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Empower 2ソフトウェアデータ取り込み /解析理論ガイド

715091099KI / Revision A

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目次

1 データ取り込み ........................................................................................... 1-1

概要 ...................................................................................................................................... 1-2 データ取り込みとは ? .................................................................................................... 1-2 解析とは ? ...................................................................................................................... 1-2 波形解析メソッド ........................................................................................................... 1-3 ApexTrack と従来法の波形解析の共通性 ....................................................................... 1-3

アナログからデジタルへの変換 .......................................................................................... 1-4 データの変換 .................................................................................................................. 1-4 データの転送および保存 ................................................................................................ 1-5

検出サンプリングレート ..................................................................................................... 1-6 最適なサンプリングレートの決定.................................................................................. 1-6 データポイントの表示.................................................................................................... 1-6 ［ピーク内のポイント数］フィールド ........................................................................... 1-7

ディスクスペースに対するデータ取り込みレートの影響 ................................................... 1-7

参考文献 .............................................................................................................................. 1-7

2 ApexTrack波形解析 ................................................................................... 2-1

特徴と機能 ........................................................................................................................... 2-1 ApexTrackの特徴 ........................................................................................................... 2-2 ApexTrack による波形解析の方法.................................................................................. 2-2解析メソッドパラメータの概要 ................................................................................ 2-3

時間イベントの概要 ....................................................................................................... 2-5 ApexTrackの波形解析ピークラベル .............................................................................. 2-6

頂点の検出 ........................................................................................................................... 2-7 頂点の検出...................................................................................................................... 2-8 頂点の検出パラメータ .................................................................................................... 2-8自動ピーク幅 ............................................................................................................. 2-8自動感度 .................................................................................................................... 2-9

2次微分プロットの取得 ................................................................................................. 2-9 ピークの検出 ................................................................................................................ 2-10分離ピークとショルダーピーク .............................................................................. 2-10ラウンドピーク ....................................................................................................... 2-11

ピークテーブル内の 2次微分頂点と変曲点 ................................................................. 2-13

目次 iii

ベースラインの位置 ..................................................................................................... 2-13ApexTrackが傾き差の感度を決定する方法 ............................................................ 2-14ApexTrackが分離ピークのベースラインを見つける手順 ....................................... 2-15ApexTrackがクラスタの仮想ベースラインを見つける手順 ................................... 2-17ApexTrackが最終クラスタベースラインを決定する方法 ....................................... 2-19立ち上がり % と立ち下がり %のベースライン位置での影響 ................................ 2-19クラスタピークに対して立ち上がり % と立ち下がり % を変更した場合

の影響 ..................................................................................................... 2-21 ピーク境界の決定 ......................................................................................................... 2-22動作のシークエンス ................................................................................................ 2-22

波形解析結果の計算 ..................................................................................................... 2-23ピーク面積 ............................................................................................................... 2-23ピーク高さ ............................................................................................................... 2-23保持時間 .................................................................................................................. 2-23どの保持時間メソッドを使用するかを決定する規則 .............................................. 2-24手動で調整したピークの保持時間と高さの値 ......................................................... 2-25

ピーク幅パラメータ ..................................................................................................... 2-25自動ピーク幅 ........................................................................................................... 2-27自動ピーク幅の使用方法 ......................................................................................... 2-27ピーク幅パラメータの変動の影響 ........................................................................... 2-28

検出感度パラメータ ..................................................................................................... 2-28自動感度 .................................................................................................................. 2-29自動感度の使用 ....................................................................................................... 2-31

時間イベントの使用 ..................................................................................................... 2-31ピーク検出イベント ................................................................................................ 2-31ピーク解析イベント ................................................................................................ 2-32時間イベントが起動するタイミング ....................................................................... 2-32

参考文献 ....................................................................................................................... 2-33

3 従来法の波形解析 ........................................................................................ 3-1

特徴と機能 ........................................................................................................................... 3-1 ピークの検出 .................................................................................................................. 3-2データバンチングの実行 ........................................................................................... 3-2ピーク開始の決定 ...................................................................................................... 3-3仮想ピーク頂点の決定 ............................................................................................... 3-5ピーク終了の決定 ...................................................................................................... 3-6ピーク幅および検出感度の決定 ................................................................................ 3-7ピーク幅パラメータ .................................................................................................. 3-7検出感度値 ................................................................................................................. 3-8

iv 目次

ピーク幅と検出感度のフィールド ............................................................................. 3-9 ピーク波形解析............................................................................................................. 3-10未分離ピークの判定 ................................................................................................ 3-10ベースラインの作成 ................................................................................................ 3-12ベースライン調整 .................................................................................................... 3-14ピーク保持時間、高さ、および面積の計算 ............................................................ 3-14保持時間と高さ ....................................................................................................... 3-15面積 ......................................................................................................................... 3-16ピーク除外基準 ....................................................................................................... 3-17最小面積 .................................................................................................................. 3-17最小高さ .................................................................................................................. 3-175ポイントピーク除外 ............................................................................................. 3-17

時間イベントの使用 ..................................................................................................... 3-17ピーク検出イベント ................................................................................................ 3-18ピーク波形解析イベント ......................................................................................... 3-18

波形解析ピークラベル.................................................................................................. 3-19

参考文献 ............................................................................................................................ 3-19

4 サンプル成分のピークの同定および定量 .................................................... 4-1

特徴と機能 ........................................................................................................................... 4-1

ピークの同定 ....................................................................................................................... 4-1 同定の順位...................................................................................................................... 4-2 一致の程度の計算 ........................................................................................................... 4-2 最適な同定ピークの選択 ................................................................................................ 4-2単一成分に対して単一ピーク .................................................................................... 4-2単一成分に対して複数ピーク .................................................................................... 4-3複数成分に対して単一ピーク .................................................................................... 4-3

保持時間および保持時間幅のシフト .............................................................................. 4-3RT レファレンス ....................................................................................................... 4-3保持時間の更新 ......................................................................................................... 4-4

定量 ...................................................................................................................................... 4-5 検量線による定量 ........................................................................................................... 4-5 検量線を使用しない定量 ................................................................................................ 4-6 サンプル重量と希釈率を使用する定量........................................................................... 4-6サンプル重量 ............................................................................................................. 4-7希釈率 ........................................................................................................................ 4-7

注入量を使用する定量.................................................................................................... 4-8 ピーク面積および高さ以外のレスポンスを使用する定量.............................................. 4-9

目次 v

絶対検量線法および内部標準法による定量 ................................................................... 4-9 絶対検量線法 ................................................................................................................ 4-10 単独の標準試料と未知試料による内部標準法.............................................................. 4-13 単独の標準試料や未知試料を用いない内部標準法による定量

(RF内部標準法 ) .................................................................................................... 4-18

検量線の種類 ..................................................................................................................... 4-21 一点検量線.................................................................................................................... 4-21原点通過直線 ........................................................................................................... 4-22レスポンスファクタ ................................................................................................ 4-23

多点検量線の行列演算.................................................................................................. 4-24行列演算 .................................................................................................................. 4-25行列演算の例 ........................................................................................................... 4-25

多点検量線.................................................................................................................... 4-27折れ線への適合 ....................................................................................................... 4-27成分の濃度および / または溶液濃度の決定 ............................................................. 4-293次スプライン ........................................................................................................ 4-29直線 ......................................................................................................................... 4-312次曲線への適合 2 ジキョクセンヘノテキゴウ ..................................................... 4-333次曲線 ................................................................................................................... 4-354次曲線 ................................................................................................................... 4-365次曲線 ................................................................................................................... 4-37

原点通過多点検量線 ..................................................................................................... 4-39 重み付け ....................................................................................................................... 4-40 統計............................................................................................................................... 4-42決定係数 .................................................................................................................. 4-42相関係数 .................................................................................................................. 4-42x に対する y推定値の標準誤差 ............................................................................... 4-42標準分散 .................................................................................................................. 4-43残差平方和 ............................................................................................................... 4-43検量線の標準誤差 .................................................................................................... 4-44検量線ポイントの計算値と％偏差 ........................................................................... 4-44％相対標準偏差 ....................................................................................................... 4-44

参考文献 ............................................................................................................................ 4-45

索引 ........................................................................................................... 索引 -1

vi 目次

1 データ取り込み

本章では、データの取り込み方法およびアナログからデジタルへのデータ変換方法について説明します。

内容：

トピックページ

概要 1-2

アナログからデジタルへの変換 1-4

検出サンプリングレート 1-6

ディスクスペースに対するデータ取り込みレートの影響 1-7

参考文献 1-7

1-1

概要

データ取り込みとは ?クロマトグラムは、時間の経過に伴って一律にサンプリングされた一連の検出器レスポンスのことをいいます。成分の溶出により、独特なクロマトグラムピークプロファイルが生じます。

波形解析は、部分的または全体的に曲線で囲まれた面積を計算する計算プロセスです。クロマトグラムピークの波形解析の目標は、これらのピークの保持時間、高さ、および面積を求めることです。

ピーク波形解析では 2つの鍵となるアルゴリズムを使用します。1つはピークを検出し、もう 1つはそのベースラインを判定します。ピーク頂点とベースラインを求める事により、保持時間 (RT)、高さ、面積を計算することができます。

解析とは ?解析とは、分離された成分の識別や量を判定するデータ操作のことをいいます。解析には、多くの場合、クロマトグラムのピークを調べ、標準試料から検量線を生成し、成分を定量することが含まれます。

解析メソッドは、Empowerが、2Dチャンネルまたは 2D生成チャンネルからの未解析の生データを検出、波形解析、検量線作成、および定量する方法を定義します。解析メソッドウィザードを使用すると、解析メソッドの作成が容易になり、レビュー画面で解析メソッドを対話形式で作成することもできます。

レビュー画面では、未知試料 (チャンネル )から取り込んだ未解析のデータで解析を開始します。次に、異なる濃度の標準試料を用い、多点検量線を作成します。解析メソッドをメソッドセットに追加することで、ソフトウェアは生データを取り込んでいる間にその生データを処理することができます。

1-2 データ取り込み

波形解析メソッド

Empowerは、ピーク検出とベースラインの決定の 2つのメソッドを提供します。

• ApexTracka 波形解析 – クロマトグラムの 2次微分を使用してピーク頂点を検出します。ピーク検出パラメータは、ベースラインのロケーションパラメータから独立しています。各ピークのベースラインは、立ち上がり %と立ち下がり %パラメータを使用して決定されます。検索アルゴリズムは各ピークの頂点から開始して、下側および外側に向かってベースラインを引きます。拡張しているベースラインが一致し、分離しないときにクラスタとして識別されます。

• 解析メソッドで ApexTrack解析法の使用を選択するには、最初にシステムとプロジェクトのポリシーを有効にする必要があります。

• 従来法の波形解析 – 傾きを一定の感度と比較し、ピークの立ち上がりを識別します (第 3章、従来法の波形解析を参照 )。ピークの立ち下りは、適切な傾きの検出感度に一致するまでクロマトグラムを続行し、形状、谷、頂点などを見つけるアルゴリズムによって決定されます。

ApexTrack と従来法の波形解析の共通性ApexTrackがピークの検出とベースラインの決定に使用するアルゴリズムは、従来法の解析で使用されるアルゴリズムとは異なりますが、従来法と ApexTrackではかなりの機能が共通しています。

• 自動ピーク幅と自動感度がサポートされています。

• ベースラインは実際のサンプリングされたデータポイントで開始および終了します。

• 積分禁止、接線スキム、ピーク幅の設定、最小高さの設定、最大高さの設定、最小面積の設定、最大ピーク幅の設定などの時間イベントがサポートされています。

• ピークは手動で追加または削除できます。

• ピークの開始および停止マーカーは手動で変更できます。

概要 1-3

アナログからデジタルへの変換

Empowerがデータを取り込み、解析する前に、検出器のアナログ出力信号をデジタル信号に変換しなければなりません。本節では、データの変換およびデータの転送と保存の一連のプロセスについて説明します。

データの変換

アナログからデジタルへ（A/D）のデータ変換は、次の 2とおりの方法で行われます。

• IEEE-488バスで制御される検出器 (例えば、Waters¨

996/2996または 2487検出器)の場合は、アナログからデジタルへの変換は、検出器の内部で行われます。

• IEEE-488タイプでない検出器の場合、検出器はアナログ出力信号をクロマトグラフのインターフェース (Waters busSAT/INaモジュール )に送信します。この信号の強さ (・ )は、検出されたサンプルの濃度に対応しています。

入力可能なアナログ信号の電圧範囲は、–0.25～ +2.25 Vです。信号の 1 mVが、1,000ハイトカウントに相当します (ここで、1ハイトカウントは 1 µVと同等です )。例えば、1 AUが1 Vに等しくなるように設定されている検出器の場合、1 AUのピークはピーク高さ1,000,000ハイトカウントに等しくなります (ベースラインは 0 V)。

busSAT/INモジュールは、毎秒指定された回数だけ (これをサンプリングレートと呼びます)アナログ信号をデジタル信号に変換します。

データ取り込みプロセス：

busSAT/INモジュール

IEEE-488検出器

busLAC/Eカード

Empowerデータベース

Empower システム

非 IEEE-488タイプ検出器

デジタル信号

(取り込みデータ )

デジタル信号 (ファイル

)アナログ信号


データの転送および保存

ソフトウェアによるデータの転送と保管は、次のようにして行われます。

1. 変換されたデジタル信号は、busLAC/E™カードや Equinoxシリアルカード (両カードとも、Empowerワークステーション、LAC/E32

取り込みサーバー、または取り込みクライアントにインストールすることができます )、あるいはコンピュータの COMポートに送信されます。

注記 : 2つの異なる busLAC/Eカードが使用可能です。つまり、(コンピュータのISAカードスロットで使用される ) ISA busLAC/Eカードおよび (コンピュータのPCIカードスロットで使用される ) PCI busLAC/Eカードです。

2. 取り込まれたデータは、busLAC/Eカード、Equinoxシリアルカード、あるいはCOMポートからコンピュータのハードディスクドライブに送信されます。

3. デジタル電圧値は、取り込まれ、解析されていないデータとしてコンピュータに保存されます。保存されたデジタル値は、クロマトグラムの生データポイントです。生データは、取り込み時にサンプルの分析画面で表示することができます。プロジェクト画面のサンプルセット、インジェクション、およびチャンネルビューは、現在のプロジェクトに存在する生データを表わしています。

取り込まれたデータポイント

DetectorOutput

Signal (mV)

Time

Raw Data Points生データポイント

検出器アウトプット信号 (mV)

時間

アナログからデジタルへの変換 1-5

検出サンプリングレート

Empowerは、装置メソッド編集の関連する装置タブでユーザーが指定したサンプリングレートに合わせてデータの取り込み頻度を指定します。取り込まれる生データポイントが適切なクロマトグラムを表わすためにはサンプリングレートを十分に大きくする必要があります。しかし、必要以上のデータを取り込むほど大きくする必要はありません。

液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、およびイオンクロマトグラフィでは、検出対象となる最も狭いピークのピーク開始から終了までの間に最低 15のデータポイントを生成するサンプリングレートが最適です。このデータポイントの最適数 15という値は、典型的な信号対ノイズ比と指数的に変換したガウシャンピークの周波数成分によって決定された値です。

データ取り込み中に必要なハードディスクスペースの量は、サンプリングレートと分析時間によって異なります (データ取り込み理論の詳細は、1-7ページの参考文献を参照してください )。

最適なサンプリングレートの決定

最適なサンプリングレートは、次の式から算出することができます。

この場合、

SR =サンプリングレート (ポイント /秒 )

15 =ピーク開始からピーク終了までのデータポイントの最適値

W =検出したい最も狭いピーク幅 (単位、秒 )

例えば、測定されたピーク幅が 3秒の場合、サンプリングレートを 5に設定すれば、15の生データポイントのデータ取り込みが保証されます (15/3 = 5)。

注記 :対象となる最も狭いピークのデータポイントの数が 15より少ない場合は、もっと高いサンプリングレートを指定してください。サンプリングレートを高くすると、データポイントが多く生成されるため、データ保存用に大量のディスクスペースが必要となります (1-7ページのディスクスペースに対するデータ取り込みレートの影響を参照 )。(上述の方法で )計算したサンプリングレートが使用できない場合には、使用可能なできるだけ高いサンプリングレートを設定してください。

データポイントの表示

レビュー画面の［ピーク］タブには、クロマトグラムの各成分の開始時間、終了時間、およびピーク内のポイント数が表示されます。これらは、どのレポートグループにも表示できるレポート可能なフィールドです。

SR 15W------=


［ピーク内のポイント数］フィールド

Empowerは、クロマトグラムの各成分についてピーク内のポイント数を計算します。Empower 2では、Empower (ビルド 1154)またはミレニアム 32

ソフトウェアとは異なる方法でこの値を計算します。Empower 2が使用する計算法は、「終了時間に最も近いデータポイントのインデックス -開始時間に最も近いデータポイントのインデックス」です。この改良により、サンプリングレートが統一されていないピークを正確に計算できます。

ディスクスペースに対するデータ取り込みレートの影響

データ取り込み中に必要なハードディスクスペースの量は、サンプリングレートと分析時間によって異なります。次の表に、種々のサンプリングレートと分析時間で取り込まれた単一チャンネルのデータを格納するのに必要なハードディスクスペースの量を示します。

サンプルの分析でデータの取り込みを開始すると、Empowerソフトウェアは、現在使用可能なディスクスペースの容量を判定します。十分なディスクスペースが存在しない場合には、ソフトウェアは警告を表示し、取り込みは開始されません。分析と解析または分析とレポートモード中にスペースが限られてきた場合には、すべての残りのディスクスペースを使いきるまで解析は停止され、取り込みが継続されます。

参考文献

データ取り込み理論の詳細については、以下の文献を参考にしてください。

『Chromatographic Integration Methods』、Dyson, Norman著、The Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Cambridge、1990年

ハードディスクスペースに対するサンプリングレートと分析時間の影響

サンプリングレート (ポイント /秒 )

一分間の分析で取り込まれるデータポイント数

一分間の分析で使用される容量 (キロバイト )(1024 bytes)

分析時間(分 )

概算の使用容量(キロバイト )

1 60 0.23 10 2.3

5 300 1.17 10 12.0

20 1200 4.69 10 47.0

ディスクスペースに対するデータ取り込みレートの影響 1-7

2 ApexTrack波形解析

本章では、ApexTrackピーク検出および波形解析の理論の概要を説明します。

特徴と機能

Empowerによる ApexTrackピーク検出と波形解析には、次のような機能があります。

• 解析メソッドで特に設定されていない限り、クロマトグラムの適切なピーク幅と検出感度の値を自動的に決定します。

• クロマトグラム中のピーク頂点を検出し、ピークとショルダーの位置を決定します。

• ピークを波形解析し、保持時間、面積、および高さを決定します。

解析メソッドは、Empowerソフトウェアが生データのファイル内でピークを検出して波形解析するために使用するパラメータを定義します（検出 /波形解析イベントも含まれます）。

従来法の機能と同じ ApexTrack解析の機能の詳細については、1-3ページの「ApexTrackと従来法の波形解析の共通性」を参照してください。

内容：


特徴と機能 2-1

頂点の検出 2-7

特徴と機能 2-1

ApexTrackの特徴Empowerは従来法の波形解析と ApexTrack波形解析の両方をサポートしています。「従来法の波形解析」とは、ミレニアム

32ソフトウェアによるデータの解析方法（ピークの検出と

ベースラインの決定）のことをいいます。ApexTrackのデータ解析方法は、以下の点で従来法の波形解析とは異なります。

• ApexTrackは、ピークの立ち上がり点ではなく頂点でピークを検出します。ApexTrackは曲率 (2次微分 )によって頂点を検出します。対照的に、従来法の波形解析では傾きの立ち上がりでピークを検出します（1次微分）。

• ApexTrackでは曲率基準を使用するので、ショルダーピークを確実に検出できます。

• ApexTrackアルゴリズムは、試行ベースラインを各ピークの頂点から開始して下側および外側に向かって拡張し、ベースラインを見つけます。

• ApexTrackは、内部の傾きを比較することで、ピークの終点とクラスタベースラインを決定します。その結果、ベースラインの場所は検出器のドリフトとは無関係になり、ApexTrackにより、傾いたベースライン上の小さなピークを確実に波形解析できるようになります。

ApexTrackの主な特徴は、以下のとおりです。

• ショルダーを検出 –ショルダーとラウンドピークの対を検出します。

• ガウシャンスキム–ガウスプロファイルを含むクラスタ内の複数のピークをスキム処理します。

• 接線スキム–親ピークからライダピークを分離するために接線を引くことによってクラスタ内の複数のピークをスキム処理します。

• 負のピークの検出と波形解析 –負のピークおよび負 (および正 )のピークを含むクラスタを波形解析します。ショルダー検出および負のピークのガウシャンスキム処理をサポートしています。

ApexTrackによる波形解析の方法ApexTrack波形解析は、4つの主要なプロセスで構成されています。

• ピークの検出 –2次微分頂点でピークを検出します。ベースラインの傾きはピーク検出に影響しません。ApexTrackでは検出感度以上のすべての頂点が検出されます。これに対し、従来法の波形解析ではピークの立ち上がり点でピークを検出します (2-7ページの「頂点の検出」を参照 )。

• ベースラインの決定 –立ち上がり%および立ち下がり%パラメータを使って各ピークのベースラインを決定します (2-13ページの「ベースラインの位置」と 2-22ページの「ピーク境界の決定」を参照 )。

• ピーク検出とベースラインの決定は互いに独立した関係です。

• ピーク面積、高さ、および保持時間 (RT)の計算 –ピークを波形解析し、2次曲線へのフィッティング (5点または 3点フィット )、あるいは、2次微分頂点の時間や最高点の時間によってピークの高さと保持時間を決定します (2-23ページの「波形解析結果の計算」を参照 )。

2-2 ApexTrack波形解析

解析メソッドパラメータの概要

ApexTrack波形解析の既定の解析メソッドは、従来法の波形解析の解析メソッドとは異なります。

ApexTrackの既定の解析メソッド：

ApexTrackで使用可能な解析パラメータは次のとおりです。

• 波形解析アルゴリズム – ApexTrackまたは従来の解析方法のどちらを使用するかを決定します。システムポリシーとプロジェクトポリシーにより、ApexTrackを使用できるようにします。有効にすると、従来法と ApexTrack法の間で解析メソッドを切り替えることができます。

• 開始 (分 )および終了 (分 ) – ApexTrackは開始時間から終了時間までの間に位置する頂点のみを検出します。［開始］および［終了］時間の効果は積分禁止イベントと同様です。これらの値は手動で指定するか、空白のまま（既定）にすることができます。［開始］が空白の場合はデータの開始時間を意味し、［終了］が空白の場合はデータの終了時間を意味します。指定できる値の範囲は、0～ 655分です。［開始］および［終了］の値がいずれも指定されている場合、［開始］の値は［終了］の値よりも小さくなければなりません。

特徴と機能 2-3

次の 2つのパラメータでピークの検出を制御します。

• ピーク幅 (秒 ) –ピーク幅の値は、5%ピーク高さでのピークの幅 (秒 )を表わします。これらの値は手動で指定するか、空白のまま（既定）にすることができます。指定できる値の範囲は、0.01～ 9999.9秒です。ピーク幅のフィールドが空白である場合、ソフトウェアは解析メソッドに指定された開始時間と終了時間の間のクロマトグラムの領域にピーク幅の自動設定アルゴリズムを適用します。クロマトグラムの開始または終了時に積分禁止イベントがある場合、ソフトウェアは積分禁止イベントが設定されていない区間の最初の良好なデータポイントから最後の良好なデータポイントにピーク幅の自動設定アルゴリズムを適用します。ピーク幅の値はデータのスムージングのみを制御します。これにより、ピーク間の最小間隔が設定されます。一般に、ピーク幅の値を小さくすると、検出できるピーク数が増加します（2-25ページの「ピーク幅パラメータ」を参照）。

• 検出感度 –検出感度の値は、ピーク高さ (μV)と同じ単位に合わせたレスポンス単位でのピーク間ベースラインノイズです。この値は手動で指定するか、空白のまま（既定）にすることができます。指定できる値の範囲は、0.000～ 1.000e+090µVです。検出感度のフィールドが空白である場合、ソフトウェアは解析メソッドに指定された開始時間と終了時間の間のクロマトグラムの領域に自動感度アルゴリズムを適用します。クロマトグラムの開始または終了時に積分禁止イベントがある場合、ソフトウェアは積分禁止イベントが設定されていない区間の最初の良好なデータポイントから最後の良好なデータポイントに自動感度アルゴリズムを適用します。検出感度の値を小さくすると、検出できるピーク数が増加します (2-28ページの「検出感度パラメータ」を参照 )。

注記 :一般に、積分禁止イベント、および開始時間と終了時間をクロマトグラムのベースライン範囲内に設定することをお勧めします。

次の 2つのパラメータでベースラインの位置を制御します。

• 立ち上がり %と立ち下がり% –これらのパラメータは、ApexTrackがピークの始点と終点、およびピーククラスタを識別するために、傾き差の感度を決定するときに使用する値を定義します。立ち上がり %はピークの始点に使用され、立ち下がり %はピークの終点に使用されます。立ち上がり %の既定値は 0.0で、立ち下がり %の既定値は 0.5です。指定できる値の範囲は 0～ 100％です。値を増やすと、立ち上がりまたは立ち下がりが現れるピークのポイント数が増加します (2-14ページの「ApexTrackが傾き差の感度を決定する方法」を参照してください )。

注記 : GPC解析メソッドでの立ち上がり %と立ち下がり %の最大値は 5です。GPCでの立ち上がり %と立ち下がり %の既定値は 0.000です。

次の２つのパラメータでは、指定値よりも小さいピークは除外されます。

• 最小面積および最小高さ –いずれも波形解析結果に基づいてピークを除外します。


時間イベントの概要

ApexTrackピーク検出と波形解析イベントは、［波形解析］テーブルの［種類］列で使用することができます。ApexTrackイベントは、すべての種類の解析メソッドで使用することができます。ピークの統合イベントも GPC解析メソッドで使用できます。

注記 :すべての時間イベントの概要および各説明については、Empowerオンライン情報システムを参照してください。

ApexTrack時間イベント：

テーブルエントリで指定した時間範囲内で、以下の ApexTrack時間イベントを有効にすることができます。

• ショルダーを検出 –ショルダーおよびラウンドピークの検出を有効にします。ピークの境界と波形解析結果は、ショルダーピークやラウンドピークの検出に影響します。

• 谷渡り–クラスタベースラインを各ピークの個別のベースラインに変更する設定を有効にします。

• ガウシャンスキム処理 –垂直分割線をガウシャンスキムに変更する設定を有効にします。

• 負ピークを検出 –負ピークの検出を有効にします。

• 接線スキム –スキム処理を行うために、垂直分割線を、親ピークから（前方または後方の）ライダピークに引いた接線に変更する設定を有効にします。

特徴と機能 2-5

既定ではこれらのイベントは無効になっています。これらのイベントは、任意の組み合わせおよび任意の時間範囲で有効にすることができます。ただし、これらのイベントを重複して使用することはできません。

また、以下のイベントを有効にし、解析メソッドに既に入力されている値を変更することもできます。

• 積分禁止 –ピークを検出できる時間範囲をさらに制限します。

• イベント設定 - 対応するメソッドの値を変更します。

• ピーク幅の設定 (秒 )

• 検出感度設定

• 立ち上がり感度 %設定

• 立ち下がり感度 %設定

• 最小面積設定

• 最小高さ設定

• 最大高さ設定

• 最大ピーク幅の設定 (秒 )

• ピークの統合イベント – GPCタイプの解析メソッドで利用できます。

すべてのイベントには開始時間を設定しなければなりません。既定値は、0.000分です。終了時間を持つイベントは、当該フィールドを空白のままにしてこのイベントが分析の終了まで有効であることを示すか、または分単位で時間を指定することができます。開始および終了時間には、既定で 3桁の有効桁数を使用し、各パラメータの有効範囲は 0～ 655分です。終了時間が空白である場合を除き、開始時間は終了時間未満でなければなりません。

ApexTrackの波形解析ピークラベルクロマトグラムの識別された各ピークには、ピークの開始および終了境界を説明する 2文字のラベルが付けられます。ピークの境界は文字のペアによって説明されます。これらの文字は、レビューの結果画面およびメイン画面のピークタブの種類列に表示されます。

波形解析イベントが何も有効になっていない場合、各ピークはベースライン (B)またはベースラインより上の谷 (V)で開始または終了します。各ピークは以下のようにラベル付けされます。

• BBはベースラインで分離しているピークを示しています。

• BVはクラスタを開始するピークを示しています。

• VBはクラスタを終了するピークを示しています。

• VVはクラスタ内のピークを示しています。


ApexTrack波形解析では、ApexTrack固有の 4つ［分割の種類］文字 (ショルダー、ラウンド、ガウシャンスキム、クロスオーバー )をサポートしています。

大文字は、ApexTrackが波形解析を自動的に実行したことを示します。小文字は、手動で波形解析されたことを示します。

例えば、ベースラインのラベルが Bbならば、ピーク開始もピーク終了もベースラインで分離しており、開始は自動で、終了は手動で調整されたことを示します。

注記 :手動波形解析の詳細については、Empowerオンライン情報システムを参照してください。

頂点の検出

ApexTrack処理が起動された場合、データに適用される最初の処理は頂点の検出です。ピークの頂点は最大曲率のポイントです。頂点の検出は曲率 (傾きの変化率または 2次微分 )の測定に基づいています。ApexTrackはピーク頂点での曲率を使用してピークを検出し、検出された各頂点を含むピークに対応するアルゴリズムを検出します。ピーク頂点を検出してから、ApexTrackはベースラインを見つけます (2-13ページの「ベースラインの位置」を参照)。

注記 :クロマトグラムの曲率の記述またはプロットについて、本書では負の曲率規則を採用しています。2次微分クロマトグラムでは、各ポイントのクロマトグラムの曲率を測定し、プロットする前にその曲率に –1を掛けてスケーリングしています。この規則では、正のピークの頂点が正の曲率を持ち、負のピークの頂点が負の曲率を持ちます。

クロマトグラムの波形解析ピークラベル

ピーク名、開始または終了文字内容

ベースライン B ピークの境界はベースラインです。

谷 V ピークの境界は谷です。

ショルダーa S ピークの境界はショルダー (数学的に算出した

谷点 )です。

ラウンドa R ピークの境界はラウンドです (2-11ページの

「ラウンドピーク」を参照 )。

ガウシャンスキムa G ピークの境界はガウシャンスキムです。

クロスオーバーa

a. 適切な時間イベントを有効にする必要があります。

X ピークの境界線は、クロマトグラム信号がベースラインと交差する場所に発生します。このポイントをはさんで両側にあるピークは、互いに反対の符号を持ちます (一方が正ならば、もう一方は負になります )。

接線スキムa T ピークの境界は接線スキムです。

頂点の検出 2-7

頂点の検出

ApexTrackソフトウェアは以下の手順でピークを検出します。

1. ピーク幅パラメータを取得します。

2. ピーク幅を使用して 2次微分スムージングフィルタを取得します。

3. 2次微分フィルタを使用して、クロマトグラムの 2次微分 (曲率 )プロットを取得します。

4. 2次微分プロット内で、ピークが最大 (正のピーク )または最小 (負のピーク検出可が有効となっている場合は負のピーク )となる時間を探し、最大値 (正のピーク )または最小値 (負のピーク )での 2次微分値を記録します。

5. 検出感度パラメータを取得します。

6. 最大値 (正のピーク )または最小値 (負のピーク )に 2次微分感度を適用し、検出感度を超える曲率 (正のピーク )を含む頂点のみ、または検出感度を下まわる曲率 (負のピーク )を含む頂点のみを残します。

頂点の検出パラメータ

次の 2つのパラメータで頂点の検出を制御します。

• ピーク幅

• 検出感度

ApexTrackは両方のパラメータの値を必要とします。ピーク幅および検出感度の値を手動で解析メソッドに指定するか、自動ピーク幅と自動感度により、自動的に値を決定することもできます。自動ピーク幅の操作の概要については、2-25ページの「ピーク幅パラメータ」を参照してください。自動感度の操作の概要については、2-28ページの「検出感度パラメータ」を参照してください。

自動ピーク幅

自動ピーク幅はピーク幅の自動決定のことをいいます。解析メソッドでピーク幅が指定されていない場合、ソフトウェアは解析メソッドに指定された開始時間と終了時間の間のクロマトグラムの領域に自動ピーク幅アルゴリズムを適用します。クロマトグラムの開始または終了時に積分禁止イベントがある場合、ソフトウェアは積分禁止イベントが設定されていない区間の最初から最後の良好なデータポイントにピーク幅の自動設定アルゴリズムを適用します。

自動ピーク幅では、2次微分の最大ピークの 5%ピーク高さでピーク幅 (秒 )を測定します。この値はクロマトグラムの波形解析で使用され、解析の結果に含められます。この値を解析メソッドに指定し、以降の処理のために保存しておくことができます。


自動感度

自動感度とは感度を自動的に決定することをいいます。解析メソッドで検出感度が空白である場合、ソフトウェアは解析メソッドに指定された開始時間と終了時間の間のクロマトグラムの領域に自動感度アルゴリズムを適用します。クロマトグラムの開始または終了時に積分禁止イベントがある場合、ソフトウェアは積分禁止イベントが設定されていない区間の最初から最後の良好なデータポイントに自動感度アルゴリズムを適用します。

自動感度では、ピーク間のベースラインセグメントにおけるピーク間ノイズを測定します。自動感度では、ピーク間ノイズの値をマイクロボルト単位で返します。ApexTrackでは、この値をクロマトグラムの波形解析で使用し、解析の結果に含めます。この値を解析メソッドに指定し、以降の処理のために保存しておくことができます。

2次微分プロットの取得ApexTrackは、クロマトグラムの 2次微分を計算して、ピークを検出します。上のプロットは理想的なガウシャンピークを示しています。下のプロットはそのガウシャンピークの 2次微分プロファイルを示しています。

ガウシャンピークとその 2次微分：

ガウシャンピーク

ガウシャンピークの 2次微分プロット

1

2

34

1

2

3

4

キー1. 2次微分の最大値は両方のプロットで最も高いポイントです。

2. 下のプロットで、変曲点は2次微分が 0 と交差するところです。これらの点の時間は上のプロットまで転送されます。

3. 上のプロットの立ち上がり傾き点は、下のプロットの最小曲率解です。

4. クロマトグラムのベースラインの 2次微分は 0です。

2

3

2

3

0

頂点の検出 2-9

注記 :本書では、すべての 2次微分プロットに –1を掛けて、正のピークの頂点が正の 2次微分として表わされるようにしています。

ピークの検出

正のピークには単一の最大曲率点があります。その最大曲率点の時間はピークの頂点として識別されます。

頂点の下のポイントが変曲点です。変曲点は頂点をまたいで位置しており、曲率は 0です (2次微分プロット上で 0を通過します )。

ピークを下がっていくと、立ち上がり傾き点があります。この点が最小曲率になります。

最終的に、曲率が 0である、ベースラインに到達します。ベースラインにかなりのドリフトがある場合でも、直線の曲率は 0であるため、その曲率は 0のままです。

分離ピークとショルダーピーク

次の図は、分離ピークおよび 3対の未分離ピークを含む、シミュレートされたクロマトグラムの 2次微分を示しています。ApexTrackはクロマトグラム信号の 2次微分を取得し、その極大点を探し、ピークを検出します。この処理では、ショルダーピークとラウンドピークを含む 7つのすべてのピークを識別します。


ベースライン分離ピーク、谷境界、ショルダー境界、ラウンド境界

注記 :本書では、すべての 2次微分プロットに –1を掛けて、正のピークの頂点が正の 2次微分として表わされるようにしています。

2次微分プロット内の矢印は、「2次微分頂点」と呼ばれる極大値を指しています。”すべての未分離ピークは、それらの 2次微分頂点により検出されます。

2つの 2次微分頂点間のクロマトグラム信号内に最小解がある場合は、未分離ピーク間に谷垂線が追加されます。

2つの 2次微分頂点間のクロマトグラム信号内に最小解がない場合は、未分離ピーク間にショルダー垂線が追加されます。

2つの 2次微分頂点間のクロマトグラム信号内に最小解がなく、2次微分プロット (頂点間 )の最小解が 0よりも大きい場合は、未分離ピーク間にラウンド垂線が追加されます。

ラウンドピーク

ラウンドピークの対は、ほとんど同じ高さのピークが低分離度 (0ではない )で溶解しているときに現れます。2つのピークが完全に分離していない場合、2つのピークの間に谷が形成される場合があります。分離度が低い場合には、その境界はショルダー (2つのピークの高さが異なる場合 )またはラウンド (2つのピークの高さが同じ場合 )になります。

未解析のクロマトグラム

2次微分

ベースライン分離ピーク

未分離ピーク(谷 )

未分離ピーク( ラウンド )

未分離ピーク( ショルダー )

波形解析されたクロマトグラム

頂点の検出 2-11

注記 :ショルダーを検出時間イベントが有効である場合、ショルダーピークとラウンドピークが検出されます。ショルダー境界には (S)のラベル、ラウンド境界には (R)のラベルが付けられます。

次の図は、2種類の未分離ピークの対を示し、ラウンドピークの発生について解説しています。左側のピークは谷境界になっています。右側のピークはラウンドピークになっています。分離度が低いときには、谷が消失して、頂点が丸みを帯びるか平坦になったラウンドピークとして現れます。谷 (およびショルダー )境界では、変曲点のペア (ひし形で示しています )が各頂点をまたいで位置しています。ラウンド境界の特徴は、2つの頂点が、同じペアの変曲点を共有することです。

谷がある未分離ピーク (左 ) と未分離のラウンドピーク (右 )

2次微分

ラウンド

シミュレートされたクロマトグラム

負の曲率正の曲率

ラウンド谷


ピークテーブル内の 2次微分頂点と変曲点各ピークの 2次微分頂点の時間は、ピークテーブルの 2次微分頂点というラベルの付いた列に表示されます。一般に、この時間はピークの保持時間とは異なります。2次微分頂点の時間を保持時間に使用する場合、ピークコード I20が表示されます。テールピークの場合、2次微分頂点の時間は一般に保持時間に先行します。

解析メソッドを変更しても、ピーク幅パラメータを変更しなければ、特定のピークの 2次微分頂点に対して表示される値は変更されません。ただし、ショルダーを検出イベントが有効になっていないため、ピークからショルダー境界またはラウンド境界が削除されている場合だけは例外です。ピークに「隠れた」ラウンドまたはショルダー境界がある場合、解析メソッドを変更することによって、このピークに対して表示される 2次微分頂点が変更されることがあります。

変曲点は頂点をまたいで位置しており、曲率は 0です (2次微分プロット上で 0を通過します)。ピーク変曲点間の時間は、ピークテーブルの変曲点幅 (秒 )というラベルの付いた列に表示されます。

ベースラインの位置

有効な頂点が見つかると、ApexTrackはこれらのピークに関連するベースラインを決定します。

正のピークのベースラインを決定する手順は、次のとおりです。 1. 最初に、各ピークの変曲点の間にベースラインを引きます。

2. 各変曲点に対して接線を引きます。

3. 変曲点ベースラインと各変曲点の接線 (立ち上がり傾きと立ち下がり傾き )との傾き差を決定します。

4. 傾き差の感度を決定します。ピーク開始の傾き差の感度は、(立ち上がり % °傾き差)/100として定義されます。ピーク終了の傾き差の感度は、(立ち下がり % °傾き差)/100として定義されます。

5. 変曲点のある場所では、立ち上がり %または立ち下がり %は 100%です。

6. 立ち上がり %または立ち下がり%が 0のときは、ベースラインノイズに吸収されます。

7. 傾き差の感度がそれぞれピーク開始およびピーク終了の基準に一致するまでベースラインを拡張します。


ApexTrackが傾き差の感度を決定する方法解析メソッドでは、以下のピーク波形解析パラメータの値が必要です。

• 立ち上がり % (既定値は 0.000)

• 立ち下がり % (既定値は 0.500、ただし、GPCの既定値は 0.0)

ベースラインパラメータ：

アルゴリズムは、立ち上がり %と立ち下がり %を基に各ピークの 2つの傾き差の感度を計算します。

ApexTrackは、これらの傾き差の感度を次のようにして計算します。 1. ピーク頂点にまたがる変曲点を識別します。

2. 各変曲点で接線を引き、変曲点を結ぶベースラインを引きます。

変曲点ベースライン：

3. 2つの傾き差、 ∆m1および ∆m2 を計算します。

– 上がり傾きの変曲点に引いた接線と変曲点ベースラインの傾き ∆m1。

– 下がり傾きの変曲点に引いた接線と変曲点ベースラインの傾き ∆m2。

変曲点ベースライン

下がり傾き接線

上がり傾き接線


傾き差の計算：

ApexTrackは、メソッドからのベースライン %感度を使用し、2つの傾き差の感度 (Tstart および Tend)を計算します。

• Tstart = ∆m1 × (立ち上がり %)/100

• Tend = ∆m2 × (立ち下がり %)/100

ApexTrackが分離ピークのベースラインを見つける手順ApexTrackは、各ピークごとに傾き差の感度基準に一致するまでベースラインを下側および外側向かって拡張します。拡張される各ポイントで、傾き差の感度基準がテストされます。

∆m1 ∆m2∆m1 ∆m2∆m1 ∆m2


最終ベースラインの計算

この図は、テーリングピークをシミュレートしたもので、ベースライン分離したピークのベースラインを ApexTrackがどのように見つけるかを示しています。初期ベースラインは変曲点ベースラインです。ピークを下に移動するに従ってベースラインは拡張され、傾き差の感度がテストされます。各ステップにより、ベースラインの終端はピークにさらに接するようになります。ピークの開始、終了の両方で傾き差の感度が満たされるとベースラインはそれ以上拡張されません。

開始矢印線の間の角度終了矢印線の間の角度


テーリングピークでのベースラインの検索例

ApexTrackがクラスタの仮想ベースラインを見つける手順ApexTrackは、少し異なる手法を用いてクラスタピークのベースラインを決定します。

クラスタピークの仮想ベースラインを決定する手順は、次のとおりです。

1. ApexTrackは、各ピークの終端が傾き差の感度基準に一致するまで、そのベースラインを拡張します。ピークが分離されていない場合、ベースラインを拡張していくとピークは重なります。次の図は、ピークが 2つあるクラスタの仮想ベースラインが重なるところを示しています。

変曲点ベースライン

最終ベースライン


クラスタピークの仮想ベースライン

2. 拡張したベースラインの重複により谷を識別します。

3. 2つの重なり合った仮想ベースラインを 1つの未分離ベースラインに置き換えます。この新しいベースラインは、クラスタ内で最初の仮想ベースラインの先頭を開始点とし、クラスタ内で最後の仮想ベースラインの終わりを終了点とします。

クラスタベースライン

仮想ベースライン

仮想ベースライン

仮想未分離ベースライン

拡張後の最終ベースライン

谷垂線


ApexTrackが最終クラスタベースラインを決定する方法ベースラインがまとめられると、クラスタベースラインの終端点で傾き差の感度のテストが行われます。

傾き差の感度が一致していない場合、 ApexTrackは以下の操作を行います。1. 前述のようにクラスタベースラインを拡張します。

2. 傾き差の感度が一致すると、ベースラインの拡張を停止します。

– 傾き差の感度 Tstart = ∆m1 × (立ち上がり %)/100

– 傾き差の感度 Tend = ∆m2 × (立ち下がり %)/100

3. 最終ベースラインの真上で最も高さの低いポイントから谷垂線をおろします。

立ち上がり % と立ち下がり %のベースライン位置での影響ベースラインの位置は立ち上がり %と立ち下がり %によって制御されます。両方を 0%に設定すると、結果的にベースラインは検出器ベースラインに接します。両方を 1%に設定すると、傾き差の感度は変曲点の傾き差の 1%になります (∆m1 と ∆m2)。結果的にベースラインはピークの高さの約 1%で終わります。両方を 100%に設定すると、各ピークに使用されるベースラインはそのピークの変曲点ベースラインになります。

ApexTrackは傾き差の感度の計算にパーセンテージを使用するため、一連のピークについて計算された傾き差の感度はピーク高さに比例します。したがって、大きなピークは大きな傾き差の感度を持ち、小さなピークは小さな傾き差の感度を持ちます。これにより、同じ立ち上がり %値と立ち下がり %値を用いた単一の手法で、異なるサイズのピークを適切に解析できます。

次の図は、高さ比 1、1/10、1/100を持つピークの例を示しています。ここでは規定値の、立ち上がり %＝ 0および立ち下がり %＝ 0.5を用いています。

• 立ち上がりは各ピークで同じ時間です。

• 立ち下がりは各ピークで同じ時間です。

• 立ち下がりは各ピークで適切に配置されています。


最大ピークの立ち下がり

中間 (1/10)のピークを拡大表示します。立ち下がりはうまく配置されていますが、傾きが異なります。中間サイズのピークの終点はピークのテール部分の同じ時間に現れます。

1/10のピークの立ち下がり

最小 (1/100)のピークを拡大表示します。立ち下がりはうまく配置されていますが、傾きが異なります。第 3のピークの終点はピークのテール部分の同じ時間に現れます。最大ピークの傾き差の感度は最小ピークの傾き差の感度の 100倍です。

最大ピークの立ち下がり

元のピーク( これを 1 とする )

1/10のピーク

1/100のピーク

1/10のピーク

1/100のピーク


1/100のピークの立ち下がり

クラスタピークに対して立ち上がり % と立ち下がり % を変更した場合の影響立ち上がり %と立ち下がり%を変更すると、ベースライン位置が変わり、これにより、谷垂線の時間が変わる場合があります。これは、垂線が現在のベースラインから相対的に最も低いポイントに設定されるためです。

立ち上がり %や立ち下がり%を変更すると、ショルダー垂線が谷垂線になったり、反対に谷垂線がショルダー垂線になることがあります。垂線がショルダーになるか、または谷になるかは、ベースラインの傾きによって決まります。現在のベースラインに対する 2つの隣接するピーク頂点の間に最小解がある場合、垂線は谷境界 (V)になります。最小解がなければ、垂線はショルダー境界 (S)になります。立ち上がり %や立ち下がり %の変更によってベースラインの傾きが変わったとき、ショルダー垂線が谷垂線に (または、谷垂線がショルダー垂線に )なる場合があります。

ショルダーを検出が有効になっていない場合、立ち上がり %と立ち下がり %の変更時にピークが新たに生じたり、消滅する場合があります。ピークがショルダーかどうかは、現在のベースラインを使用して決定されます。ショルダーを検出が設定されていない場合、ショルダーピークは現れません。ただし、立ち上がり %や立ち下がり %を変更すると、ベースラインの傾きが変わります。そのピークの境界が、新しいベースラインに対して谷となり、ピークが出現する場合があります。一般に、ショルダー境界をなくすと、2つの隣接するピークを 1つに結合させるという効果があります。

1/100のピーク

1/10のピーク


ピーク境界の決定

頂点の検出とベースラインの決定の後、ApexTrackは各ピークの開始および終了を識別します。既定の境界はベースラインと谷です。ピークがベースライン分離している場合、開始および終了はベースラインとの接点であり、Bというラベルが付けられます。ピークがクラスタ内にある場合、ピーク間の境界は、谷に配置された垂直分割線であり、Vというラベルが付けられます (2-6ページの「ApexTrackの波形解析ピークラベル」を参照 )。

時間イベントは以下の追加の境界の種類を可能にします。

ショルダーを検出 –ショルダーを検出が有効になっている領域では、ショルダーピークやラウンドピーク間の境界が垂直分割線となり、それぞれ “S”と “R”のラベルが付けられます。

ガウシャンスキム –ガウシャンスキム処理が有効になっている領域では、垂直分割線はガウスプロファイルに置き換えられ、新しいピークの境界には “G”のラベルが付けられます。

接線スキム –接線スキム処理が有効になっている領域では、親ピークからライダピークをスキム処理するために、垂直分割線に代えて接線が引かれ、新しいピークの境界には “T”のラベルが付けられます。

負ピーク –ピーククラスタが負のピークだけで構成され、負ピーク検出可が有効である場合、ピーク開始および終了境界には Bや Vのラベルが付けられます。これらの領域で、ショルダーを検出またはガウシャンスキムが有効である場合は、S、R、G境界も許可されます。

クロスオーバー–クラスタが正負両方のピークを含む場合、クロマトグラム信号はこれらの隣接するピーク間でベースラインと交差します。この場合、境界は交点であり、“X”のラベルが付けられます。

動作のシークエンス

ピーク、ベースライン、境界の決定には、3つの処理 (頂点検出、ベースラインの位置決定、境界の決定 )に 4つの時間イベント（負ピーク検出可、ショルダーを検出、谷渡り、ガウシャンスキム、接線スキム）が組み込まれます。

これらの処理の動作順序は以下のとおりです。

1. 頂点の検出

2. 負ピーク検出可イベントの処理

3. ベースラインの位置決定

4. ピーク境界の位置決定

5. 谷渡りイベントの処理

6. ショルダーを検出イベントの処理

7. ガウシャンスキムイベントの処理

8. 接線スキムイベントの処理


波形解析結果の計算

頂点が検出されると、ベースラインの位置が確定され、境界が識別されます。次に、ApexTrackは各ピークの波形解析結果を取得します。すべてのピーク面積、保持時間、高さは、ベースライン補正された信号を使用して計算されます。

注記 :ApexTrack波形解析では、ベースライン補正された信号を使って保持時間を決定します。これに対して、従来の解析法では補正されていない信号を使って保持時間を決定します。相対的に平らなベースラインでは、どちらの解析法でも保持時間の値は同じであるか、差があってもごくわずかです。傾きがかなり大きなベースライン上のピークの場合、ベースライン補正された信号に基づく ApexTrackの計算のほうがより正確です。

ピークの境界の片方または両方がガウシャンスキムである場合は、ピークプロファイルやベースラインの部分はベースライン補正の前にスキムに置き換えられます。例えば、ピークがスキムを生成する場合、このスキムプロファイルは大きい方の (親 )ピークのスキムの開始時間から終了時間までの間のレスポンスを変更します。この同じプロファイルは、スキム処理されている小さいほうの (子 )隣接ピークのベースラインになります。

ピーク面積

ピーク面積はシンプソンの公式を適用することによって得られます。ピーク面積に対するサンプルポイントの隣接する対からの影響度は、サンプル期間 (隣接するサンプルポイント間の時間 )を乗算したサンプル時間でのベースライン補正されたレスポンスの平均です。

ピーク高さ

ピーク高さは、保持時間でのベースライン補正されたレスポンスの値です。

保持時間

ApexTrackは、保持時間とピーク高さを、ピーク境界とピーク形状に応じて、4通りの方法のいずれかによって決定します。

• ピーク頂点のポイントに対する 2次曲線の 5点フィット

• ピーク頂点のポイントに対する 2次曲線の 3点フィット

• 2次微分頂点の時間

• 最も高い点の時間

注記：

• ほとんどの条件下では、2次曲線の 5点フィットを使用して、保持時間とピーク高さが決定されます。解析コードは報告されません。

• 3点フィットと 2次微分の時間は ApexTrackに固有の機能であり、従来法による解析では実装されていません。

• ApexTrack波形解析では、ベースライン補正された信号に 3点および 5点フィットが使用されます。従来法では、未補正の信号に対して、5点フィットのみが使用できます。


どの保持時間メソッドを使用するかを決定する規則

保持時間メソッドを決定するために、ApexTrackにより各ピークでテストの階層が実行されます。

テストおよびテストの順序は以下のとおりです。

1. 2次微分頂点の保持時間は以下のいずれかの場合に使用されます。

– いずれかの境界がラウンド（R）ピークである場合。

– ベースライン補正された信号の最高点がピーク境界にある場合。通常、これにより、2次微分頂点からショルダーピークの保持時間が取得されます。

ピークの解析結果に報告された保持時間と高さが 2次微分頂点で計算されている場合は、解析結果に解析コードの I20が追加されます。

ピークの境界から外れているために 2次微分頂点の保持時間を使用できない場合は、代わりにピークの最も高いポイントを保持時間とみなします。ピークの解析結果には、2次微分頂点の保持時間を適用できなかった事を示す解析コードのI23が追加されます。

2. ピークが最初のテストの基準に適合しないときは、次のいずれかの場合に 3点フィットが使用されます。

– ピークの変曲点幅の範囲のサンプルポイントが 4ポイント未満の場合。

ピークの解析結果に報告された保持時間と高さが 3点フィットから計算されている場合は、解析コードの I19が追加されます。

保持時間の決定に 3点フィットが使用できなかった場合、2次微分頂点値が使用されます。ピークの解析結果には 3点フィットを適用できなかった事を示す解析コードの I22が追加されます。ピークの解析結果に報告された保持時間と高さが、2次微分頂点で計算されている場合は、解析結果に解析コードの I20が追加されます。

保持時間の決定に 2次微分頂点を使用できなかった場合、代わりにピーク頂点を用いて保持時間を決定します。ピークの解析結果には、保持時間の決定に 2次微分頂点を使用できなかった事を示す解析コードの I23が追加されます。

3. ピークがいずれのテストの基準にも適合しないときは、5点フィットが使用されます。

– この場合解析コードは報告されません。

次のいずれかの条件に適合する場合、5点フィットが失敗することがあります。

• フィッティングに使用される 5点のうち最初と最後の点が、ピークの開始および終了時間から外れて存在する場合。

• フィッティングから得られた保持時間が、フィッティングに使用される 5ポイントから外れている場合。

この場合、ピークの解析結果には、5点フィッティングが適用できなかった事を示す解析コードの I21が追加されます。上記のいずれの場合も、次に 3点フィッティングが試みられます。ピークの解析結果に報告された保持時間と高さが 3点フィッティングから計算されている場合は、解析コードの I19が追加されます。


3点フィットで得られた保持時間がフィッティングに使用される 3ポイントから外れている場合、ピークの解析結果には、3点フィットを適用できなかった事を示す解析コードの I22が追加されます。この場合、2次微分値が試みられます。ピークの解析結果に報告された保持時間と高さが 2次微分頂点で計算されている場合は、解析結果には解析コードの I20が追加されます。

ピークの境界から外れているために 2次微分頂点の保持時間を使用できない場合は、代わりにピークの最も高いポイントを保持時間とみなします。ピークの解析結果には、保持時間の決定に 2次微分頂点を適用できなかった事を示す解析コードの I23が追加されます。

手動で調整したピークの保持時間と高さの値

ピークの保持時間、高さ、および面積を決定するには、ベースライン位置とピーク境界が必要です。手動で決定したベースライン位置とピーク境界が、自動で決定されるときの値と一致する場合、手動で決定した保持時間、高さ、および面積の各値も自動で決定されるときの値に一致します。

注記 :保持時間と高さを 2次微分頂点を使って計算する場合、I20解析イベントが報告されま

す。I20ピークを手動で調整する場合、2次微分値が使用できなくなるため、ソフトウェアは保持時間と高さの計算方法を決定するのに別の規則を使用します。その結果、保持時間と高さは 5点フィットまたは 3点フィット、あるいは最も高いポイントにある時間によって決定されます。

ショルダーを検出が有効になっている場合は、ピークがショルダーまたはラウンドとみなされ、I20イベントが報告される場合があります。ショルダーを検出が有効になっていない場合は、幅が狭く低いレベルのピークに対して I20イベントが報告される場合があります。

ピーク幅パラメータ

数秒から数分にかけて広い範囲で幅が変動するピークでは別のシナリオが使用されます。ApexTrackは解析メソッドへの入力としてピーク幅を必要とします。ピーク幅はデジタルフィルタの幅を設定します。このデジタルフィルタは内部的に使用され、スムーズな、1次および 2次微分クロマトグラムを得ることができます。ApexTrackでは、ピーク幅の唯一の役割はこれらのフィルタの幅を決定することです。

注記 :フィルタをかけられたクロマトグラムのポイント数は、元のクロマトグラムと同じです。従来法による解析とは異なり、データポイントは ApexTrackではバンチングされません。ApexTrack解析では、元のまたはフィルタをかけられたクロマトグラムを使用します。

フィルタの幅は追加されるスムージングの程度を決定します。幅が広いフィルタでは、1次または 2次微分クロマトグラムでのスムージングの程度が大きくなります。スムージングにより高周波数成分 (ノイズ )が削除され、実際のクロマトグラムの特性に対応する周波数 (ピーク )が残されます。

クロマトグラムピークの幅を表わすために、種々の規則を採用することができます。ApexTrack解析メソッドは、高さの 5%で測定されたピークの幅 (秒単位 )を入力として予測しています。


注記 :分布の幅を測定する最も一般的な方法は標準偏差 (SD)です。ガウスピークでは、クロマトグラムピーク幅は 4.0 Åã SDとして定義されています。

ApexTrackでは、5%高さにおけるピーク幅を目視検査で測定し、その値をメソッドに指定するか、または自動ピーク幅を使用してピーク幅を自動的に決定することができます。

ガウシャンピークでのピーク幅定義

変曲点でのピーク幅、2.0 x SD

ピーク高さの半分、2.4 x SD

クロマトグラムピーク幅、4.0 x SD

5%高さ4.9 x SD 1%高さ、

6.1 x SD

変曲点でのピーク幅、2.0 x SD


自動ピーク幅

自動ピーク幅はピーク幅を自動的に測定します。クロマトグラムの領域は、1つまたは複数のピークを含んでいる必要があります。自動ピーク幅は、その領域にある最大の２次微分値を含むピークを選択し、ピーク幅を決定します。このピークの幅は、変曲点間の時間間隔を実際に測定することで決定されます。この時間間隔に係数 4.89549/2を掛けます。これにより、ガウシャンピークの 5%における幅が算出されます。

以下の 2通りの方法で、自動ピーク幅を計算するために使用する範囲を選択できます。

• クロマトグラムの領域を拡大表示し、 (解析メソッドのピーク幅の設定 )をクリックします。ピーク幅が解析メソッドに入力されます。ユーザーがデータを解析するときに、ApexTrackはこの値を報告および適用します。

• 解析メソッドのピーク幅フィールドは空白のままにします。ユーザーがデータを解析するときに、自動ピーク幅は開始および終了時間の間の領域と、クロマトグラムの開始および終了時の積分禁止イベント間の領域を使用し、ピーク幅を決定します。ApexTrackはこの値を報告および使用します。

自動ピーク幅の使用方法

ピーク幅フィールドが空白である場合、自動ピーク幅は開始および終了の間のデータと、クロマトグラムの開始および終了時の積分禁止イベント間の領域を使用し、ピーク幅を決定します。開始および終了時間を選択し、インジェクションショックや初期条件への復帰に起因する変動を除外します。例えば、ボイドボリュームが含まれる場合、ApexTrackはインジェクションショックを最高ピーク (通常、非常に狭いピーク幅 )として選択する可能性があります。

開始および終了時間を適切に選択した場合であっても、自動ピーク幅は次のような状況下で不正確な結果を提供する可能性があります。

• 最大ピークが飽和している場合、ピーク幅の値が大きくなりすぎる可能性があります。

• 最大ピークが別のピークと同時溶出している場合、ピーク幅の値が大きくなりすぎる可能性があります。

• 最大ピークがノイズを含む場合、自動ピーク幅はノイズの影響を受けたピークの幅を測定し、ピーク幅の値が小さくなりすぎる可能性があります。

これらの問題に対処するには、有効な幅を持つ有効なピークを含むクロマトグラムを拡大表示し、 (解析メソッドのピーク幅の設定 )をクリックします。ピーク幅は解析メソッドに指定されます。ユーザーがこのメソッドでデータを解析するときに、ApexTrackはこの指定された値を報告および使用します。一般に、参照とする分離から得たピーク幅は以降の分離に関連しています。

積分禁止イベントを有効にすると、自動ピーク幅は、積分禁止イベント外の最初から最後の良好なデータポイントにあるデータを使用します。例えば、積分禁止の開始時間が 0分、終了時間が 1分であり、別の積分禁止イベントが開始時間 5分から終了までの範囲である場合、自動ピーク幅は 1分より後の最初の良好なデータポイントから 5分より前の最後の良好なデータポイントを使用して計算されます。


ピーク幅パラメータの変動の影響

ベースライン分離されたピークでは、自動ピーク幅の値が変動しても、変動幅が 1.5以下であれば、ピーク検出やベースラインの位置決定への影響は少ししかありません。

ピーク高さの範囲に広がる同時溶出ピークを含む複雑なクロマトグラムでは、ピーク幅の値が 1.5以下の幅で変動 (および自動感度で感度を再決定 )しても、低レベルのピーク検出が変化する可能性があります。

ピーク幅の値を 2まで増加させる (および自動感度で感度を再決定する )と、ベースライン近くのピークが消失する可能性があります。ただし、この値を増加させると、検出されるショルダーの数が減ります。

検出感度パラメータ

クロマトグラムピークとノイズピークを区別するために、ApexTrackは解析メソッドへの入力として検出感度を必要とします。ソフトウェアは、この値をベースラインノイズのピーク間ノイズとして解釈します (マイクロボルト単位 )。

以下の 2つのノイズ源により、クロマトグラム信号に変動が追加される可能性があります。

• あらゆる検出プロセスにおいて避けられない統計的な変動

• 溶媒の流れに対する検出器のレスポンス

ApexTrackでは、2次微分クロマトグラムのベースラインノイズはベースラインのノイズ変動からピークを区別することに関連しています。次の図は、2つのクロマトグラムピークとベースラインノイズの 2次微分を示しています。

ベースラインノイズを示す 2次微分

2次微分クロマトグラムのベースラインにあるノイズは元のクロマトグラムのベースラインにあるノイズに比例します。このため、ソフトウェアは元のクロマトグラムのベースラインにあるピーク間ノイズから、2次微分感度を取得します。

最初のピークベースラインノイズ

2番目のピーク

ゼロ曲率

検出感度値


内部的には、その感度が解析メソッドに入力され、曲率の値に変換されます (マイクロボルト /秒 2)。この変換された値は 2次微分クロマトグラムに適用されます。曲率感度よりも上にくる 2次微分を持つピークのみがピーク頂点の有効な検出点として受け入れられます。正しく感度を選択することで、検出器ノイズによるすべての悪影響を除外し、有効なピークのみを受け入れることができます。

ApexTrackでは、ベースラインのピーク間ノイズを目視検査で測定し、その値をメソッドに指定するか、または自動感度を使用して自動的にピーク間のノイズを測定することができます。

ピーク間ベースラインノイズの例

自動感度

自動感度は自動的にベースラインノイズ振幅を判定します。自動感度はクロマトグラムの領域とピーク幅の値を入力として必要とします。自動感度はピークのないクロマトグラム内の領域を識別し、これらの領域でのピーク間ノイズを評価します。選択した領域は 1つまたは複数のピークを含むか、またはピークがない場合もあります。正確な測定のためには、ピークのないクロマトグラムのセグメントを含む領域を選択し、少なくとも 1ピークの幅があることが必要です。

自動ピーク幅と同様に、自動感度への入力となる領域の選択には、次の 2とおりの方法があります。

• クロマトグラムの領域を拡大表示し、 (解析メソッドの感度設定 )をクリックして、解析メソッドの検出感度値を設定します (このボタンは、解析メソッドにピーク幅が指定されている場合のみ有効です )。ユーザーがデータを解析するときに、ApexTrackはこの値を報告および使用します。

• 解析メソッドの感度フィールドは空白のままにします。ユーザーがデータを解析するときに、自動感度は開始および終了時間の間の領域と、開始および終了時の積分禁止イベント間の領域を使用し、検出感度を決定します。ApexTrackはこの値を報告および使用します。

自動感度は、2次微分クロマトグラムのノイズ領域を検証して感度を決定します。自動感度は、2次微分クロマトグラムのノイズを、元のベースラインで見られる同等のピーク間ノイズ感度に変換し、この値を報告します。

4 × SD = ピーク間ノイズ

1 × SD


次の図は、サンプルクロマトグラム (図中にそのベースラインを示します )の波形解析を示しています。自動感度は感度を 23.00µVとして報告します。

ベースラインノイズの自動測定

ベースラインを手動で拡大表示し、ピーク間ノイズを視覚的に評価することもできます。正および負の傾きを持つ直線はドリフトを示しており、ピーク間高さを評価できます。この例でのピーク間ノイズの大きさは、約 25µVです。この値を ApexTrackメソッドに指定できます。

ベースラインノイズの手動測定

分

分


自動感度の使用

検出感度フィールドが空白である場合、自動感度は開始時間と終了時間の間のデータ、および積分禁止イベント間のデータを使用して検出感度を決定します。開始および終了時間を選択し、別の領域のノイズとは異なるベースラインノイズを含む領域を除外します。

クロマトグラムの開始または終了時の積分禁止イベントを有効にすると、自動感度は、積分禁止イベント外の最初から最後の良好なデータポイントの間にあるデータを使用します。例えば、積分禁止の開始時間が 0分、終了時間が 1分であり、別の積分禁止イベントが開始時間 5分から終了までの範囲である場合、自動感度は 1分より後の最初の良好なデータポイントから 5分より前の最後の良好なデータ点を使用して計算されます。

解析メソッドパラメータを適切に選択した場合であっても、自動感度が不正確な結果を算出する場合があります。多くの成分を含むクロマトグラムでは、ピークがない領域が存在しない場合もあります。このようなケースでは、自動感度は高すぎる値を提供する場合があり、したがって有効なピークは検出されません。この問題に対処するには、ベースライン領域を拡大表示し、検出感度を最小ピークの高さに設定してください。通常は、一時的に検出感度を 0.0に設定すれば、これまで検出されなかったすべてのピークを確認できます。

時間イベントの使用

Empowerは、ピーク検出と波形解析の時間イベントをサポートしています。

注記 :すべての時間イベントの概要および各説明については、『Empowerオンライン情報システム』を参照してください。

ピーク検出イベント

ApexTrackでは、時間イベントを設定することによりピークの検出を変更することができます。ApexTrackピーク検出のイベントは、［波形解析］テーブルの［種類］列から使用することができます。

ピーク検出に影響を与える ApexTrackのイベントは次のとおりです。

• 積分禁止イベント

• ショルダーを検出イベント

• 負ピークを検出イベント

• イベント設定

– ピーク幅の設定 (秒 )

– 検出感度設定


ピーク解析イベント

イベントは、検出されたピークに関連する解析結果を変更できます。これらの ApexTrackピーク解析イベントは［波形解析］テーブルの［種類］列から使用することができます。ピークの統合イベントも GPC解析メソッドで使用できます。

すべてのイベントは開始時間を必要とします。既定値は、0.000分です。終了時間を持つイベントは、［終了 (分 )列］を空白のままにしてこのイベントが分析の終了まで有効であることを示すか、または分単位で時間を指定することができます。開始および終了時間には、既定で 3桁の有効桁数を使用します。［開始］および［停止］時間の有効範囲は 0～ 655分です。終了時間が空白である場合を除き、開始時間は終了時間未満でなければなりません。

ピーク解析に影響を与える ApexTrackのイベントは次のとおりです。

• 谷渡りイベント

• ガウシャンスキムイベント

• 接線スキムイベント

• ピークの統合イベント (GPC、GPCV、GPC-LS、GPCV-LSのみ )

• 立ち上がり感度 %設定イベント

• 立ち下がり感度 %設定イベント




• 最大ピーク幅設定 (秒 )

時間イベントが起動するタイミング

以下のイベントは、ピークの 2次微分頂点がイベント時間中に現れる場合に影響を与えます。

• 積分禁止

• 負ピークを検出

• 検出感度設定

• 立ち上がり感度 %設定

• 立ち下がり感度 %設定

以下のイベントは、ピークの保持時間がイベント時間中に現れる場合に影響を与えます。



以下のイベントは、垂直分割線がイベント時間中に現れる場合に影響を与えます。

• ショルダーを検出

• ガウシャンスキム

• 谷渡り

• ピークの統合 (GPCのみ )


以下のイベントは、時間イベントを有効にした直後のデータポイントに影響を与えます。ピーク幅の設定 (秒 )

参考文献

ApexTrackピーク検出および波形解析の理論の詳細については、以下の参考文献をご参照ください。

『ApexTrack Intergration：Theory and Application』、Waters Corp., Milford, MA, 2002年（www.waters.com）


3 従来法の波形解析

本章では、従来法のピーク検出および波形解析の理論の概要を説明します。

特徴と機能

Empowerによる従来法のピーク検出および解析には、次のような機能が含まれます。

• 解析メソッドですでに設定されている場合を除き、クロマトグラムの適切なピーク幅および検出感度の値を自動的に決定する。

• クロマトグラムの中のピークを検出し、それらの位置を決定する。

• ピークを波形解析し、保持時間、面積、および高さを決定する。

解析メソッドは、ソフトウェアが生データのファイル（チャネル）内でピークを検出して波形解析するために使用するパラメータを定義します（検出 /波形解析イベントも含まれます）。

内容：


特徴と機能 3-1

時間イベントの使用 3-17

ピーク波形解析イベント 3-18

参考文献 3-19

特徴と機能 3-1

ピークの検出

ピークの検出は、次のプロセスで構成されます。

1. データバンチングの実行

2. ピーク開始点の決定

3. 仮想ピーク頂点の決定

4. ピーク終点の決定

5. 解析メソッドのピーク幅および検出感度の決定

6. 積分禁止

検出アルゴリズムは、まずシグナルの変化率と設定した受け入れ基準を比較して、ピークの存在を確認します。次に、取り込まれた生データファイルにおけるピークの開始と終了を決定します。これらピークの検出テストはピークを波形解析する前に必ず行います。

ピーク検出テストの基準を決定するにはいくつかの方法があります。

• レビューの解析メソッド画面の［波形解析］タブにあるピーク幅と検出感度の選択項目

• レビューのメイン画面の解析ツールバーまたは［解析メソッド編集］

• レビューの解析メソッド作成ウィザード

関連項目 : ピーク検出理論の詳細については、3-19ページの「参考文献」を参照してください。

データバンチングの実行

検出アルゴリズムが、データをテストしてピークの存在を調べる際には、個々の生データポイントを個別のグループ、すなわちバンチ（群）にまとめて平均し、1つのポイントを生成します。バンチにまとめられるデータポイントの数は、ピーク幅パラメータによって設定されます。

ほとんどの場合、サンプリングレートが最適化されていれば、データの各バンチは 1つのポイントになります。データバンチングは、取り込まれた生データに影響を与えません。データバンチングは、ピークの開始と終了を判別するプロセスを強化するために使用される内部計算機能です。ピークが必要以上のデータポイントを含む場合、バンチングされたデータはピークを検出するためだけに使用されます。即ち、全ての生データポイントが波形解析に使用されます。

下図にノイズの多いデータでのバンチング効果を示します。この例では、ピーク幅は 60で、サンプリングレートは 1に設定されており、検出アルゴリズムは 4つの生データポイントを1つにバンチングしてデータポイントを生成しています。その結果、まとめられたデータの数は (60秒のピーク内で 60個のデータポイントがある )15に最適化され、データを効果的にスムージングします。

3-2 従来法の波形解析

データのバンチングの例

検出には、ソフトウェアは次の式を用いたバンチでポイント数を計算します。

ここで、

PB = バンチに含まれるポイント

PW= ピーク幅 (秒単位 )

SR =サンプリングレート (データポイント /秒、取り込みに使用した装置メソッドでユーザーが指定した値 )

ヒント : このピーク検出アルゴリズムは各ピークの開始から終了までのデータポイントが 15のとき、最も効果的に機能します。この理由は、ピーク幅を前述の式のように設定すれば、ソフトウェアは生データを 15の独立したバンチに編成するからです。ピーク幅を 15、サンプリングレートを 1に設定すると、データポイントはバンチングされません。全てのデータポイントがピーク開始と終了を検出するために使用されます。

ピーク開始の決定

解析メソッドで指定される立ち上がり検出感度は、検出されたピーク開始点またはピーク開始点を超えた箇所でのシグナルの最小傾き (μV/秒 )と定義されます。

ヒント : デフォルトでは、負のピークの検出は行いません。負ピークを検出イベントを有効にする方法については、3-17ページの「時間イベントの使用」を参照してください。

��

��

��

生データ

1つに平均化した4つのデータポイント

バンチングされたデータ

PB PW SR×( )15

----------------------------=

特徴と機能 3-3

ピーク開始点を決定するために、ソフトウェアの検出アルゴリズムは以下のことを行います。

1. シグナルに対して検出感度テストを行います。

• ソフトウェアは 2つのデータバンチ間でシグナルの傾きの平均を算出し、立ち上がりの検出感度と比較します。

• バンチ B1とバンチ B3間のシグナルの平均の傾きが、立ち上がり検出感度値と同じか、それよりも大きい場合、ソフトウェアは B1を有望なピークの開始点としてフラグを立てます。

2. 実際の開始点を決定するには、B1バンチの個々のポイントを調べます。正のピークの場合、これは最小 Y値をもつデータポイントになります。負のピークの場合、これは最大 Y値をもつデータポイントになります。

仮想ピーク頂点の決定

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有望なピーク開始

傾き 2

立ち上がり検出感度の傾き

理論的ベースライン(波形解析により変化する )

平均の傾き

傾き１

傾き 1

平均の傾き

傾き 2

傾き 2傾き 1


仮想ピーク頂点の決定

ピーク開始点が確認された後、仮想ピーク頂点 ( ピーク最大値 ) を決定するために、ソフトウェアは以下のことを行います。

1. 傾きの符号が正から負へ変わるまでシグナルをモニタします。負のピークの場合、傾きの符号は負から正に変わります。

2. 傾きの符号が変化した個所のバンチ (次の図のバンチ B12)を解析し、理論的ベースラインから最も離れたバンチ内のデータポイントを仮のピーク頂点に指定します。

ヒント : これは仮想ピーク頂点です。なぜなら、ソフトウェアは波形解析が行われてベースラインが指定されるまで実際のピーク頂点を決定しないからです。

仮想ピーク頂点の決定：

B1

B5

B10

B12

B13

B14

B17

B20

B24

Peak Start Point

Positive Slope

Peak Apex Point

Negative Slope

Theoretical Baseline

ピーク頂点ポイント

負のポイント

ピーク開始ポイント

理論的ベースライン

正のポイント

特徴と機能 3-5

ピーク終了の決定

ピーク終了点を決定するために、ソフトウェアは以下のことを行います。

1. シグナルの傾きと立ち下がり検出感度とを比較します。2つの連続する傾きが検出感度の値より小さければ、アルゴリズムは後のほうのバンチにまとめられている最後のデータポイントを有望なピーク終了点とします。

2. 実際のピーク終了点を決定するには、現バンチおよび次のバンチ内の個々のデータポイントを調べます。正のピークの場合、これは最小 Y値をもつデータポイントになります。負のピークの場合、これは最大 Y値をもつデータポイントになります。

3. ピーク終了のテスト中に、傾きの符号の変化をチェックします。立ち下がりが決定される前の符号の変化は、仮想ピークの谷 (現ピークの終了および次ピークの開始 )を示しています。

ヒント : これは仮想のピーク終了点かつ開始点です。なぜなら、ソフトウェアは解析処理が行われてベースラインが割り当てられるまでは、ピークの実際の終了点を決定しないからです。

4. このピーク開始点からピーク頂点までのテストを行い、ピークの立ち下がりの判定に成功するまでこれを続けます。

ピーク終了点の決定：

��*

��

��

�� +

�� &!�� !��

��, �-��

立ち下がり検出感度の傾き

この領域内でのピーク終了


ピーク幅および検出感度の決定

ソフトウェアは、ピーク幅と検出感度を自動的に設定するためにピークの 2次微分値を使用しています。

ヒント : ミレニアム 32のすべてのバージョンで使用されていたピーク幅、検出感度の計算方

法を使用したい場合は、［システムの管理］>［表示］>［システムポリシー］の順にクリックし、［データ解析ポリシー］タブの［V3.0Xのピーク幅、検出感度の計算方法を使用］をクリックします (Empowerオンライン情報システムを参照 )。このシステムポリシーが有効な場合、［ピーク幅］ボタンと［検出感度］ボタン、解析メソッドウィザード、解析メソッド、および結果はすべてミレニアム

32のすべてのバージョンと同じように機能します。

ピーク幅パラメータ

ソフトウェアは、クロマトグラム領域で最も高い 2次微分値を示すピークの 2次微分の変曲点を用いて、自動的にピーク幅値 (自動ピーク幅 )を決定します。

ソフトウェアはピークの検出時に、ピーク幅値を使用してバンチング係数を決定するため(3-2ページの「データバンチングの実行」を参照 )、このピーク幅値はピーク検出感度に影響を与えます。指針では、ソフトウェアが設定するピーク幅値の± 2倍の範囲内でピーク幅値を使用します。

信号対ノイズ (S/N)比が許容範囲にある場合、このピーク幅値の範囲で最も高い値を設定すれば感度を上げることができ、比較的小さなピークでも正しく波形解析することができます。ただし、大きなピークにショルダーがあるような場合には、ショルダーピークが検出されないかもしれません。この範囲以上にピーク幅を大きくすると、感度が低下します。

ピーク幅設定の有効範囲は 0.01から 9999.99です。ピーク幅の初期値は空欄になっています。

レビューでピーク幅を設定するには、以下のいくつかの方法があります。

• レビューの解析メソッド作成ウィザードを使用し、新規の解析メソッドを作成するか、既存の解析メソッドを編集する際、ソフトウェアは［波形解析］－波形解析領域ウィザード画面でズームアップした領域に含まれるデータを用いて自動的に適切なピーク幅を決定します。

• レビューのメイン画面でデータを表示する際に、波形解析ツールバーで［ピーク幅］ボタンをクリックすると、現在の拡大領域内で最も高い 2次微分値を有するピークに対してピーク幅を自動的に設定します。

• 有効な解析メソッドでピーク値が設定されていない場合、［解析］>［波形解析］とクリックして (またはツールバーの［波形解析］ボタンをクリックして )、データを波形解析することができます。ピーク幅は (クロマトグラムの開始点および /または終了点で積分禁止イベントがなければ )クロマトグラム全体のデータに従って自動的に設定されます。

ピーク幅設定に使用されるクロマトグラム領域の開始点は、クロマトグラムの最初、またはクロマトグラムの最初から始まる積分禁止イベントの終了時間です。ピーク幅設定に使用されるクロマトグラム領域の終了点は、クロマトグラムの最後、またはクロマトグラムの最後に終了する積分禁止イベントの開始時間です。

特徴と機能 3-7

ピーク幅を設定する際、クロマトグラムの最初または最後に重ならない積分禁止イベントは無視されます。

ヒント : この方法を使用した場合、ピーク幅は［結果のピーク幅］フィールドにのみ表示されます。［解析メソッドのピーク幅］フィールドは空欄のままです。右クリックメニューから［解析メソッドにコピー］をクリックすることによって、［結果のピーク幅］値を［メソッドのピーク幅］フィールドにコピーすることができます。

• レビューのメイン画面の波形解析ツールバーまたは解析メソッド画面の［波形解析］タブで値を入力することによってピーク幅を設定します。

ヒント : 最も高い 2次微分値を有するピークが未分離の場合、決定されたピーク幅は最適ではない可能性があります。このような場合にピーク幅パラメータを設定するときは、未分離のピーク以外のピークを拡大してください。

検出感度値

ソフトウェアは、まずクロマトデータの 2次微分値にメジアンフィルタを適用してノイズを求めることによって、自動的に検出感度値 (自動検出感度 )を決定します。次に、2次微分されたノイズに現在のピーク幅値を掛けることによって検出感度値を得ます。

検出感度値は、ピークの検出時にソフトウェアがピークの開始点と終了点を決定するために使用する傾きの測定値です (3-3ページの「ピーク開始の決定」と、3-6ページの「ピーク終了の決定」を参照 )。検出感度値を小さくすると感度は上昇し、比較的小さなピークでも適切に波形解析することが可能です。あまりにも多くのベースラインノイズがピークとして波形解析されるようであれば、検出感度値を大きくすると、このような小さなピークを解析しないようにすることができます。

通常、解析メソッドに設定されている検出感度値が、すべてのピークの開始 (立ち上がり )と終了 (立ち下がり )の決定に使用されます。クロマトグラムにテーリングピークやベースラインのドリフトがあり、ピークの開始点と終了点で異なる検出感度値を使用する必要がある場合、立ち上がり感度設定または立下り感度設定イベントを使用します。

検出感度設定に有効な範囲は 0.0以上になります。検出感度の初期設定は空欄です。

レビューで検出感度を設定するには、以下のいくつかの方法があります。

• 解析メソッド作成ウィザードを使用して新規の解析メソッドを作成するか、既存の解析メソッドを編集する際、ソフトウェアは［波形解析］－波形解析領域ウィザード画面でズームアップした領域に含まれるデータを用いて自動的に適切な検出感度を決定します。

• レビューのメイン画面のデータを表示する際に、波形解析ツールバーの［検出感度］ボタンをクリックすると、現在の拡大領域 (クロマトグラフ領域全体にわたる場合もあり )のデータを使用して、自動的に検出感度値が設定されます。

ヒント : ［解析メソッドのピーク幅］フィールドが空欄の場合、［解析メソッドの検出感度］ボタンは無効になります。

• 有効な解析メソッドで検出感度が設定されていない場合、［解析］>［波形解析］とクリックして (またはツールバーの［波形解析］ボタンをクリックして )、データを波形解析することができます。検出感度は（クロマトグラムの開始から終了までの間に積


分禁止イベントがなければ）クロマトグラム全体のデータに従って自動的に設定されます。

検出感度設定に使用されるクロマトグラム領域の開始点は、クロマトグラムの最初、またはクロマトグラムの最初から始まる積分禁止イベントの終了時間です。検出感度設定に使用されるクロマトグラム領域の終了点は、クロマトグラムの最後、またはクロマトグラムの最後に終了する積分禁止イベントの開始時間です。

クロマトグラムの最初または終了と重なっていない積分禁止イベントは、検出感度を設定する際には無視されます。

ヒント : この方法を使用した場合、検出感度は［結果の検出感度］フィールドにのみ表示されます。［解析メソッドの検出感度］フィールドは空欄のままです。右クリックメニューから［解析メソッドにコピー］を選択することによって、この値を［メソッドの検出感度］フィールドにコピーすることができます。

ピーク幅の値は必ず検出感度の値を決める前に設定します。ピーク幅の値が解析メソッドにない場合は、検出感度のボタンを使用できません。ピーク幅の値が指定されていない状態でこの方法を用いて解析を行うと、ソフトウェアはまず、ピーク幅の値を決め、次に検出感度値を決定します。両値は、自動的にそれぞれのツールバーのフィールドに表示されます。

• レビューのメイン画面の波形解析ツールバーまたは解析メソッド画面の［波形解析］タブで値を入力することによって検出感度値を設定します。

ピーク幅と検出感度のフィールド

ピーク幅および検出感度の値は［メソッド］フィールドおよび［結果］フィールドに表示されます。これらのフィールドはレビューのメイン画面の波形解析ツールバーにあり、［結果］フィールドに結果が報告されます。このメソッドのフィールドには解析メソッドのピーク幅および検出感度が示されます。［結果］フィールドには、生データが処理されたときに使われたピーク幅および検出感度が表示されます。

解析中にソフトウェアは［解析メソッドのピーク幅］および［解析メソッドの検出感度］フィールドの値を使用します。次に、これらの値を［結果のピーク幅］および［結果の検出感度］フィールドに保存します。この場合、［結果のピーク幅］と［結果の検出感度］フィールドは［解析メソッドのピーク幅］と［解析メソッドの検出感度］フィールドと同じです。［解析メソッドのピーク幅］および /または［解析メソッドの検出感度］が空欄の場合、ソフトウェアはデータ解析時に［結果のピーク幅］および /または［結果の検出感度］フィールドを決定します。

［解析メソッドのピーク幅］および /または［解析メソッドの検出感度］が空欄であるような解析メソッドを用いてデータを解析するときは、結果は異なる結果のピーク幅および結果の検出感度を用いて生成される可能性があります。

ヒント : 自動ピーク幅および自動検出感度決定を無効にしたい場合は、［システムの管理］>［表示］>［システムポリシー］の順にクリックし、［その他のポリシー］タブの［V3.0Xのピーク幅、検出感度の計算方法を使用］をクリックします (Empowerオンライン情報システムを参照 )。このシステムポリシーが有効な場合、［ピーク幅］ボタンと［検出感度］ボタン、解析メソッドウィザード、解析メソッド、および結果はすべてミレニアム

32のすべてのバー

ジョンと同じように機能します。

特徴と機能 3-9

ピーク波形解析

本節では、以下のピーク波形解析プロセスについて説明します。

• 未分離ピークの判定

• ベースラインの作成

• ピーク保持時間、高さ、および面積の計算

波形解析では、ピーク検出中に識別されたピーク開始およびピーク終了の値を使用してベースラインを決定し、分離されたピークと未分離ピークを波形解析します。

クロマトグラムが複雑な場合には、時間による解析イベントを使用してピークの波形解析を実行することができます。

関連項目 : ピーク波形解析理論の詳細については、3-19ページの「参考文献」を参照してください。

未分離ピークの判定

波形解析の最初のプロセスは、クロマトグラムの中の未分離ピークと分離したピークを区別することです。ソフトウェアは隣接するピーク間の距離を調べます。

隣接するピーク幅の比較：

開始終了開始終了

W1 W2

W3


未分離ピークの場合、従来法の波形解析アルゴリズムは以下のことを行います。

1. 隣接するピークの開始点と終了点の間の距離 (W3)を、隣接するピークの広い方 (W1またはW2)の幅と比較します。

2. 広い方のピークを決定します (W2 > W1)。

3. 広い方の隣接ピークの幅と、2つのピーク間の距離 (W3)との比率を、式W2/W3によって計算します。この比率が 3.0以上である場合は、これらのピークは未分離であるとみなされます。この比率が 3.0未満である場合は、これらのピークは分離しているとみなされます。

ヒント : ソフトウェアが 3.0の比率を使用する理由は、これによってピークの重なりを検出する確率が高まるからです。

未分離ピークを分割するために、ソフトウェアは以下のことを行います。

1. 最初のピークの開始点から最後のピークの終了点まで想定ベースラインを引きます。

2. 隣接する未分離ピークの間の谷のポイントを探し、想定ベースラインに最も近い生データポイントを谷ポイントとして選択します。谷の前のピークの終了点を谷の時間に合わせます。同様に、谷の後のピークの開始点を谷の時間に合わせます。

3. 谷から想定ベースラインに垂線を引き、それによってピークを分割します。

次の図で、波形解析アルゴリズムがクロマトグラム内の 2つの未分離ピークグループを全部で 6つのピークに分割する例を示します。

特徴と機能 3-11

分離ピークと未分離ピークの判定：

ベースラインの作成

クロマトグラム内で分離ピークと未分離ピークが識別されると、波形解析アルゴリズムは各ピーク (または未分離ピークのグループ )の開始から終了までベースラインを引きます。

［開始時間］および［終了時間］フィールドには、ピークの波形解析中に計算されたピークの開始時間と終了時間が示されます。［ベースライン開始］および［ベースライン終了］フィールドには、ピークを波形解析するために使用されたベースラインの開始時間および終了時間が示されます。［ベースライン開始］と［ベースライン終了］の値は、次のようになります。

• ベースライン分離されたピーク (ベースラインからベースラインまで )について波形解析が行われる場合は、ピークの［開始時間］および［終了時間］と同じになります。

• 未分離ピーク（ベースライン分離されていないピーク）について波形解析が行われる場合は、ピークの［開始時間］および［終了時間］と異なります。

ピーク 1垂直分割

想定ベースライン

ピーク 2

終了1開始2

谷ポイント

未分離ピークグループ1

終了2開始3

終了1開始2

終了1開始1 開始1 終了1

想定ベースライン開始1 終了3

未分離ピークグループ2ピーク 1

ピーク 1 ピーク 2 ピーク 3 ピーク 1ピーク 2


ベースライン作成：

波形解析の初期設定では、識別された各ピークに 2文字からなるラベルが付けられます。これは各ピークが、ベースライン上のポイント (B)またはベースラインより上の谷 (V)で開始または終了したことを示しています。ピークは 4タイプのベースラインの作成を行います。このラベルは、レビューの結果画面およびメイン画面の［ピーク］タブの［分割の種類］欄に表示されます。

ヒント : 指数スキムまたは接線スキム波形解析イベントを使用する場合は、さらにベースライン作成の種類が表示される場合があります (3-19ページの「波形解析ピークラベル」を参照 )。

ラベルの大文字と小文字は以下のことを示します。

• 大文字 Ø 波形解析がソフトウェアによって自動的に実行されたことを示します。

• 小文字 ― 波形解析が手動で実行されたことを示します。

例えば、ベースラインレベルが Bbであれば、ピーク開始もピーク終了もベースライン分離しており、開始は自動で、終了は手動で波形解析されたことを示します。

デフォルトの波形解析ピークラベル

ピークの開始点と終了点ラベル

ベースラインからベースライン BB

ベースラインから谷 BV

谷からベースライン VB

谷渡り VV

B B B B

1 2 3

V

V

Peak 1 = BV (Baseline-to-Valley)Peak 2 = VV (Valley-to-Valley)Peak 3 = VB (Valley-to-Baseline)

BB = Baseline-to-BaselineBB = ベースラインからベースラインピーク 1 = BV(ベースラインから谷 )ピーク 2 = VV(谷から谷 )ピーク 3 = VB(谷からベースライン )


ベースライン調整

想定ベースラインがクロマトグラム信号と交差する場合には、ソフトウェアは未分離ピークグループの中の最も低い点に合わせてベースラインの調整を行い、ピークグループを分離ピークまたは未分離ピークとして区別します。次に、ソフトウェアは新しいベースラインを再チェックし、ピーク開始点とピーク終了点を除き、ベースラインとクロマトグラフィム信号が交差しないことを確認し、ベースラインを必要に応じて再調整します。

ベースライン調整：

ピーク保持時間、高さ、および面積の計算

実際のベースラインが作成されたら、波形解析アルゴリズムは以下のことを行います。

1. 各ピークの保持時間、高さ、面積を計算します。

2. 波形解析された各ピークを、ユーザーが解析メソッドで指定した最小面積および最小高さのピーク除外基準と比較します。

��

��.��ベースライン交差シグナル

調整前のベースライン調整後のベースライン


保持時間と高さ

保持時間と高さを決定するために、ソフトウェアは以下のことを行います。

1. ピークの中の、作成されたベースラインからの最高点にあるデータポイントの保持時間を見つけます。

2. ピーク頂点と、ピーク頂点の 5つのデータポイント (最高点のデータポイントおよびそのポイントの前後の 2点ずつ )に、二次曲線をあてはめます。

3. あてはめた曲線の変曲点をピーク頂点に設定します。ピーク頂点の X座標の値が保持時間です。

4. 作成されたベースラインからピーク頂点までの Y座標の距離 (単位μV)として、ピーク高さを計算します。

ヒント : ソフトウェアがピーク頂点に曲線をあてはめられない場合は、ミレニアム V2.15以前のようにピーク頂点 (ベースラインから最高点にあるデータポイント )から保持時間および高さが計算されます。ソフトウェアにより、レビューの［ピーク］タブの［解析コード］欄に解析コード (I05、I06、I07、または I08)が追加されます。このコードは、ピーク頂点にうまく曲線をあてはめられなかった理由を示します。

次の図に、ピーク保持時間およびピーク高さの計算について示します。

ピーク保持時間とピーク高さの計算：

最高点計算されたピーク頂点（データポイント上ではない )

クロマトグラムの開始ピーク

開始

作成されたベースライン

計算されたピーク頂点

ピーク高さ

ピーク終了

保持時間

P1

P2

P3P4

P5


ヒント : ［システムの管理］>［表示］>［システムポリシー］の順にクリックし、［データ解析ポリシー］タブで［V2.XXの保持時間の計算方法を使用］を有効にすれば、ピーク頂点に二次曲線をあてはめないようにすることもできます (Empowerオンライン情報システムを参照 )。このシステムポリシーを有効にして結果を解析すると、結果の［解析コード］フィールドに解析コード I09が追加されます。このフィールドは、レビューの結果画面またはプロジェクト画面の［結果］タブの中のクロマトグラム［結果］テーブルに表示されます。

面積

アルゴリズムは、ピーク開始からピーク終了までの各生データポイント間の間隔ごとの面積を加算していくことによって総ピーク面積を計算します。作成されたベースラインより下の領域 (Ab)がピークの総面積 (At)から差し引かれます。これによって、作成されたベースラインより上のピーク面積 (Ap)が求められます。

ピーク面積の計算：

��,

��

��,

��

�

�

��

��

/��

/��

�0�1��2�2��

�0�1��2�2��

��"��%�

��(��3��

��"��%

��"��%�

ベースラインより下の差し引かれる面積（Ab）

ピーク開始


ピーク面積（At）

ピーク終了

A/D最小シグナル

ベースライン面積（Ab）

ピーク面積（Ap）

ピーク総面積（At）

ピーク開始


ピーク終了

A/D最小シグナル


ピーク除外基準

ソフトウェアがピークを波形解析する際、波形解析アルゴリズムは、ピークを、ユーザーが指定した波形解析ピーク除外基準と比較します。波形解析のピーク除外基準は、レビューの解析メソッド画面の［波形解析］タブ、レビューのメイン画面の［最小面積］ボタンおよび［最小高さ］ボタン、あるいは解析メソッド作成ウィザードによって設定することができます。この比較に基づいて、アルゴリズムはピークを認識するか、または除外します。波形解析の許容基準には、以下が含まれます。

• 最小面積

• 最小高さ

• 最小 5ポイントのピーク

最小面積

最小面積条件では、ピークリストに載せる解析されたピークに必要な最小面積 (単位 µV秒 )を定めます。解析されたピークの面積が設定された値より小さい場合は、そのピークはピークリストから削除されます。設定された値以上の面積があれば、そのピークは認識されます。

最小高さ

最小高さ条件では、ピークリストに載せる解析されたピークに必要な最小高さ (単位 µV)を定めます。解析されたピークの高さが設定された値より小さい場合は、そのピークはピークリストから削除されます。設定された値以上の高さがあれば、そのピークは認識されます。

ヒント : 最小面積および最小高さは、小さいピークをクロマトグラムから除外する場合に有効です。値を大きくすると、小さなピークをノイズとして除外してしまう可能性があり、値を小さくすると、ベースラインノイズをピークとして認識してしまう可能性があります。

5ポイントピーク除外5ポイントピーク除外はソフトウェアが 4つ以下のデータポイントしか含まないピークをピークリストから削除する方法です。

ヒント : 5ポイントピーク除外の基準はソフトウェアに組み込まれており、自動的に実行されます。これは、解析メソッドのパラメータではありません。

時間イベントの使用

Empowerは、ピークの検出と波形解析における時間イベントの使用をサポートしています。

ヒント : すべての時間イベントの概要、各時間イベントの説明については、Empowerオンライン情報システムを参照してください。


ピーク検出イベント

ソフトウェアは、正確にピークを検出するために次のような時間による検出イベントをサポートしています。

• 負ピークを検出

• 立ち上がり感度設定

• 立ち下がり感度設定

• ピーク幅設定

ヒント : 立ち上がり感度設定 (SL)、立ち下がり感度設定 (ST)、ピーク幅設定 (SPW)イベントは、検出された単一ピークや未分離ピーク以外のベースライン領域でのみ有効になります。このイベントが単一分離ピークまたは未分離ピーク内で開始される場合、このイベントは単一分離ピークまたは未分離ピークの終了から有効になります。

ピーク波形解析イベント

本ソフトウェアは、ピークの波形解析を正確にするために次のような時間ベースの解析イベントをサポートしています。

• 強制ベースライン (時間 )

• 強制ベースライン (ピーク )

• 水平ベースライン (時間 )

• 水平ベースライン (ピーク )

• 逆水平ベースライン (時間 )

• 逆水平ベースライン (ピーク )

• 谷渡り

• 強制垂直分割

• 強制ピーク検出

• 指数スキム

• 接線スキム




• 最大幅設定 (秒 )


波形解析ピークラベル

波形解析の初期設定では、クロマトグラムで識別された各ピークに 2文字からなるラベルが付けられます。これは各ピークが、ベースライン上のポイント (B)またはベースラインより上の谷 (V)で開始または終了したことを示しています。このラベルは、レビューの結果画面およびメイン画面の［ピーク］タブの［分割の種類］欄に表示されます。

ラベルが大文字になっている場合は、波形解析がソフトウェアによって自動的に実行されたことを示します。小文字は、波形解析が手動で実行されたことを示します。

参考文献

ピーク検出および波形解析の理論の詳細については、以下の参考書をご参照ください。

• 『Chromatographic Integration Methods』、Dyson, Norman著、The Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Cambridge、1990年

• 『Chemometrics: A Textbook』、 Massart, D.L. 他著、Elsevier Science Publishers, Amsterdam、1988年

• 『Signal Analysis』、Papoulis, Athanasios著、McGraw-Hill, New York、1977年

• Introduction to Modern Liquid Chromatography第 2版』、Snyder, L.R.および J.J. Kirkland著、Wiley-Interscience、New York、1979年

クロマトグラム上の波形解析ピークラベル：

ピークの開始点と終了点ラベル

ベースラインからベースライン BB

ベースラインから谷 BV

指数から指数 EE

指数から谷 EV

接線から接線 TT

接線から谷 TV

谷からベースライン VB

谷から指数 VE

谷から接線 VT

谷渡り VV

参考文献 3-19

4 サンプル成分のピークの同定

および定量

この章では、ピークの定量方法について説明します。

特徴と機能

Empowerは、ピークを照合および定量することにより、未知成分の同定と定量を行います。

• ピークの同定 ― 既知の標準ピークの保持時間 (RT)に対する未知ピークの保持時間の一致度を調べるプロセスです。

• 定量 ― 目的ピークの波形解析結果と、既知ピーク (標準試料 )の濃度と波形解析結果によって導出した検量線を使用して、目的ピークの濃度を計算するプロセスです。

ピークの同定

ピークの同定を行う際、ソフトウェアは未知のピークに最も良く一致する成分を、解析メソッドの［成分］テーブルから選択します。このために、ソフトウェアは以下のことを行います。

1. 成分の検量線の保持時間 (RT)±成分の保持時間幅として定義される時間幅、ならびにピーク同定タイプを使用してピークの同定を行います。

2. 解析メソッドに定義された成分の保持時間 (RT)と各未知ピークの差を計算し、成分の保持時間幅にあるピークを照合します。

3. この差を用いて、成分ピークに最も一致する未知のピークを選択します。

内容：


特徴と機能 4-1

ピークの同定 4-1

定量 4-5

検量線の種類 4-21

参考文献 4-45

特徴と機能 4-1

同定の順位

未知のピークを成分と一致させるとき、ソフトウェアはピーク同定タイプの階層体系を使用します。ソフトウェアは、各成分をその保持時間幅にある未知のピークと照合します。未知のピークが複数の成分と一致する場合、ソフトウェアはまず溶出位置、次にピークサイズ、最後は保持時間によって当該ピークに最も適合する成分を決定します。

一致の程度の計算

ピーク同定タイプが近接ピークや負の近接ピークの場合、ソフトウェアは差を「成分の保持時間－未知のピークの保持時間」の絶対値として計算します。それ以外のピーク同定タイプの場合は、一致の程度が 0(完全に一致 )または一致しないと判定されます。

次の条件のうちの 1つでも当てはまる場合、ピークは完全に一致していると見なされます。

• 保持時間幅の中でピークの溶出位置が、1番目、2番目、3番目、4番目、5番目または最後に対応する場合

• 保持時間幅の他のピークに対してピークの大きさが次のいずれかと一致する場合

– 最大面積または最大高さ

– 最小面積または最小高さ

– 最大幅 (GPCVデータのみ )

• 対象ピークと成分の保持時間の差が 0.0である場合

最適な同定ピークの選択

同定プロセスの次のステップでは、複数の未知のピークと一致する成分があるかどうか、あるいは、複数の成分と一致する未知のピークがあるかどうかを確認します。最初の成分同定プロセスからは次の 3通りの結果が得られます。

• 単一成分に対して単一ピークが一致する

• 単一成分に対して複数ピークが一致する

• 複数成分に対して単一ピークが一致する

単一成分に対して単一ピーク

成分の保持時間幅が重なり合わず、各保持時間幅に未知のピークが 1つしかない場合、ピークを一定させるプロセスは単純です。この状況では、ピーク同定タイプや一致の程度 (差の計算 )は必要ありません。

ヒント : ピーク同定タイプの 2番目、3番目、4番目、5番目は、保持時間幅のピーク数がそれぞれ、常に 2、3、4、5よりも少ない場合は使用しないでください。

4-2 サンプル成分のピークの同定および定量

単一成分に対して複数ピーク

成分の保持時間幅に未知のピークが複数存在する場合には、ソフトウェアは一致の程度を使用してピーク同定タイプに最も良く適合するピークを選択します。

• 2つのピークが単一成分と一致する場合、ソフトウェアは一致の程度が最大のピークを選択します。もう一方のピークは、次に近い成分として同定されます。

• 2つのピークが単一の成分と同程度一致する場合、ソフトウェアは最初のピークを選択します。2番目のピークは、次に近い成分として同定されます。

複数成分に対して単一ピーク

同じピークが 2つ以上の成分と一致する場合、ソフトウェアは一致しているピークのうち一致の程度が大きい方の成分を選択します。2つの成分とピークとの保持時間の差が全く同じ場合には、選択は行われず、未知のピークは同定されません。ソフトウェアは、レビューのメイン画面と結果画面の［ピーク］タブにその成分のピークタイプを「未検出」として表示します。また、未同定ピークについて［解析コード］フィールドに Q04コードが表示され、成分が未検出である理由が示されます。

保持時間および保持時間幅のシフト

ピークが保持時間幅の外にシフトしてしまうために同定ができない場合は、保持時間幅を拡大してください。保持時間幅を拡大するのが困難で、拡大することによって誤同定をするようであれば、RTレファレンスピークを使用するか、保持時間の更新パラメータを使用します。

RT レファレンス［RTレファレンス］フィールドを使用すると、RTレファレンスとして定義されたピークがクロマトグラムで検出される場所を基準にして、成分の保持時間を一時的に調整することができます。成分の保持時間は、RTレファレンスピークのシフトと同じパーセンテージで、同じ方向に一時的にシフトします。(RTレファレンスピークは、検量線中のレファレンスピークの保持時間と、実際のクロマトグラム中のレファレンスピークの保持時間を比較して決められます。)ソフトウェアはこの調整された保持時間を使用して、クロマトグラムの未知のピークを同定し、次の式を用いて成分の調整保持時間を計算します。

RTリファレンスピークは、常にクロマトグラムに存在し、他のピークとはっきりと区別され、保持時間が他の成分と共にシフトするものを使用してください。この特性を持つピークであれば、ほとんどの場合、特定のクロマトグラムに影響を与える保持時間シフトを補正することができます。

RT調整された=RT検量線中の成分•RT調整されたレファレンスピーク

RT検量線中の成分レファレンスピーク

ピークの同定 4-3

保持時間の更新

［保持時間の更新］フィールドは検量線の保持時間を調整するため、ソフトウェアが未知のピークを同定するために使用する保持時間に影響を与えます。これは、保持時間のシフトやドリフトが問題になる場合に、クロマトグラムのピークの実際の保持時間をより正確に反映したい場合に行われます。

通常、ピークの同定時、ソフトウェアは解析されたピークの保持時間を検量線の保持時間と比較し、また解析メソッドの成分タブの成分にリストされた保持時間幅とも比較します。［保持時間の更新］を選択すると、ソフトウェアは前回のクロマトグラムの解析時に実際に成分が検出された場合の保持時間を使用します。クロマトグラムを引き続き解析する場合、(選択されている保持時間の更新オプションによって )クロマトグラムを処理するたびに、ピークの同定に使用する新しい保持時間を保存することができます。更新された保持時間は、その成分の検量線に保存され、検量線画面の［時間］フィールドに表示されます。保持時間の更新機能は、レビュー画面の［成分］タブにリストする保持時間には影響を与えません。

［保持時間の更新］の選択肢は、以下のとおりです。

• ［しない］ ― 検量線の保持時間は更新されません。

• ［置換］ ― 検量線の保持時間は、サンプルの種類にかかわらずクロマトグラムの検量線作成や定量が行なわれるたびに更新されます。クロマトグラムの検量線作成や定量が行なわれる場合、保持時間幅でピークが同定されると、ソフトウェアは (成分テーブルではなく )検量線の保持時間を、新しく求めた保持時間で置き換えます。

• ［標準の置換］ ― 検量線の保持時間は、標準試料の検量線作成が行なわれる場合にのみ更新されます。クロマトグラムの検量線作成が行なわれる場合、保持時間幅で標準ピークが同定されると、ソフトウェアは (成分テーブルではなく )検量線の保持時間を、新しく求めた保持時間で置き換えます。

• ［平均］ ― 検量線の保持時間は、サンプルの種類にかかわらずクロマトグラムの検量線作成や定量が行なわれるたびに更新されます。クロマトグラムの検量線作成や定量が行なわれる場合、保持時間幅でピークが同定されると、ソフトウェアは (成分テーブルではなく )検量線の保持時間を、新しく求めた保持時間で平均化します。

• ［標準の平均］ ― 検量線の保持時間は、標準試料の検量線作成が行なわれる場合にのみ更新されます。クロマトグラムの検量線作成が行なわれる場合、保持時間幅で標準ピークが同定されると、ソフトウェアは (成分テーブルではなく )検量線の保持時間を、新しく求めた保持時間で平均化します。

平均化オプションを使用して保持時間を更新する場合、ソフトウェアは以下の式を使用します。

ここで、

RTc = 検量線の保持時間

n =値がこれまでに平均化された回数

保持時間の更新は粗調整であり、以下の場合にのみ使用してください。

RTc=（検量線からの平均時間 × n +新しい保持時間）

n+1


• ピークの保持時間が一方向にシフトしている場合

• 成分ピークの保持時間幅を大きくしても、あるいは保持時間レファレンスピークを使用しても、シフト全体を補正することができない場合

ヒント : ［置換］と［平均］オプションは、誤って同定する可能性があるようなピークが未知試料にない場合にのみ使用してください。

定量

以下の方法によって定量を行うことができます。

• 検量線の使用

• 検量線の非使用

• サンプル重量と希釈率の使用

• 注入量の使用

• ピーク面積および高さ以外のレスポンスの使用

関連項目 : 定量に際してソフトウェアが使用するプロセスの詳細については、4-45ページの「参考文献」を参照してください。

検量線による定量

Empowerは、分析システムが取り込んだ解析済みの標準試料を使用して検量線を作成します。標準試料の分析をする際には、以下の情報を指定する必要があります。

• サンプルの分析、サンプルセットメソッド編集、またはサンプルの変更画面のサンプルテーブルに注入量を入力する。

• 解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブまたはサンプルの分析やサンプルの変更画面の［成分の編集］に成分名および濃度または溶液濃度を入力する。

クロマトグラムの解析時には、ソフトウェアは検出器信号に基づいて各ピークのレスポンスを計算します。このレスポンスは、以下のとおりです。

• ピーク面積

• ピーク高さ

• 別のピーク値 (カスタムピーク値を含む )

検量線用標準試料が解析されると、ソフトウェアは成分テーブルに示されている各成分の検量線を作成します。検量線には、以下の情報が表示されます。

• 絶対検量線法の場合は、レスポンス (［定量の基準］フィールド )対濃度または溶液濃度 (［濃度の種類］フィールド )

• 内部標準法の場合は、内部標準試料の濃度または溶液濃度を乗じたレスポンス比対濃度または溶液濃度 (［濃度の種類］フィールド )

検量線の形状は、ユーザーが選択した適合タイプに基づきます (4-21ページの「検量線の種類」を参照 )。検量線の適合タイプには以下の 3つがあります。

定量 4-5

• 直線 ― 必ず直線になります。

• 非直線 ― 多点検量線への様々な適合法を選択することができます。

• 原点通過 ― 検量線が必ず原点を通るようにすることができます。

ソフトウェアは、解析メソッド画面の［成分］タブでユーザーが指定した平均ボックスの設定に基づいて、個々のまたは平均化された点を使用して検量線を作成し更新します。

サンプルの解析時には、ソフトウェアは以下を順に実行します。

• クロマトグラム中で波形解析されたピークの保持時間と、検量線の成分の保持時間を照合します。

• 一致したピークのレスポンスを、対応する成分の検量線に適用します。

定量をする際には、ソフトウェアは未知試料の濃度や溶液濃度を検量線から計算します。サンプルのレスポンスを用いて、濃度や溶液濃度に対応した X値を見つけます。その後、レビューのメイン画面および結果画面のピークタブに最終的な成分の濃度を表示します。

検量線を使用しない定量

検量線を作成しないで定量したい場合には、％面積および％高さを基にサンプル中の各ピークの相対濃度が計算されます。ピークの面積パーセントと高さパーセントは、波形解析した全ピークの総面積や全高さに対する各波形解析ピークの相対パーセントとして計算されます。

サンプル重量と希釈率を使用する定量

サンプル重量と希釈率は、標準および未知成分の濃度と溶液濃度を調整するために使用されます。これらの 2つの値を使用して、以下のような要因のために生じる差を補正します。

• 希釈率が変更された

• 初期サンプル重量または容量が異なる

サンプル重量と希釈率を、サンプルの分析画面、サンプルセットメソッドの編集画面、またはサンプルの変更画面のサンプルテーブルに、標準試料ごと、または未知試料ごとに入力します。通常、サンプル重量および /または希釈率は標準試料または未知試料の両方ではなく、いずれかのために使用されます。


サンプル重量

一般的に、サンプル重量はシステムに注入された成分の量の元のサンプル全量に対する比を計算するためにサンプルで使用されます。

検量線を作成する際に、ソフトウェアは、入力された標準試料の成分の濃度または溶液濃度に、ユーザーが入力したサンプル重量値を乗じて、標準試料の濃度および溶液濃度を計算します。

定量をする際に、ソフトウェアは検量線から読み取った濃度や溶液濃度 (［濃度の種類］フィールド )をサンプル重量値で割り、未知試料の濃度および溶液濃度を計算します。

例えば、秤量値が 0.5mgのサンプルで全サンプル重量と比較した成分の濃度をソフトウェアで決定し報告書にしたい場合、未知試料のサンプル重量を 0.5と入力してください。ソフトウェアは検量線から成分濃度を定量し、サンプル重量でこの値を割り、全サンプル濃度に対する成分の濃度の最終比を算出します。この濃度は希釈率 100を使うか、カスタムフィールドで濃度を 100倍する式を使用するかのいずれかによってパーセンテージに変換できます。

サンプル重量を使用する際は、この値が報告書にある成分の濃度または溶液濃度と単位が同じであることを確認してください。例えば、サンプルが 1.44mgと秤量され、標準試料濃度の単位が µgであれば、サンプル重量は 1440(µg)を使用しなければなりません。

希釈率

［希釈率］フィールドは、通常、注入する前にサンプル (標準試料、未知試料またはコントロール試料 )を希釈する場合に使用されます。このとき、元になる希釈前のサンプル中の分析対象物の濃度が報告書に明記されます。直接カラムに注入される希釈前のサンプルが検量線の範囲から外れるような場合に使用されます。サンプルの希釈率をサンプルの分析画面の［サンプル］テーブルに入力し、通常の注入量でサンプルを注入する必要があります。

検量線を作成する際に、ソフトウェアは入力された標準試料の成分の濃度または溶液濃度をユーザーが入力した希釈率で割り、標準試料の濃度および溶液濃度を計算します。

定量をする際に、ソフトウェアは検量線から読み取った濃度や溶液濃度 (X値 )に希釈率を掛けて、未知試料の濃度および溶液濃度を計算します。

例えば、単一成分 100 µgを含む標準サンプルで 1:10の希釈を行う場合、成分の濃度を、［成分の編集］または解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブで 100 µg(元の濃度、希釈されていない量 )と入力し、希釈率に 10を入力します。ソフトウェアがこの標準試料の検量線を作成する際、指定した濃度 100 µgを用い、指定した希釈率 10でそれを割ります。そして、結果の濃度を 10 µg(カラムに注入された濃度 )と表示します。この値も検量線にプロットされます。

同じサンプルが未知試料だった場合、成分の量は入力できませんが、希釈率は 10のままになります。ソフトウェアが未知試料を定量すると、検量線から濃度 10 µgが読み取られるので、その値に 10(希釈率の値 )をかけた結果として、濃度 100 µg(希釈前の濃度 )が求められます。

標準試料の希釈液を分析している場合は、希釈率と、希釈前の元の標準試料の量を指定します。未知試料の希釈液を分析している場合は、希釈率を指定すれば、ソフトウェアによってレポートされる濃度および溶液濃度が希釈前の元の試料の濃度および溶液濃度となります。

定量 4-7

希釈率のフィールドを使用すれば、注入量の調整によって希釈率を補正する必要がなくなります。

ヒント : 注入量を調整することによって、サンプルの希釈率を補正することができます。誤ってサンプルや標準試料を 10倍に希釈した場合は、［希釈率］フィールドに 10と指定する代わりに通常の注入量の 10倍の量を注入することができます。標準試料の場合は、標準試料成分に希釈前の濃度も指定する必要があります。未知試料の場合は、希釈率を指定せず、注入量を 10倍に調整します。ソフトウェアは、成分の希釈前の量を定量します。通常の注入量を使用していたところにこの注入量が増えたとすると、この量は本来の 10倍になります。標準サンプルでも未知試料でも、注入量によって希釈率を補正する場合は、［希釈率］フィールドで値を調整しないでください。

注入量を使用する定量

ソフトウェアは、標準試料および未知試料に対して濃度と溶液濃度の両方を計算します。そのため、ユーザーは自分にとって意味のある方の数値を選んで報告書に印刷することができます。

ソフトウェアは、ユーザーが入力する標準試料成分の量の単位が濃度であるか、溶液濃度であるかを、解析メソッド画面の［成分］タブの［サンプル濃度の種類］リストで選択された内容によって判断します。濃度を選択するか、溶液濃度を選択するかによって、ソフトウェアは以下のように成分量を解釈します。

• ［濃度］ ― ソフトウェアは (サンプルの変更画面の［成分の編集］、サンプルの分析画面の［成分の編集］、または解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブで )入力する成分の量を濃度と解釈します。ソフトウェアは指定された濃度を注入量 (µL)で割ることによって、対応する溶液濃度を算出します。

• ［溶液濃度］ ― ソフトウェアは (サンプルの変更画面の［成分の編集］、サンプルの分析画面の［成分の編集］、または解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブで )入力する成分の量を溶液濃度と解釈します。ソフトウェアは指定された溶液濃度に注入量 (µL)を掛けることによって、対応する濃度を算出します。

標準試料成分の量の単位を濃度と指定しても、溶液濃度と指定しても、検量線は標準試料の濃度と溶液濃度のどちらを使っても作成できます。解析メソッド画面の［成分］タブで入力する濃度の種類によって、検量線はレスポンス対濃度かレスポンス対溶液濃度かが決定されます。

検量線がレスポンス対濃度のプロットである場合 (［濃度の種類］フィールドを［濃度］に設定した場合 )、ソフトウェアは成分のレスポンスを用いて検量線から直接濃度を求めることによって未知試料を定量します。その後、ソフトウェアは計算された濃度を注入量 (µL)で割ることによって対応する成分の溶液濃度を求めます。

ヒント : ［濃度の種類］フィールドを［濃度］に設定した場合、未知試料の計算された溶液濃度はサンプルの注入量の影響を受けますが、計算された濃度は影響を受けません。

同様に、検量線がレスポンス対溶液濃度のプロットである場合 (［濃度の種類］を［溶液濃度］に設定した場合 )、ソフトウェアは成分のレスポンスを用いて検量線から直接溶液濃度を求めることによって未知試料を定量します。その後、ソフトウェアは計算された溶液濃度に注入量 (µL)を掛けることによって対応する成分の濃度を求めます。


ヒント : ［濃度の種類］フィールドを［溶液濃度］に設定した場合、未知試料の計算された濃度はサンプルの注入量の影響を受けますが、計算された溶液濃度は影響を受けません。

成分の単位 (µg、µg/µLなど )を指定するとき、指定した単位がそのまま表示されるので注意してください。成分の定量値が注入量に影響される場合は、単位が適切であることを確認してください。ソフトウェアは、注入量の単位として必ずμLを使用します。

ピーク面積および高さ以外のレスポンスを使用する定量

このソフトウェアでは、レスポンスとして面積、高さ、％面積、％高さを使用することができます。さらに、データ型が実数であるピークカスタムフィールドをレスポンスとして使用することができます。ただし、以下を使用しているカスタムフィールドは除きます。

• 時間フィールド

• ベースラインフィールド

• レスポンス

• 濃度

• 溶液濃度

• ％濃度

解析メソッド画面の［成分］タブの［定量の基準］フィールドで適切な選択を行います。

絶対検量線法および内部標準法による定量

成分濃度の計算では、以下のいずれかの定量法を使用します。

• 絶対検量線法

• 単独の標準試料と未知試料を用いた内部標準法

• 単独の標準試料や未知試料を用いない内部標準法による定量 (通常、ガスクロマトグラフィで使用されます )

本節では、これらの定量方法について簡単に説明します。

関連項目 : ソフトウェアが計算する濃度と溶液濃度の算出方法については、4-21ページの「検量線の種類」を参照してください。

定量 4-9

絶対検量線法

絶対検量線法による定量は、成分ピークの検出器レスポンスを検量線に適用することにより、成分の濃度と溶液濃度を決定します。検量線は、別々に取り込み・解析された標準試料のセットから作成されます。

ヒント : 標準試料のセットには、標準が 1つしか含まれていない場合もあります (一点検量線法と呼ばれます )。

また、以下の基準も必要となります。

• サンプルの分析画面でサンプルローディング時に［標準試料の注入］機能を使用することによって、あるいは (サンプル取り込み後に )サンプルの変更画面で［サンプルの種類］に［標準試料］を指定することによって、標準サンプルを「標準試料」として指定する必要があります。

• サンプルの分析画面でサンプルローディング時に［未知試料の注入］機能を使用することによって、あるいは (サンプル取り込み後に )サンプルの変更画面で「サンプルの種類］に［未知試料］を指定することによって、未知試料を「未知試料」として指定する必要があります。

• 解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブで、あるいはサンプルの分析やサンプルの変更画面の［成分の編集］で、各標準試料成分の成分名と濃度または溶液濃度を指定する必要があります。

• レスポンスは検量線の Y値です。解析メソッド画面の［成分］タブの［定量の基準］フィールドを選ぶことによって、Y軸として使用するパラメータを選択します。

• 検量線の X値は、濃度、溶液濃度、またはカスタムフィールドです。解析メソッド画面の［成分］タブの［濃度の種類］フィールドで X軸を選択します。

データ型が実数であるピークカスタムフィールドを X値として使用することができます。ただし、以下を使用しているカスタムフィールドは除きます。

– 時間フィールド

– ベースラインフィールド

– レスポンス

– ％濃度

• 絶対検量線法による定量では、標準試料成分の検出器レスポンス対標準試料成分の濃度や溶液濃度をプロットすることによって各検量線を作成することができます。

• 解析メソッド画面の［成分］テーブルの中で、検量線に使用される検量線次数を定義します。

一点の絶対検量線法による定量を行う際には、ソフトウェアは以下を行います。

1. ピークの照合によって、標準試料注入の成分ピークを同定します。

2. それぞれの標準試料ピークのレスポンスおよび濃度または溶液濃度を決定し、その成分の検量線の検量点としてこれらの 2つの値をプロットします。

次の図のようなクロマトグラムが与えられた場合、検量点を決定するのに使用する値は、この図の下にある表の溶液濃度およびレスポンス値になります。


絶対検量線標準試料のクロマトグラム

ヒント : 下表では、［濃度の種類］は溶液濃度に設定されています。

3. ［成分］テーブルの名前欄に示されている各成分の検量線 (レスポンス対濃度 )を作成します。

4. 以下のステップを順に実行して、作成された検量線と比較して未知試料を定量します。

• 成分テーブルの成分と試料の保持時間を照合し、各未知ピークを識別します。

• サンプルピークのレスポンスと注入量を使用して、成分の検量線から各未知ピークの濃度および溶液濃度を計算します。

• その後、濃度および溶液濃度はサンプルの読み込みテーブルで入力された［サンプル重量］および［希釈率］フィールドで調整されます。計算された濃度と溶液濃度は、レビューのメイン画面および結果画面の［ピーク］タブに表示されます。

次の図で、ピーク成分 A、B、および Dの定量について説明します。各検量線は、一点検量線 (原点を通る直線 )を使用しています。

絶対検量線法における標準試料のピーク値：

成分名

定量の基となるレスポンス(ユーザー指定のY値 )

標準試料の濃度または溶液濃度(ユーザー指定のX値 )

成分面積成分高さレスポンス

A 面積 20 µg/µL 10000 900 10000

B 高さ 100 µg/µL 12000 1100 1100

D 高さ 5 µg/µL 8000 700 700

Peak A

Peak B

Peak Dピーク A

ピーク B

ピークD

定量 4-11

絶対検量線の標準成分の検量線 (一点検量線、溶液濃度 )

ヒント : 多点検量線を使用する場合も、ソフトウェアは同様のプロセスを実行します。

レスポンス

10000μV Std

サンプルレスポンス

サンプル溶液濃度

20μg/μL Std

ピークA

レスポンス

1100μV Std



100μg/μL Std

ピークB

レスポンス

700μV Std



5μg/μL Std

ピークD

0

0

0


単独の標準試料と未知試料による内部標準法

この方法は、回収標準試料として標準試料と未知試料の両方に加えられる内部標準試料を使用します。この方法は、サンプル調製時のロスを補償するために一般的に使用されます。

この方法は、内部標準試料を含む標準試料のセットに対するレスポンスを計算することによって、最初に作成された検量線にレスポンスを適用して成分の濃度と溶液濃度を決定します。レスポンスは、成分ピークと内部標準試料ピークのレスポンスから計算されます。レスポンスのタイプは、解析メソッド画面の［成分］テーブルの［定量の基準］フィールドで選択します。

従来の内部標準法では、成分と内部標準試料のレスポンス比に対して成分と内部標準試料の濃度比または溶液濃度比をプロットし、検量線を作成しました。このソフトウェアは、レスポンス比に内部標準試料の X値を掛けたものに対して成分量をプロットすることによって作成された同様の検量線を使用します。このとき、X値は解析メソッド画面の［成分］テーブルで設定された濃度または溶液濃度になります。

従来のレスポンス比対濃度比 ( または溶液濃度比 )のプロット：

レスポンス比に内部標準試料の濃度 ( または溶液濃度 ) を掛けたプロット：

0

レスポンス標準試料

レスポンス内部標準試料

濃度標準試料

濃度内部標準試料

0

濃度標準試料

レスポンス標準試料

レスポンス内部標準試料濃度内部標準試料•

定量 4-13


• サンプルの分析画面でサンプルローディング時に［標準試料の注入］機能を使用することによって、あるいは (サンプル取り込み後に )サンプルの変更画面で［サンプルの種類］に［標準試料］を指定することによって、標準サンプルを「標準試料」として指定する必要があります。

• サンプルの分析画面でサンプルローディング時に［未知試料の注入］機能を使用することによって、あるいは (サンプル取り込み後に )サンプルの変更画面で「サンプルの種類］に［未知試料］を指定することによって、未知試料を「未知試料」として指定する必要があります。

• 解析メソッド画面の［スロースピーク濃度］タブで、あるいはサンプルの分析やサンプルの変更画面の［成分の編集］で、各標準試料成分の成分名と濃度または溶液濃度を入力する必要があります。

• 検量線の X値は、濃度または溶液濃度です。解析メソッド画面の［成分］タブの［濃度の種類］フィールドで X軸として濃度または溶液濃度を選択します。

• 解析メソッド画面の［成分］テーブルの中で、検量線に使用される検量線次数を定義します。

内部標準法による定量 (単独の標準試料と未知試料を使用 ) を行うためには、ソフトウェアは次のことを行います。

1. ピークの照合によって、クロマトグラムの中の成分ピークを同定します。

2. 標準試料および内部標準試料のピークのレスポンスおよび濃度または溶液濃度を決定します。ソフトウェアは、各標準試料のピークのレスポンス比を計算し、その値に内部標準試料の濃度または溶液濃度を掛けます。その結果として得られたレスポンス値は、該当する成分の検量線に標準試料ピークの濃度または溶液濃度に対してプロットされます。

次の図のような標準クロマトグラムの場合、検量点を決定するのに使用する数値は、図の下にある表の溶液濃度およびレスポンス値になります。


内部標準試料のクロマトグラム：

ヒント : 下表では、［濃度の種類］は濃度に設定されています。

3. 解析メソッド画面の［成分］テーブルの［名前］フィールドの中に示されている各成分の検量線 (レスポンスに内部標準試料の濃度を乗じたもの (Y)、濃度または溶液濃度(X))を計算します。

標準試料のピーク値、内部標準試料の検量線作成 (単独の標準試料と未知試料を使用 ) ：

成分名

定量の基となるレスポンス(ユーザー指定の Y値 )

標準試料の濃度または溶液濃度(ユーザー指定のX値 )

成分面積レスポンス

A 面積 20mg 10000

B 面積 100mg 12000

C(内標準 ) 面積 10mg 6000 N/AD 面積 5mg 8000

Peak A

Peak B

Peak CPeak D

InternalStandard Peak

ピーク A

ピーク B

ピークDピークC

内部標準試料ピーク

面積C面積A = 10000

6000 ×10 = 16.67

面積C面積B = 12000

6000 ×10 = 20.0

面積C面積D = 8000

6000 ×10 = 13.33

定量 4-15

4. 以下のステップを順に実行して、作成された検量線と比較して未知試料を定量します。

• ［成分］テーブルの成分と試料の保持時間を照合し、各未知ピークを識別します。

• ピークレスポンスを内部標準試料のレスポンスで割り、同定された各ピークのレスポンス比を計算します。

• このレスポンス比に各同定ピークの内部標準試料の濃度または溶液濃度を掛けてレスポンスを計算します。

• サンプルのピークレスポンスおよび注入量を用いて成分の検量線から各サンプルピークの濃度または溶液濃度を計算します。

• サンプルの分析やサンプルの変更画面の［サンプル］タブで指定する［サンプル重量］と［希釈率］フィールドで、濃度および溶液濃度を調整します。計算された濃度と溶液濃度は、レビューのメイン画面および結果画面の［ピーク］タブに表示されます。

次の図で、ピーク成分 A、B、および D(内部標準試料 Cは示しません )の定量について示します。各検量線は、一点検量線を使用しています。


内部標準試料を用いた検量線 (一点検量線、濃度 )

ヒント : 多点検量線を使用する場合も、ソフトウェアは同様のプロセスを実行します。

レスポンス


レスポンスサンプル

サンプル 20μg Std

ピークA

0

レスポンス

レスポンス








16.67 Std

20.0Std

13.38Std

（成分の読み込みテーブルから）



サンプル

サンプル

100μg Std

5μg Std

濃度

濃度

濃度

ピークB

ピークD

0

0

定量 4-17

単独の標準試料や未知試料を用いない内部標準法による定量 (RF内部標準法 )

この方法は、ガスクロマトグラフィでよく使用されます。すべてのサンプルには、定量する未知成分とは異なる時間に溶離する標準試料成分を 1種類以上使用してスパイク波形を示します。各クロマトグラムが解析される際には、未知のサンプルタイプとして扱われます。ソフトウェアは、検量線の係数ではなく、標準試料成分のレスポンスファクタ (RF)を計算し、そのレスポンスファクタを使用して未知成分を定量します。


• サンプルの分析画面でサンプルローディング時に［RF内部標準試料の注入］機能を使用することによって、あるいは (サンプル取り込み後に )サンプルの変更画面で［サンプルの種類］に［RF内部標準］を指定することによって、すべてのサンプルを RF内部標準試料として指定する必要があります。

• 検量線の X値は (解析メソッドの［成分］タブの［濃度の種類］フィールドで指定されている )濃度または溶液濃度のいずれかです。

• 解析メソッドの［成分］タブに、標準試料成分の成分名を入力する必要があります。

• 解析メソッドの［スロースピーク濃度］タブで、あるいはサンプルの分析やサンプルの変更画面の［成分の編集］で、各標準試料成分の濃度または溶液濃度を指定する必要があります。

• 解析メソッドの［成分］タブに、未知成分の成分名を入力することができます (オプション )。

• 解析メソッドの［成分］タブで名前が指定された未知成分は、一般的に、検量線レファレンスピークによって求められた標準試料成分のレスポンスファクタ (RF)を使用して定量します。ただし、スロースピークによって定量することもできます。

• 解析メソッドの［成分］タブで名前が指定されていない未知成分は、スロースピークを使用して定量します。

ヒント : 名前を付けた、あるいは名前を付けていない成分を定量する際に、どの標準試料成分のレスポンスファクタを使用するかを指定するには、［スロースピーク定量］フィールドを使用します。標準試料ピークをスロースピークとして使用するには、解析メソッドの［成分］タブのスロースピークがある列で、［スロースピーク定量］フィールドをチェックします。このスロースピークを使用する場合のクロマトグラムの領域を［スロースピーク開始］フィールドと［スロースピーク終了］フィールドで定義します。これらのフィールドを使用すると、必要に応じて、クロマトグラムの別の領域に別のスロースピークを使用することができます。スロースピークの開始とスロースピークの終了の間で検出されるピークは、その濃度や溶液濃度を決定する際に、このスロースピークのレスポンスファクタを使用します。

ヒント : 名前付き成分の定量時に使用する標準試料成分のレスポンスファクタを指定するには、［検量線レファレンス］フィールドを使用します。検量線レファレンスを使用するには、解析メソッドの［成分］タブの名前付きの未知成分の列で、［検量線レファレンス］フィールドに適切な標準試料成分の名前を入力します。

• レスポンスファクタは、解析メソッドの［成分］タブに定義する［定量の基準］と［濃度の種類］(濃度または溶液濃度 )を使用して計算されます。


内部標準法による定量 (単独の標準試料と未知試料を使用しない ) を行うためには、ソフトウェアは次のことを行います。

1. ピークの照合によって、標準試料注入の成分ピークを同定します。

2. 次式を使用して、各標準試料成分のレスポンスファクタを決定します。

ここで、

RF = レスポンスファクタ

Y値 = ソフトウェアによって計算される標準試料成分のレスポンス

X値 = 標準試料成分の濃度または溶液濃度

次の図のような RF内部標準試料のクロマトグラムが与えられた場合、レスポンスファクタを決定するために使用する数値は、図の下にある表の濃度およびレスポンス値になります。

ヒント : このタイプの内部標準法を使用すると、検量線は作成されません。

RF内部標準試料のクロマトグラム：

RF = Y値X値

ピーク A

ピーク B

ピークCピークD

未知成分

未知成分未知成分

標準試料成分

定量 4-19

ヒント : 下表では、［濃度の種類］は濃度に設定されています。

3. 次の式を使用して未知成分の濃度（または溶液濃度）を決定するには、各未知成分のレスポンスと適切なレスポンスファクタを使用します。

ここで、

RF =標準試料ピークのために計算されるレスポンスファクタ値

Y値 =ソフトウェアによって計算される未知成分のレスポンス

X値 = 成分の濃度または溶液濃度

次の表の未知成分の濃度を決定するために使用する値は、この前の表で求められたレスポンスファクタと、次の表の未知成分の値です。

ヒント : 下表では、ソフトウェアによって設定された［濃度の種類］は濃度です。

標準試料のピーク値、 RF内部標準試料の検量線作成 (単独の標準試料と未知試料を使用しない ) ：

成分名定量の基となるレスポンス

標準試料の濃度または溶液濃度(ユーザー指定の X値 )

成分面積 ( レスポンス、 Y値 ) レスポンスファクタ

C(標準試料成分 ) 面積 10mg 6000

未知成分値、 RF内部標準試料の検量線作成 (単独の標準試料と未知試料を使用しない ) ：

成分名定量の基となるレスポンス

成分面積( レスポンス、 Y値 )

未知成分の濃度または溶液濃度 ( ソフトウェアによって設定された X値 )

A(未知成分 ) 面積 10000

mg

B(未知成分 ) 面積 12000

mg

D(未知成分 ) 面積 8000

mg

600010

------------- 600=

X値 = Y値RF

10000600

---------------- 16.667=

12000600

---------------- 20=

8000600

------------- 13.333=


検量線の種類

このソフトウェアは、多点の標準試料を使用する場合の絶対検量線法および内部標準法の検量線に適合する種々の検量線をサポートします。検量線の適合は、複雑さの程度によって 3つのグループに分類できます。

• 一点検量線 (原点通過直線、レスポンスファクタ )

• 多点検量線行列演算：

– 多点検量線 (直線、1/Xの直線、両対数直線、2次曲線、3次曲線、4次曲線、5次曲線、累乗曲線 )

– 原点通過多点検量線 (直線、2次曲線、3次曲線、4次曲線、5次曲線、レスポンスファクタ )

• 多点検量線 (折れ線、3次スプライン )

ヒント : 重み付けは、直線、2次曲線、3次曲線、4次曲線、および 5次曲線にのみ適用できます。

本節では、検量線タイプについて次のように扱います。

• ソフトウェアは、行列演算を使用して多点検量線作成を行います。

• ソフトウェアが検量線を作成する際に使用している解析のバックグランドについては、4-45ページの「参考文献」を参照してください。

• 以下の例に示した式では、サンプル重量と希釈率に関する調整は行われていません(4-5ページの「定量」を参照 )。

一点検量線

一点検量線の場合には、検量線は原点を通る直線です。ソフトウェアは次の一点検量線をサポートします。

• 原点通過直線

• レスポンスファクタ

次の図に、一点検量線を示します。


一点検量線

原点通過直線

原点通過直線は、次の式で表されます。

ここで、

y = ソフトウェアによって計算される標準試料成分のレスポンス

B =検量線の傾き

x =成分の濃度または溶液濃度

サンプル中の成分濃度または溶液濃度は、次式から求めることができます。

ここで、


y =ソフトウェアが計算したサンプルピークのレスポンス


y Bx=

x yB----=


レスポンスファクタ

レスポンスファクタ (RF)適合タイプを使用すれば、レスポンスファクタ (RF)カスタムフィールドを作成する必要がなくなります。レスポンスファクタ適合タイプを使用する場合は、原点通過直線への適合を使用する場合のように、解析メソッド画面の［成分］タブで適切な X値と Y値を指定してください。

ソフトウェアは、標準試料成分のレスポンスに対する濃度 (または溶液濃度 )を検量線上にプロットします。レスポンスファクタは検量線の傾きです。検量線に複数のデータポイントをプロットすると、各ポイントのレスポンスファクタが決定され、平均レスポンスファクタが検量線の傾きとして使用されます。

レスポンスファクタは、次式によって表わされます。

ここで、

RF =レスポンスファクタ (検量線の傾き )

y = ソフトウェアによって計算される標準試料成分のレスポンス

x =標準試料成分の濃度または溶液濃度

平均レスポンスファクタポイントに原点通過直線を適合させるとその検量線の式になります。

次図に、レスポンスファクタ検量線を示します。

RF = Y値X値


レスポンスファクタの検量線：

多点検量線の行列演算

多点検量線 (直線、1/xの直線、両対数直線、2次曲線、3次曲線、4次曲線、5次曲線、原点通過 )の場合は、ソフトウェアは行列演算を使用して必要な係数を取得します。

すべての多項式適合について、ソフトウェアは、x-yのポイントのセットまたは x、yおよび重み付きポイントを、最小二乗法によって重みなしまたは重み付き検量線に適合させます。この手法は、LU(Lower and Upper triangular matrix：上下三角行列 )分解と呼ばれる重み付きまたは重みなし検量線用の定型の計算手順です。

• 成分テーブルで重み付けがなしになっている場合、ソフトウェアは、x-yの各ポイントに対して重みなし最小二乗法を用いて検量線を適合させます。

• 成分テーブルで重み付けが有効になっている場合、ソフトウェアは、x-yの各ポイントに対して重み付き最小二乗法を用いて検量線を適合させます。


行列演算

検量線の係数を計算するために最小二乗法を使用します。

[Y] = [A] Þ [C]

ここで、

[[Y} = レスポンスベクトル

[A] = 計画行列

[C] = 係数ベクトル

これを行うためには、最小二乗法で次の直線の正規方程式を解きます。

([A]T Þ [W] Þ [A]) Þ [C] = [A]T Þ [W] Þ [Y]

[W]が対角重み行列である場合、重みなし検量線に対して単一に (全ての対角要素が 1に等しく )なります。この解は、

[C] = ([A]T Þ [W] Þ [A]) -1 Þ ([A]T Þ [W] Þ [Y])

行列の逆転は LU分解を使用して行われます。最小二乗法については、『Numerical Recipes in C』(William H. Press他著 (第 2版 ))のセクション 15.4「General Linear Least Squares」に説明されています。

行列演算の例

以下の行列演算は、分析された標準サンプルの数に基づいて係数を計算するために使用します。以下の演算は、重みなしの 5次曲線の適合を説明したものです。

一例として、7個の標準試料を各濃度 1点ずつで分析したとします。ソフトウェアは、検量線ポイントに対して 5次曲線の適合させようとします。

検量線の式の係数は次に示す手順で計算します。

1. 7個の標準試料が次の濃度、レスポンスの組み合わせ (検量線上にプロットされた x-yポイント )だったとします。

(x1, y

1), (x

2, y

2), (x

3, y

3), (x

4, y

4), (x

5, y

5), (x

6, y

6), (x

7, y

7)

2. 以下の 7つの式は、ステップ 1で示したデータを使用しており、6個の未知の係数(c

5～ c0

)と 7個のポイントのセットを含んでいます。

y1 = c

5(x

1)

5 + c

4(x

1)

4 + c

3(x

1)

3 +c

2(x

1)

2 + c

1(x

1)

1 + c0(x

1)

0

y2 = c

5(x

2)

5 + c

4(x

2)

4 + c

3(x

2)

3 + c

2(x

2)

2+ c

1(x

2)

1 + c0(x

2)

0

y3 = c

5(x

3)

5 + c

4(x

3)

4 + c

3(x

3)

3 +c

2(x

3)

2+ c

1(x

3)

1 + c0(x

3)

0

y4 = c

5(x

4)

5 + c

4(x

4)

4 + c

3(x

4)

3 + c

2(x

4)

2 + c

1(x

4)

1 + c0(x

4)

0

y5 = c

5(x

5)

5 + c

4(x

5)

4 + c

3(x

5)

3 + c

2(x

5)

2 + c

1(x

5)

1 + c0(x

5)

0

y6 = c

5(x

6)

5 + c

4(x

6)

4 + c

3(x

6)

3 + c

2(x

6)

2 + c

1(x

6)

1 + c0(x

6)

0

y7 = c

5(x

7)

5 + c

4(x

7)

4 + c

3(x

7)

3 + c

2(x

7)

2 + c

1(x

7)

1 + c0(x

7)

0

3. 上の式は、行列の形で次のように書くことができます。


または

[Y ] = [A] × [C ]

ここで、

[Y ] = レスポンスの行列

[A ] = 計画行列

[C ] = 計算して求める係数の行列

計画行列 Aは、n+1列と i行で構成されています (この場合、nは多項式の次数、iはレベルの数 )。5次式の適合のための目的行列 Aの構造は上記のとおりです。

4. ソフトウェアは次に LU分解を使用して最小二乗法の正規方程式を解きます。([A]T × [A]) × [C] = [A]T × [Y]

y1

y2

y3

y4

y5

y6

y7

x15 x1

4 x13 x1

2 x11 x1

0

x25 x2

4 x23 x2

2 x21 x2

0

x35 x3

4 x33 x3

2 x31 x3

0

x45 x4

4 x43 x4

2 x41 x4

0

x55 x5

4 x53 x5

2 x51 x5

0

x65 x6

4 x63 x6

2 x61 x6

0

x75 x7

4 x73 x7

2 x71 x7

0

c5

c4

c3

c2

c1

c0

•=


多点検量線

このソフトウェアは、以下の多点検量線をサポートしています。

• 折れ線

• 3次スプライン

• 直線

• 1/xの直線

• 両対数直線

• 2次曲線

• 3次曲線

• 4次曲線

• 5次曲線

• 累乗曲線

適合度の統計値を計算するために使用される式については、以下の結果とともに 4-42ページの「統計」で説明します。

• 検量線についてはすべて、正の X値、すなわち濃度または溶液濃度のみが報告されます。

• 直線の検量線については、標準試料の最高濃度以上の値も外挿するので X≧ 0の値が報告されます。

• 直線以外の検量線については、0から標準試料の最高濃度までの X値が報告されます。

折れ線への適合

折れ線 (点から点 )検量線を作成する場合は、ソフトウェアは異なる濃度間で直線を引きます。検量線の最初および最後の部分は直線的に外挿され、最小値から最大値の間から外れるX値を計算する場合に使用されます。

折れ線検量線はすべてのポイントを通るので、相関係数は 1で、標準誤差は 0になります。検量線の係数は計算されず、保存されません。次の図は折れ線検量線を示します。


折れ線の検量線：

検量線の折れ線の区間は、次の式によって表されます。

ここで、

y =ソフトウェアが計算した標準試料ピークのレスポンス

Ai = i番目の区間の y切片

Bi = i番目の区間の傾き


y Ai Bix+=


成分の濃度および / または溶液濃度の決定定量されたサンプルピークの成分の濃度および /または溶液濃度は、次の式によって決定できます。

ここで、

x = 成分の濃度および /または溶液濃度


Ai = i番目の区間の y切片

Bi= i番目の区間の傾き

3次スプライン3次スプラインの検量線を作成する場合、ソフトウェアは各連続する 2つのレベルの間に 3次多項式を適合させ、各ポイントの境界で傾きと曲率を一致させます。3次スプラインは、ポイント毎に検量線の形状を調整します。

3次スプラインの検量線はすべての点を通過するので、相関係数は 1で、標準誤差は 0です。3次スプラインの検量線が使用された場合は、検量線の係数は計算されず、保存されません。

次の図に、3次スプラインの検量線を示します。

xy Ai–

Bi

---------------=


3次スプラインによる検量線：

3次スプラインの検量線の各区間は、次の式で表されます。

この場合、Ai、Bi、 Ci、および Diは、その区間の多項式係数です。

ヒント : yが与えられると反復法を使用して xを算出します。

y Ai Bi Cix2 Dix

3+ + +=


直線

直線の検量線には、直線、1/xの直線、両対数の直線、累乗曲線が含まれます。

直線

直線の検量線を計算する場合は、ソフトウェアは、検量線ポイントの濃度および /または溶液濃度およびレスポンスに最も良く適合する直線を計算します。各ポイントの Y値は標準試料のレスポンス、X値は標準試料の濃度または溶液濃度です。次の図に、最小自乗法によって直線を適合させた検量線を示します。

1/xの直線 1x ノチョクセン1/xの直線の検量線を計算する場合は、ソフトウェアは検量線ポイントの X値および Y値に直線を適合させます。各ポイントの Y値は標準試料ピークのレスポンスで、X値は標準試料ピークの 1/X値 (濃度または溶液濃度 )です。

両対数直線リョウタイスウチョクセン

両対数直線の検量線を計算する場合は、ソフトウェアは検量線ポイントの X値および Y値に直線を適合させます。各ポイントの Y値は標準試料ピークのレスポンスの対数で、X値は標準ピークの X値 (濃度または溶液濃度 )の対数です。

ヒント : 1/xの直線および両対数直線は、直線適合の式を使用します。

累乗曲線

累乗曲線を計算する場合は、ソフトウェアは Yをレスポンス、Xを濃度の種類として、Xの対数と Yの対数に対して直線を適合させます。この検量線のプロットと式は、濃度の種類とレスポンスの関数として報告されます。


最小二乗法による直線の検量線：

直線の検量線は、次の式で表されます。

ここで、


A=-検量線の y切片



y A Bx+=


成分の濃度または溶液濃度の決定

定量された試料ピークの成分の濃度または溶液濃度は、次式によって決定できます。

ここで、



A=-検量線の y切片


2次曲線への適合 2 ジキョクセンヘノテキゴウ2次曲線による検量線を作成する場合、ソフトウェアは検量線ポイントに最小二乗法によって 2次式を適合させます。このタイプの検量線はポイントが 3つ以下では作成できません。最低 5ポイントは使用することを強くお勧めします。

次の図に、2次曲線の検量線を示します。

x y A–B

-------------=


2次曲線の検量線：

2次曲線は、次式で表される検量線を作成します。

ここで、



A、B、および C = 検量線の多項式の係数

y A Bx Cx2+ +=


成分の濃度または溶液濃度の決定

定量されたサンプルピークの成分の濃度または溶液濃度は、xを解くことにより決定できます。

ここで、



A、B、および C = 検量線の多項式の係数

ソフトウェアは、検量線の範囲内にある正の x値のみを報告します。

3次曲線3次曲線の検量線を計算する場合は、ソフトウェアは検量線ポイントに最小二乗法によって 3次式を適合させます。このタイプの検量線は 4ポイント未満では作成できません。最低 6ポイントは使用することを強くお勧めします。


x B– B2 4C A y–( )–±2C

-----------------------------------------------------------=




ここで、



A、B、C、および D = 検量線の多項式係数



y A Bx Cx2 Dx3+ + +=




ここで、



A、B、C、D、および E = 検量線の多項式係数



y A Bx Cx2 Dx3 Ex4+ + + +=



5次曲線は、次式で表される検量線を生成します。

ここで、



A、B、C、D、E、および F = 検量線の多項式の係数

y A Bx Cx2 Dx3 Ex4 Fx5+ + + + +=


原点通過多点検量線

このソフトウェアは、以下の原点通過多点検量線をサポートしています。

• 直線

• 2次曲線

• 3次曲線

• 4次曲線

• 5次曲線

• レスポンスファクタ

原点の強制通過検量線は、検量線が数学的に必ず 0を通過することを除いては、原点を通過しない検量線に似ています。検量線が強制的に原点を通過するようにすることにより、強制的に原点を通過しない検量線とは異なった係数がもたらされます。原点強制通過検量線の場合は、0次係数 (C0)は原点に設定され、ソフトウェアが残りの係数を計算します。

y1 = c

5(x

1)

5 + c

4(x

1)

4 + c

3(x

1)

3 + c

2(x

1)

2 + c

1(x

1)

1 + 0(x1)

0

y2 = c

5(x

2)

5 + c

4(x

2)

4 + c

3(x

2)

3 + c

2(x

2)

2 + c

1(x

2)

1 + 0(x2)

0

y3 = c

5(x

3)

5 + c

4(x

3)

4 + c

3(x

3)

3 + c

2(x

3)

2 + c

1(x

3)

1 + 0(x3)

0

y4 = c

5(x

4)

5 + c

4(x

4)

4 + c

3(x

4)

3 + c

2(x

4)

2 + c

1(x

4)

1 + 0(x4)

0

y5 = c

5(x

5)

5 + c

4(x

5)

4 + c

3(x

5)

3 + c

2(x

5)

2 + c

1(x

5)

1 + 0(x5)

0

y6 = c

5(x

6)

5 + c

4(x

6)

4 + c

3(x

6)

3 + c

2(x

6)

2 + c

1(x

6)

1 + 0(x6)

0

y7 = c

5(x

7)

5 + c

4(x

7)

4 + c

3(x

7)

3 + c

2(x

7)

2 + c

1(x

7)

1 + 0(x7)

0

下表に、標準的な式と原点強制通過の式の違いを示します。

原点通過検量線の詳細については、標準的な検量線タイプである原点を通過しない検量線の項を参照してください。ソフトウェアは、係数 Aが必ずゼロであることを除いて同様な計算を行います。

標準的な式と原点通過の式の比較：

適合タイプ (次数 ) 標準的な式原点強制通過の式

直線

2次曲線

3次曲線

y A Bx+= y Bx=

y A Bx Cx2+ += y B Cx2+=

y A Bx Cx2 Dx3+ + += y Bx Cx2 Dx3+ +=


重み付け

重み付けは、以下の目的で複数レベルのポイントを検量線に適合させる際に適用されます。

• 最も確実な (最も誤差が小さい )ポイントが、検量線の係数決定の際に寄与率が最も高いことを確認するため。

• X値 (濃度または溶液濃度 )に対する Y値 (レスポンスまたはレスポンス比 )の精度の誤差を調整するため。

検量線を検量ポイントに適合させるために、ソフトウェアは最小二乗法を実行して、検量線の個々のポイントとの差の合計が最小になるような係数を選択します。重み付けに関しては、以下のようになります。

• 重み付けを使用しないと、すべてのポイントが同等にその合計に寄与します。

• 重み付けを使用すると、検量線の各レベルでのばらつきを反映するように寄与率が調整されます。

最小化された式は、次のようになります。

ここで、

= 観測されたデータポイント

= 計算されたデータポイント

= 各データポイントの重み係数

自由度 = ポイントの数 - 計算された係数の数

重み付けされない (wi= 1)データは、すべてのレベルで精度が同等とみなされます。

重み付けタイプを選択するには、各レベル対 X値の標準偏差をプロットします。レベルによる標準偏差の違いに基づいて、重み付けタイプを選択します。

重み付けは、以下の標準の検量線に対して適用することができます。

• 直線

• 2次曲線

• 3次曲線

• 4次曲線

• 5次曲線

yi yi–( )2wi------------------------------

i 1=∑ 自由度

yi

yi

wi


重み付けのタイプとそれを適用した場合の結果を、次の表に示します。

ここで、

wi = 各データポイントの重み付け係数

xi =データポイントの X値

yi =データポイントの Y値

ヒント : ソフトウェアが重み付きポイントを計算できない場合は、検量線の係数は計算されず、計算されなかった理由を示す解析コードが表記されます。

重み付け適用の結果：

重み付けタイプ重み付けの式

x wi = xi：検量線 (濃度または溶液濃度 )の高濃度側のポイントに適合します。

1/x および 1/x2 wi = 1/xiまたはwi= 1/xi2：検量線 (濃度または溶液濃度 )の低濃度

側のポイントに適合します。x=0の場合は、そのポイントの重みおよび係数を計算できません。x=0のポイントがある場合は、検量線の係数は計算されず、解析コード Q28が検量線コードフィールドに表示されます。

1/y および 1/y2 wi = 1/yiまたはwi= 1/yi2：検量線 (レスポンス )の低濃度側のポイ

ントに適合します。y=0の場合は、そのポイントの重みおよび係数を計算できません。y=0のポイントがある場合は、検量線の係数は計算されず、解析コード Q30が検量線コードフィールドに表示されます。

x2 wi = xi2：検量線 (濃度または溶液濃度 )の高濃度側のポイントに適

合します。

log x wi = log xi：検量線上のポイントに 10を底とする対数による重み付き検量線を適合させ、検量線の高濃度側への対数的適合をもたらします。xi<0の場合は、そのポイントの重みおよび検量線の係数は計算されず、解析コード Q29が検量線コードフィールドに表示されます。

ln x wi = ln xi検量線上のポイントに自然対数による重み付き検量線を適合させ、検量線の高濃度側への対数的適合をもたらします。xi<0の場合は、そのポイントの重みおよび検量線の係数は計算されず、解析コード Q29が検量線コードフィールドに表示されます。


統計

統計は、ポイントの検量線への適合度の指標です。このソフトウェアは、以下の統計的基準を計算します。

• 決定係数

• 相関係数

• 残差平方和

• xに対する yの推定値の標準誤差 (報告されない )1

• 標準分散 (報告されない )1

• 検量線の標準誤差

• ％相対標準偏差

• 検量線の各ポイントの計算値と％偏差

決定係数

決定係数 (R2)は、適合度の大まかな指標で、次の式によって計算されます。

ここで、

R2 = 決定係数

R = 相関係数

Sy = xに対する y推定値の標準誤差

σ2y = 標準分散

相関係数

相関係数 (R)は、適合度の指標です。これは決定係数の平方根です。

xに対する y推定値の標準誤差x(Sy)に基づく yの推定値の標準誤差は、R2(決定係数 )および R(相関係数 )を決定するもので、次の式によって計算されます。

1. ソフトウェアは、報告されない 2つの基準を、中間値として計算します。

R2 1Sy )2(

σ2

y

---------------–=

Sy1n--- wi yi

ˆ yi–( )i 1=

n

∑2

=


ここで、

= ポイントの数

= 重み係数 (重み付けがない場合は 1に設定します )

= 検量線を使用して予測されたレスポンス

= 検量線ポイントのレスポンス

標準分散

標準分散 (σ2y)を使用して、決定係数および相関係数を計算します。標準分散は、次式によって計算されます。

ここで、



=次式によって与えられる重み付き平均

残差平方和

残差平方和 (RSS)は、適合度およびデータの精度の指標です。これを使用して、推定値の標準誤差および検量線の標準誤差を計算します。残差平方和は、次式によって計算されます。

ここで、

= 残差平方和

= ポイントの数




n

wi

yiˆ

yi

σ2y 1n--- wi yi y–( )2

i 1=

n

∑=

wi

yi

y

y

wiyii 1=

n

∑

wii 1=

n

∑----------------------=

RSS wi yiˆ yi–( )

2

i 1=

n

∑=

RSS

n

wi

yiˆ

yi


検量線の標準誤差

検量線の標準誤差 (E)は、検量線に係数を適合させると最小になるような和の平方根で、次式によって計算されます。

ここで、

= 自由度 = ポイントの数 - 計算された検量線の次数




= 残差平方和

検量線ポイントの計算値と％偏差

検量線ポイントの計算値および％偏差は、目視確認または X値に対してプロットすることにより、適合度を調べるために使用されます。

％偏差は、次式によって計算されます。

ここで、

= 検量線を使用して予測された X値 (計算された値 )

= 検量ポイントの X値

％偏差対濃度のプロットは、適合タイプが正しければ、ランダムに分散されるはずです。計算値対濃度または溶液濃度のプロットは、直線になるはずです。

％相対標準偏差

% RSDはデータの適合度および精度の指標になります。

% RSDは次式によって計算されます。

E 1

d--- wi yi

ˆ yi–( )2

i 1=

n

∑

1d---RSS==

d

wi

yiˆ

yi

RSS

100xiˆ xi–

xiˆ----------------

％偏差 =

xiˆ

xi

%RSD

wi[i 1=

n

∑ yi• YWM ]–2

[n-1]⁄

12---

YWM--------------------------------------------------------------------------------------- 100•=


ここで、



= 全検量線ポイントの重み付き平均レスポンスで、次式で表されます。

= ポイント数

参考文献

定量の理論に関しての詳細は、以下の書籍を参照してください。

• 『Numeric Recipes in C』、Flannery, Brian P.著、Cambridge University Press, Cambridge, UK、1988年

• 『Chemometrics: A Textbook』、Massart, D.L., 他著、Elsevier Science Publishers, Amsterdam、1988年

• 『Signal Analysis』、Papoulis, Athanasios著、McGraw-Hill, New York、1977年

• 『Introduction to Modern Liquid Chromatography第 2版』、Snyder, L.R.および J.J. Kirkland著、Wiley-Interscience、New York、1979年

• 『Linear Algebra and Its Applications』、Strang, Gilbert著、Harcourt Brace Jovanovich, Inc., New York、1988年

wi

yi

YWM

YWM

wi yi )•(i 1=

n

∑n---------------------------------=

n

参考文献 4-45

索引

数字1/xの直線 4-312次曲線への適合 4-332次微分感度、ApexTrack 2-8頂点 2-13ピークプロファイル 2-9フィルタ、ApexTrack 2-8例 2-10

2次微分フィルタ、ApexTrack 2-83次曲線 4-353次スプライン 4-295次曲線 4-375ポイントピーク除外、従来法 3-17

AA/D変換 1-4ApexTrack解析パラメータ 2-3ガウシャンスキム 2-5傾き差の感度 2-14クロスオーバー 2-22検出感度 2-4自動感度 2-9, 2-29自動ピーク幅 2-8, 2-27立ち上がり 2-19立ち上がり% 2-4立ち下がり 2-19立ち下がり% 2-4頂点、定義する 2-10頂点の決定 2-2波形解析 1-3波形解析イベント 2-5, 2-31, 2-32波形解析ピークラベル 2-6ピーク検出の手順 2-10ピークの検出プロセス 2-8ピーク幅 2-4負ピーク 2-5ベースラインの決定 2-2変曲点 2-10, 2-13ラウンドピーク 2-11

ApexTrack解析メソッドの波形解析タブ 2-3

ApexTrackでの負ピークの検出 2-2ApexTrackの立ち上がり 2-19

BbusLAC/Eカード 1-5

GGPC立ち上がり %と立ち下がり % 2-4

GPC解析、ピークの統合イベント 2-5

IISA busLAC/Eカード 1-5

PPCI busLAC/Eカード 1-5

RRF内部標準法 4-18RTレファレンス 4-3

Xxに対する y推定値の標準誤差 4-42

あアナログからデジタルへの変換 1-4

い一致の程度 4-2

お重み付け 4-40折れ線 4-27

か解析メソッド

ApexTrackの既定 2-3定義 1-2

ガウシャンスキム処理、ApexTrack 2-2, 2-5傾き差、ApexTrack 2-14傾き差の感度 2-15

ApexTrack 2-14

索引 -1

き希釈率 4-7生データポイント 1-5行列演算多点検量線 4-24例 4-25

曲率、ApexTrackで使用 2-7, 2-8

くクロスオーバー

ApexTrack 2-22

け決定係数 4-42検出イベントショルダーを検出 2-5

検出感度、ApexTrack 2-4, 2-8検出サンプリングレート 1-6原点強制通過 4-39原点通過直線 4-22検量線

Xに基づく Yの推定値の標準誤差 4-42決定係数 4-42検量線の標準誤差 4-44検量線ポイントの計算値と％偏差 4-44残差平方和 4-43相関係数 4-42標準分散 4-43

検量線の適合1/xの直線 4-312次 4-333次 4-355次曲線 4-37重み付け 4-40原点通過 4-39原点通過直線 4-22検量線適合 4-27, 4-29直線 4-31統計 4-42両対数直線 4-31レスポンスファクタ 4-23

検量線の標準誤差 4-44検量線ポイントの計算値と％偏差 4-44

さ最小高さ従来法 3-17

最小面積従来法 3-17

残差平方和 4-43サンプリングレート化学式 1-6最適なサンプリングレート 1-6データ取り込み頻度 1-6

サンプル重量 4-7

し自動感度、ApexTrack 2-9, 2-29自動ピーク幅、ApexTrack 2-8, 2-27従来法の波形解析 1-3, 3-10ピーク波形解析イベント 3-18ピークの検出 3-2ピークラベル 3-19

除外基準、従来法 3-17

ショルダー検出 2-2, 2-10

ショルダーを検出イベント、ApexTrack 2-5

すスキムイベント

ApexTrack 2-2

せ接線スキム 2-5絶対検量線法 4-9

そ相関係数 4-42

た立ち上がり %、ApexTrack 2-4, 2-14立ち上がり傾き点、ApexTrack 2-10立ち下がり %、ApexTrack 2-4, 2-14立ち下がり、ApexTrack 2-19谷渡りイベント、ApexTrack 2-5

索引 -2

I

ち頂点

ApexTrackで定義する 2-10ApexTrackでの検出 2-2

直線 4-31

てディスクスペース 1-7定量

RF内部標準試料 4-18希釈率の使用 4-7検量線による 4-5サンプル重量の使用 4-7絶対検量線 4-9注入量の使用 4-8適合タイプ (次数 ) 4-5内部標準法 4-13

定量時の検量線作成 4-5データ取り込み 1-2データの転送 1-5データの保管 1-5データバンチング、従来法 3-2

と統計 4-42

な内部標準法による定量 4-13波形解析

ApexTrack 1-3ApexTrackアルゴリズム 2-3従来法 1-3

波形解析イベントApexTrack 2-5, 2-32ApexTrack波形解析テーブル 2-31従来法の波形解析、概要 3-18

波形解析、定義 1-2波形解析ピークラベル、ApexTrack 2-6

はハードディスクスペース 1-7

ひピーク開始、決定、従来法 3-3ピーク間ベースラインノイズ 2-29

ピーク高さ、決定、従来法 3-15ピーク、最大曲率、ApexTrack 2-7ピーク終了、決定、従来法 3-6ピーク除外の基準、従来法 3-17ピーク頂点、決定、従来法 3-5ピーク波形解析

ApexTrackピークラベル 2-7イベント、従来法 3-18概要、従来法 3-10ピーク高さ、従来法 3-15ピーク除外の基準、従来法 3-17ピーク面積、従来法 3-16ピークラベル、従来法 3-19ベースラインの作成、従来法 3-12保持時間、従来法 3-15未分離ピークの決定、従来法 3-10

ピークの検出ApexTrack 2-2, 2-8開始時間（分）、ApexTrack 2-3従来法 3-2終了時間（分）、ApexTrack 2-3データバンチング、従来法 3-2ピーク開始、従来法 3-3ピーク終了、従来法 3-6ピーク頂点、ApexTrack 2-2ピーク頂点、従来法 3-5

ピークの最大曲率、ApexTrack 2-7ピークの統合イベント

GPC解析 2-5ピークの同定 4-1一致の程度 4-2保持時間、シフト 4-3保持時間の更新 4-4

ピーク幅、ApexTrack 2-4, 2-8ピーク面積、決定、従来法 3-16ピークラベル

ApexTrack 2-6, 2-7従来法の波形解析 3-19

標準分散 4-43

ふプロセス、定義 1-2

索引 -3

へベースライン、ApexTrack 2-10ベースラインノイズ 2-4

ApexTrackでの役割 2-28評価 2-29

ベースラインの決定、ApexTrack 2-2, 2-13ベースラインの作成、従来法 3-12変換、A/D 1-4変曲点、ApexTrack 2-10, 2-13

ほ保持時間決定 3-15シフト 4-3保持時間レファレンス 4-3

保持時間の更新 4-4保持時間のシフト 4-3

み未分離ピーク

2次微分、ApexTrack 2-10従来法 3-10

め面積、従来法の波形解析 3-16

らラウンドピーク、ApexTrack 2-2, 2-5, 2-10,

2-11

り両対数直線 4-31

れレスポンスファクタの適合 4-23

索引 -4

empower 2 - waters corporation...empower は、ピーク検出とベースラインの決定の 2...

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