Per Amstrup Pedersen Institute of Molecular Biology

August Krogh Building

Copenhagen University Universitetsparken 13 2100 Copenhagen OE PAPedersen@aki.ku.dk

En genteknologisk værktøjskasse. Version 2007

Indholdsfortegnelse

Southern blot 2 – 3

Northern blot 3 - 4

Western blot 4 – 5

Immunoprecipitation 4, 6

RNase protection 6 – 7

Primer ekstension 8

Bandshift (EMSA) 9

Colony/plaque lift 10 – 11

S1 nuklease mapning 10, 12,13

Mærkning af prober 10, 14, 15

Nuclear run on 15, 16

5’ RACE 17 - 18

3’ RACE 19

Inverse PCR 20

En hybrid system 21 - 22

To hybrid system 23 – 24

Polysomanalyse 25, 26, 27

Filterbindingsassay 28-29

Site directed mutagenese 30-33

Fusion af to DNA fragmenter 34

Proteomics 35- 36

Transkriptom analyse 37-39

Differential display 40- 42

Expressionskloning 43- 44

Pulse-chase forsøg 45- 46

Real time PCR 47 - 51

1

Følgende katalog er tænkt som en præsentation af en række vigtige molekylærbiologiske teknikker, som ikke er beskrevet direkte i lærebogen. Anvendelse af teknikkerne til løsning af konkrete molekylærbiologiske problemstillinger vil blive illustreret i forbindelse med opgave diskussionerne, men for at lette forståelsen beskrives principperne kort i dette kompendium. Nukleinsyre hybridisering.

En af de vigtiske teknikker til påvisning af et givent DNA eller RNA molekyle

i et biologisk materiale bygger på komplementære nukleinsyrers evne til at binde til hinanden via hydrogenbindinger. Denne proces benævnes hybridisering. Hybridiseringen kan enten foregå i opløsning eller på en membran. Langt de fleste hybridiseringen foretages på en membran. For at visualisere hybridiseringsproduktet anvendes en mærket probe. Mærkningen kan enten foretages ved at inkorporere et eller flere radioaktive nukleotider i proben eller ved at inkorporere biotinylerede nukleotider i proben. Lange prober fremstilles enten ved primer ekstension, nick translation, eller random labelling medens kortere, biotinylerede prober kan fremstilles direkte på DNA syntesemaskinen. Begge typer mærkning bevirker at hybridiseringsproduktet kan visualiseres ved at lægge en røntgen film over hybridiseringblandingen eller ved PhosphorImage analyse. PhosphorImage analyse foregår ved, at den det radioaktivt mærkede materiale lægges ned i en phosphorImage kasette med en PhosphorImage plade, som er i stand til at absorbere β-stråling. Molekyler i pladen exiteres af β-strålingen og den absorberede energi frigives først, når pladen scannes af en laser i PhosphorImage maskinen. På dette tidspunkt opsamles og kvantificeres den frigivne energi af en monitor og en computer regenererer et billede. Fordelen ved PhosphorImage analyse er, at kvantificeringen er mere nøjaktig end den, der kan opnås ved almindelig autoradiografi på røntgenfilm. Problemet med filmen er, at sammenhængen mellem sværtning af filmen og radioaktiviteten i prøven kun er lineær over et forholdsvis lille område. Southern blotting.

Den oprindelige metode til blotting blev udviklet af Southern i 1975. Metoden

bygger på at restriktionsskåret DNA separeres i en agarosegel. Herefter blottes DNAet over på en nylon eller nitrocellulose membran. Dette blev i den oprindelige protokol gjort ved kapilært flow men gøres i dag oftest elektroforetisk eller med sug eller tryk. Hermed reduceres overførselstiden fra overnat til 1 time. DNA bindes til membranen enten ved bagning eller ved bestråling med UV lys.

For at overføre DNAet effektivt fra gel til membran, og for at sikre at alt DNA overføres lige effektivt, er det nødvendigt at fragmentere DNAet. Dette gøres ved at inkubere agarosegelen i 0,25M HCl. Dette depurinerer DNAet og gør fosfordiester-bindingen tilgængelig over for efterfølgende spaltning med NaOH. Efter overførsel af DNAet til membranen inkuberes denne med den mærkede denaturerede probe, som så vil binde til de DNA molekyler på filteret, der har tilstrækkelig sekvenshomologi til proben. Den nødvendige grad af sekvenshomologi afhænger af, hvor stringente hybridiserings-betingelserne er. Her er temperaturen og saltkoncentrationen vigtige parametre, idet der kræves højere sekvenshomologi for at proben kan binde, jo højere hybridiseringstemperaturen er. Samtidig kræver hybridisering i lav salt højere sekvenshomologi end hybridisering i høj salt. Positionen i gelen af det fragment, der

2

har sekvenshomologi til proben, visualiseres ved autoradiografi på en røntgenfilm eller med en PhosphoImager. De enkelte trin i Southern blotting er vist i Figur 1.

Separer skåretDNA ved agarosegelelektroforese

Figur 1: Princippet i Southern blotting teknikken. Restriktionsskåret DNA separeres ved agarose-gel-elektroforese. Efter depurinering med HCl og spaltning med NaOH overføres DNAet til en membran. Efter endt overførsel inkuberes membranen i et lille volume hybridiseringsvæske sammen med en mærket probe, hvis sekvens er komplementær til det stykke DNA man gerne vil visualisere. For at kunne bestemme størrelsen af DNA fragmenterne fotograferes den ethidiumbromid farved gel sammen med en lineal før overførslen.

3

Northern blotting.

Proceduren i northern blotting er i princippet den samme som for Southern

blotting blot kan vi påvise tilstedværelsen af et bestemt RNA molekyle i et RNA ekstrakt. RNA separeres i modsætning til DNA i formamid holdige agarosegeler for at holde RNAet denatureret under gelkørslen. RNAet overføres til en nylon membran eller en nitrocellulose membran, bages eller UV bestråles og tilsættes den mærkede probe. Efter hybridisering visualiseres positionen af det til proben komplementære RNA molekyle ved autoradiografi eller med en PhosphoImager. Som probe kan anvendes både DNA og RNA prober. RNA-RNA hybrider har højere smeltetemperatur end DNA-RNA prober. Western blotting.

Efter udvikling af Southern og northern blotting teknikkerne blev der udviklet en analog teknik, western blotting, til påvisning af et bestem protein i et protein ekstrakt. Proteinerne i ekstraktet separeres i en SDS holdig polyakrylamid gel og overføres til en nitrocellulose membran eller en nylon membran. Som probe anvendes et antistof rettet mod det protein, vi vil påvise tilstedeværelsen af. Dette primære antistof vil binde til det på membranen immobiliserede protein. Ved anvendelse af et enzym-mærket eller radioaktiv mærket sekundært antistof kan det primære anstistof-antigen kompleks visualiseres ved tilsætning af enzymsubstratet,ved autoradiografi. eller ved PhosphoImage analyse. Princippet i western blot proceduren er vist i Figur 2. Immunoprecipitation.

Som en alternativ metode til identifikation af et bestemt protein i et protein ekstrakt kan anvendes immunoprecipitation. Dette gøres som oftest efter, at proteinerne i en cellekultur er blevet radioaktiv mærket efter tilsætning af radioaktive aminosyrer til vækstmediet. Dette er som oftest 35 14S , C eller 3H mærkede aminosyrer. Cellerne lyseres og inkuberes med et IgG antistof rettet mod det protein, der ønskes identificeret. Efter antigen-antistof komplekset er dannet tilsættes enten døde Staphyllococcus aureus celler eller sepharose kugler coated med protein A eller protein G. Fidusen er, at protein A og protein G binder til Fc delen af IgG antistoffer. S. aureus celler indeholder netop protein A og G proteiner på overfladen. Resultatet er, at vi får dannet et antistof-antigen-protein A/G-sepharose kugle kompleks, som kan isoleres fra resten af cellens proteiner ved centrifugering. Når dette kompleks loades på en denaturerende poly-akryl-amid-gel (SDS-PAGE) går komplekset i stykker og de enkelte proteiner separeres i gelen. Da det kun er det immunpræcipiterede protein, som er radioaktiv mærket, er det kun dette protein, der visualiseres ved autoradiografi eller PhosphoImage analyse. Princippet i Immunoprecipitations-proceduren er vist i Figur 3.

4

MW

MWMW

MW

MW

. Figur 2: Western blotting. De enkelte trin i western blotting proceduren til påvisning af et bestemt protein i et proteinekstrakt. Teknikken kan også bruges til at kvantificere mængden af ef et givent antigen, hvis man kan fremstille en standardkurve ud fra forskellige mængder påsat oprenset antigen. MW angiver en molekylvægtsmarkør, så størrelse af det identificerede antigen kan bestemmes.

5

Radioaktiv mærket protein ekstrakt inkuberes i opløsning med antistof

Tilsæt protein A/G coatedesepharose kuglereller inaktiverede

cellerStaphyllococcusaureus

Sedimenter i centrifugenog kasser supernatanten

Separer immunpræcipitatet ved SDS-PAGE og visualiserproteinbåndede vedautoradiografi eller påPhosphoImager

Figur 3: Skematisk oversigt over immunoprecipitationsproceduren. Forskellige proteiner er angivet med forskellige farver. Sepharosekugler/S. aureus celler er angivet med grønt. RNase protektion assay.

Dette er et alternativ til northern blotting og er mere sensitivt. Princippet er, at

en fremstillet radioaktiv probe indkuberes med den RNA preparation, der ønskes undersøgt. Er der RNA molekyler med sekvenser, der er komplementære til proben, vil der dannes en dobbeltstrenget, mærket RNA-probe hybrid. Dette kompleks vil i modsætning til det ikke-hybridiserede RNA være resistent overfor RNase A behandling. Tilsættes der derfor et overskud af probe, vil alle RNA molekyler med sekvenser komplementære til proben ikke blive fordøjet helt. Kun den del af RNA

6

molekylet, der ikke hybridiserer med proben, vil blive nedbrudt. Separation af det RNase fordøjede RNA i en formamid-holdig polyacrylamidgel efterfulgt af autoradiografi eller PhosphoImage analyse viser et bånd, der svarer til længden af proben. Princippet i RNase protection teknikken er vist i Figur 4.

Lane A: RNA + probe brugt til forsøgetLane B: kun RNA brugt til forsøgetLane C: kun probe brugt til forsøget

Isoler mRNA fra det interessante væv.

A B C

mRNA AAAAA

mRNA AAAAA

mRNA AAAAA

mRNA AAAAA

mRNA AAAAAmRNA AAAAA

Tilsæt overskud af radioaktiv mærket, fremstillet RNA.

in vitro

Inkuber med RNase A som fjernerenkeltstrenget RNA

Figur 4: Princippet i RNase protection analyse. Efter hybridisering med en mærket RNA probe (angivet i rødt og gult), tilsættes RNase A som nedbryder ikke hybridiseret RNA. Efter elektroforese i en denaturerende poly-acryl-amid-gel og autoradiografi/PhosphorImage analyse vil mængden af radioaktivitet i det fremkomne bånd reflektere mængden af mRNA, der var i den isolerede prøve. Som negative kontroller laves de under B og C benævnte forsøg.

7

Primer ekstention.

Primer ekstention en fællesbetegnelsen for en teknik, der involver hybridisering af en primer til et stykke komplemetært nukleinsyre efterfulgt af forlængelse af primeren med en polymerase. Teknikken bruges især til mapning af transkriptions startsitet for promotorer, d.v.s. identifikation af hvilket nukleotid, der er det første i 5’ enden af et mRNA molekyle. Teknikken kræver, at genet der koder for mRNA molekylet er kendt og at exon-intron strukturen er kendt. Primerekstension teknikken er vist i Figur 5.

3’5’

5’

Isoler mRNA (evt. totalt RNA) fra det ønskede væv

mRNA AAAAA

RT-primer

3’5’mRNA AAAAA

RT-primer

3’3’

3’

5’5’

mRNA AAAAA

Anneal den kinerede RT-primertil mRNAet mindre end 100 baserfra den formodede 5' ende.

Tilsæt reverse transkriptase ognukleotider

Sekventer en genomklon med sammeprimer og separer primerekstensionproduktet og sekvensprodukterne påden samme denaturerende polyacryl-amidgel

P G A T CIdentificer det bånd i sekvensreaktionen der har samme længde som primerekstension produktet ogbestem længden på dette. Dette kan gøres idet vi .har kendskab til nukleotidsekvensen af det sekventeredeDNA og den anvendte primer. Sekvensreaktionernefungerer i dette tilfælde fungerer som lineal påfor hvor lang primer-ekstension-produktet er. Er primer-ekstension-produktet f.eks. 55 nukleotider langtkan vi gå ind i sekvensen af det genomiske DNAhvorfra mRNAet blev transkriberet og tælle55 nukleotider fra 5' enden af den til forsøget anvendte primer.Her findes transkriptions-startsitet.

Figur 5: Illustration af primerekstension teknikken. Teknikken er baseret på, at en sekvensspecifik, radioaktiv mærket primer anneales til et område i 5’enden af mRNA og forlænges ved hjælp af en reverse transkriptase indtil 5’enden af mRNA molekylet. Lægden af primerekstension produktet kan dernæst bestemmes efter elektroforese i en urinstofholdig denaturerende polyacrylamidgel med et sæt sekvensreaktioner som lineal.

8

Band shift assay, EMSA (electrophoretic mobility shift assay) Denne teknik bruges oftest til at undersøge, om der i cellekernen findes et eller

flere proteiner, der specifikt binder til promoter regionen af et gen. Der skal anvendes radioaktivt mærkede oligonukleotider, der dækker forskellige dele af promotoren og et protein ekstrakt fra kerner (kerne ekstrakt) fra de celler, man arbejder med. Alternativt/suplerende kan er anvendes rekombinant fremstillet og oprenset protein. Blandes kerneekstraktet/oprenset protein med radioaktive oligonukleotider efterfulgt af separation i en ikke-denaturerende polyacrylamidgel og autoradiografi eller PhophoImage analyse, vil de nøgne oligonukleotider have en højere mobilitet i gelen end oligonukleotid-protein komplekset. Positionen af oligonukleotidet i gelen bliver således shiftet når der er protein i kerneekstraktet, der har affinitet for oligonukleotidet. Proteinerne, der binder, vil som oftes være transkritionsfaktorer. Har man antistoffer mod forskellige transkriptionsfaktorer, kan man undersøge om tilsætning af disse vil forårsage et supershift af positionen af oligonukleotid-protein komplekset. På denne måde kan et EMSA forsøg identificere de DNA bindende proteiner. Assayet kan også udføres med RNA. Princippet i et EMSA assay er vist i Figur 6.

A B C

Supershift

Shift

Nøgentoligonukleotid

A B C

Supershift

Shift

Nøgentoligonukleotid

Figur 6: Illustration af EMSA teknikken. Radioaktivt mærkede dobbeltstrengede DNA molekyler blandes med kerekstrakt og blandingene separeres i en ikke-denaturerende poly-acryl-amid-gel. Hvis der binde protein til DNA molekylerne får disse en lavere mobilitet i gelen. Tilsættes yderlige antistof mod det DNA bindende protein før separation i gelen fås et supershift, idet mobiliteten nedsættes yderliger. A, kun tilsat oligonukleotider; B, tilsat oligonukleotider og kerneekstrakt; C, tilsat, oligonukleotider, kerneekstrakt og antistof.

9

Identifikation af enkelte kolonier der indeholder et bestemt stykke DNA eller protein.

Hybridiseringsteknikkerne kan også bruges i forbindelse med screening af

genbiblioteker. Hele kolonier kan føres over på et membranfilter (man taler om colony lift) og efter lysering af cellerne kan DNAet eller proteinet bindes til membranen. Har man en mærket probe, kan man som i Southern Blotting teknikken identificere kolonier, der indeholder nuklein syre sekvenser, der er komplementære til proben. Helt analogt kan man, hvis man har et antistof, identificere de kolonier, der udtrykker et bestemt protein. Selve visualiseringen af de rigtige kolonier foregår som under western blotting. Ofte bruges teknikken til at identificere lambda fager indeholdende sekvenser komplementære til en probe. Dette gør sig gældende ved screening af genom og cDNA biblioteker. Her taler man om plaque lift idet de plaques som dannes efter lambda infektion ”løftes” over på et membranfilter. Teknikken er illustreret i Figur 7. Nuklease S1 mapning af transkriptions start sites.

Dette er et alternativ til primer ekstenstion teknikken. Teknikken kræver at

nukleotid sekvensen af genet er kendt. Princippet minder om princippet i RNase protection. Et radioaktiv mærket nukleotid hybridiseres til RNA efterfulgt af fordøjelse med nuklease S1 som fjerner enkeltstrenget nukleinsyre. Da 5’ enden af den mærkede oligo kendes, kan man ved at bestemme længden af det ikke-fordøjede oligo nukleotid bestemme, hvor mange nukleotider der er fra oligoens 5’ ende til det første nukleotid der transkiberes af RNA-polymerasen. Dette er netop 5’ enden af mRNAet. Ved i genomsekvensen at tælle det bestemte antal nukleotider op fra oligoens 5’ ende (introns springes over), findes det første nukleotid der transkriberes. Teknikken er illustreret i Figur 8. Teknikken kan helt analogt anvendes til at bestemme 3’ enden af mRNA. Dette er vist i Figur 9. Mærkning af prober.

Nick translation bygger på at DNase I kan lave et nick (bryde

fosfordiesterbindingen) i den ene streng af et dobbeltstrenget DNA molekyle. DNase I mængden titreres således, at hvert DNA molekyle kun får lavet et nick. Tilstedeværelse af DNA polymerase vil bevirke at dennes 5’-3’ exonuklease aktivitet vil fjerne nukleotider startende fra det område, hvor DNasen har lavet et nick. Samtidig vil 3’ enden fra det sted, hvor nicket er sket, kunne bruges af DNA polymerasen som primer til nysyntese af DNA med den komplementære streng som template. Sker syntesen i tilstedeværelse af radioaktive nukleotider vil replikations- produktet blive radioaktiv. Random labeling bygger på primer ekstension teknikken idet en blanding af alle mulige hexanukleotider hybridiseres med det DNA fragment, der skal mærkes. Tilsætning af en DNA polymerase og mærkede nukleotider forlænger primeren og inkorporerer de mærkede nukleotider. I stedet for at anvende en blanding af alle hexanukleotider, kan der i stedet anvendes en sekvens specifik primer. Teknikkerne er illustreret i figur 10 og figur 11.

10

Petrisklål med bakterie koloniereller -plaques (masterplade)λ

Overfør bakterier til membran(kaldes colony lift henholdsvisplaque lift på engelsk)

Lyser cellerne på filterethvis plaques er dette trinoverflødigt

Inkuber med antistof

( )

Inkuber med mærket probe

( )

Fremkald som ved western blot

Fremkald som ved Southern blot

Figur 7. Princippet i colony lift henholdsvis plaque lift.

11

mRNA 5' AAAAA

mRNA 5'

mRNA 5' AAAAA

Anneal en radioaktiv mærketsekvensspecifik primer til mRNA

Tilsæt nuklease S1

Separer produktet i en denaturerende poly-acryl-amid-gelsammen med en sekvensreaktion

S1 G A T C

Figur 8: Bestemmelse af transkriptionsstartsite med S1 nukelase behandling. En sekvensspecifik, radioaktiv mærket primer der ”når udover” mRNAets 5’ ende anneales. Herefter fjerner nuklease S1 alt det enkeltstrengede DNA og RNA. Det, der bliver tilbage, er således den del af den mærkede probe, der ”når hen til” 5’ enden af mRNAet. Længden af den tilbageværende del af proben kan bestemmes efter elektroforese i en denaturerende poly-acryl-amid-gel sammen med en sekvensreaktion, der fungerer som lineal. Måles fragmentlængden f.eks. til 58 nukleotider kan vi gå ind i DNA sekvensen for det pågældende gen og tælle 58 nukleotider op fra 5’ enden af den radioaktiv mærkede primer. Dette nukleotid er det første der transkriberes.

12

mRNA 5' AAAAA

mRNA 5'

mRNA 5' AAAAA

Anneal en radioaktiv mærketsekvensspecifik primer til mRNA

Tilsæt nuklease S1

Separer produktet i en denaturerende poly-acryl-amid-gelsammen med en sekvensreaktion

S1 G A T C

Figur 9: Bestemmelse af 3’ enden af mRNA ved S1-nuklease mærkning. En sekvensspecifik, radioaktiv mærket primer der ”når udover” mRNAets 3’ ende anneales. Herefter fjerner nuklease S1 alt det enkeltstrengede DNA og RNA. Det, der bliver tilbage, er således den del af den mærkede probe, der ”når hen til” 3’ enden af mRNAet. Længden af den tilbageværende del af proben kan bestemmes efter elektroforese i en denaturerende poly-acryl-amid-gel sammen med en sekvensreaktion, der fungerer som lineal. Måles fragmentlængden f.eks. til 58 nukleotider kan vi gå ind i DNA sekvensen for det pågældende gen og tælle 58 nukleotider ned fra 5’ enden af den radioaktiv mærkede primer. Dette nukleotid svarer til det sidste i det færdige mRNA.

13

Før brug testes proben for om den er mærkettilstrækkeligt. Dette kan gøres ved at separere proben fra u-indkorporerede nukleotider på en søjle. Umiddelbart før brug koges proben for at den skaldenaturere.

Figur 10: Mærkning af prober med nick-translation.

14

Her benyttes principppet i primerekstension, idet der som primerer anvendes en blandingaf alle mulige hexamerer ( ).

Denaturer DNAet og tilsæt tilfældige hexamerer

Tilsæt DNA polymerase og mærkede nukleotider(kan være biotinylerede eller radioaktive)( )

Resultatet er stykker af mærket DNA. Figur 11: Mærkning af prober med random hexamerer. Nuclear run on.

Denne teknik anvendes til sammenligning af transkriptions-initierings-

frekvensen af et givet gen under forskellige betingelser. Der isoleres kerner fra de celler, der arbejdes med og der tilsættes en inhibitor af transkriptionsinitieringen samt radioaktive nukleotider. Disse vil blive indkorporeret i det RNA, der var under syntese da kernerne blev isoleret. Under antagelse af at RNA nedbrydningen i kernen er negligeabel, vil den mængde RNA, der dannes i et givent tidsrum, afhænge af hvor mange RNA polymeraser, der på kerne isolerings tidspunktet var i gang med at transkribere. Det RNA transkript man gerne vil påvise kan identificeres ved northern blotting eller dot blotting med en mærket probe. Teknikker er illustreret i figur 12

15

Isoler kerner fra de celler der skal undersøges og tilsæt inhibitorer af transkriptions-initieringen og nukleotider. Umiddelbart efter inhibering af initieringen får den sidste RNA polymerasesåledes lov at initiere transkriptionen, medens de, der er i gang, får lov at "køre" færdig.

Den sidste RNA polymerase der får lov at initiere

Transkriptionen forløberindtil den sidste RNA polymeraseterminerer transkriptionen

Tilstedeværelse og kvantificering af de enkelte transkripter kan ske med med northern blotting, RNase protection eller slot blotting. Figur 12: Illustration af nuclear run on teknikken.

16

5’ RACE (Rapid Aplification of cDNA Ends)

5’ RACE er en metode til at amplificere 5´enden af et stykke cDNA. Ofte

resulterer screening af et cDNA bibliotek med en probe i isolering af en klon der mangler større eller mindre dele af 5’ enden. I stedet for at konstruere et nyt bibliotek er det nemmere at bruge RT-PCR. RT reaktionen udføres med en primer der annealer til et område så tæt på mRNAets 5’ ende som muligt (svarende til 5’ enden af cDNA sekvensen). Ved hjælp af terminal transferase påsættes der enten en polydG eller polydC hale på RT produktets 3’ ende. Ved at udføre PCR med en polydC eller polydG primer samt den primer der blev brugt til RT rekationen får vi amplificeret den manglende 5’ ende. Denne kan nu klones i et plasmid og nukleotidsekvensen kan bestemmes. Teknikken er illustreret i figur 13.

17

5' AAAA 3'mRNA

5' AAAA 3'mRNA

AcDNA

5' AAAA 3'

A

mRNA

cDNA

Terminal transferase+ dCTP eller dGTP

PCR med primer A +polydC primer ellerpolydG primer

GGGGGGCCCCCC/

Anneal den sekvens-specifike primer Aog foretag reversetranskription

Figur 13: Princippet i 5’ RACE teknikken.

18

3’ RACE

3’ RACE er helt analogt til 5’ RACE blot ønsker vi at få kendskab til 3’ enden

af et mRNA molekyle. Til dette formål udfører vi en RT reaktion med en polydT primer, hvorpå der i 5’ enden er påhæftet en hale med en kendt nukleotidsekvens. PCR med en halespecifik primer og en primer i det kendte stykke cDNA efterfulgt af kloning og sekventering vil give nukleotidsekvensen af den ukendte 3’ del af mRNA molekylet. 3’ RACE teknikken er illustreret i Figur 14.

5' AAAA 3'mRNA

5' AAAA 3'mRNA

cDNA

5' AAAA 3'mRNA

cDNA

PCR med primer A +primer B

polydTA

A

Reverse transkriptionmed polydT primermed halesekvensenA

B

Anneal den sekvens-specifikke primerB til cDNAet

Figur 14: Illustration af 3’ RACE teknikken.

19

Inverse PCR

Ofte står man i den situation, at man har klonet og sekventeret et stykke kromosomal DNA, men mangler noget sekvens opstrøms og eller nedenstrøms for det sekventerede stykke DNA.

For at tilvejebringe dette DNA kan man benytte sig af inversePCR. Konceptet bag denne teknik er vist i Figur ss.

Figur 15: Skematisk oversigt over inverse PCR teknikken. Vi forudsætter at vi kender sekvensen af det ”røde” område. Vi kan derfor fremstille 2 PCR primere som er specifikke for området og som har de viste orienteringer. Restriktionsanalyse af vores ”røde” region viser at der ingen BamHI og PstI sites er. Derfor kan vi skære en portion kromosomal DNA med det ene enzym og et med det andet enzym uden at vi skærer i det ”røde” område. Ligerer vi nu de mange fragmenter der genereres ved PstI eller BamHI skæring ved en meget lav koncentration af DNA vil fragmenterne langt overvejende ligere med sig selv. Vi får derfor genereret en række cirkulære molekyler af forskellig længde. Fidusen er, at kun et cirkulært DNA molekyle indeholdende det ”røde” område kan PCR amplificeres med vores primere. Resultatet at PRC reaktionen er et linerært stykke DNA, der indeholder de ønskede opstrøms og nedenstrøm sekvenser.

20

Én-hybrid teknikken En-hybrid metoden anvendes ofte hvis man vil klone transkriptionsfaktorer fra

højere eukaryoter. Transkriptionsfaktorer er karakteriseret ved at de kan binde en bestemt DNA sekvens (promotor element) og aktivere transkription. Problemet er imidlertid, at et transkriptionsaktiverende domæne fra højere eukaryoter ikke fungerer i gær. Så selv om trankriptionsfaktoren binder til den rigtige sekvens i en gærcelle, vil det transkriptionsaktiverende domæne ikke kunne interagere med det generelle transkriptionsapparat og aktivere transkriptionsinitiering. For at finde cDNA kodende for den trankriptionsfaktor, der binder et bestemt identificeret DNA element, fremstiller vi et reporterplasmid med en minimalpromotor (TATA box) og det promotorelement, der bindes af vores ukendte transkriptionsfaktor. Samtidig fremstiller vi et cDNA bibliotek Det transkriptionsaktiverende domæne af GAL4 (GAL4TR) fusioneres in frame til vores cDNA. Det rigtige fusionsprotein vil binde til DNA elementet i vores reporterkonstruktion og dermed via GAL4TR aktivere transkriptionen. Er ekspression af vores reportergen essentiel for gærens overlevelse vil kun de gærceller, der indeholder cDNA, der koder for et protein med affinitet for vores DNA element overleve. Teknikken er illustreret i Figur 16

21

ReportergenDNA element

GAL4TR

cDN

A

GAL4TRcD

NA

GAL4 -cDNA fusionTRP

Figur 16: llustration af principperne bag en-hybrid teknikken. Der fremstilles et cDNA bibliotek i en gærvektor indeholdende en konstitutiv promotor. cDNA biblioteket transformeres i en gærstamme, der indeholder et reporterplasmid bestående af et DNA element fusioneret til en minimalpromotor og et reportergen, som f.eks. kunne være et LYS2 gen. Efter transformation i en lys2 stamme og selektion for lysin autotrofi vil kun transformanter, der er i stand til at initiere transkription af reportergenet kunne gro. Disse transformanter indeholder cDNA, der koder for protein med affinitet for vores DNA element.

22

To-hybrid teknikker Ofte er man interesseret i at undersøge, om to proteiner eller proteinfragmenter

interagerer in vivo. Ud over immunoprecipitation efterfulgt af western blotting er to-hybridteknikken den eneste mulighed. To-hybridteknikken udnytter, at transkriptions-faktorer er opbyggede af mindst to uafhængige domæner; det DNA bindende domæne og det transkriptionsaktiverende domæne. Det DNA bindende domæne er i stand til at genkende en bestemt sekvens i en promotor/enhancer region, medens det transkriptionsaktiverende domæne er i stand til at interagere med det generelle transkriptionsapparat og aktivere transkription. Hvis vi vil vise at to proteiner X og Y interagerer, kan vi fremstille et plasmid der koder for en in frame fusion mellem det DNA bindende domæne fra gærens GAL4 protein (GAL4DNA)og protein X. Expression af dette fusionsprotein vil bevirke, at der dannes et protein, der vil kunne binde til DNA indeholdende GAL4 proteinets genkendelsessekvens. Samtidigt fremstiller vi et plasmid, der koder for en in frame fusion mellem det transkriptionsaktiverende domæne fra GAL4 (GAL4TR) og protein Y. Hvis protein X og protein Y kan interagere, vil de danne et proteinkompleks, hvorved det transkriptionsaktiverende domæne bliver bundet til en promotor med GAL4 genkendelsessekvens og transkriptionen vil aktiveres. Indeholder værstorganismen en transkriptionel fusion mellem en promotor, hvis aktivitet er afhængig af GAL4, og et reportergen, vil dette kun blive udtrykt hvis protein X og protein Y interagerer stabilt. Reportergenet kan være en autotrof markør (f.eks. et LYS2 gen) eller lacZ fra E. coli. Aktivering af reportergenet vil således gøre en lys2 stamme autotrof (den kan leve uden lysin i mediet) eller gøre stammen blå på en X-gal plade.

Systemet kan også bruges til at fiske cDNA kloner, der koder for protein, som er i stand til at binde et bestemt kendt protein. Ønsker vi f.eks. at bestemme, hvilke proteiner der interagerer med protein X, vil vi fremstille et cDNA bibliotek i en vektor der indeholder GAL4TR. Biblioteket vil vi fremstille så vi opnår in frame fusioner mellem GAL4TR og vores indsatte cDNA. Kun cDNA kloner, der koder for et protein der binder til X, vil give anledning til transkription af reportergenet. Er reportergenet et autotrof markør vil de rigtige gærkolonier kunne selekteres på plader.

Her har vi beskrevet to-hybridsystemet i gær under anvendelse af GAL4 proteinet. Der findes forskellige variationer over dette tema, så som anvendelse af andre DNA bindende proteiner og transkriptionsaktiverende domæner. Endvidere er der udviklet to-hybridsystem til anvendelse i E. coli. Teknikken er illustreret i Figur 17

23

ReportergenGAL4 UAS

GAL4 -XDNAP

P GAL -YTR

GAL4DNAX

GAL4DNAX

GAL4TR

Y

GAL4TR

Y

Figur 17: Illustration af to-hybrid teknikken: En gærstamme transformeres med to plasmider, der udtrykker GAL4DNA-X fusionen henholdsvis GALTR-Y fusionen fra en konstitutive promotorer (P). Gærstammen indeholder på sit kromosom en fusion mellem minimalpromotor (TATA box) og GAL4 UAS (upstream activating sequence), som er nødvendig for effektiv transkription fra promotoren. Hvis protein X binder til protein Y, bliver det transkriptionsaktiverende domæne bragt i position til at kunne aktivere transkription, og reportergenet bliver transkriberet. I litteraturen kaldes X ofte for ’bait’ og Y for ’prey’.

24

Bestemmelse af polysomfordelingen i eukaryote celler

Ofte er det interessant at vide, hvorledes frekvensen af translationsinitieringer

reagerer på en bestemt fysiologisk påvirkning. Da translationen normalt er reguleret

på initieringsniveau, vil antallet af ribosomer på det enkelte mRNA molekyle afspejle

initieringsfrekvensen.

For at fastfryse ribosomerne på mRNAet under oprensning tilsættes

cykloheximid, som inhiberer elongering af ribosomerne. Herefter kan cellerne lyseres

og celleekstraktet påsættes en sukrosegradient, der separerer efter densitet.

Sædvanligvis anvender man en gradient der indeholder fra 15-47% sukrose. Jo flere

ribosomer, der sidder på mRNAet, jo længere migrerer ribosom-mRNA komplekset i

sukrosegradienten. Efter ultracentrigering pumpes gradienten ud af centrifugerøret og

0.5 – 1.0 ml fraktioner opsamles. På vej til fraktionsopsamleren passerer væsken en

UV-recorder, der måler UV absorptionen ved 260 nM. Ved denne bølgelængde er

absorptionen propertional med indholdet af nukleinsyre. Figur 18 viser i skematisk

form forsøgsopstillingen. Figur 18 viser udprintet fra computeren der kontinuert

opsamler UV data. UV absorptionen er angivet som funktion af det volumen, der er

pumpet ud af gradienten. Den viste UV profil er karakteristisk for en eukaryot celle

med aktiv proteinsyntese.

Ønsker man at bestemme, hvor i gradienten et givet mRNA molekyle

befinder sig (og dermed om det er i polysom, monosom eller nøgent RNA fraktionen)

kan det gøres ved Northern blotting, RNase protection eller real-time PCR på de

opsamlede fraktioner.

25

UV monitor

Pumpe

47% sukrose

Fraktionsopsamler

15%

47%

Computeropsamlingaf data

Figur 18: Skematisk oversigt over ”instrumentparken” til bestemmelse af polysomfordelingen i eukaryote celler. Et typisk opsamlet datasæt er vist i Figur 19.

26

Polysomer

Figur 19: Resultatet af en polysomanalyse fra en levercelle med aktiv proteinsyntese. Positionen af 40S, 60S, monosomer (M) og polysomer er angivet. Sukrosekoncentrationen stiger fra højre mod venstre .

27

Filterbindingsassay En alternativ metode til undersøgelse af binding mellem protein of DNA ved EMSA er filterbindingsassay. Metoden bygger på det princip at nitrocellulosemembraner ikke binder dobbelstrenget DNA men protein. Dobbelstrenget DNA tilbageholdes derfor kun af filteret, hvis det er bundet til et protein. Dette simple assay kan anvendes til at kvantificere protein-DNA interaktionen. Dette kan også bruges til at separarere enkelstrenget DNA fra dobbeltstrenget. Som i et EMSA assay anvendes radioaktivt mærkede dobbelstrengede oligonukleotider. Princippet i assayet er vist i Figur 20.

28

A B

C

Figur 20: Princippet i filterbindingsassay. Dobbelstrenget DNA løber igennem nitrocellulose membranen, medens protein tilbageholdes. DNA, der er bundet til protein, tilbageholdes derfor også. Anvendes radioaktivt mærket DNA kan den tilbageholdte mængde DNA bestemmes ved scientillationstælling.

29

Site-directed mutagenese ved ”overlap extension”

Ofte ønsker man at ændre på nukleotidsekvensen i et klonet stykke DNA. Det

kan være for at undersøge betydningen af enkelte nukleotider for binding af en

transkriptionsfaktor eller for at ændre på den primære struktur af et protein. Den

nemmeste måde at gøre det på, er ved hjælp af PCR. Figur 21 illustrerer teknikken og

Figur 22 giver et konkret eksempel.

Figur 21: Skematisk oversigt over den af Ho et al (1989) beskrevne site-directed mutagenese

protokol. Dobbelstrenget DNA templates og syntetiske DNA primere er angivet som orienterede linjer.

Pilen angiver 5'- 3' orienteringen af den enkelte DNA streng. Mutationsstedet er angivet med en sort

firkant. PCR primere er angivet med små bogstaver mens PCR produkter er angivet med store

bogstaver, som angiver hvilke primere, der blev brugt til PCR amplifikationen. Den indrammede del af

figuren angiver intermediæren under den afsluttende PCR reaktion, hvor de denaturerede initiale PCR

fragmenter anneales i de overlappende regioner og hvor de frie 3' ender forlænges af DNA

polymerasen. Resultatet er et PCR fragment indeholdende den ønskede mutation. Dette DNA fragment

kan nu klones tilbage i plasmidet, idet PCR fragmentet er planlagt således at det i enderne indeholder

genkendelsesekvenser for restriktions enzymer.

30

For at konkretisere metoden fra Figur 20 viser nedenstående figur sekvenserne af de

primere der skal bruges for at ændre den med fed skrift angivne adenin til cytosin. C

↑ 5’ GTCATAGCGGATTAGCAAAG------------------GCTTACGTAAGCTGACTGGC------- 3’ CAGTATCGCCTAATCGTTTC------------------CGAATGCATTCGACTGACCG--------

------------------------------------------TAGCTAGCCGGATTTCGATGCTG 3’ ------------------------------------------ATCGATCGGCCTAAAGCTACGAC 5’ PCR 1: PCR fragment genereret med primeren 5’ GTCATAGCGGATTAGCAAAG 3’ Og mutant-primeren 5’ GCCAGTCAGCGTACGTAAGC 3’. Dette PCR fragment har sekvensen 5’ GTCATAGCGGATTAGCAAAG----------------------GCTTACGTACGCTGACTGGC 3’ 3’ CAGTATCGCCTAATCGTTTC----------------------CGAATGCATGCGACTGACCG 5’ PCR 2: PCR fragment genereret med primeren 5’ CAGCATCGAAATCCGGCTA 3’ og Mutant-primeren 5’ GCTTACGTACGCTGACTGGC 3’. Dette PCR fragment har sekvensen 5’ GCTTACGTACGCTGACTGGC-------------------TAGCTAGCCGGATTTCGATGCTG 3’ 3’ CGAATGCATGCGACTGACCG-------------------ATCGATCGGCCTAAAGCTACGAC 5’ PCR 3: PCR fragment generet med fragmenterne fra de to initielle PCR reaktioner som template og primerne 5’ GTCATAGCGGATTAGCAAAG 3’ og 5’ CAGCATCGAAATCCGGCTA 3’ (de to ”yderprimere”). Dette fragment har sekvensen 5’ GTCATAGCGGATTAGCAAAG------------------GCTTACGTACGCTGACTGGC------- 3’ CAGTATCGCCTAATCGTTTC------------------CGAATGCATGCGACTGACCG--------

------------------------------------------TAGCTAGCCGGATTTCGATGCTG 3’ ------------------------------------------ATCGATCGGCCTAAAGCTACGAC 5’ Figur 22: Et konkret tilfælde for at illustrere metoden der er skematiseret i Figur 20.

31

Alternativ site directed mutagenese protokol

En anden metode til site directed mutagenese er at in vitro replikere et plasmid

ved hjælp af en primer indeholdede de(n) ønskede nukleotidsubstitutioner og en

termostabil DNA polymerase. Princippet i metoden er vist nedenfor og bygger på at

mutantprimeren indbygges i det ”nye” plasmid som resultat af DNA syntesen.

Samtidig gøres der brug af restriktionsenzymet DpnI, som kun skærer sekvenser som

er enten fuldt metylerede eller hemimetylerede. Skæres DNAet efter endt syntese vil

de oprindelige template strenge blive nedbrudt og dermed ikke kunne transformere E.

coli. Da syntesen af DNA sker i tilstedeværelse af u-methylerede nukleotider vil de

nysyntetiserede plasmider ikke blive skåret, og derfor give anledning til

transformanter i E. coli. Derved opnår man en forøget frekvens af plasmider

indeholdende de(n) ønskede substitutioner.

32

Figur 23 : Alternativ site-directed mutagenses protokol til overlap extension metoden. De to strenge i

template DNAet er vist som rød henholdsvis blå. Mutantprimerne er angivet som pile. Et gult kryds

angiver inkorporering af nukleotidsubstitutionen. Efter den første replikationsrunde vil der være

plasmider med en mutant streng og en vildtype streng. Efter den anden replikationsrunde vil der være 2

plasmider med mutation i begge strenge og to plasmider med en muteret streng og en vildtype streng,

Jo flere replikationsrunder jo flere korrekte plasmider. Hvis nogle plasmider slet ikke replikeres, vil de

selvfølgelig også være tilstede. DpnI skæring fjerner plasmider med to eller en vildtype streng.

33

Fusionering af to DNA fragmenter ved hjælp af PCR. Den i Figur 21 viste metode til site-directed-mutagenese kan også bruges til præcist

at fusionere to DNA fragmenter. Princippet bygger igen på ”overlap extension”.

Ønsker vi at fusionere de to nedenstående DNA fragmenter på de viste steder kan vi

generere to initielle PCR fragmenter, der har sekvensidentitet der, hvor den endelige

fusionering skal foregå.

PCR 1: PCR på den øverste template med primerne A og B. PCR 2: PCR på den øverste template med primerne C og D. PCR 3: De to initielle PCR produkter blandes sammen og der foretages PCR med primer A og D. PCR 1 PCR 2

PCR 3

34

Proteomics. De analyser, det er blevet muligt at udføre på hele cellers

proteinsammensætning, går under fællesbetegnelsen ”proteomics”. Proteomet er således en beskrivelse af hele cellens indhold af protein; hvilke der er tilstede under bestemte fysiologiske omstændigheder og hvor meget der er af det enkelte protein. Oftest udføres analysen ved at koble to-dimensionel gelelektroforese med massespektrometri. Der kan dog også anvendes søjlekromatografiske metoder til at adskille proteomet før identifikationen ved massespektrometri.

To-dimensionel gelektroforese udføres ved, at et proteinekstrakt separeres ved isoelektriosk fokusering i en immobiliseret pH gradient. Under den isoelektriske fokusering vandrer det enkelte protein i et elektrisk felt, indtil det når et område med en pH værdi hvor proteinets nettoladning er nul. Herefter er det upåvirkede af det elektriske felt og forbliver på denne position. Separering i den første dimension sker i en en lille ”strip” som er nogle få millimeter tyk og typisk 18 eller 24 cm lang. Efter denne separation ligger proteiner adskilt som i en stregkode fra Brugsen. Da mange proteiner har det samme isoelektriske punkt, er der flere proteiner tilstede i hver ”streg” i ”stregkoden”. Resultatet ses i Figur 24.

For at adskille proteiner med det samme isoleketriske punkt foretages en adskillelse efter størrelse. Dette gøres ved at separere proteinerne ved SDS-PAGE (poly-akryl-amid-gelelektroforese i tilstedeværelse af detergentet sodium-dodecyl-sulphate). Denne adskillelse sker efter størrelse. Rent praktisk foregår det ved, at ”strippen” lægges ovenpå SDS-PAGE gelen og fæstnes med agarose. Derefter pålægges gelen et elektrisk felt og de SDS-bundne proteiner vandrer med en mobilitet, der er afhængig af deres størrelse. Efter endt kørsel visualiseres proteinerne typisk ved sølvfarving, som kan detektere proteiner i ng området. Resultatet ses i figur 24.

En sådan 2-dimensionel gel kan separere op mode 2000 proteiner. Da en typisk eukaryot celle udtrykker væsentlig flere proteiner, kan følsomheden øges ved at anvende 1. dimensions strips, der separerer proteiner i mindre pH intervaller. Man kan således få strips der separerer fra pH 3–5.6, 5.3–6.5, 6.2–7.5, 7–11 eller pH 3 til pH 11.

Formålet med den to-dimensionelle separation af protein er oftest at bestemme ændringer i cellens proteom som resultat af en fysiologisk ændring. Det er derfor essentielt at kunne bestemme identiteten af de proteiner hvis koncentration ændres. Da vi ønsker beskrivelse af hele proteomet der det derfor vigtigt, at identifikation kan foregå hurtigt og nemt. Dette er i dag muligt på grund af udviklingen indenfor to områder; sekventering og bioinformatisk analyse af hele genomer samt massespektrometri. Går man ind på nettet på adressen kan man se hvor mange genomer der er sekvensbestemt.

Ud fra en genomsekvens er det muligt at komme med kvalificerede gæt på, den primære struktur af hver enkelt protein den enkelte organisme kan producere. Med den primære struktur til rådighed kan man forudsige, hvorledes et sekvensspecifik proteolytisk enzym vil spalte hver enkelt protein. Et sådant enzym er serin proteasen trypsin, som spalter efter lysin og arginin. Vi kan således beregne, hvor store peptidfragmenter trypsinbehandling af hvert enkelt protein i cellen vil generere. Nu er det så heldigt, at trypsinfragmenterne udgør et fingeraftryk af hvert enkelt protein. Kendskab til de tryptiske fragmenters størrelse kan således for mere end 75% af alle proteiners vedkommende bruges til at identificere proteinet. Her kommer massespektrometri ind i billedet. Massespektrometri er en ekstrem nøjaktik

35

teknik til bestemmelse af proteiners og peptiders molekylvægt (se lærebogen afsnit 24.4 Proteomics til side 845 nederst).

Med kendskab til molekylvægten af de tryptiske fragmenter og den organisme proteinet er isoleret fra kan vi gå på internettet på adressen http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe og få at vide, hvilket protein vi har isoleret fra vores 2-D gel.

1. Dimension

. 2. Dimension Figur 23: Illustration af hvorledes proteinerne er fordelt efter isoelektrisk fokusering i den 1. dimension og efter separation i den 2. dimension. Efter 2. dimension fremstår proteinerne som pletter, hvor størrelsen og intensiteten i pletten siger noget om proteinmængden. I en ”rigtig” gel vil der være om mod et par tusinde pletter, som kan identificeres. De interessante pletter skæres ud af gelen og proteinerne fordøjes i gelen med trypsin, hvorefter de tryptiske fragmenter oprenses og deres molekylvægt bestemmes ved massespektrometri.

36

Transkriptomanalyse

Hvor 2-D elektroforese giver information om proteomets sammesætning, er der ved

hjælp af microarray teknologi mulighed for at bestemme transkriptomets

sammensætning. Transkriptomet udgøres af samtlige mRNA molekyler i cellen.

D.v.s. at en transkriptomanalyse giver information om hvilke mRNA der findes i en

givet celle på et givet tidspunkt samt hvad koncentrationen af det enkelte mRNA

molekyle er. I det følgende vil vi kigge på den teknologi, der anvendes af firmaet

Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx) Som det var tilfældet med de

tidligere beskrevne mRNA analyser (northern blotting, RNase protektion og real time

PCR) bygger microa array teknologien på at bestemte nukleinsyresekvenser kan

identificeres ved hjælp et oligonukleotid med komplementær sekvens og mængden af

den bestemte nukleinsyresekvens kan kvantifiseres.Forudsætningen for at kunne

fremstille en microarray chip er at nukleotidsekvensen af hele organismen er kendt og

at nukleotidsekvensen af alle de mRNA molekyler organismen kan producere kan

estimeres ved en bioinformatisk analyse. Er dette tilfældet kan man designe

oligonukleotider (prober) der vil være specifikke for hvert enkelt transkript.Hver

probe er 25 nukleotider lang og syntetiseres direkte på en glasoverflade med en

fotolitografisk proces udviklet til elektronikindustrien. For at øge nøjaktigheden i

kvantifikationen syntetiseres der 22 forskellige nukleotider til genkendelse af hvert

transkript. Hver probe hybridiserer så til hver sit område af det enkelte mRNA

molekyle.Da det er vigtigt at kunne estimere den uspecifikke binding mellem den

enkelte probe og det enkelt mRNA molekyle, syntetiseres der også for hver probe en

mis-match probe (en probe indeholdende en nukleotidsubstitution i midten af proben,

hvilket under optimale hybridiseringsomstændigheder vil forhindre binding til den

korrekte target sekvens).Metoden til syntese af de mange prober på glaspladen er vist

i Figur 25.

For at kunne kvantificere den mængde mRNA der er hybridiseret til hver

enkelt probe er det nødvendig med en detektionsmetode der er simpel og meget

følsom. Derfor mærkes RNAet før det hybridiseres til micro array chippen med biotin,

som flourescerer efter bestråling med laserlys. D.v.s. at laseren exciterer den

inkorporerede biotin og måler flourescence fra hvert lille område af chippen hvor der

sidder oligonukleotider. Da der sidder >500.000 prober per cm2 er det vigtigt, at der

kun måles fluorescens fra et sæt prober adgangen.

37

Figur 25: Metode til syntese af prober direkte på glaspladen. Som nævnt sker der syntese i >500.000

punkter per cm2. Koncepter er, at der fremstilles en lang række ”net”, der kun tillader lys at slippe

igennem de steder, hvor der skal kobles et nyt nukleotid på. Der skal således skiftes net efter hvert

syntesetrin.

Protokollen for mærkning af mRNAet med biotin og hybridisering til microaary

chippen er vist i Figur 26.

38

Figur 26: Protol til mærkning af mRNA og hybridisering til micro array chippen.

39

Differential display Konceptet bag denne teknik er at visualisere alle mRNA molekylær i en celle

under to forskellige fysiologiske omstændigheder for at identificere hvilke mRNA

molekyler, der er differentielt udtrykt

Teknikken giver et sekvensen af et stykke cDNA der repræsenterer et differentielt

udtrykt gen.

Sekvensen af den isolerede cDNA stump bruges efterfølgende til at klone

fuldlængde cDNA.

Som vist i Figur 27 kan mRNAdeles op i fire grupper efter hvilket nukleotid, der

sidder før det første A i polyA halen

5’

5’ AAAAAAA

5’

5’

AAAAAAA 3’

AAAAAAA 3’

G

C

T

A AAAAAAA 3’

3’

Figur 27: Strukturen af de tre klasser cellens mRNA kan inddeles i. Revers transkription med

polydTC, polydTG eller polydTA primer vil generere cDNA fra ca. 1/3 af cellens mRNA (Hvis der er

et eller flere A’er før polyA halen kommer der på et tidspunkt et G, C eller T). Klassen af mRNA med

et A før polyA halen vil såles kunne underopdeles i tre klasser hvor nukleotidet før det første A er

enten G,C, eller T.

For at generere tilfældige fragmenter fra forskellige mRNA sekevnser er det

nødvendigt at amplificere sit revers transkriberede DNA med en primer som annealer

til en sekvens der er så kort, at den findes i de fleste mRNA molekyler. Dette sikres

ved at anvende en relativ kort primer på 13 nukleotider. Dog kan vi ikke bruge

samtlige 13 merer da vi så ville få alt for mange PCR produkter til at vi praktisk kan

håndtere dem. Samtidigt er det vigtigt, at revers transkriptions primeren altid binder

det samme sted til 3’ enden af mRNAet. Det sikres ved, at have enten et G, C eller T i

denne primers 3’ ende. Primeren kan da kun fungere, hvis den binder korrekt til

polyA halen. Figur 28 viser hvorledes der genereres DNA fragmenter ved PCR

amplifikationen med polydT primeren og de tilfældige 13 merer.

40

GAAAAAAAA 3’ OH 3’ OH

3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH 3’ OH

CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p CTTTTTTTTT 5’ p

CTTTTTTTTT 5’ p 5’ p

mRNA

cDNA

Tilsæt en blanding af 40 tilfældige 13 nukleotider lange primere ( ) og polydTC primeren ( )

PCR

α−[32P]-GTP

Figur 28: Skematisk oversigt over hvorledes den faste position af revers transkriptionsprimeren og

bindingsstedet i det enkelte mRNA molekyle giver PCR fragmenter af forskellig længde fra forskellige

mRNA molekyler. For at øge sensitiviteten i assayet tilsættes α-[32P]-GTP til reaktionen

For at visualisere alle de genererede cDNA fragmenter separeres de i en

denaturerende poly-akrylamid-gel (indeholder urinstof)

De separerede bånd visualiseres ved PhosphoImage analyse eller autoradiografy.

Figur 29 viser i skematisk form resultatet af et differential display forsøg hvor

en kontrol celle er sammenlignet med den ”den rigtige prøve”. F.eks. en normal celle

og en cancercelle.

41

Kontrol Prøve

Differentielt udtrykt mRNA

Figur 29: resultatet af et differential display experiment, hvor mRNA mønsteret sammenlignes

mellem en kontrol celle og den rigtige celleprøce. Bånd der forsvinder eller opstår i prøven er

interessante og repræsenterer differentialt udtrykte gener.

cDNA, der repræsenterer differentielt udtrykt mRNA, kan ekstraheres fra gelen og

PCR amplificeres med den anvendte polydT primeren og de 40 tilfældige 13 merer.

Dernæst sekventeres PCR fragmentet.

Sekvensen kan bruges til at screene et cDNA bibliotek eller til at designe primere til

5’ og 3’ RACE

42

Ekspressionskloning i Xenopus oocytter

Når det eneste håndtag, man har for at screene et cDNA bibliotek, er den aktivitet, det

tilhørende protein besidder, er ekspressionskloning den eneste mulighed.

Ekspressionskloning af cDNA kodende for membranproteiner tager udgangspunkt i

æg (oocytter) fra den afrikanske klofrø, Xenopus laevis. Oocytter herfra har den

fordel, at de e 3-5 mm store, hvilket tillader injektion i oocytter med nogle få nl RNA

eller DNA opløsning via en meget tynd glaspipette. Oocytten har en høj kapacitet for

proteinsyntese så det injicerede RNA vil blive translateret effektivt og proteinet vil

blive transporteret til den rigtige membran. Man kan injicere RNA oprenset fra væv

eller man kan injicere in vitro fremstillet RNA. Oocytternes store diameter gør også,

at man kan anvende dem til elektrofysiologiske eksperimenter. Dette er relevant, hvis

man udtrykker en ion-kanal, idet transport gennem kanalen vil forårsage, at der løber

en strøm gennem oocyttens membran. Denne strøm kan så måles. Så vil vi gerne

undersøge, om der findes en eller flere K-kanaler i hjernevæv, kan vi oprense polyA

RNA fra hjerne og injicere dette i oocytten. Kan vi nu måle en K+ afhængig strøm

gennem oocytten, må vi konkluderem at hjernevævet indeholder polyA RNA,

kodende for en K-kanal.

Næste trin vil være, at vi gerne vil klone cDNA kodende for de K-kanaler, der findes i

vores hjernevæv. Her er problemet, at vi intet kender til kanalen, bortset fra at de kan

transportere K+ ioner. Kanaler forekommer i så lille koncentration i nativt væv, at det

umuliggør oprensning og sekventering af proteinet. Anvendelse af en probe er derfor

udelukket. K-kanal mRNA udgør måske 0.05% af det total mRNA, så vi er virkelig

ude at lede efter en nål i en meget stor høstak.

For at komme igang, vil vi først størrelsesfraktionere vores polyA RNA fra hjerne for

at finde de(n) længder af mRNA, der koder for K-kanalen/K-kanalerne. Dette kan

man gøre ved ultracentrifugering i en sukrosegradient, som omtalt under afsnittet

”polysom analyse”. Vi udtager så fraktioner fra gradienten og injicerer dem en af

gangen i oocytterne og måler elektrofysiologisk, om der går en K+ strøm gennen

oocymembranen. Den fraktion, der giver positivt signal, anvender vi til at fremstille et

cDNA bibliotek i en vektor, der tillader in vitro transkription. Biblioteket, der typisk

vil indeholde 4 104 kolonier, plades ud på 10 petriskåle. Hvis andelen af K-kanal

mRNA er 0.05 % vil hver petriskål, der indeholder 4000 kolonier indeholde 2 rigtige

kolonier.

43

Vi isolerer nu cDNA fra samtlige 4000 celler på hver plade. Vi har således 10

portioner cDNA stammende fra hver sin petriskål. Hver portion cDNA in vitro

transkriberes til RNA, hvoraf en lille del injiceres i oocytter. Vi måler nu

elektrofysiologisk, hvilke oocytter der transporterer K+ ioner. En af de portioner

RNA, der gave et godt signal i vores elektrofysiologiske assay, anvender vi til at

fremstille et nyt cDNA bibliotek. Dette cDNA bibliotek består af 4000 kolonier, som

vi fordeler på 10 petriskåle, med 400 kolonier på hver plade. Vi gentager nu

proceduren fra før; oprensning af cDNA fra hver petriskål, in vitro transkription,

injektion af en lille del af RNAet i oocytter og elektrofysiologisk assay for kanal

aktivitet. Vi vil nu finde, at in vitro transkriberet cDNA fra mindst en petriskål giver

et positivt signal i vores assay. Lad os sige, at skål nummer 2 giver positivt signal. Så

ved vi, at blandt de 400 kolonier i vores bibliotek, er der mindst en, der koder for en

K-kanal.

Noget af det in vitro transkriberede cDNA fra den positive skål anvendes til at

fremstille et nyt cDNA bibliotek, som fordeles på 10 nye plader, med 40 kolonier på

hver. Igen fremstiller vi in vitro RNA fra disse 10 portioner, og lidt fra hver enkelt

portion injiceres i oocytter og, der screenes for kanal aktivitet. Antager vi, at skål

nummer 7 giver positivt signal, ved vi nu, at blant de 40 kolonier, er der minst en, der

koder for en kanal. Vi isolerer nu cDNA fra hver enkelt koloni, in vitro transkriberer

det og injicerer det i oocytter. De oocytter, der giver kanal aktivitet er blevt injiceret

med RNA fremstillet fra en enkelt cDNA klon. Vi har nu fundet cDNAet for vores K-

kanal og kan sekventere det samt bestemme proteinets primære struktur.

44

Pulse-chase experimenter

Ofte er man interesseret i at undersøge, hvad der sker med et makromolekyle in vivo

og hvor hurtigt det sker. For at være i stand til at følge en pool af molekyler kan man

mærke cellernes makromolekyler med en radioaktiv precursor i en kort periode, som

benævnes pulse perioden. Det kunne typisk være en blanding af [35S]-methionin og

[35S]-cystein. I denne periode vil de proteiner, der er under syntese (og som

indeholder cys/met), blive radioaktivt mærket. For at være i stand til at følge kun den

pulje af makromolekyler, tilsætter vi efter pulsen et stort overskud af koldt (ikke-

radioaktivt) met/cys. Det betyder i praksis, at hvis koncentration af de kolde

aminosyrer er 10.000 gange højere end de hotte, vil ribosomerne kun en ud af 10.000

gange inkorporere radioaktivt materiale under proteinsyntesen. Så i praksis betyder

det, at den radioaktive indkorporering slutter ved starten af chasen. Vi har derfor fået

generet en pulje af mærkede proteiner, hvis skæbne vi kan følge i tiden.

Vi har selvfølgelig brug for en måde at måle, hvad der sker præcist med vores favorit

protein og ikke alle cellens proteiner. Måden af isolere vores protein vil være med

immunoprecipitation, som angivet tidligere i værktøjskassen. Vi vil så lave

immunoprecipitation på protein isoleret umiddelbart før chasen og til forskellige

tidspunkter herefter. Når vi adskiller immunoprecipitatet ved SDS-PAGE og

analysere resultatet ved autoradiografi eller fosfoimage analyse, vil intensiteten af

båndet afspejle mængden af vore radioaktivt mærkede protein i cellen til de

forskellige tidspunkter. Sker der en post-translationel modifikation af proteiner, kan vi

også se det, hvis det giver anledning til en ændret mobilitet i gelen som funtion af

tiden.

Hvis vi vil bestemme proteinets halveringstid in vivo kan vi plotte intensiteten af det

radioaktive bånd i gelen mod tiden i et semilogaritmisk plot. Grunden til, at det skal

plottes semilogaritmisk er følgende: ændringen i proteinkoncentration med tiden er

givet ved følgende ligning:

d[protein]/dt = k – k [protein], hvor k er syntesehastigheden og ks d s d er

nedbrydningskhastigheden. Dette betyder at syntesen følger 0.ordens kinetik medens

nedbrydningen følger 1. ordens kinetik. Laver vi vores pulse-chase forsøg stopper

syntesen af radioaktivt protein, når chasen indledes. D.v.s. at ks = 0 efter dette

tidspunkt. Det betyder at d[protein]/dt = - kd [protein]. Løser vi denne

differentialligning får vi: [protein] (t) = [protein](t = 0) exp (-k t). d

I et semilogaritmisk plot vil vi derfor få:

45

Log{[protein](t)/[protein] (t = 0)} = -kd t. Vi får derfor en ret linje hvor hældningen er

–kd. Halveringstiden kan findes, som der tid der går fra proteinmængden ændres fra

100% til 50%.

46

Real time PCR

Den nemmeste og mest følsomme metode til kvantificering af mRNA er real time

PCR. Før vi kan udføre PCR reaktionen bliver vi nødt til at revers transkribere vores

mRNA (fremstille cDNA). Dette kan ske med random hexamerer, polydT eller en

sekvensspecifik primer. Det resulterende cDNA er så det vi bruger som template i

PCR reaktionen og reelt det, vi kvantificerer. Så en forudsætning for at estimatet af

vores mRNA er korrekt, er at alle mRNA molekyler revers transkriberes lige effektivt.

Konceptet i real time PCR er det samme som i konventionel PCR, blot kvantificeres

mængden af PCR produkt efter hver cyklus. Som det var tilfældet for micro array

analysen bygger kvantificeringen i real time PCR på måling af flourescens, således at

fluorescens intensitetet er propertional med mængden af PCR produkt. De to mest

anvendte kemier til real time PCR er SYBR green og TaqMan. SYBR green er et stof

som flourescerer, når det er bundet til ”minor groove” i dobbeltstrenget DNA, men

ikke (meget lidt ca. en faktor 1000 lavere) når det findes i fri opløsning. Mængden af

SYBR Green fluorescens vil derfor afspejle mængden af dobbelstrenget DNA i PCR

røret. Fordelen ved SYBR Green er, at det er billigt og kan bruges til kvantifikation af

alle templates, medens ulempen er at det netop binder uspecifikt til dobbelstrenget

DNA. Hvis der sker uspecifik amplifikation, vil dette bidrage til flourescencen,

hvorfor mængden af estimeret DNA derfor ikke bliver korrekt.

Figur 30: Princippet I SYBR Green detektion af dobbelstrenget DNA. SYBR Green (markeret med

grønt) fluorescerer 1000 gange kraftigere, når det er bundet til dobbelstrenget DNA, end det gør i fri

opløsning.

For at øge specificiteten i real time PCR kan man anvende TaqMan prober. Her

fremkommer fluorescencen fra hydrolyse af TaqMan proben. En TaqMan probe er

komplementær til det mRNA molekyle man ønsker at kvantificere. Derudover er

TaqMan probens 5’ ende mærket med en flourefor (et flourescerende stof) og dens 3’

47

ende er mærket med en Quencer (et stof der skærmer flourescencen fra floureforen).

Når floureforen og quenceren er fysisk tæt på hinanden detekteres der ingen

flourescens fra floureforen. Er floureforen og quenceren imidlertid ”langt” fra

hinanden kan vi registrere en flourescens.

Figur 31 viser et skematisk billede af en TaqMan probe.

Figur 31: Her ses placeringen af flourefor (Reporter) og quencer i den enkeltstrengede TaqMan

probe.

Figur 32 viser mekanismen for hvorledes TaqMan proben bringes til at fluorescere

under en PCR amplifikation.

48

Figur 32: Figuren viser hvorledes de to specifikke PCR primere og den specifikke TaqMan probe

annealer til den dobbelstrengede DNA template. Når DNA polymerasen møder TaqMan proben

displaceres og hydrolyseres denne ved hjælp af DNA polymerasens 5’ exonuklease aktivitet. Derved

frigøres fluoreforen fra quenceren, hvorfor der i real time PCR maskinen kan måles en flourescens,

hvis intensitet er propertional med mængden af template DNA.

I Figur 33 er der vist forløbet af en real time PCR reaktion samt defineret hvad den

såkaldte Ct værdi (Threshold value) er.

49

Amplification Plots4380,4319.alle.12.sep.2005.mxp

Figur 33: Resultatet af en real time PCR reaktion udført med SYBR Green kemi. Der

er ialt 5 PCR reaktioner, hvori der kan detekteres en fluorescens. Det ses, at der går et

antal cykler før maskinen kan detektere en specifik flourescens. Det mindste cycklus

nummer hvor maskinen sikkert detekterer en fluorescens kaldes Ct værdien. Det har

vist sig at Ct værdien afspejler den mængde PCR template, der var tilstede ved starten

af PCR reaktionen. Ct værdien kan derfor anvendes til at bestemme mængden af en

specifik template i en reaktionsblanding.

Amplifikationskurverne i Figur 33 vil være paralelle, hvis amplifikationseffektiviteten

er den samme for alle templates. Den maksimale amplifikationseffektivitet (100%) vil

kræve at mængden af DNA fordobles efter hver cyklus. Mængden af produkt som

funktion af antal cykler kan bestemmes som ; N = No (1 + E)c hvor N er antal

molekyler efter c cykler og E er PCR reaktionens effektivitet. E vil så ligge mellem 0

og 1. Amplifikationseffektiviteten vil ofte være mindre end 100% og dette påvirker

selvfølgelig de målte Ct værdier. Så vil man gerne kvantificere, hvor meget der er af

forskellige transkripter i den samme RNA preparation, bliver man nødt til at

bestemme amplifikationseffektiviteten for hvert primer sæt. Dette kan gøres ved at

50

lave real time PCR på en fortyndingsrække af sin template og plotte Ct værdierne

mod logaritmen til den initielle template koncentration. Et eksempel på en sådan

kurve er vist i Figur 34

.

Standard CurveQuantitative PCR 10 Fold Example.mxp

Figur 34: Resultatet af realtime PCR reaktioner med fortyndinger af template. Ct værdierne er plottet

mod logaritmen til den fortynding, der er sket af templaten. Ud fra hældningen på den rette kurve

beregnes effektiviteten til 107%.

Kvantificerer man f.eks. mængden af mRNA molekyle 1 relativt til mRNA

molekyle 2 må man korrigere for amplifikationseffektivitet for at få det samme

forhold mellem PCR produkternes antal, som mellem de initielle mRNA forhold.

Hvis vi ikke gør dette, vil forholdet mellem de genererede PCR fragmenter være

forskellig fra forholdet mellem de to mRNA molekyler i vores udgangs materiale.

Nedenstående formel kan bruges til at kvantificere to mRNA molekyler i forhold til

hinanden, når der tages hensyn til forskel i PCR amplifikationseffektivitet.

Ratio (E1/E2) = (1 + E2)Ct2 Ct1/(1 + E1)

Denne ratio fremkommer idet mængden af produkt 1 henholdsvis 2 ved deres Ct

værdi er givet ved;

N1 = No1(1 + E1)Ct1 N2 = No2(1 + E )Ct2. Da N = N2 1 2 ved de to produkters

respective Ct værdier fås at N Ct21 = N2 ↔ No1/No2 = (1 + E2) /(1 + E )Ct1

1

51