( 1 9 9 0 ) P h . D T h e s i s , U n i v e r s i t y o f Z u r i c h .

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