SALESE Lucía 1,2; LIGGIERI Constanza S. 1,3; BRUNO Mariela A. 1,2 * - 1. CIPROVE, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP.

Centro asociado a la CICpBA, Argentina. 2. CONICET, Argentina. 3. CICpBA, Argentina. E-mail: brunomariela@biol.unlp.edu.ar

© Latitud – Fundación LATU – Av. Italia 6201 – CP 11500 – Tel. (+598) 2601 3724 – Montevideo, Uruguay – www.latitud.org.uy

Empleo de peptidasas

de Bromelia hieronymi Mez

(Bromeliaceae) para la obtención

de hidrolizados de proteínas alimentarias

Adler-Nissen 1979. Determination of the degree of

hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem.,

27, 1256e1262.

Bradford 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248e254.

Bruno et al. 2010. Milk clotting and proteolytic activity of an enzyme preparation from

Bromelia hieronymi fruits”. Food Sci.Technol., 43, 695e701.

Carmona et al. 2006. A continuous fluorescence resonance energy transfer angiotensin I-

converting enzyme assay. Nature Protocols, 1, 1971e1976.

Peterson 1979. Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry,

Rosebrough, Farr and Randall. Anal. Biochem. 100:201-220.

Re et al. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation

decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26:1231-1237.

Serpen et al. 2012. Solvent effects on total antioxidant capacity of foods measured by

direct QUENCHER procedure. J. Food Compos. Anal., 26: 52-57.

Wiles et al. 1997. Routine analysis of proteins by Kjeldahl and Dumas methods: review

and interlaboratory study using dairy products. J. of AOAC Int., 81, 620e632.

Se obtuvo un extracto proteolítico (EC) a

partir de frutos de B. hieronymi, el cual fue parcialmente purificado por precipitación

etanólica, obteniéndose una preparación denominada PER-Bh que recuperó un 91%

de actividad.

El PER-Bh provocó una degradación visible sobre caseína bovina, proteínas de

lactosuero bovino y aislado proteico de soja, monitoreada por tricine-SDS-PAGE.

El mayor grado de hidrólisis obtenido fue de 49 % para el hidrolizado de caseína a

55 ºC.

Todos los hidrolizados presentaron actividad antioxidante neta respecto de sus

controles, siendo los de caseína de 30 min los más elevados con valores de 9,5±0,86

y 10,5±0,06 mg/ml Trólox para 45 y 55 ºC, respectivamente.

La actividad inhibitoria de la ECA fue máxima para el hidrolizado de lactosuero de

45 ºC, inhibiendo un 76,98%.

Se concluye los hidrolizados de caseína y proteínas de lactosuero serían de utilidad

como ingredientes activos para la formulación de alimentos funcionales.

y = -0,872x + 0,7174R² = 0,997

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

A 7

34

nm

Concentración de Trólox (mg/ml)

Curva de calibración de Trólox

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

CASEÍNA 45 ºC

-2

0

2

4

6

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

róls

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

LACTOSUERO 45 ºC

0

10

20

30

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

SOJA 45 ºC

0

20

40

60

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

CASEÍNA 55 ºC

-5

0

5

10

15

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

LACTOSUERO 55 ºC

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de hidrólisis (min)

SOJA 55 ºC

Figura 1. Grado de hidrólisis (4). Hidrolizados de 0-

180 min, de caseína, proteínas de lactosuero y aislado

de soja, a 45 y a 55 ºC

Tabla 2. Actividad inhibitoria de la ECA (7): hidrolizado de lactosuero

de 180’ (LAC 180’). BE: Blanco de enzima. BS: Blanco de sustrato.

Muestra Pendiente % Inhibición

ECA 2,04 0

BE 0,90 55,79

BS 1,84 9,89

LAC 180’ 0,47 76,98

0

2

4

6

8

10

12

BE 0 5 10 30 60 90 180

EQU

IVA

LEN

TES

DE

TRÓ

LOX

(M

G/M

L)

BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)

CASEÍNA

45 ºC 55 ºC

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

BE 0 5 10 30 60 90 180

EQU

IVA

LEN

TES

DE

TRÓ

LOX

(M

G/M

L)

BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)

LACTOSUERO

45 ºC 55 ºC

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

BE 0 5 10 30 60 90 180

EQU

IVA

LEN

TES

DE

TRÓ

LOX

(M

G/M

L)

BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)

SOJA

45 ºC 55 ºC

Figura 3.a. Actividad antioxidante (6). Las barras horizontales corresponden a ±DS.

Figura 3.b. Curva de calibración.

Antioxidante de referencia: Trólox.

Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae) es una especie nativa de Argentina que posee elevadas cantidades de proteasas

cisteínicas. Estas enzimas pueden ser empleadas para la obtención péptidos bioactivos a partir de proteínas alimentarias. El

objetivo del presente trabajo fue obtener un extracto enzimático a partir de frutos inmaduros de dicha especie, emplearlo en la producción de hidrolizados de proteínas

alimentarias y evaluar la presencia de actividades biológicas en los mismos.

Frutos inmaduros de

Bromelia hieronymi Mez

Bromeliaceae

Obtención del

extracto crudo (EC):

0,4 mg fruto/mL buffer

Precipitado etanólico

redisuelto (PER)

Preparación de los sustratos

proteicos

Aislado de soja (5,545 mg/mL).

Caseína bovina (9,104 mg/mL ,

Sigma)

Proteínas de lactosuero bovino

(7,96 mg/mL)

Hidrólisis de proteínas alimentarias

Condiciones de hidrólisis:

Proporción enzima:sustrato: 1:9

Temperaturas: 45 y 55 ºC

Agitación: 200 rpm

Tiempo de reacción: 0-180 min

Detención de las hidrólisis: shock

térmico (100 ºC, 10 min)

Controles: BS (tiempo cero de

hidrólisis); BE (control sólo con enzima).

Caracterización de los hidrolizados

4. Grado de hidrólisis (TNBS, Adler Nissen, 1979; Figura 1)

5. Tricine-SDS PAGE (Bruno et al., 2010; Figura 2)

6. Actividad antioxidante: método “quencher” empleando

ABTS (Serpen et al., 2012; Figura 3, a y b)

7. Actividad inhibitoria de la ECA (Carmona et al., 2006;

Tabla 2).

Caracterización de los extractos: EC y PER

(Tabla 1)

1. Actividad caseinolítica (Bruno et al., 2010)

2. Proteínas (Bradford, 1976)

3. Actividad antioxidante: método del ABTS

(Re et al., 1999)

Determinación de la concentración

proteica en hidrolizados

Método de Lowry (Peterson, 1979)

Método de Kjeldahl (Wiles et al.,

1997)

Muestra

Actividad

enzimática (Ucas/mL)

Proteínas (mg/mL)

Actvidad

antioxidante (mg/mL Trólox)

EC 16,46 ± 0,26 2,03 ± 0,07 3,32 ± 0,02

PER 13,63 ± 0,28 1,84 ± 0,53 0,56 ± 0,02

Tabla 1. Caracterización de los extractos: EC y PER (1, 2, 3)

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625 0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR

CASEÍNA 45 ºC

0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR

CASEÍNA 55 ºC

0’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP

SOJA 45 ºC

5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR

SOJA 55 ºC

0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’MPLR

LACTOSUERO 45 ºC

0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR

LACTOSUERO 55 ºC

Figura 2. Tricine-SDS PAGE (5). Hidrolizados de caseína, soja y lactosuero de 45 y 55 ºC.

Tiempos de hidrólisis: 0-180’. Patrones de peso molecular: multipeptídico (MP) y “Low Range” (LR).

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

14,4

20,1

30,0

45,0

66,0

97,0

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625

3,496

6,512

14,437

16,950

26,625