ENANTIOMEREK KIRÁLIS ELVÁLASZTÁSA ÉS

MEGKÜLÖNBÖZTETÉSE

Ph.D. ÉRTEKEZÉS

Készítette:

Berkecz Róbert

Témavezetők:

Péter Antal egyetemi tanár

Ilisz István egyetemi adjunktus

SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM Természettudományi és Informatikai Kar Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék

Kémia Doktori Iskola

2010

2

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK .................................................................................................2

AZ ÉRTEKEZÉSBEN HASZNÁLT GYAKORI RÖVIDÍTÉSEK...............................4

1. BEVEZETÉS................................................................................................................5

1.1. A KIRALITÁS ÉS A KIRÁLIS ELVÁLASZTÁSOK JELENTŐSÉGE ........................................5

1.2. CÉLKITŰZÉS .............................................................................................................6

2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÓ .................................................................................7

2.1. KIRÁLIS ÁLLÓFÁZISOK..............................................................................................7

2.1.1. Makrociklusos antibiotikum (glikopeptid) alapú királis állófázisok ...................8

2.1.2. Koronaéter alapú királis állófázisok ...............................................................15

2.1.3. Ciklodextrin alapú királis állófázisok..............................................................26

2.2. A HŐMÉRSÉKLET HATÁSA A KROMATOGRÁFIÁS ÉS A KIRÁLIS KROMATOGRÁFIÁS

ELVÁLASZTÁSRA...........................................................................................................31

2.2.1. A kromatográfiás elválasztás hőmérsékletfüggése...........................................31

2.2.2. A van´t Hoff egyenlet alkalmazása a kromatográfiában ..................................32

2.2.3. A van´t Hoff egyenlet alkalmazása a királis kromatográfiában .......................33

2.3. A TÖMEGSPEKTROMETRIA ALKALMAZÁSA A KIRÁLIS FELISMERÉSBEN......................33

2.4. A ß-LAKTÁM ÉS ß-AMINOSAV SZÁRMAZÉKOK KÉMIAI ÉS BIOLÓGIAI JELENTŐSÉGE.....35

3. KÍSÉRLETI RÉSZ ....................................................................................................36

3.1. VIZSGÁLT ANYAGOK ..............................................................................................36

3.2. FELHASZNÁLT VEGYSZEREK ...................................................................................41

3.3. ALKALMAZOTT BERENDEZÉSEK ..............................................................................42

3.4. ALKALMAZOTT FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS OSZLOPOK. .......................................42

4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK...............................................43

4.1. ELVÁLASZTÁSOK MAKROCIKLUSOS GLIKOPEPTID ÉS CIKLODEXTRIN ALAPÚ KIRÁLIS

ÁLLÓFÁZISOKON ...........................................................................................................43

4.1.1. A 4-Arilszubsztituált ß-laktámok elválasztása Chirobiotic T és TAG állófázison

.................................................................................................................................43

4.1.2. Kondenzált gyűrűs ß-laktámok és ß-aminosavak elválasztása Chirobiotic T,

TAG, V, VAG és Cyclobond DMP oszlopokon ..........................................................49

3

4.2. ELVÁLASZTÁSOK KORONAÉTER ALAPÚ KIRÁLIS ÁLLÓFÁZISOKON ............................56

4.2.1. Aromás ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 1 állófázison............56

4.2.2. Alifás és aliciklusos ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 1

állófázison................................................................................................................64

4.2.3. Alifás és aromás ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 2 állófázison

.................................................................................................................................68

4.3. A ß3-AMINOSAV ENANTIOMEREK KIRÁLIS TÖMEGSPEKTROMETRIÁS

MEGKÜLÖNBÖZTETÉSE ..................................................................................................73

5. ÖSSZEFOGLALÁS...................................................................................................80

6. SUMMARY................................................................................................................83

7. HIVATKOZÁSOK ....................................................................................................86

8. KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA ....................................................................................92

8.1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK .....................................................92

8.2. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ AZ ÉRTEKEZÉSBEN FEL NEM HASZNÁLT

KÖZLEMÉNYEK .............................................................................................................93

8.3. POSZTEREK ............................................................................................................94

8.4. ELŐADÁSOK...........................................................................................................95

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS....................................................................................96

10. FÜGGELÉK.............................................................................................................97

10.1. NÉHÁNY KIVÁLASZTOTT ARILSZUBSZTITUÁLT ß-LAKTÁM KROMATOGRAMJA .........97

10.2. NÉHÁNY KIVÁLASZTOTT ARIL SZUBSZTITUÁLT ß3-AMINOSAV KROMATOGRAMJA ....98

10.3. NÉHÁNY KIVÁLASZTOTT ARIL SZUBSZTITUÁLT ß2-AMINOSAV KROMATOGRAMJA ....99

4

Az értekezésben használt gyakori rövidítések

2-PrOH: propán-2-ol

2-BuOH: bután-2-ol

AcOH: ecetsav

CD: ciklodextrin

DMP: dimetilfenilkarbamoil- ß –ciklodextrin oszlop

EtOH: etanol

KÁF: királis állófázis

Korona 1: koronaéter állófázis szabad szilanol csoportokkal

Korona 2: koronaéter állófázis szabad szilanol csoportok nélkül (endcapped)

MeCN: acetonitril

MeOH: metanol

PIM: poláris-ionos mód

POM: poláris-szerves mód

PrOH: propán-1-ol

R: ristocetin A oszlop (ChirobioticTM R)

T: teicoplanin oszlop (ChirobioticTM T)

TAG: teicoplanin aglikon oszlop (ChirobioticTM TAG)

t-BuOH: 2-metilpropán-2-ol

TEA: trietilamin

TEAA: trietil-ammóniumacetát

TFA: trifluorecetsav

V: vankomicin oszlop (ChirobioticTM V)

VAG: vankomicin aglikon oszlop (ChirobioticTM VAG)

5

1. Bevezetés

1.1. A kiralitás és a királis elválasztások jelentősége

A kiralitás és a hozzá kapcsolódó jelenségek iránti érdeklődés az utóbbi években

mind tudományos, mind gazdasági szempontból megsokszorozódott, elsősorban a biológia,

az orvostudomány, a gyógyszeripar, valamint a növényvédőszer-, élelmiszer- és

színezékipar támasztotta igényeknek köszönhetően. Egy 2004-es tanulmány az

engedélyezett királis gyógyszerek százalékos megoszlását vizsgálta 1983-2002 között. Az

eltelt 10 év alatt a racém hatóanyaggal rendelkező újonnan engedélyezett gyógyszerek

száma jelentősen lecsökkent és a tiszta enantiomer formában való előállítás került előtérbe

(1. Diagram). A tiszta enantiomert tartalmazó gyógyszerek piaci részesedése becslések

szerint az 1996 évi 27 %-ról (74,4 milliárd USA $) 2002-ben 39 %-ra nőtt elérve a 151,9

milliárd USA dollár bevételt [1].

12

34

5

Racémok (diaszteromerkeverékekkel)

Tiszta enaniomerek

Nem királisok

43

3635

41

34

25

3942

41

58

32

2524

18

8

0

10

20

30

40

50

60

Arány / %

1983-19861987-1990

1991-19941995-1998

1999-2002Periódus / év

1. Diagram. Gyógyszerek hatóanyagának kiralitás szerinti eloszlása 1983 és 2002 között

A biológiai és farmakológiai hatású anyagok nagy része királis. Az emberi

szervezetben lejátszódó fizikai és kémiai folyamatok során a bejuttatott

gyógyszermolekula aszimmetrikus biológiai makromolekulákkal (fehérjék,

polinukleotidok, glikopeptidek) kerül kölcsönhatásba. Ez a királis környezet képes

megkülönböztetni az enantiomereket is. Az enantiomerek hatástani tulajdonságai, úgymint

farmakodinamikai, farmakokinetikai, lebomlási, fehérjékhez kötődési és mérgezési hatásuk

gyakran eltérő [2]. Az alkalmazott terápiás hatásért felelős enantiomer, az eutomer mellett

jelenlévő másik izomer, a disztomer csak ideális esetben inaktív [3]. Számos példa

Racemátok

6

bizonyítja, hogy a disztomer mutathat:

azonos farmakológiai hatást, de nagyobb toxicitást,

más farmakológiai hatást vagy

antagonizmust.

Ennek következményeként a gyógyszerhatóanyag enantiomerek megkülönböztetése és

elválasztása elengedhetetlen feladat. Napjainkban a jelentős piaci részesedéssel rendelkező

gyógyszerek nagy része tiszta enantiomer formában törzskönyvezett, ami a királis analitika

szükségességére utal [4].

1.2. Célkitűzés

Munkám során célul tűztük ki folyadékkromatográfiás módszerek fejlesztését

különböző biológiai és gyógyszeripari szempontból fontos vegyületek elválasztására új

fejlesztésű királis kolonnákon. Vizsgálni kívántuk:

a) aromás ß-laktám enantiomerek elválasztását makrociklusos glikopeptid alapú

Chirobiotic T és Chirobiotic TAG királis állófázisokon,

b) kondenzált gyűrűs ß-laktám és ß-aminosav enantiomerek elválasztását

makrociklusos glikopeptid (Chirobiotic T, TAG, V, VAG és R) és ciklodextrin

(Cyclobond DMP) oszlopokon,

c) 3-arilszubsztituált, alifás és aliciklusos ß3–aminosav enantiomerek

folyadékkromatográfiás elválasztását (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav

szelektort tartalmazó koronaéter állófázison,

d) alifás és aromás ß2-aminosav enantiomerek elválasztását módosított koronaéter

állófázison.

Célul tűztük ki, hogy közvetlen királis folyadékkromatográfiás elválasztások során, a

vizsgált vegyületek és a királis szelektorok szerkezetének ismeretében, a kromatográfiás

körülmények változtatásával befolyásoljuk az elválasztást és a kromatográfiás paraméterek

változásának nyomonkövetésével értelmezni kívántuk az eluens minőségének és

összetételének, a hőmérsékletnek és a vizsgált vegyületek szerkezetének hatását a királis

megkülönböztetési folyamatokra.

További célunk között szerepelt Cooks kinetikai tömegspektrometriás módszer

alkalmazásával aromás ß3-aminosav enantiomerek királis megkülönböztetési

mechanizmusának tanulmányozása.

7

2. Irodalmi összefoglaló

2.1. Királis állófázisok

Louis Pasteur 1848-ban fedezte fel, hogy a kristályos racém nátrium-

ammóniumtartarát két enantiomorf alakból áll. Tíz évre rá írta le, hogy a

mikroorganizmusok sokkal gyorsabban bontják a (+)-ammóniumtartarátot szemben (-)-

enantiomerrel. Ez az áttörés indította el a királis vegyületek tanulmányozását és

elválasztási technikájuk fejlődését. Az enantiomer elválasztási technikák több csoportra

oszthatók, ennek egy lehetséges, de nem teljes, felosztása a következő:

az enantiomorf kristályok kézi elválasztása, diasztereomer kristályosítás,

komplex adduktum képzés optikailag aktív gazda molekulával,

kinetikai rezolválás enzimekkel,

közvetett kromatográfiás módszerek: diasztereomerpárok létrehozásával majd

elválasztásával,

közvetlen kromatográfiás módszerek: királis mozgófázis vagy mozgófázis

adalék, illetve királis állófázis alkalmazása.

A két utóbbi módszer eltérő elválasztási mechanizmusokon alapuló technikákat

jelent, úgymint gázkromatográfia (GC), folyadékkromatográfia (HPLC), kapilláris

elektroforézis (CE), kapilláris elektrokromatográfia, stb. Közülük a GC és a HPLC

tekinthető a legelterjedtebbnek.

Munkám során királis állófázisokat alkalmaztam, ezért a következőkben a közvetlen

folyadékkromatográfiás módszereket ismertetem. Ennél a módszernél a minta közvetlenül

vizsgálható. Természetesen itt is lehetséges származékképzési reakció alkalmazása, de

ebben az esetben a származékképző ágens nem királis, célja további funkcióscsoportok

bevitele a vizsgálandó molekulába, növelve az állófázissal kialakuló kölcsönhatások

számát és erősségét illetve kromofor csoportok beépítésével csökkentve a detektálás alsó

határát [5].

A hárompontos, „three-point” illeszkedési modell a királis felismerésnek talán a

legmegbízhatóbb és legelterjedtebb szemléltetési módja, amely Easson [6] és Dalgliesh [7]

nevéhez fűződik, megteremtve a királis megkülönböztetési folyamatok értelmezésének

alapját. Dalgliesh [7] úttörő munkájában királis Phe-származékok papírkromatográfiás

elválasztását tanulmányozta, amelynek során feltételezte, hogy a királis

megkülönbözetéshez legalább három kölcsönhatás kialakulása szükséges a vizsgált

8

enantiomerek és az állófázis között. Ezt a modellt további feltétellel bővítette Pirkle és

Pochapsky [8], akik szerint a három szükséges kölcsönhatás közül legalább egynek

sztereoszelektívnek kell lennie. Ebből a megfontolásból a királis állófázist kutató és

fejlesztő szakemberek igyekeznek minél több kölcsönhatás kialakítására alkalmas

szelektorokat létrehozni. A teljesség igénye nélkül a leggyakrabban alkalmazott állófázis

típusokat és a jellemző kölcsönhatásokat a 2.1. Táblázatban mutatom be.

2.1. Táblázat. Fontosabb királis állófázisok csoportosítása

Típus Szelektor Meghatározó

kölcsönhatások makrociklusos antibiotikumok

antibiotikumok elektrosztatikus, H-híd, π-π, hidrofób, sztérikus

koronaéterek makrociklusos poliéterek H-híd, komplex-képzés

oligoszacharidok ciklodextrinek

cellulóz-, amilóz alapúak

zárványkomplex-képzés, H-híd, sztérikus, π-π,

πsav-πbázis fehérje alapúak fehérjék hidrofób, ionos, H-híd

ligandumcserés aminosav+fémion

komplexek komplex képzés

Pirkle-típusú („brush”) π-elektron donor és akceptor csoportok

π-π, πsav-πbázis, dipól-dipól

polimer-bázisúak szintetikus polimerek hidrofób, sztérikus, H-híd

Munkám során három állófázis típussal foglalkoztam, a következőkben ezek fontosabb

sajátosságait és alkalmazásait ismertetem.

2.1.1. Makrociklusos antibiotikum (glikopeptid) alapú királis állófázisok

1928-tól, a penicillin felfedezése után, azt gondolták, hogy a fenyegető fertőzéseket

kézben tudják tartani. A penicillin rezisztens baktériumok megjelenése azonban

felgyorsította újabb antibiotikumok kutatását és bevezetését. Természetesen a „kard-pajzs”

folyamat napjainkban is tart, jelenleg a vankomicin család tagjai képviselik a „kard”

szerepét [9]. Baktériumölő tulajdonságuk abban rejlik, hogy a Gramm(+) baktériumok

falának D-alanil-D-alanin terminális részéhez kötődve gátolják a falépítő folyamatokat. A

mechanizmus ismeretében Armstrong és munkatársai arra gondoltak, hogy a vankomicin

sajátos királisan irányított kötődése aminosav enantiomerek elválasztására nyújthat

lehetőséget. Hogy mennyire helyes volt ez a feltételezés, az a 1994-es Pittsburgh

Konferencián vált nyilvánvalóvá, ugyanis akkor mutatták be először a makrociklusos

glikopeptidek királis szelektorként való folyadékkromatográfiás alkalmazását normál,

illetve fordított fázisú kromatográfiás módban [10]. Azonos oszlopon különböző

9

kromatográfiás rendszerben eltérő szelektivitási értékeket kaptak, amiből más-más királis

felismerési folyamatra következtettek [11,12]. Ebben a témában az elmúlt években több

száz közlemény jelent meg. A makrociklusos antibiotikumok összetett szerkezetük és

többféle funkcióscsoportjuk révén többféle kölcsönhatás kialakítására képesek, úgymint

elektrosztatikus, hidrofób-hidrofób, π-π, H-híd, poláris kölcsönhatások, sztérikus gátlás,

így alkalmazhatóságuk a vegyületek széles spektrumát lefedi [13-15]. A kölcsönhatások

sokféleségéből következik, hogy multimodális állófázisként alkalmazhatók, azaz normál,

fordított fázisú, poláris-szerves (POM) illetve poláris-ionos (PIM) módban. A POM

mozgófázisként nemvizes poláris szerves oldószer használatát jelenti, PIM esetében a

nemvizes poláris szerves oldószerhez savas illetve bázisos karakterű módosítót adagolunk.

[16]. Utóbbi nagy jelentőséggel bír ionizálható királis vegyületek elválasztásánál, ami az

ionos kölcsönhatás meghatározó szerepével magyarázható.

Makrociklusos antibiotikumok részletes felosztása a 2.1. ábrán, fizikai-kémiai

jellemzői a 2.2. Táblázatban találhatóak [17].

Makrociklusos antibiotikumok

Ansamicinek Glikopeptidek Polipetidek Aminoglikozidok

Rifamicin B Rifamicin SV Avoparcin Teicoplanin Ristocetin Vankomicin Thiostrepton Kanamicin

teicoplanin A2-2

40,926MDL 63,246

teicoplanin aglikonderivatizált teicoplaninok

ristocetin Aristocetin B

vankomicin AVankomicin Bnorvankomicin

A35512BA82846BLY307599LY333328

derivatizált vankomicinek

streptomicinfradiomicin

fradiomicin Bfradiomicin C

.

2.1. ábra Makrociklusos glikopeptidek felosztása [17]

A 2.2. Táblázat tartalmazza a fontosabb fizikai-kémiai adatokat, így a szelektorok

jellemzése során csak a fontosabb tulajdonságokra térek ki és a makrociklusos

antibiotikumok közül csak a makrociklusos glikopeptidek főbb sajátosságait, alkalmazásait

mutatom be.

A természetes vankomicin (2.2. ábra) Streptomyces orientalis baktérium által

termelt 18 kiralitás centrummal rendelkező amfoter glikopeptid [18]. A természetes

vankomicin jól oldódik vízben és kevésbé alkoholban, ez a tulajdonsága poláris karakterére

utal.

10

HOOH

Cl

HN

NH

HO

O

NH

NH

NH2O

O

OO

O

NH

O

O

O

HN

Cl ONH

OH

OHO

HOHO O O CH3

OH

H3C

NH2

HO

H3C

COOH

2.2. ábra Vankomicin molekula szerkezete

Három makrociklusos részből épül fel, amelyek a térben három apoláris zsebszerű formát

hoznak létre, és együttesen egy kosárszerkezetet képeznek. Ennek a szerkezetnek

tulajdonítják a királis kölcsönhatásban fontos szerepet betöltő hidrofób-hidrofób

kölcsönhatást, illetve a sztérikus hatást, az utóbbihoz hozzájárul a két cukoregység is. Az

aromás gyűrűt tartalmazó vizsgálandó vegyülettel a π-π kötések kialakításaiért a

szelektorban található öt aromás gyűrű a felelős. A két klór szubsztituenst tartalmazó

aromás gyűrű π-savas jellegével járul hozzá a királis felismeréshez. Az ionos kölcsönhatás

kialakításért a két primer amino-, egy szekunder amino- és egy karboxilcsoport a felelős

[11]. Nair és mtsai. [19] vankomicin és CuII komplexének királis megkülönböztetési

mechanizmusát hasonlították össze karbonsav és aminosav enantiomerek elválasztása

esetén CE mérésekkel. A réz(II)ion a vankomicin N-metilleucin nitrogénjéhez és a

környezetében lévő amid-nitrogének és karboxil oxigénhez koordinálódik. A CuII

jelenlétében létrejövő gyűrűs komplex akadályozza a szelektor és aminosav közti

kölcsönhatást és így a királis felismerést. A cukorrész szabad aminocsoportja nem vesz

részt a koordinációban.

11

2.2. Táblázat. Makrociklusos glikopeptidek fizikai-kémiai tulajdonságai [17] Ansamicinek Glikopeptidek Polipeptidek

Tulajdonságok Rifamycin B Rifamycin

SV Avoparcin

Teicoplanin A2-2

Teicoplanin A-40,926

Teicoplanin aglicon

Ristocetin A

Vankomicin Norvankomicin Thiostrepton

Molekula tömeg 755 698 α= 1908 β=1942

1877 B0=1732 B1=1718

1197 2066 1449 1435 1665

Kiralitás centrumok száma

9 9 32 23 B0=19 B1=18

8 38 18 18 17

Makrociklusok száma

1 1 3 4 4 4 4 3 3 2

Aromás gyűrűk száma

2 2 7 7 7 7 7 5 5 1

Monomer cukorrészek száma

0 0 5 3 2 0 6 2 2 0

Hidrofób lánc 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Hidroxilcsoportok száma

4 5 16 15 11 7 21 9 9 5

Aminocsoportok száma

0 0 2 1 0 1 2 2 2 1

Szekunder aminok száma

0 0 1 1 2 0 0 1 1 1

Amidocsoportok száma

1 1 6 7 6 6 6 7 7 11

Karboxilcsoportok száma

1 0 1 1 2 1 0 1 1 0

Metoxicsoportok száma

1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Metoxi észterek száma

1 1 0 0 0 0 1 0 0 0

Előállítása Nocardia

mediterranei

Nocardia

mediterranei

Streptomyces

candidus

Actinoplanes

teicomyceticus

Actinoplanes

teicomyceticus

Teicoplaninbó

szintetikus

úton

Nocardia

lurida

Streptomyces

orientalis

Streptomyces

orientalis

Streptomyces

azureus

12

Ezáltal nyilvánvalóvá vált, hogy az elektrosztatikus kölcsönhatás az anion jellegű molekula

és a szelektor protonált aminocsoportja között a meghatározó lépés a királis elválasztásban

[19]. Dipól-dipól és H-híd kölcsönhatás a mintával az –OH és –Cl csoportok

közreműködésével jöhet létre.

A teicoplanin (2.3. ábra) Actinoplanes teichomyceticus baktérium által termelt

makrociklusos glikopeptid [20].

OH

H2N

O

O O

O

OO

Cl

O

O

COOH

O

OH

O

O

O O

HO

OHOH

O

HOHO

O

Cl

HO

HO

OH

O

HO OHOH

O

HO

HN

NH

HNNHNH

NH

NH

NH

2.3. ábra A teicoplanin A2-2 molekula szerkezete

Hasonlóan a vankomicinhez, itt is megtalálható a kosár szerkezet, de itt négy makrociklus

alakítja ki. A 7 aromás gyűrű, amelyek közül kettő egy-egy klór szubsztituenst tartalmaz a

π-π kötés illetve πsav-πbázis kölcsönhatás kialakítására alkalmas centrumok. A teicoplanin

ionos jellegéért egy karboxil- (pK~2,5) illetve primer aminocsoport (pK~9,2) a felelős. A

fordított fázisú kromatográfiás mérések ideális pH tartományában pH=3,5-8,0 között a

molekula ikerionos állapotban van.

Az ionos kölcsönhatás meghatározó szerepét a visszatartásban α-aminosavak esetén

Berthod és mtsai. igazolták [21]. H2O/MeOH=60/40 eluensösszetételt alkalmazva, a

semleges közegben anion jellegű Asp (pK=3,9) és Glu (pK=4,3) esetében csekély, a kation

jellegű Lys, Arg és His esetén nagy visszatartást tapasztaltak. Az eluens pH-ját 3,80-ra

csökkentve az Asp és Glu ionos jellege megváltozott, ami visszatartás növekedést

eredményezett. Ezen a pH-n az állófázis karboxilcsoportjának deprotonálódása is

visszaszorul, ami a kationos jellegű aminosavak esetén kisebb retenciós időt

eredményezett. A retenciós idő növekedését figyelték meg az α-aminosavak esetén az

13

eluens víz tartalmának növelésével, amit a víz nagy dielektromos állandójával és a

hidrofób-hidrofób kölcsönhatások kialakulásával magyaráztak [21]. Néhány esetben nagy

MeOH-tartalmú eluensben a MeOH-tartalom növelése retenciós idő növekedést

eredményezett. Armstrong metanolban gazdag eluensben ezt a nem fordított fázisú

viselkedést, amikor is a MeOH-tartalom növekedésével a visszatartás nő, a vizsgált poláris

vegyületek csökkenő oldhatóságával magyarázta [14].

A 2.3. ábrán látható, hogy a teicoplanin A2-2 vázához három cukorrész kapcsolódik,

két D-glükózamin és egy D-mannóz formájában. A hidrofób-hidrofób kölcsönhatás

kialakításért felelős nonil-lánc a D-glükózaminhoz kötődik. A cukorrész elválasztásban

betöltött szerepének tisztázásához a teicoplanin és a baktérium sejtfal közti kölcsönhatás

már ismert mechanizmusát használták fel; a glikopeptid a baktérium sejtfal D-Ala-D-Ala

részhez kapcsolódik [22]. Ennek ismeretében Arriaga és mtsai. [23] meghatározták a

teicoplanin acetil-D-Ala-D-Ala dipeptidhez való kötési energiáját. A kötési energia natív

teicoplanin esetén 31,2 kJ/mol, míg a cukorrész nélküli aglikon esetén 23,0 kJ/mol volt. Ez

arra utal, hogy az aglikon rész alapvető, a cukorrész pedig további hozzájárulást jelent a

kölcsönhatás kialakításához. A cukorrész lehetséges hozzájárulását a királis felismerési

folyamathoz három pontban lehet összefoglalni:

sztérikusan gátolhatja a kosár belsejéhez való hozzájutást,

meggátolhatja a lehetséges kölcsönhatás kialakítását az aglikon két fenolos és

egy alkoholos hidroxilcsoportjával, amelyeken keresztül a három cukorrész

kapcsolódik a natív teicoplanin esetén,

a cukorrészen lévő alkoholos hidroxil-, éter- és amidcsoportok, valamint a

nonillánc további kölcsönhatási lehetőséget biztosítanak a minta molekulákkal

[24].

Az előző felsorolásból kiderül, hogy a cukorrész nem minden esetben segíti a királis

megkülönböztetést.

Péter és mtsai. [25] kevésbé poláris α- és ß-aminosavak esetén a cukorrészek

árnyékoló hatásaként visszatartás csökkenést tapasztaltak, szemben Berthod és mtsai.

eredményeivel, akik poláris aminosavakat vizsgálva a visszatartás növekedését figyelték

meg natív teicoplanin szelektoron teicoplanin aglikonhoz viszonyítva [24]. A cukorrész

királis felismerésre gyakorolt hatását vizsgálva kevésbé poláris α- és ß-aminosavak esetén,

az általuk számolt enantioszelektív szabadenergia különbség az aglikon és a natív

teicoplanin királis állófázis között -84 és -1255 J mol-1 közé esett, ami a cukorrész

kedvezőtlen hatását jelenti a királis elválasztásban [25].

14

A 38 kiralitás centrummal rendelkező ristocetin A (2.4. ábra) a Nocardia lurida

fermentációs terméke. Az előző makrociklusos glikopeptidekhez hasonlóan itt is

megtalálható az aglikon rész kosár szerkezete, amelyet négy makrociklus hoz létre.

Jelentős különbség, hogy szabad karboxilcsoport helyett metilésztercsoportot tartalmaz a

szelektor, ami a kationos jellegű vegyületekkel gyengébb kölcsönhatást eredményezhet,

illetve a ristocetin A 21 darab hidroxilcsoportjának köszönhetően a legpolárisabb szelektor,

amit a hidrofób lánc hiánya tovább erősít. Ekborg-Ott és mtsai. [26] több mint 234

vegyületet vizsgáltak ristocetin A oszlopon különböző kromatográfiás módban (normál,

fordított fázis, POM, PIM). Megállapították, hogy fordított fázisban a meghatározó

kölcsönhatás az állófázis protonált aminocsoportjával létrejövő elektrosztatikus és a

hidrofób zsebbel kialakuló hidrofób-hidrofób kölcsönhatás, járulékos a H-híd illetve

sztérikus gátló hatás.

OHO

HO

H3C

OH

HO

OH

H2N

NHONH

O O

O

O

NH

NHNH

O

O

NH

O

OH

O

O

COOCH3

O

OH

CH3

HO

O

HO

OO

OH

OH

CH2OH

O

O

O OH

OH

OH

ONH2

OHHO

OHO

HOCH2OH

HO

CH3

O

2.4. ábra

A ristocetin A molekula szerkezete

Normál fázisú módban a π-π és H-híd kölcsönhatások a meghatározóak, illetve a sztérikus

hatás az irányadó. POM-ban a normál módhoz hasonló kölcsönhatások lépnek fel.

Acetonitrilt (MeCN) tartalmazó mozgófázisban túl nagy retenciós idővel rendelkező

vegyületek visszatartását a H-híd kötésre hajlamos MeOH hozzáadásával sikerült

csökkenteni. Összehasonlítva a normál fázisban és POM-ban vizsgált vegyületeket, azokat

sikerült az utóbbiban elválasztani, amelyek a következő funkcióscsoportok közül legalább

15

egyet tartalmaztak:

szabad amino- vagy amidcsoport,

hidroxil-,

fenil-,

benzoil-,

naftil-,

karboxil és/vagy észtercsoport.

Az N-védett aminosavak enantiomerjeinél csak normál fázisban tapasztaltak

megfelelő szelektivitást, ott is csak abban az esetben, ha a szelektor aminocsoportja

protonált állapotban volt az eluenshez hozzáadott ecetsav hatására, ami a retenciós idő

csökkentése mellett felbontás növekedést (talpszélesség csökkenés, elméleti tányérszám

(N) növekedés) is eredményezett.

Ugyanebben a cikkben [26] a vizsgált vegyületek nagy számának köszönhetően a

szerzők összehasonlították a különböző makrociklusos glikopeptid alapú állófázisokon

mért azonos vegyületek kromatográfiás adatait. A három szelektoron (vankomicin,

teicoplanin és ristocetin A) sikeresen elválasztott vegyületeket három csoportba sorolták:

amidok, valamint semleges molekulák, melyek aromás, vagy más gyűrűs

egységgel rendelkeznek,

karboxilcsoportot tartalmazók, ide sorolandók az N-védett aminosavak is,

szekunder és tercier aminocsoportot tartalmazók.

Számos esetben egyik, vagy másik makrociklusos glikopeptid szelektor szolgáltatott jobb

enantiomer szelektivitást, azt sugallva, hogy bár hasonló szerkezettel rendelkeznek, de az

eredő királis felismerés egyedi sajátosságuk, amit apróbb szerkezeti eltérések határoznak

meg.

2.1.2. Koronaéter alapú királis állófázisok

A koronaéterek, mint makrociklusos poliéterek ismertek azon tulajdonságaik révén,

hogy képesek az alkáli-, alkáli földfém- illetve ammóniumionokkal komplexet képezni. A

„korona” jelző Pedersen [27] nevéhez fűződik, az általa leírtak szerint a kationok

reverzibilisen „megkoronázhatók”. Az így létrejövő komplexek stabilitása az éteres

oxigénatomok számától, elhelyezkedésétől, a poliéter és a kation méretétől függ.

Vizsgálták a létrejövő komplexek röntgendiffrakciós kristályszerkezetét, ahol azt

tapasztalták, hogy koordinatív telítettség és a kötés irányultsága kisebb jelentőségű, mint

16

számos átmenetifémkomplexnél. Cram és mtsai. [28] több mint 35 évvel ezelőtt írták le az

első szintetikus királis makrociklusos koronaéter szintézisét. Koronaéter előállítása mellett

különböző aminosavak királis megkülönböztetését is vizsgálták binaftil-tartalmú

koronaéterekkel. Shinbo és mtsai. [29,30] oktadecil-szilikagélen dinamikusan rögzített

(adszorbeált) királis koronaéter állófázist állítottak elő és D,L aminosavakat választottak el

rajta. Az oxigén, illetve nitrogén tartalmú koronaétereknek a királis analízisben fellépő

jelentőségének felismerésével számos publikáció jelent, illetve jelenik meg, vizsgálva

többek között a különböző funkcióscsoportokkal (szénhidrogén lánc, piridin, stb.)

módosított koronaéterek királis szelektivitásra gyakorolt hatását.

A királis koronaéterek elválasztástechnikai jelentősége többek között a protonált

aminocsoportokkal képzett stabil komplexének köszönhető. Feltételezés szerint az

ammóniumion három hidrogén híddal kötődik a nagy elektronsűrűségű poliéteres

gyűrűben (2.5. ábra). A 18-korona-6 poliéter gyűrű üregmérete 260-320 pm tartományban

van, amibe az ammóniumion 286 pm ionátmérőjével beleillik [31].

OOO

OOO

N

HHH

R

+

2.5. ábra 18-korona-6 koronaéter szubsztituált ammóniumionnal képzett komplexe

A hárompontos illeszkedési modellből kiindulva a koronaéter szelektorokra nézve

általánosan elmondható, hogy ez az akirális kölcsönhatás szükséges, de nem elégséges a

királis megkülönböztetéséhez [32]. Ezért a különféle funkcióscsoportok jelenléte a

szelektoron, illetve a „karon” („spacer”, a szelektort a szilikagéllel összekötő láncon)

szükséges, hogy további kölcsönhatások alakuljanak ki az elválasztandó molekulával,

meggátolva azok szabad rotációját és egyéb mozgásukat, így létrehozva a

kvázidiasztereomer komplexeket. A hárompontos modell legalább egy sztereokémiától

függő kölcsönhatást követel meg a három egyidejű kölcsönhatás közül. Enantiomer

megkülönböztetés abban az esetben figyelhető meg, ha az egyik enantiomerre nézve

kevésbé stabil komplex jön létre. Természetesen ehhez nem csak a szelektor szerkezete

járul hozzá, hanem az enantiomeré is. Dearden és mtsai. [33] a koronaéter gyűrűjében

piridint tartalmazó szelektoron négy különböző amin királis megkülönböztetését

vizsgálták, FT-ICR/MS technikával. A királis megkülönböztetés a sec-

17

butilamin<ciklohexiletilamin<feniletilamin<naftiletilamin sorban nőtt. A legkisebb

térkitöltésű sec-butilamin esetén nem tapasztaltak királis megkülönböztetést, a sec-

butilcsoport nagyobb és merevebb ciklohexil gyűrűvel való helyettesítésével már

enantioszelektivitást figyeltek meg. A két aromás amin esetén tapasztalták a legnagyobb

fokú királis megkülönböztetést, melyet a fellépő π-π kölcsönhatás kialakulásával és a

nagyobb fokú sztérikus hatás fellépésével magyaráztak.

Cram és mtsai. [34,35] két naftilgyűrűt tartalmazó koronaéter és különböző

aminosavak által képzett komplexek lehetséges kölcsönhatásait vizsgálták. Feltételezésük

szerint a két karboxilcsoport elég hosszú láncon keresztül kapcsolódik a naftilgyűrűkhöz

ahhoz (2.6. ábra), hogy a koronaéter gyűrűje alatt és felett elhelyezkedve H-híd kötést

alakítsanak ki a vizsgált aminosav karboxilcsoportjával, illetve deprotonált formában az

ammóniumionnal ion-párt képezzenek. Az aromás rendszer további poláris kölcsönhatások

kialakításában vehet részt.

O

O

O

OO

O

O COOH

O COOH

2.6. ábra Binaftil tartalmú koronaéter

Izatt és mtsai. [36] a királis szelektoron lévő szubsztituens méretének hatását

tanulmányozták. A szubsztituens méretének növelésével a sztérikus taszítás nőtt, ami

általában nagyobb enantiomer szelektivitást eredményezett. A nagyobb térkitöltésű

csoportok azonban megakadályozhatják a diasztereomer komplex létrejöttét és így a királis

felismerést.

A koronaéter gyűrűben található éterkötés jelentőségét igazolták Sawada és mtsai.

[37]. FAB/MS technikával vizsgálták a koronaéter gyűrűjében található –CH2-O-CH2-

stabilizáló hatását fenilglicin-metilészter enantiomerek esetén. A koronaéterben található

két éterkötést két aromás gyűrűvel helyettesítve nem tapasztaltak megkülönböztetést és a

molekulaion intenzitása is messze elmaradt az alapvegyülettel képzett diasztereomerétől.

Pirkle [38] és Armstrong [39] írták le, hogy a királis felismerés a gazdamolekula és a

vendégion közötti másodlagos vonzó és sztérikus taszító kölcsönhatások eredőjeként jöhet

18

létre. Still és mtsai. [40] mutattak rá a makrociklusos szelektor flexibilitásának

fontosságára a királis megkülönböztetésben. Ha a komplex szerkezete kellően rugalmas,

akkor mind a két enantiomer találhat egy olyan konformációt, ami a sztérikus hatás

eliminálásával a szelektivitás csökkenését, illetve megszűnését eredményezheti [41].

Elmondható, hogy a merev makrociklusos szerkezet, illetve a többpontos kötés kialakítása

a diasztereomer komplex konformációját csökkenti, így segítve az elválasztást.

Kuhn [42] racém primer-aminok CE elválasztásáról számol be királis koronaéter,

(+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor alkalmazásával (2.7. ábra).

OO

O

OOO

COOH

HOOC COOH

HOOC

2.7. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szerkezete

Machida és mtsai. [43] a (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsavat reagáltatták

3-aminopropil szilanizált szilikagéllel, így a szelektort egy, illetve két egymás mellett lévő

karboxilcsoporton lévő n-propilamin karon keresztül rögzítették a hordozóhoz (2.8. ábra).

O

NH

Si

O

OO

O

O

O O

O

HOOC

COOH

COOH

O

O

O

O

O O

O

COOH

COOH

O

NH

Si

OO

O

NH

Si

O

O

O

O

O

NH

Si

O

O

O

O

NH

Si

O

O

O

2.8. ábra Machida királis állófázisa

A szerzők α-aminosavak, aminok és amino-alkoholok enantiomerjeit választották el és az

utóbbi két molekulacsoport esetén jobb szelektivitást tapasztaltak.

Hyun [44] ugyanezt a szelektort rögzítette aminopropil szilikagélhez oly módon,

hogy a szelektor dianhidridjét reagáltatta két napig 0°C hőmérsékleten, trietilamin

jelenlétében, száraz diklórmetánban, argon atmoszféra alkalmazásával. A módosított

19

szilikagélt MeOH, víz, 1,0 M HCl, víz, MeOH, diklórmetán és hexánnal való mosás, majd

nagyvákuumban történő szárítás követte. A dianhidrid gyűrű azonos oldali felnyílási

reakciója primeraminnal, trietilamin jelenlétében, a szelektor merevebb struktúrával

rendelkező szin-diamid formáját eredményezte [45] (2.9. ábra).

OOO

OOOHOOCCOOH

NHO

Si

HN

Si

ONH2

Si

NH2

Si

2.9. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor szilikagélen rögzítve

Ezen a szelektoron primeramint tartalmazó kinolon antibiotikum enantiomerek

elválasztását tanulmányozták elsőként [45]. Következő közleményükben racém

természetes és szintetikus α-aminosavak, α-amino-amidok és észterek elválasztásáról és az

elválasztás lehetséges mechanizmusáról számoltak be [46]. Az aminosav enantiomerek

elválasztása mind sikeres volt, egyedül a Pro esetén figyeltek meg nagyon gyenge

visszatartást és sikertelen elválasztást. Véleményük szerint a primeraminocsoport hiánya

miatt nem tudott kialakulni az R-NH3+-koronaéter diasztereomer komplex, amely alapvető

fontosságú a kölcsönhatások kialakításában (2.10. ábra). Összehasonlítva a királis

felismerés szempontjából az aminosavak szabad, N-alkil illetve N,N-dialkil formáit, a

mono-alkil forma volt a legkedvezményezettebb, majd ezt a szabad aminosav és végül a

dialkil-származék követte. Az elválasztási mechanizmus magyarázatakor a szelektor

szabad karboxilcsoportjának jelentőségét említették, mint további kölcsönhatás

kialakítására alkalmas funkcióscsoportot [46].

Aminok, amino-alkoholok és α-amino-ketonok vizsgálatakor érdekes viselkedést

figyeltek meg. Az eluens szerves összetevőjének növelésével nőtt a visszatartás a

viszonylag hidrofilebb vegyületeknél, hasonlóan a makrociklusos glikopeptid szelektort

tartalmazó állófázisokhoz. Ezt Hyun és mtsai. [47] a vegyületek és a mozgófázis közötti

hidrofil kölcsönhatás csökkenésével magyarázták, ezáltal az állófázison való tartózkodás

vált kedvezményezetté. A szelektivitás egységesen csökkent a mozgófázis MeOH

tartalmának növelésével.

20

OOO

OOOHOOCCOOH

NO

Si

N

Si

O

N

HHH

R

H H

+

2.10. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav és szubsztituált amóniumion komplex képzése

Vizsgálták a mozgófázishoz adagolt sav minőségének (H2SO4, CH3COOH, HClO4 és

CF3COOH) és mennyiségének (1,0–20,0 mM) a kromatográfiás folyamatokra gyakorolt

hatását is. Aminok, amino-alkoholok és α-amino-ketonok esetén tapasztalataik szerint a

savkoncentráció növelésével nőtt a visszatartás és többnyire a szelektivitás is [47].

Aminosavak esetén ezzel ellentétes viselkedést is megfigyeltek, amit a szabad

karboxilcsoport protonáltsági állapotának növekedésével és a protonált karboxilcsoport és

a felületi protonált aminocsoportok közötti kölcsönhatás csökkenésével magyaráztak.

Hyun és mtsai [48] az előzőleg ismertetett szintézist módosítva, trietilamin helyett

2,6-lutidint használtak. Az így kapott állófázis feltételezett szerkezete a 2.11. ábrán

látható. Ez a változtatás számottevően nem befolyásolta a szelektor már korábban leírt

kromatográfiás viselkedését. Vizsgálták a halogénatommal szubsztituált aromás gyűrűt

tartalmazó α-aminosavakat, illetve a vegyületek szerkezete és a kromatográfiás viselkedés

közötti összefüggést [48]. Tanulmányozták a másodikként eluálódó enantiomer retenciós

faktorának változását a molekula szerkezetétől függően, abból a megfontolásból kiindulva,

hogy a másodikként eluálódó enantiomer királis affinitása az állófázissal nagyobb.

OOO

OOOHOOCCOOH

NHO

Si

HN

Si

O

O O

2.11. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor módosított aminopropil szilikagélen

21

Megfigyelték, hogy az aminosavak aromás gyűrűjén található halogén szubsztituensek

méretének növekedésével a visszatartás nőtt. A szubsztituens helyzete ugyancsak

meghatározó volt: orto-helyzetben fluor szubsztituenst tartalmazó Phe másodikként

eluálódó enantiomerjének retenciós faktora nagyobb volt a para- és meta-helyzetű fluor

szubsztituenst tartalmazóknál, viszont kisebb szelektivitást eredményezett. A szerzők ezt a

viselkedést azzal magyarázták, hogy az orto-szubsztitució miatt fellépő sztérikus gátlás

felülmúlja a nemkirális kölcsönhatást, például a szilikagélen lévő szabad

propilamincsoportok és az aminosav között, amely a retenció növekedését eredményezi, de

a sztérikus gátlás miatt a két orto-szubsztituált enantiomer kölcsönhatása az állófázissal

egymástól alig különbözik, ezért a szelektivitás csökken.

1998-tól Hyun és mtsai. a (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektort

tartalmazó állófázisnak számos változatát készítették el az elválasztás javítása és a királis

megkülönböztetés folyamatának tisztázása céljából. Az állófázis szintézise során maradnak

vissza elreagálatlan n-propilamincsoportok (2.12. ábra), melyeknek jelentős lehet a

hozzájárulása az elválasztás sikeréhez vagy sikertelenségéhez.

OOO

OOOHOOCCOOH

NHO

Si

HN

Si

ONH3

Si

+

2.12. ábra Aminopropil szilikagélen kötött (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav és a szabad

felületi protonált propilamin feltételezett komplexképzése

A szelektoron található karboxilcsoportok pK értéke 2,1-4,9 [49], az aminosavak

karboxilcsoportjának pK értéke 1,7-2,3 tartományba esik [50]. Jin és mtsai. [51] vizsgálták

az eluens pH hatását pH=2,0, 2,1 és 2,6 esetén, állandó koncentrációjú 10 mM kénsav

mellett trietilamin jelenlétében. A pH 2,0-ről 2,1-re történő változása számottevően nem

befolyásolta az aminosav és a koronaéter ionizáltsági állapotát, azonban 2,6 esetén már

várható a karboxilcsoport deprotonálódása, segítve a szelektor karboxilátionja és az

aminosav protonált aminocsoportja között, illetve az aminosav karboxilátionja és a

felületen szabadon maradó primer protonált aminocsoportok között kialakuló

elektrosztatikus kölcsönhatást.

Mindezek mellett a felületi szabad propilamin, illetve az aminosav protonált

22

aminocsoportjai között versengés alakulhat ki a koronaéter kötőhelyéért. Ennek a zavaró

hatásnak a csökkentésénél szerepe lehet az alkalmazott savak anionjainak (ellenionjainak).

ß-Aminosavak esetén azonos koncentrációjú ecetsav, kénsav és perklórsav alkalmazásával

ecetsav esetén tapasztalták a legnagyobb visszatartást és szelektivitást [52]. Feltételezés

szerint az eluensben lévő sav ellenionja ionpárt képez az aminosav protonált

ammóniumionjával, az így létrejövő ionpár a koronaéterrel egy komplex terner rendszert

alakít ki. [30,31]. Az ellenion lipofil tulajdonsága befolyásolja a visszatartást az

állófázison. Viszonylag apoláris, ionizálható csoportot nem tartalmazó, fenilglicin (Phg) és

Met vizsgálatakor koronaéter oszlopon sósav, salétromsav és perklórsav tartalmú eluensek

összehasonlításakor Cl-<NO3-<ClO4

- sorrendben nőtt a visszatartás, ami megegyezik az

anionok lipofil jellegének növekedési sorrendjével [53]. Ez az apoláris viselkedés kevésbé

jelentős poláris koronaétereknél, hiszen a rajtuk lévő ionizálható funkcióscsoport (pl.

karboxilcsoport) és a vizsgált vegyület szintén ionizálható pl. aminocsoportja között

kialakuló elektrosztatikus kölcsönhatás felülmúlja a viszonylag gyenge hidrofób-hidrofób

kölcsönhatást [52,54-56].

Hyun és mtsai. a n-propilcsoportok hatásának csökkentésére két új állófázis szintézist

dolgoztak ki. Az első esetben [57] a szabad n-propilamincsoportokat a szilikagélen acetil,

butiril- és pivaloil- védőcsoporttal látták el. Az általuk vizsgált vegyületek közül a Leu,

Phe, Phg és Tyr erdményeit emelném ki. Míg az acetil és butiril védőcsoport jelenléte

növelte a visszatartás mértékét, melyet a hidrofób-hidrofób kölcsönhatás erősödésével

magyaráztak, addig a nagy térkitöltésű pivaloilcsoport sztérikusan gátolta az aminosav-

koronaéter komplex létrejöttét, retenciós idő és szelektivitás faktor csökkenést

eredményezve. Meglepő módon az első két védőcsoport alkalmazásával a szelektivitás

kismértékű csökkenést mutatott, szemben a felbontással, amely nőtt. A jelenséget a szerzők

a szabad n-propilamin csúcsszélesítő hatásával magyarázták.

A második esetben [58] a szelektor N,N’-trietoxiszililpropil szin-amidját közvetlenül

kötötték a szilikagélhez. Ezzel az eljárással készített oszloppal β-aminosav enantiomerek

elválasztása esetén jelentős (közel nyolc-tízszeres) visszatartás növekedést tapasztaltak,

igazolva a korábbi modellt: versengés lép fel a szabad felületi n-propilamin és az aminosav

protonált aminocsoportja között a koronaéter üregéért. A megnövekedett visszatartás

csökkentése céljából NH4+-tartalmú módosítót alkalmaztak az eluensben (NH4Cl vagy

NH4OAc).

Nishi és mtsai. [59] is vizsgálták a mozgófázisba adagolt különböző szervetlen

módosítok hatását. Azt találták, hogy Li+>Na+>NH4+>K+ sorrendben csökken a

23

visszatartás, ami a káliumion 18-korona-6 poliéterrel képzett komplex nagy stabilitásával

magyarázható [60]. A mozgófázisban levő kationok (hasonlóan a szabad felületi

ligandumokhoz) versengenek a koronaéter kötőhelyeiért, ezáltal csökkentve a vizsgált

vegyületek visszatartását. A csökkenés mértéke befolyásolható az alkalmazott

koncentrációval és a kation melletti anion változtatásával is. Az ellenion hozzájárulása

megegyezik a savaknál már korábban leírt lipofil jellegükből adódó viselkedéssel,

kiegészítve a H2PO4-<Cl-<Br-<NO3

-<I- lipofilicitási sorrenddel.

Hyun és mtsai. [61] ß-aminosavak és a szabad felületi n-propilamint nem tartalmazó

állófázis kölcsönhatását vizsgálva azt tapasztalták, hogy a mozgófázisba adagolt kation

koncentrációjának növelésével (0-0,5 mM) csökkent a visszatartás és a szelektivitás is,

viszont a felbontás nőtt, köszönhetően a zónaszélesedés jelentős csökkenésének. A

felbontás tekintetében hasonló eredményt tapasztaltak CH3COO- illetve Cl-

összehasonlításakor, az acetátion alkalmazása bizonyult hatékonyabbnak.

Vizsgálták a karon található N-hidrogének hatását is. Gehin és mtsai. [62] leírták,

hogy a karon lévő nitrogén hidrogénje szintén kölcsönhatásba léphet a koronaéter

karboxilcsoportjával párhuzamosan a vizsgált vegyületek ammóniumionjával, így gátolva

az ammónium-koronaéter komplex létrejöttét. Hyun és mtsai. feltételezték, hogy a

hidrogén metilcsoporttal történő kicserélésével javulhat a királis felismerés [63] (2.13.

ábra). Az új állófázist (2.13. ábra) összehasonlítva a korábbival (2.9. ábra) a szerzők

különböző amin enantiomerek és tokainid esetén jobb, míg α-aminosavak esetén hasonló

szelektivitást tapasztaltak [64]. Érdekes viselkedést figyeltek meg ß-aminosav

enantiomerek elválasztása esetén. Ha a mozgófázis 10 mM koncentrációjú ecetsavat

tartalmazott, a metilcsoport jelenléte a nitrogénen jelentősen csökkentette a visszatartást és

a királis megkülönböztetést, míg az ugyanilyen koncentrációjú kénsavat tartalmazó eluens

hatásosabbnak bizonyult.

OOO

OOOHOOCCOOH

NO

Si

N

Si

OCH3 H3C

2.13. ábra Aminopropil szilikagélhez kötött (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor

amid hidrogénje metilcsoporttal helyettesítve

24

Ez két dologban is eltérést mutat a korábbi irodalmi adatokhoz képest:

pH csökkentésével nőtt a visszatartás,

kénsav használata bizonyult kedvezőbbnek [65].

Az állófázis szintézise során visszamaradt elreagálatlan n-propilamincsoportok

hatása mellett tanulmányozták a szelektort az állófázissal összekötő kar („spacer”)

hosszának hatását is a kromatográfiás elválasztásra, szelektorként (+)-(18-korona-6)-

2,3,11,12-tetrakarbonsavat alkalmazva. Az alifás-amin szénlánc hosszának növelésével az

eredeti három szénatomú propilamint 11 szénatomszámú aminra cserélték, apolárisabbá

téve a felületet ezáltal (2.14. ábra).

OOO

OOOHOOCCOOH

NHO

Si

O

HN

Si

O

O

( )9 ( )9

2.14. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor aminoundecil-szilikagélen kötve

Viszonylag kevésbé hidrofil ß-aminosav, amin és amino-alkohol enantiomerek

elválasztását vizsgálva mind a visszatartásra, mind a szelektivitásra nagyobb értékeket

kaptak, ugyanekkor α-aminosavak esetén ezek az értékek rendre kisebbnek adódtak [66].

A jelenség magyarázatára a szerzők a szabad aminopropilcsoport és a szabad

aminoundecilcsoport koronaéterrel fellépő eltérő komplexképzési hajlamát feltételezték.

Hyun és mtsai. vizsgálták a kar rögzítési módjának az állófázis stabilitására gyakorolt

hatását is [67]. A korábbi állófázisoknál a szelektort két karboxilcsoportján keresztül egy-

egy n-propilamin karon kötötték a szilikagélhez (2.9. ábra). Az új állófázisnál bis(3-

aminopropil) szilikagélt használtak, így a karboxilcsoportok két-két alifás lánccal kötődnek

(2.15. ábra). Aminok, amino-alkoholok és α-amino-ketonok vizsgálatakor érdekes

viselkedést figyeltek meg. Az eluens szerves összetevőjének növelésével nőtt a visszatartás

a viszonylag hidrofilebb vegyületeknél, hasonlóan a makrociklusos glikopeptid szelektort

tartalmazó állófázisokhoz. Ezt Hyun és mtsai. [47] a vegyületek és a mozgófázis közötti

hidrofil kölcsönhatás csökkenésével magyarázták, ezáltal az állófázison való tartózkodás

vált kedvezményezetté. A szelektivitás egységesen csökkent a mozgófázis MeOH

25

tartalmának növelésével.

OOO

OOOHOOCCOOH

NO

NO

Si SiSi Si

2.15. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor kötése bis-(3-aminopropil)

szilikagélhez

Ezzel a módszerrel az amid-hidrogén eliminálódik, ezért a pontos összehasonlítás

végett a szerzők az eredeti szelektornál (2.9. ábra) is lecserélték az amid-hidrogént egy

metilcsoportra (2.13. ábra). Az állófázis stabilitás vizsgálatakor a szelektivitási tényező és

a retenciós faktor változását figyelték, viszonylag nagy 20 mM kénsav koncentráció

mellett az átáramlott eluens térfogatának függvényében. Az N-CH3 védett állófázist (2.13.

ábra) alkalmazva aromás aminok elválasztása esetén 25000 ml eluens térfogat

átáramoltatása után a szelektivitás több mint a felére, a retenciós faktor a negyedére

csökkent. Az új oszlopnál (2.15. ábra) a szelektivitás ~10%-kal, a retenciós faktor

mindössze ~20%-kal csökkent. Természetesen ez a változtatás a felület hidrofób jellegének

növekedésén keresztül az elválasztási folyamatra is hatással bír, például aminok és

aminoalkoholok esetén nagyobb visszatartást és kismértékű szelektivitás csökkenést

figyeltek meg [67].

Hyun és mtsai. [68] utóbbi közleményükben újabb állófázisról tesznek említést.

Figyelembe véve az amid-hidrogén kedvező hozzájárulását a királis megkülönböztetéshez,

a szerzőknek sikerült a (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektort az amid

hidrogén megtartása mellett két-két karral rögzíteni a szilikagélhez (2.16. ábra)

Összefoglalásként megállapítható, hogy a koronaéterek királis szelektorként primer-

és szekunderamin funkcióscsoportot tartalmazó vegyületek esetében alkalmazhatóak,

figyelembe véve az aminocsoport-koronaéter komplex létrejöttének szükségességét.

Hasonlóan a makrociklusos glikopeptidekhez, a koronaétereknél is a szelektoron, a karon

illetve az állófázison lévő eltérések kisebb, vagy nagyobb mértékben, de befolyásolják a

visszatartás és a királis megkülönböztetés mértékét.

26

Si Si

OOO

OOOHOOCCOOH

NHO

HNO

Si Si

2.16. ábra (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektor „kétkarú” kötése szilikagélhez

az N-H kötés megtartása mellett

2.1.3. Ciklodextrin alapú királis állófázisok

A ciklodextrinek (CD) α-1,4-kapcsolt D-glükóz gyűrűs oligomerek, melyekben az

összes cukoregység a gyűrűs szerkezetben szék konformációs állapotban található [69].

Három, széles körben ismert és vizsgált CD az α-ciklodextrin (α-CD, ciklohexamilóz), ß-

ciklodextrin (ß-CD, cikloheptamilóz) és a γ-ciklodextrin (γ-CD, ciklooktamilóz) (2.17.

ábra). A cukoregységek számának növelésével nő a gyűrűs szerkezet átmérője, α, ß és γ

sorrendnek megfelelően 0,57, 0,78 és 0,95 nm.

O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

HO

HO

HO

OH

HO HO

OH

OH

OH

HO

OH

OH

HO

HO

HO

n =

1 (α-ciklodextrin)

2 (β-ciklodextrin)

3 (γ-ciklodextrin)

n

2.17. ábra Ciklodextrinek szerkezete

A gyűrű hidrofób belseje és jól definiált átmérője alkalmassá teszi a CD-t

zárványkomplexek képzésére számos szerves vegyülettel, ezt a tulajdonságát már az 1960-

27

as években leírták [70-72]. A hattagú aromás gyűrű a méretéből adódóan az α-CD-nel, a

bifenil- és naftilcsoportot tartalmazó vegyületek ß-CD-nel míg a pirén és származékai a γ-

CD-nel képeznek viszonylag stabil zárványkomplexeket. A zárványkomplex kialakulása

hozzájárul a királis felismerési képességéhez, melynek felfedezése Cramer és Dietsche

[73] nevéhez fűződik. Munkájukban racém karbonsav-észterek sztereoszelektív kicsapását

végezték, igazolva a CD-ek királis megkülönböztető képességét. A már korábban

ismertetett hárompontos illeszkedési modell feltételei a CD-ek esetében oly módon

teljesülnek, hogy a térben kialakuló csonka kúp szerkezet viszonylag hidrofób belsejében

hidrofób-hidrofób és sztérikus kölcsönhatások alakulnak ki. Ezen hatások mellett, a

cukoregységek 2. és 3. pozícióban lévő szekunder hidroxilcsoportjai a csonka kúp

szélesebb, a primer hidroxilcsoportok a glükóz egységek 6. pozíciójában a keskenyebb

nyílásnál a felületi hidrofil karakter létrehozása mellett H-híd, dipól-dipól kölcsönhatás

kialakításával járulnak hozzá a királis felismeréshez (2.18. ábra) [74-76].

OH

HO

n

HO

n =

6 (αααα-ciklodextrin)

7 (ββββ-ciklodextrin)

8 (γγγγ-ciklodextrin)

n

n

2.18. ábra Ciklodextrin szerkezete

Míg a koronaéter szelektoroknál a R-NH3

+–koronaéter diasztereomer komplex

létrejötte alapvető fontosságú, addig a CD szelektoroknál, a vizsgált vegyület kiralitás

centrumához kapcsolódó szubsztituensnek kell elég közel lennie a CD üreg szélén lévő

szekunder hidroxilcsoportokhoz, hogy kölcsönhatás alakulhasson ki közöttük. A vegyület

szoros illeszkedése a csonka kúp belsejében segítheti az elválasztást, de nem alapvető

követelmény olyannyira, hogy normál fázisú kromatográfiás mérésnél a CD üregében az

apoláris eluens foglalhat helyet. Ezért a természetes CD-ek többnyire nem mutatnak királis

felismerést normál fázisban, szemben a módosított változatukkal, ahol a

származékképzéssel bevitt aromás gyűrűk π-π illetve πsav-πbázis kölcsönhatásba léphetnek

az enantiomerekkel. POM és PIM módszernél a fordított fázisú mérésekhez hasonlóan

meghatározó a CD gyűrű mérete, illetve további követelmény, hogy a vizsgált vegyület α

28

vagy ß helyzetben lévő szubsztituense H-híd kialakítására alkalmas legyen [77,78].

A glükózegységenként 1 primer és 2 szekunder hidroxilcsoport kiváló lehetőséget

biztosít a szilikagélhez való kapcsoláshoz, illetve CD-ek módosítására anélkül, hogy

sérülne a gyűrűs szerkezet. Általában a módosítás eredményeképpen a csonka kúp „szája”

részben fedetté válik, így bár a kialakuló H-hidak száma csökken, ugyanakkor az új

funkcióscsoportok beépítésével további kölcsönhatások léphetnek fel. A természetes CD-

hez képest a módosítás jelentős szelektivitásbeli különbséget eredményezhet, továbbá a

normál fázisú és POM alkalmazhatóságot is lehetővé teszi [78]. Így az utóbbi másfél

évtizedben a CD-ek legkülönfélébb származékait (pl. acetil, hidroxipropil, fenil,

aminometil-benzil, naftiletilkarbamoil, dimetil-fenil, stb.) állították elő [79-81]. A CD-

származékok esetén az egész molekulára vonatkozó úgynevezett átlagos szubsztitúciós fok

mutatja meg, hogy hány hidroxilcsoporton történt meg a helyettesítés. A szubsztituensek

eloszlása a hidroxilcsoportok reaktivitásától függ, amely a következő sorrendben nő: C-

3<C-6<C-2 [82]. A szubsztitúciós fok általában a nagyobb térkitöltésű szubsztituensek

esetén kisebb (pl. naftiletil-ß-CD esetén hat az átlagos szubsztituciós fok, acetil-ß-CD

esetén a hidroxilcsoportok 90%-a védett). Armstrong és mtsai. [77] naftiletil-izocianáttal

módosított három és hat szubsztitúciós fokú ß-CD-ek kromatográfiás viselkedésének

összehasonlításakor azt tapasztalták, hogy a védőcsoportok számának növekedésével csak

a visszatartás nőtt, a szelektivitás nem változott. A CD-ek királis szelektorként való

széleskörű elterjedése ezen speciális tulajdonságaik együttesének köszönhető.

O

HO

HO

HN

O

Szilikagél

DMP−−−−ββββ-CD

O

O2N NO2

CF3

HO

HO

Szilikagél

O

O2N

O2N

CF3

2.19. ábra 3,5-dimetilfenilkarbamoil ß-CD és 2,6-dinitro-4-trifluorometilfenil-éter-ß-CD szerkezete

29

Az első királis CD állófázist Harada és mtsai. [83] α-CD és ß-CD térhálósításával

állították elő, melyeken fordított fázisú kromatográfiás módszerrel racém mandulasavat és

annak észtereit és étereit választották el. Az azóta eltelt harminc évben a CD-nel

foglalkozó közlemények száma évről-évre jelentősen nő.

A tíz átlagos szubsztitúciós fokú DMP-ß-CD szelektor (2.19. ábra) a módosított CD

π−bázis jellegű csoportjába tartozik. Ebbe a csoportba tartozó szelektorok π-elektron

küldésre hajlamos molekularésszel rendelkeznek, amelyek a vizsgált vegyületek aromás

részével π-π, πsav-πbázis illetve sztérikus kölcsönhatásba léphetnek (a természetes CD-nél

már ismertetett kölcsönhatások mellett).

Mitchel és mtsai. [84] aromás szulfoxidok királis elválasztását végezték természetes

(ß-CD) és módosított (aromás DMP-ß-CD és nem aromás dimetil-ß-CD, acetil-ß-CD)

állófázisokon. Vizsgálataik során néhány fontosabb megállapítást tettek:

a kiralitás centrumhoz közeli nagy térkitöltésű molekularész jelentősen

javította az enantiomer felismerést,

kisebb mértékű változtatás a szulfoxidok szerkezetében jelentősen befolyásolta

a szelektivitást,

az aromás gyűrűn lévő szubsztituensek típusának és helyzetének eltérő volt a

hozzájárulása,

az aromás-szubsztituenst tartalmazó CD-ek esetén nagyobb a visszatartás,

összehasonlítva a nem aromás (alifás) jellegű szubsztituenst tartalmazókkal.

Armstrong és mtsai. [85] a π-bázikus DMP-ß-CD-t hatékonynak találták π-savas

enantiomerek elválasztásában, ezt a logikát követve Zhong és mtsai. [86] elkészítették a π-

savas, tíz átlagos szubsztitúciós fokú DNP-ß-CD−t π-bázisos tulajdonságú királis

vegyületek elválasztására. A DNP-ß-CD π-savas karakterét az aromás gyűrűkön található

negatív indukciós és konjugációs effektussal rendelkező két nitrocsoportnak köszönheti,

amelyet a para-helyzetű trifluormetilcsoport tovább erősít. A királis felismerési

folyamatban a π-π, πsav-πbázis, dipól-dipól illetve sztérikus kölcsönhatás alakulhat ki a

természetes CD-eknél már megismert hidrofób-hidrofób, H-híd és zárványkomplex

(kromatográfiás módszertől függően) kialakulása mellett. A szerzők 9 π-savas karakterű ß-

CD királis állófázis kromatográfiás viselkedését hasonlították össze (többek között DNP-

ß-CD−t is) királis heterociklusok, savak, bázisok, alkoholok, szulfoxidok és N-védett

aminosavak elválasztásakor. Az állófázisok az aromás gyűrűn található nitrocsoportok és

trifluormetilcsoportok helyzetében, az aromás gyűrű CD-hez való kötésében (éter vagy

30

karbamoil), illetve az átlagos szubsztitúciós fokban különböztek. Míg a 3-5 helyzetű

hidroxilcsoport származékképzése segítette, addig a 10 helyzetű hidroxilcsoport

módosítása már jelentős sztérikus gátlásával erősen rontotta az enantiomerek elválasztását.

A szubsztituensek helyzete és száma az aromás gyűrűn jelentősen befolyásolta az

enantiomer szelektivitást. Említést érdemel, hogy a szelektorok közül a 2,6-dinitro-4-

trifluorometilfenil-ß-CD bizonyult a legjobbnak. A szerzők összehasonlítottak két

állófázist, amelyek ugyanezt a szelektort tartalmazták, de eltérő kapcsolással a CD-hez. Az

egyik megegyezik az általunk használt DNP-ß-CD oszloppal, ahol az aromás rész

éterkötésen keresztül véletlenszerűen kapcsolódik a primer és szekunder

hidroxilcsoportokhoz, a másik állófázisnál a kötés karbamoilcsoporton keresztül történik a

C-2 és C-3 helyzetű szekunder hidroxilcsoportokhoz. Az utóbbi oszlop normál fázisban

sokkal hatékonyabbnak bizonyult, ami a szelektor CD-hez való kötés típusának és

helyzetének fontosságát is mutatja. Ennek az érdekes viselkedésnek a tanulmányozása

végett a szerzők további DNP-ß-CD állófázisokat állítottak elő, melyek a kar hosszában és

a hidroxilcsoportokhoz való kapcsolás helyzetében különböztek. Összehasonlítva a

véletlen eloszlású éter vagy karbamoilcsoporton kapcsolódó állófázisokat, nem volt

számottevő különbség a szelektivitásban. Azonban, ha az aromás gyűrű csak a C-2 illetve

C-3 hidroxilcsoporthoz kapcsolódott és a CD a C-6 primer hidroxilcsoporton keresztül volt

kötve a szilikagélhez, akkor az éterkötést tartalmazó állófázis sokkal hatékonyabbnak

bizonyult. A szelektor hatása mellett vizsgálták a vegyületek szerkezetének hozzájárulását

is a királis megkülönböztetéshez. Megállapították, hogy a királis centrum és a

funkcióscsoport (jelen esetben fenilgyűrű) közötti kisebb távolság esetében könnyebb

enantiomer elválasztást elérni [87].

A módosított CD-ek hatékonyak lehetnek olyan esetekben, amikor a királis

vegyületet nemkirális (főleg aromás gyűrűt tartalmazó) származékképzővel reagáltatjuk. A

származékképzési reakció során lehetőség van olyan molekularész bevitelére (pl. π-savas

állófázis esetén π-bázisos származékképző alkalmazásával), ami további kölcsönhatásba

léphet a módosított CD szelektorral, lehetővé téve a királis felismerést [88].

Az első királis ciklodextrin állófázis megjelenése óta eltelt 30 évben nagyon sokat

fejlődött a CD-ek kromatográfiás alkalmazása. Ezen a területen tapasztalt fejlődés a CD-k

sajátos kémiai tulajdonságának köszönhető, hiszen a gyűrű méretével és a

hidroxilcsoportokhoz való funkcióscsoportok kötésével számos eltérő tulajdonsággal

rendelkező királis származék és állófázis állítható elő, ezáltal lehetővé téve nagyszámú

királis vegyület elválasztását.

31

2.2. A hőmérséklet hatása a kromatográfiás és a királis kromatográfiás

elválasztásra

A királis kromatográfiás retenciós mechanizmus kutatásának egyik lehetséges módja

a kromatográfiás paraméterek hőmérsékletfüggésének vizsgálata és az ezekből számolt

termodinamikai adatok értékelése.

2.2.1. A kromatográfiás elválasztás hőmérsékletfüggése

Számos közlemény jelent meg ebben a témában, az eredmények tükrében két ismert

hatást emelnék ki.

Az első hatás a szelektivitási tényező (α) változásában figyelhető meg. Ez a

termodinamikai hatás, Chen és mtsai. [89] illetve Zhu és mtsai. [90] mutattak rá, hogy a

szelektivitási tényező általában csökken a hőmérséklet emelésével. Ez azért következik be,

mert változtatva a hőmérsékletet a megoszlási hányados is változik, ami maga után vonja a

szabadentalpia változását, miközben a megoszlás létrejön a két fázis között. Ionosan

disszociáló mozgófázis, vagy minta esetén a disszociáló vegyület pK-ja is befolyásolható

az eluensösszetétel, vagy a hőmérséklet változtatásával. A hőmérséklet hatása a

szelektivitási tényezőre nem teljesen tisztázott, mivel nem ismerjük, hogyan változik a

komponens entalpiája a mozgófázisból az állóba történő átmenet során [89,90].

A második hatás a mozgófázis viszkozitásának és ebből eredően a diffúziós

állandónak a változása, amit kinetikai hatásnak nevezünk. A hőmérséklet emelésével az

eluens viszkozitásának csökkenése az oldott anyag diffúziós állandójának növekedését

vonja maga után mind a mozgó-, mind az állófázisban, amely a hatékonyságért felelős

anyagátadási gátlást csökkenti. Természetesen a hőmérséklet emelésével a másodlagos

kötések kialakulásának erőssége is csökken, így a királis felismerés mértékének

csökkenése erősen függ a királis eredő kölcsönhatás nagyságától. További problémát

jelenthet a hőmérséklet emelésével járó állófázis és/vagy a vizsgált molekula bomlása. A

nagyobb hőmérséklet alkalmazásának korlátot szab adott áramlási sebesség mellett

kialakuló nyomáson az eluens forráspontja, illetve az oszlop utáni nyomás kiegyenlítésből

adódó forráspontcsökkenés is [91].

32

2.2.2. A van´t Hoff egyenlet alkalmazása a kromatográfiában

Értékes információkat nyerhetünk a retenciós mechanizmusról, ha a retenció

hőmérsékletfüggését vizsgáljuk. Természetesen ezek a termodinamikai adatok egyensúlyi

rendszerekre igazak, mely feltétel nem teljesül a kromatográfiás folyamatokra, azonban

megfelelő becslést tudnak nyújtani az elválasztási folyamatok értelmezésénél.

Egy, a termodinamikából ismert összefüggés kapcsolatot teremt a standard

szabadentalpia változása és az egyensúlyi állandó (ami kromatográfiás retenció esetén a

megoszlási hányados) között, miközben az adott komponens az egyik fázisból a másikba

kerül:

RT ln K = -∆Go (9)

Ismert még a standard szabadentalpia változás definíciója is a Gibbs függvényből:

∆G° = ∆H°- T∆S° (10)

ahol:

∆H° = standard entalpiaváltozás,

∆S° = standard entrópiaváltozás.

Ezt az előző egyenletbe helyettesítve:

R

S

RT

H

R

S

RT

HK

oooo ∆+

∆−=

∆−

∆−=ln (11)

Az egyensúlyi állandó egyenlő a retenciós faktor (k) és a fázisarány (Φ) hányadosával.

Φ

=k

K (12)

Ha ezt az előző egyenletbe helyettesítjük, megkapjuk a kromatográfiában használt van´t

Hoff egyenletet:

Φ+∆

+∆

−= lnlnR

S

RT

Hk

oo

(13)

Ezen egyenlet szerint ln k-t 1/T függvényében ábrázolva egyenest kapunk, melynek

meredeksége –∆H° /R, tengelymetszete, pedig ∆S° /R+ln Φ (ha nem ismerjük az lnΦ tagot,

akkor a tengelymetszet R-el szorzott értékét ∆S0† = R ∆S° + R ln Φ használjuk).

A fázisarány számítása: egy kromatográfiás oszlop fázisaránya, a mozgófázis

térfogatának (Vm) és az állófázis térfogatának (Vs) aránya.

33

2.2.3. A van´t Hoff egyenlet alkalmazása a királis kromatográfiában

Fontos következtetéseket tudunk levonni a királis megkülönböztetési

mechnizmusról, ha megvizsgáljuk a két enantiomer standard szabadentalpia változásának a

különbségét

∆G2°-∆G1°=∆(∆G°). (15)

A már ismert Gibbs-Helmholtz formulát

-∆G°=RT ln K, (16)

az előző egyenletbe behelyettesítve a következő összefüggéshez jutunk:

-∆(∆G°)=RT ln (k2/k1). (17)

Az α elválasztási tényező a két enantiomer csúcs egymáshoz viszonyított helyzetét adja

meg.

1

2

k

k=α (18)

a k1 és a k2 a két enantiomer retenciós faktorát jelöli. Az elválasztási tényezőt

behelyettesítve a 17. egyenletbe a következő kifejezést kapjuk:

-∆(∆Go)=RT ln α . (19)

Az előző pontban megismert van’t Hoff egyenlet (13) felhasználásával ln α

egyszerűsítések után kifejezhető a következő formulával:

R

S

RT

H )()(ln

oo ∆∆+

∆∆−=α (20)

Az egyenlet szerint ln α-t 1/T függvényében ábrázolva egyenest kapunk, melynek

meredeksége –∆(∆H°)/R, tengelymetszete pedig ∆(∆S°)/R.

2.3. A tömegspektrometria alkalmazása a királis felismerésben

A tömegspektrometriában, a királis felismeréshez királis környezet szükséges,

melyet királis molekulák (szelektorok) alkalmazásával biztosíthatunk. Többféle királis

tömegspektrometriás módszer ismert, úgymint kinetikus módszer [92-105], rögzített-

ligandum kinetikus módszer [102,105–108], ion/molekula reakciók (gazda/vendég

komplexek) [109–111], valamint egyéb módszerek [112,113]. Ezek közül, a trimer

34

fémkomplexeken alapuló kinetikus módszer [92–95] a leggyakrabban alkalmazott

természetes és szintetikus α- és ß-aminosavak és királis gyógyszermolekulák analízisére

[96–105]. Ebben a megoldásban, egyszeresen töltött trimer fémkomplexeket

[MII(ref)2(A)−H]+ képzünk és választunk ki. Ütközéssel indukált disszociáció során

(„collision-induced dissociation, CID”), a trimer-komplex ionok disszociálnak dimer

komplexeket képezve (21), ahol A a minta, MII a kétértékű fémion és ref a királis

referencia anyag:

(21) Az R és S enantiomerre vonatkozó RR (22) és RS (23) arányok a [MII(ref)(AR vagy S)−H]+

dimer és [MII(ref)2−H]+ dimer hányadosából adódnak:

(22)

(23)

A királis szelektivitás (Rkirális) az R és S enantiomerek RR és RS értékének a hányadosa:

(24)

Abban az esetben amikor az Rkirális értéke eltér egytől, akkor királis felismerésről

beszélhetünk. Rkirális értéke nagymértékben függ a minta és a referencia anyag

szerkezetétől; általában a fémion hozzájárulása a királis felismeréshez sem hanyagolható

el. A hárompontos kölcsönhatás kialakulása [104] szükséges a királis felismeréshez, ezért a

minta, a királis referencia anyag és a fémion közti kölcsönhatások típusa és erőssége

meghatározó jelentőségű [99–105]. Különböző α-aminosavak, mint minta és referencia

anyagok viselkedését Cooks és mtsai. [96] részletesen vizsgálták és rámutattak, hogy a π–π

„stacking” kölcsönhatás a referencia anyag aromás oldallánca és az aminosav

karboxilcsoportja között meghatározó. Kumari és mtsai. [98] alifás, aromás és savas-

jellegű aminosavak királis megkülönböztetését vizsgálták L-Tyr és jódozott L-Tyr királis

referencia anyagok jelenlétében. A jódatomok jelenléte a referencia molekulában sztérikus

hatások eredményeként javította a királis felismerést. Kumari és mtsai. [98] elméleti

számításokat felhasználva rámutattak, hogy a π–d „stacking” kölcsönhatás a referencia

molekula fenilgyűrűje és a fémion között, valamint a jódatom és a fémion közti

kölcsönhatás segíti a királis felismerést.

35

2.4. A ß-laktám és ß-aminosav származékok kémiai és biológiai

jelentősége

A β-laktámok fontos kémiai (ß-aminosav szintézis) és élettani (antibakteriális)

tulajdonságuknak köszönhetően számos kutatás alapját képezik. A ß-laktám

antibiotikumok hatócsoportja a ß-laktám gyűrű, az ehhez kapcsolódó oldalláncok (gyűrűk)

határozzák meg a származék antibakteriális spektrumát, farmakokinetikáját és a vegyület

stabilitását a baktériumok által termelt ß-laktamáz enzimekkel szemben.

Hatásmechanizmusok során a baktériumok sejtfalszintézisében résztvevő fehérjékhez

kötődve gátolják a sejtfal felépítését, e fehérjéket nevezik penicillinkötő fehérjéknek

(penicillin binding protein - PBP). Biológiai aktivitásuk jelentősen függ sztereokémiai

tulajdonságuktól, így királis azonosításuk, illetve elválasztásuk nagy jelentőséggel bír.

Az általunk vizsgált ß-laktámok két csoportra oszthatók:

4-aril-szubsztituált-,

kondenzált gyűrűs ß-laktámok.

Különleges élettani hatásuknak köszönhetően a ß-aminosavak kutatása az utóbbi

tizenöt évben fellendült. Igazolt idegrendszeri aktivitással, receptor antagonista és

antitumor hatással bírnak. Természetesen a biológiai aktivitásuk felismerése magára vonta

a szintetikus és analitikus kémikusok figyelmét is, nagyszámú publikációt eredményezve.

Az aliciklusos ß-aminosavak kiindulási anyagai a heterociklusos

gyógyszerhatóanyagoknak. A peptidkémikusok számára is fontosak, hiszen

konformációsan gátolt ß-aminosavak beépítésével merevebb szerkezetű peptideket

hozhatnak létre, lehetővé téve receptorokhoz való kötődésük tanulmányozását [114].

36

3. Kísérleti rész

3.1. Vizsgált anyagok

A vizsgált vegyületek a legtöbb esetben szintetikus anyagok voltak, melyek

partnereink laboratóriumaiban készültek. Előállításukra a dolgozatban nem térek ki a

leírások terjedelme miatt, a leírások rövidített változata eredeti közleményeinkben

megtalálhatók. A vizsgált vegyületek nagy számára való tekintettel a könnyebb

átláthatóság érdekében kilenc csoportra osztottuk azokat.

3.1. Táblázat. 4-Arilszubsztituált ß-laktámok

NH

O

NH

O

NH

O

F

1 2 3

4-fenilazetidin-2-on 4-(4-metilfenil)azetidin-2-on

4-(4-fluorfenil)azetidin-2-on

NH

O

Cl

NH

O

Br

NH

O

Cl

4 5 6

4-(4-klórfenil)azetidin-2-on 4-(4-brómfenil)azetidin-2-on

4-(2-klórfenil)azetidin-2-on

NH

O

Cl

7

4-(3-klórfenil)azetidin-2-on

37

3.2. Táblázat. Kondenzált gyűrűs ß-laktámok

NH

O

NHO

NH

O

8 9 10

benzo[e]1-azabiciklo[3.2.0]heptán-2-

on

benzo[f]1-azabiciklo[4.2.0]oktán-2-on

benzo[e]1-azabiciklo[5.2.0]nonán-2-on

3.3. Táblázat. Kondenzált gyűrűs ß-aminosavak

COOH

NH2

COOH

H2N COOH

NH2

11 12 13

3-aminoindán-2-karbonsav 2-

aminobenzo[c]ciklohexán-1-karbonsav

2-aminobenzo[c]cikloheptán-

1-karbonsav 3.4. Táblázat. Aromás ß3-aminosavak

HOOCNH2

HOOCNH2

HOOCNH2

CF3

14 15 16

3-amino-3-fenilpropánsav 3-amino-3-(4-

metilfenil)propánsav 3-amino-3-(4-

trifluormetilfenil)propánsav

HOOCNH2

O

HOOCNH2

O

HOOCNH2

O

17 18 19

3-amino-3-(4-metoxifenil)propánsav

3-amino-3-(3-metoxifenil)propánsav

3-amino-3-(2-metoxifenil)propánsav

38

3.4. Táblázat (folyatatás). Aromás ß3-aminosavak

HOOCNH2

O

O

HOOCNH2

F

HOOCNH2

Cl

20 21 22

3-amino-3-(3,4-dimetoxifenil)propánsav

3-amino-3-(4-fluorfenil)propánsav

3-amino-3-[4-klór(fenil)]propánsav

HOOCNH2

Cl

HOOCNH2

Cl

HOOCNH2

Cl

Cl

23 24 25

3-amino-3-(3-klórfenil)propánsav

3-amino-3-(2-klórfenil)propánsav

3-amino-3-(3,4-diklórfenil)propánsav

HOOCNH2

Br

HOOCNH2

Br

HOOCNH2

26 27 28

3-amino-3-(4-brómfenil)propánsav

3-amino-3-(3-brómfenil)propánsav

3-amino-4-fenilbutánsav

3.5. Táblázat. Alifás és aliciklusos ß3-aminosavak

HOOCNH2

HOOC

NH2

HOOCNH2

29 30 31

3-amino-butánsav 3-amino-pentánsav 3-amino-4-metilpentánsav

HOOCNH2

HOOCNH2

HOOCNH2

32 33 34

3-amino-4,4-dimetilpentánsav 3-amino-4-metilhexánsav 3-amino-4-etilhexánsav

39

3.5. Táblázat (folytatás). Alifás és aliciklusos ß3-aminosavak

HOOCNH2

HOOCNH2

HOOCNH2

35 36 37

3-aminohex-5-énsav 3-aminohex-5-insav 3-amino-3-

ciklohexilpropánsav

HOOCNH2

38

3-amino-3-(ciklohex-3-én-1-il)propánsav

3.6. Táblázat. Alifás ß2-aminosavak

H2NCOOH

H2N

COOH

H2NCOOH

39 40 41

3-amino-2-metilpropánsav 2-(aminometil)butánsav 2-(aminometil)pentánsav

H2NCOOH

H2NCOOH

H2NCOOH

42 43 44

2-(aminometil)hexánsav 2-(aminometil)-3-metilbutánsav

2-(aminometil)-4-metilpentánsav

3.7. Táblázat. Aromás és heterociklusos ß2-aminosavak

H2N COOH

H2N COOH

OH

H2N COOH

OH

45 46 47

3-amino-2-benzilpropánsav 3-amino-2-(4-

hidroxibenzil)propánsav 3-amino-2-(3-

hidroxibenzil)propánsav

40

3.7. Táblázat (folytatás). Aromás és heterociklusos ß2-aminosavak

H2N COOH

O

H2N COOH

O

O

48 49

3-amino-2-(4-etoxibenzil)propánsav

2-aminometil-3-(benzo[d]1,3-dioxolán-5-il)-

propánsav 3.8. Táblázat. Tömegspektrometriás királis felismeréshez alkalmazott referencia anyagok (enantiomerek)

NH

COOH

COOH

NH2 COOH

NH2

OH

L-Pro L-Phe L-Tyr

(S)-pirrolidin-2-karbonsav

(S)-2-amino-3-fenilpropánsav (S)-2-amino-3-(4-

hidroxifenil)propánsav

COOH

NH2

OH

OH

H2N

COOH

COOH

NH2

OH

L-DOPA L-2’,6’-diMePhe L-2’,6’-diMeTyr

(S)-2-amino-3-(3,4-dihidroxifenil)propánsav

(S)-2-amino-3-(2,6-dimetilfenil)propánsav

(S)-2-amino-3-(4-hidroxi-2,6-dimetilfenil)propánsav

COOH

NH2

COOH

NH2

HO

L-Phg L-4’-OHPhg

(S)-2-amino-2-fenilecetsav

(S)-2-amino-2-(4-hidroxifenil)ecetsav

41

3.9. Táblázat. Tömegspektrometriás királis felismerésben alkalmazott aromás ß3-

aminosavak

HOOCNH2

HOOCNH2

HOOCNH2

F

50 51 52

3-amino-3-fenilpropánsav 3-amino-3-(4-

metilfenil)propánsav 3-amino-3-(4-

fluorfenil)propánsav

HOOCNH2

Cl

HOOCNH2

Cl

NH2HOOC

53 54 55

3-amino-3-(4-klórfenil)propánsav

3-amino-3-(3-klórfenil)propánsav

3-amino-4-(4-metilfenil)butánsav

NH2HOOC

Cl

56

3-amino-4-(4-klórfenil)butánsav

3.2. Felhasznált vegyszerek

Az alkalmazott HPLC tisztaságú oldószerek, metanol (MeOH), etanol (EtOH),

propán-1-ol (PrOH), propán-2-ol (2-PrOH), bután-2-ol (2-BuOH), 2-metilpropán-2-ol (t-

BuOH), acetonitril (MeCN) Merck (Darmstadt, Németország), a HPLC tisztaságú ecetsav

(AcOH) Scharlau Chemie S. A., (Barcelona, Spanyolország) gyártmányúak voltak.

Az analitikai tisztaságú perklórsav (HClO4), trifluorecetsav (CF3COOH, TFA),

foszforsav (H3PO4), kénsav (H2SO4), sósav (HCl), trietil-amin (TEA) és NaOH Merck

gyártmányú volt.

A puffereket Milli Q vízzel készítettük és 0,45 µm-es szűrőn szűrtük (Millipore,

Molsheim, Franciaország).

42

3.3. Alkalmazott berendezések

A pH mérése Thermo Orion 420 pH mérő (Orion, USA) készüléken történt.

A folyadékkromatográf a következő egységekből épült fel: Waters 1525 bináris

HPLC-pumpa, 2487 kétcsatornás UV-VIS detektor, Breeze adatfeldolgozó rendszer

(Waters, Milford, MA, USA), Rheodyne 7125 20 µl-es mintaadagoló (Cotati, CA, USA),

MK 70 termosztát (Mechanik Prüfgerate Medlingen Németország).

A tömegspektrometriás mérésekhez Bruker Esquire 3000 plus kvadrupol-ioncsapda

(QIT) tömegspektrométert és Bruker Daltonics Compass 1.1 MS vezérlő és adatfeldolgozó

szoftvert alkalmaztunk (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Németország).

A tömegspektrométer pozitív „elektroporlasztásos ionizációs” módban (ESI)

működött, a következő paraméterekkel: a mintát közvetlenül vezettük a

tömegspektrométerbe 2,5 µL perc−1 áramlási sebességgel. A bemeneti kapilláris feszültség

−4,0 kV; „end plate” −3,5 kV; a „skimmer” feszültség 46,5 V; oktopol 1 dc 4,73 V;

oktopol 2 dc 2,43 V; és oktopol RF amplitude 258 V. 100–990 m/z tömegtartomány;

maximális gyűjtési idő, 20 ms; maximális ion szám, (ICC) 20 000. Porlasztó és szárító gáz,

250 oC-os N2; ütközési gáz, He. CID mérés alatt mind a prekurzor ion izolálása mind a

fragmentációs ablak szélessége 3,0 m/z volt. Az ütközési feszültség 0,17–0,40 V között

változott optimalizálva minden egyes komplexre. Azonos enantiomerpárra azonos

fragmentációs feszültséget alkalmaztunk.

3.4. Alkalmazott folyadékkromatográfiás oszlopok.

A makrociklusos glikopeptid alapú oszlopok: ChirobioticTM V (V), királis szelektora

vankomicin, ChirobioticTM VAG (VAG), királis szelektora vankomicin aglikon,

ChirobioticTM T (T), királis szelektora teicoplanin, ChirobioticTM TAG (TAG) királis

szelektora teicoplanin aglikon, ChirobioticTM R (R), királis szelektora ristocetin A. Az

oszlopok méretei és gyártói megegyeznek, 250 mm × 4,6 mm, 5 µm szemcseátmérő

(Astec, Whippany, USA).

Koronaéter alapú királis oszlopok: (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav

királis szelektort tartalmazó két oszlopot használtunk, a Korona 1 (2.9. ábra) és a Korona

2 (2.11. ábra). Szintézis módjából adódóan a Korona 1 szabad szilanolcsoporttal

rendelkezik, a Korona 2 esetén nincs szabad szilanolcsoport (az oxigén éterkötés

formájában van). A két oszlop mérete és gyártója megegyezik, 150 mm × 4,0 mm, 5 µm

szemcseátmérő (Myung Ho Hyun, Pusan National University, Busan, Dél-Korea).

43

Ciklodextrin alapú oszlopok: Cyclobond I 2000 DMP (DMP), királis szelektora 3,5-

dimetilfenilkarbamoil-β-ciklodextrin. Az oszlopok mérete és gyártója: 250 mm × 4,6 mm,

5 µm szemcseátmérő (Astec, Whippany, USA).

4. Kísérleti eredmények és értékelésük

Az eredmények bemutatása három részre tagolódik az irodalmi összefoglalóban

tárgyalt állófázisok sorrendjét követve. A jobb és egyszerűbb áttekinthetőség érdekében, a

kísérleti részben bevezetett rövidítéseket és a vizsgált vegyületek számozási rendszerét

használom, illetve csak a magyarázatok értelmezéséhez szükséges adatok közlésére

szorítkozom. Az összes mérési eredmény a feldolgozott közleményekben megtalálható.

4.1. Elválasztások makrociklusos glikopeptid és ciklodextrin alapú királis

állófázisokon

4.1.1. A 4-Arilszubsztituált ß-laktámok elválasztása Chirobiotic T és

TAG állófázison

A 4-arilszubsztituált ß-laktámok (1-7) (N-peptidil származékai szerint proteáz,

elasztáz és cisztein proteáz papain inhibítorok) [115], a laktám gyűrű mellett egy

fenilgyűrűt is tartalmaznak (3.1. Táblázat). Az 1 vegyület esetén a fenilgyűrű nem

szubsztituált szemben a 2-7 ß-laktámokkal, így összehasonlítási alapként használható a

szubsztituens kromatográfiás hatásának vizsgálatára. Méréseink kiterjedtek a szelektor

minősége (T, TAG), az eluensösszetétel és a hőmérséklet hatásának tanulmányozására is.

ß-laktámok kromatográfiás viselkedését két oszlopon (T és TAG), illetve két

eluensösszetétel mellett 0,1% TEAA (pH=4,1)/MeOH = 60/40 (v/v) és MeOH = 100%

vizsgáltuk, (4.1. táblázat) továbbá a hőmérsékletfüggés hatását 278-318 K tartományban

tanulmányoztuk. Mind a két állófázison sikerült a hét vegyületet alapvonalra elválasztani.

Az enantiomerek elúciós sorrendjének meghatározásakor minden esetben az S enantiomer

eluálódott elsőként, (az 5 minta esetében, tiszta enantiomer hiányában nem tudtuk az

elúciós sorrendet meghatározni).

Mind a két állófázisnál egységesen a puffert tartalmazó eluens alkalmazása esetén

nagyobb k’1 értékeket tapasztaltunk, mint 100% MeOH alkalmazásakor, ami az ionos

kölcsönhatások meghatározó szerepére utal a visszatartásban. Ez a különbség TAG oszlop

alkalmazása esetén jelentősebb, sok esetben meghaladja a 4-5-szörös retenciós faktor

44

különbséget. Ez a viselkedés megfelel Berthod és mtsai. [21] által kation jellegű

aminosavak vizsgálatakor az eluens pH csökkentésénél tapasztalt nagyobb visszatartásnak.

A ß-laktámok kationos jellegűek, a gyűrűben levő nitrogén képes protonálódni, ikerionos

illetve anionos állapot nem alakulhat ki, mivel szabad karboxilcsoportot és aminocsoportot

nem tartalmaznak. Az alkalmazott pH=4,1 mellett az ikerionos állófázis

karboxilcsoportjával a ß-laktám protonált aminocsoportja ionos kölcsönhatásba tud lépni.

Az eluens összetételének hatását a kromatográfiás paraméterekre a 2 és 4 vegyület

esetén vizsgáltuk. A retenciós faktor, a szelektivitási tényező és a felbontás változását a T

és TAG állófázisokon a 4.1. ábra szemlélteti.

4.1. Táblázat. A 4-aril-szubsztituált ß-laktámok kromatográfiás paraméterei (k1’, α és RS) és az enantiomerek elúciós sorrendje Chirobiotic T és TAG oszlopon

Vegyület KÁF Mozgófázis k1’ αααα RS

Elúciós sorrend

T a 2,79 1,48 4,64 S<R T b 1,39 1,30 3,60 S<R

TAG a 10,04 1,69 3,31 S<R 1

TAG b 1,99 1,49 4,46 S<R

T a 3,34 1,52 3,67 T b 1,35 1,32 4,00

TAG a 12,51 1,78 4,21

2

TAG b 1,84 1,68 6,50

S<R S<R S<R S<R

T a 2,63 1,64 4,59 T b 1,30 1,40 4,67

TAG a 8,10 1,99 5,56 3

TAG b 1,78 1,65 6,67

S<R S<R S<R S<R

T a 3,69 1,56 3,95 T b 1,36 1,37 4,44

TAG a 13,44 2,03 6,27

4

TAG b 1,95 1,76 6,96

S<R S<R S<R S<R

T a 3,42 1,52 2,78 T b 1,37 1,36 3,64

TAG a 16,19 1,99 3,91

5

TAG b 1,94 1,73 5,73

*

T a 3,32 1,46 3,14 T b 1,20 1,23 2,56

TAG a 13,16 1,63 3,84 6

TAG b 1,66 1,73 6,44

S<R S<R S<R S<R

T a 3,50 1,39 3,00 T b 1,25 1,17 1,89

TAG a 12,31 1,63 4,28 7

TAG b 1,89 1,34 4,00

S<R S<R S<R S<R

Kromatográfiás körülmények: királis állófázis (KÁF), Chirobiotic T (T) és Chirobiotic TAG (TAG); eluens, a, 0,1% TEAA (pH 4,1)/MeOH=60/40 (v/v), b, 100% MeOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K; *nincs elúciós sorrend meghatározás.

45

Mindkét állófázisnál és vegyületnél a mozgófázisban a szerves komponens

arányának növelésével a visszatartás csökkenése figyelhető meg, ami megfelel a klasszikus

fordított fázisú viselkedésnek. A szelektivitási tényező 30-40% MeOH-tartalom mellett

maximumot mutatott. A felbontás a T oszlopnál telítési görbe szerint alakult, a TAG

oszlop esetében a szerves komponens növelésével végső soron 100% MeOH-tartalomig

egy folyamatos növekedés volt megfigyelhető (a 70% MeOH-tartalomnál bekövetkező

csökkenésre nem találtunk érdemi magyarázatot).

T

0 20 40 60 80 100

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

A

αααα and Rs

ln k1

MeOH %

ln k1

Rs

αααα

0 20 40 60 80 100

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

B

αααα and Rs

ln k1

MeOH %

ln k1

Rs

αααα

TAG

0 20 40 60 80 100

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7C

α α α α and Rsln k1

MeOH %

ln k1

Rs

αααα

0 20 40 60 80 100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9D

α α α α and Rs

ln k1

MeOH %

ln k1

Rs

αααα

4.1. ábra

Az eluensösszetétel hatása a kromatográfiás paraméterekre 2 és 4 vegyületek esetén

T és TAG oszlopokon Kromatográfiás körülmények: oszlop, Chirobiotic T (T) és Chirobiotic TAG (TAG); eluens, 0,1% TEAA (pH 4,1)/MeOH (v/v), detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Az enantiomerek szerkezeti hozzájárulását vizsgálva megállapítható, hogy a metil-,

klór- és brómszubsztituensek jelenléte a ß-laktám aromás gyűrűjén egységesen visszatartás

növekedést eredményeztek a szubsztituálatlan 1 vegyülethez képest. Amíg a klór

szubsztituensek helyzete a visszatartást jelentősen nem befolyásolja, addig a

szelektivitásban és felbontásban eltérés figyelhető meg. A királis felismerési folyamatban

αααα és RS αααα és RS

αααα és RS αααα és RS

2

2

4

4

46

egységesen legkedvezőbbnek a para-helyzetű szubsztitúció bizonyult mind a két állófázis

esetén. A meta-szubsztituált 7 vegyület esetén figyelhető meg a legkisebb szelektivitás és

felbontás utalva a kedvezőtlen sztérikus hozzájárulásra. A szubsztituensek helyzetéből

adódó eltérő szelektivitás és felbontás értékek valószínűleg Guiochon és mtsai [116] által

adszorpciós izotermák felvételével meghatározott nem-enantioszelektív (I.) és

enantioszelektív (II.) adszorpciós kötőhelyekkel magyarázhatóak. Az I. típusú nem-

enantioszelektív helyeken az elektrosztatikus, H-híd, poláris, van der Waals és diszperziós

kölcsönhatások a meghatározóak. A II. típusú enantioszelektív kötőhelyek vesznek részt a

királis felismerési folyamatban. Esetünkben a klór szubsztituens helyzete az aromás

gyűrűn az enantioszelektív kötőhelyekkel kialakított kölcsönhatásokban játszhat jelentős

szerepet.

A királis szelektor szerkezete szintén jelentősen befolyásolja a királis

megkülönböztetési folyamatot. A T szelektor esetében kisebb szelektivitást és felbontást

kaptunk, mint a TAG oszlop esetén, ami a cukorrészek sztérikus gátló hatásával

magyarázható. Az irodalmi részben már említett van’t Hoff összefüggés alapján az lnα-

1/T függvény meredekségéből és tengelymetszetéből számolt standard entalpiaváltozás

különbség ∆(∆H°), standard entrópiaváltozás különbség ∆(∆S°) és standard szabadentalpia

változás különbség ∆(∆G°) értékek segítséget nyújtanak a királis megkülönbözetési

folyamatok értelmezésében. Ha a vizsgált hőmérséklettartomány nem túl nagy [116] és a

∆(∆H°) konstans az adott hőmérséklettartományon belül, az lnα-1/T függvény

meredeksége adja -∆(∆H°) és a tengelymetszet a ∆(∆S°) értékeket.

Fizikai-kémiai szempontból a ∆(∆H°) felvilágosítást nyújt arról, hogy mennyire

kedvezményezett a folyamat, amely során a relatíve jobban kötődő enantiomer a

mozgófázisból átlépve az állófázishoz kötődik. A ∆(∆S°) a két enantiomer

rendezettségének mértékében bekövetkező változást jellemzi az állófázishoz való kötődés

során. A negatívabb ∆(∆H°) nagyobb energia felszabadulással járó (exoterm) átmenetre

utal a nagyobb retencióval rendelkező (másodikként eluálódó) enantiomerre nézve, azaz

erősebb kölcsönhatás alakul ki az állófázissal. Természetesen a kialakuló kölcsönhatás a

rendezettségben bekövetkező változást is magával vonja, negatív ∆(∆S°) eredményezve.

Általánosan elmondható, hogy az alacsony hőmérséklet kedvez az intermolekuláris

kölcsönhatások kialakulásának, azonban néhány esetben az asszociációt megelőző

deszolvatációs folyamatok pozitív ∆(∆S°) eredményeznek. Ezekben az esetekben az

enantioszelektivitás magasabb hőmérsékleten kedvezőbb lesz.

47

A királis szelektor hozzájárulását vizsgálva az enantioszelektivitáshoz, korábbi

kutatások rámutattak arra, hogy a cukorrészek a királis felismerési folyamatban betöltött

szerepe összetett. Egyrészről gátolhatják a királis felismerést, oly módon, hogy a

cukorrészek elfedik a makrociklusos üregeket, illetve az elektrosztatikus kölcsönhatások

kialakítására képes amino- és karboxilcsoportokat. Másrészről viszont segíthetik a királis

megkülönböztetést, hiszen a cukorrészeken számos kiralitás centrum és hidrogénkötések

kialakítására alkalmas csoport van.

A hőmérsékletfüggés méréséhez 100% MeOH-tartalmú eluenst választottunk- 278-

318 K hőmérséklettartományban mértük az enantiomerek kromatográfiás adatait és az lnk-

1/T ábrázolásból nyert termodinamikai adatokat a 4.2. Táblázatban foglaltam össze.

Amint a bemutatott korrelációs együtthatók bizonyítják, a kapott függvények megfelelő

jósággal leírhatók voltak egy-egy egyenes egyenletével. Az enantioszelektivitást jellemző -

∆(∆H°), -∆(∆S°) és -∆(∆G°) értékekből az alábbi általános következtetések vonhatóak le.

A számolt ∆(∆G°) 298 K-en a T és a TAG állófázisokra -0,4−-0,9 illetve -0,7−-1,4 kJ/mol

tartományba esnek (4.2. Táblázat), és mind a hét vegyület esetében nagyobbak voltak

TAG állófázison. Összefoglalóan megállapítható, hogy a vizsgált ß-laktámoknál a

cukorrészek kedvezőtlenül befolyásolták a királis megkülönböztetési folyamatot.

4.2. Táblázat. A 4-aril-szubsztituált ß-laktámok termodinamikai paraméterei, ∆(∆H°), ∆(∆S°), ∆(∆G°)298K, és az ln α-1/T függvény korrelációs koefficiense (szórásnégyzete, R2)

T Vegyület -∆∆∆∆(∆∆∆∆Ho)

(kJ mol-1) −∆−∆−∆−∆(∆∆∆∆So)

(J K-1 mol-1) -∆∆∆∆(∆∆∆∆Go)298 K (kJ mol-1)

R2

1 3,8 10,5 0,6 0,995 2 4,0 11,2 0,7 0,995 3 5,3 14,8 0,9 0,996 4 4,8 13,3 0,8 0,997 5 4,3 12,0 0,8 0,998 6 1,8 4,2 0,5 0,999 7 2,0 5,4 0,4 0,991

TAG Vegyület -∆∆∆∆(∆∆∆∆Ho)

(kJ mol-1) −∆−∆−∆−∆(∆∆∆∆So)

(J K-1 mol-1) -∆∆∆∆(∆∆∆∆Go)298 K (kJ mol-1)

R2

1 3,8 9,4 1,0 0,998 2 4,6 11,0 1,3 0,999 3 5,1 12,6 1,3 0,963 4 5,4 13,7 1,4 0,975 5 4,2 9,6 1,4 0,997 6 4,2 9,8 1,3 0,991 7 2,2 5,0 0,7 0,995

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Chirobiotic T (T) és Chirobiotic TAG (TAG); eluens, 100% MeOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 278–318 K.

48

Természetesen nemcsak a szelektor, hanem a vizsgált vegyületek szerkezeti

hozzájárulásával is számolni kell. Összehasonlítva a -∆(∆H°) különbségeket a 2, 3, 4, 5

vegyületek esetében nagyobb értékeket kapunk, szemben a szubsztituálatlan 1

ß−laktámmal, amely a para-helyzetű szubsztituensek kedvező hozzájárulását mutatja a

királis felismerésre. Az orto- és a meta-klór-szubsztituált 6 és 7 vegyület esetében kisebb -

∆(∆H°)-t kaptunk összehasonlítva a para-klór-szubsztituált 4 vegyülettel mind a két

állófázis esetében. A kisebb -∆(∆H°) arra utal, hogy az enantioszelektív kölcsönhatások 6

és 7 vegyület esetében jóval gyengébbek.

Összefoglalásként elmondható, hogy a makrociklusos glikopeptid alapú T és TAG

királis állófázisokon a hét vizsgált aromás ß-laktám enantiomerjeit sikerült alapvonalra

elválasztani. Az enantiomerek elúciós sorrendje S<R volt, (az 5 vegyület esetén nem állt

rendelkezésre tiszta enantiomer a meghatározáshoz). Összehasonlítva a két oszlopot a

TAG hatékonyabbnak bizonyult, nagyobb szelektivitási tényező és felbontás értékeket

kaptunk.

Vizsgáltuk az eluensösszetétel és a hőmérséklet hatását a királis elválasztásra. A

szerves komponens növelésével jelentősen csökkent a visszatartás mind a két vizsgált

oszlopnál. A szelektivitási tényező enyhe maximum görbe szerint változott, a felbontás

100% MeOH esetén volt a legjobb. A hőmérsékletváltozás adataiból termodinamikai

paramétereket számoltunk, amelyek a királis felismerési folyamatban a szelektorok és a

vizsgált vegyületek szerkezeti hozzájárulása közötti kapcsolat értelmezését segítették. Az

1-7 vegyületek kiválasztott kromatogramjai a 10.1. Függelékben találhatók.

49

4.1.2. Kondenzált gyűrűs ß-laktámok és ß-aminosavak elválasztása

Chirobiotic T, TAG, V, VAG és Cyclobond DMP oszlopokon

Ebben a fejezetben három triciklusos ß-laktám (8-10) és három biciklusos ß-

aminosav (11-13) enantiomerjeinek kromatográfiás viselkedését tárgyalom (3.2.

Táblázat). Mind a hat vegyület cisz izomer. Öt makrociklusos glikopeptid teicoplanin (T),

teicoplanin aglikon (TAG), vankomicin (V), vankomicin aglikon (VAG), ristocetin A (R)

és 3,5-dimetilfenilkarbamoil ß-ciklodextrin (DMP) királis szelektort tartalmazó

állófázisokon történtek a vizsgálatok fordított fázisú, poláris-szerves és poláris-ionos

körülmények között. A vizsgálataink kiterjedtek az eluensösszetétel és a

hőmérsékletfüggés tanulmányozására is.

A két vegyületcsoport fordított fázisú analízisében érdekes viselkedés figyelhető meg

a retenciós faktorok tekintetében. A ß-laktámok esetében a szerves komponens növelésével

a mozgófázisban csökken a visszatartás a makrociklusos glikopeptid alapú állófázisokon,

hasonlóan az előző fejezetben tárgyalt hét ß-laktámhoz, ami megfelel a klasszikus fordított

fázisú viselkedésnek (nem bemutatott eredmények). A ß-aminosavak vizsgálatakor ezzel

ellentétes hatást figyeltünk meg. Ez azzal magyarázható, hogy nagy MeOH-tartalomnál

(>70%) az aminosavak oldhatósága csökken a MeOH-tartalom további növelésével, így az

állófázissal való kölcsönhatás válik kedvezményezetté.

Az egyes oszlopok összehasonlításakor, fordított fázisú elválasztásoknál 0,1%TEAA

(pH 6,5)/MeOH=10/90 (v/v) eluensösszetételnél az elsőként eluálódó enantiomerek

retenciós faktoraira T oszlop esetében a 8-10 vegyületeknél 0,87-1,00, 11-13

vegyületeknél 2,89-3,31 értékeket kaptunk (4.3. Táblázat). Hasonló tendenciát figyeltünk

meg TAG állófázis alkalmazásakor 0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH=30/70 (v/v)

eluensösszetételnél, a k1’ értékek ß-laktámokra 1,57-1,81 a ß-aminosavakra 2,89-3,58

között változtak. A ß-laktámok esetén tapasztalt kisebb visszatartás a hasonló szerkezetű

aminosavakhoz viszonyítva a szabad amino- és karboxilcsoportok hiányával

magyarázható, amelyek az ionos kölcsönhatások kialakításáért felelősek, továbbá a

laktámgyűrű létrejöttével a hármas gyűrűs szerkezet sztérikusan már kedvezőtlen a

szelektor zsebeiben való illeszkedéshez. Ezt támasztja alá, a TAG oszlopon tapasztalt

nagyobb visszatartás, ahol nem érvényesül a cukorrészek sztérikus gátló hatása. A 4.3.

Táblázat adatai szerint a k1’ értékek TAG oszlopon minden esetben nagyobbak voltak,

mint T oszlopon.

50

4.3. Táblázat. Triciklusos ß-laktámok és biciklusos ß-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), szabadentalpiaváltozás különbség értékei (∆(∆G°)298K valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Chirobiotic T, TAG, V, VAG, R és Cyclobond DMP oszlopokon fordított fázisú elválasztások esetén

Vegyület KÁF Mozgófázis k1' αααα Rs -∆(∆∆(∆∆(∆∆(∆GO)298K (kJ mol-1)

Elúciós sorrend

T a 0,98 1,19 1,71 0,40 1R,5R<1S,5S

TAG b 1,81 1,46 2,81 0,90 1R,5R<1S,5S 8 DMP d 3,52 1,10 1,76 0,20 1R,5R<1S,5S

T a 0,89 1,00 0,00 0,00 -

TAG b 1,57 1,00 0,00 0,00 - 9 DMP d 4,77 1,14 2,46 0,30 1R,6R<1S,6S

T a 0,87 1,07 0,70 0,20 1R,7R<1S,7S

TAG b 1,64 1,63 4,00 1,20 1R,7R<1S,7S 10 DMP d 6,86 1,05 0,88 0,10 1R,7R<1S,7S

T a 3,31 1,03 0,50 0,10 1R,2R<1S,2S

TAG b 3,21 1,17 1,14 0,40 1R,2R<1S,2S 11 DMP c 0,72 1,24 1,49 0,50 1S,2S<1R,2R

T a 3,12 1,27 2,85 0,60 1R,2R<1S,2S

TAG b 3,58 1,70 5,00 1,30 1R,2R<1S,2S 12 TAG c 2,82 1,33 3,43 0,70 1R,2R<1S,2S

T a 2,89 1,37 4,00 0,80 1R,2R<1S,2S

TAG b 3,80 1,33 2,57 0,70 1R,2R<1S,2S 13 V a 0,81 1,68 3,47 1,30 1R,2R<1S,2S

Kromatográfiás körülmények: oszlop (KÁF), Chirobiotic T (T), Chirobiotic TAG (TAG), Chirobiotic V (V), Chirobiotic VAG (VAG) és Cyclobond DMP (DMP); eluens, a, 0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH=10/90 (v/v), b, 0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH=30/70 (v/v), c, 0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH=55/45 (v/v), d, 0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH=60/40 (v/v), detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K. ß-Laktámok és ß-aminosavak esetében 8<9<10 és 11<12<13 sorrendben változik a

hidrofób jelleg. Fordított fázisú elválasztás folyamán egy adott oszlopon és

eluensösszetételnél a vegyületek hidrofób jellegének hozzájárulását vizsgálva a retenció

kialakulásához és a két vegyületcsoportot összehasonlítva, a kevésbé hidrofób ß-

aminosavak esetében a 13 vegyületnél, míg a ß-laktámoknál a 8 vegyület esetében

tapasztaltuk a legnagyobb visszatartást. Ez a jelentős különbség a két vegyületcsoport

között az állófázissal kialakult kölcsönhatások különbségéből adódhat, a ß-aminosavak

esetében nem a hidrofób jelleg, hanem az amino- és karboxilcsoportok elektrosztatikus

kölcsönhatása az állófázissal lehet a meghatározó.

A poláris-szerves (100% MeOH) és a poláris-ionos mérések

(MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01 (v/v/v)) összehasonlításakor (4.4. táblázat) a poláris-

ionos módban nagyobb visszatartást figyeltünk meg mind a ß-laktámok, mind a ß-

51

aminosavak esetében, ez a különbség TAG oszlopon még jelentősebb. Például a 10

vegyületnél T (k1’=6,33), TAG (k1’=9,44) értékeket kaptunk. A V és VAG oszlopoknál is

a fentihez hasonló tendenciát tapasztaltunk. Sav illetve bázis jelenléte az eluensben

meghatározza az aminosavak és a szelektor karboxil- és aminocsoportjának, és az

állófázison található szabad szilanolcsoportok protonáltsági állapotát is, így befolyásolják a

létrejövő elektrosztatikus kölcsönhatások kialakulását és erősségét. Az eluensben az

ecetsav mennyiségének 0,01 %-ról 0,1 %-ra növelésével és a TEA 0,01 % értéken

tartásával retenciós idő csökkenést figyeltünk meg, ami a karboxilcsoportok

protonálódásának növekedésével magyarázható.

Poláris-ionos módban adott eluensösszetételnél (MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01

(v/v/v)) a 13 vegyületre kapott k1’ értékeket összehasonlítva különböző oszlopokon, T

(k1’=4,66), TAG (k1’=8,55), V (k1’=1,32), VAG (k1’=1,60) és R (k1’=2,57), a V és VAG

esetében kaptuk a legkisebb visszatartást. Ez azzal magyarázható, hogy a V és VAG három

makrociklusa által formált kisebb kosárban nem tud megfelelően illeszkedni a viszonylag

nagy térkitöltésű biciklusos aminosav, szemben a T illetve TAG négy makrociklusa által

létrehozott nagyobb kosarával. A V és VAG oszlopok esetében kapott retenciós faktorokat

(k1’=1,32, k1’=1,60) összehasonlítva nem kaptunk jelentős különbségeket, így kijelenthető,

hogy a cukorrészek árnyékoló hatása itt kevésbé érvényesül. A risztocetin A szelektort

tartalmazó R oszlop esetében tapasztalt kisebb k1’ a T és TAG oszlopokhoz viszonyítva az

állófázis polárisabb jellegével (több cukorrész, nincs nonillánc), illetve a szabad

karboxilcsoport hiányával magyarázható.

A királis elválasztásra jellemző szelektivitási értékeket megvizsgáltuk a ß-laktám és

ß-aminosav enantiomerek fordított fázisú elválasztása esetén (4.3. táblázat). Amíg a ß-

laktámokra Chirobiotic T oszlopon 1,19; 1,00; 1,07, addig TAG esetében 1,46; 1,00 és

1,63 szelektivitási tényezőket kaptunk. Ezzel szemben ß3-aminosavaknál Chirobiotic T

oszlopon 1,03; 1,27; 1,37 és TAG oszlopon 1,17; 1,70; 1,33 értékeket kaptunk.

Elmondható, hogy mindkét vegyületcsoportnál, a 13 ß-aminosav esetén nem jelentős az

eltérés, a TAG bizonyult hatékonyabbnak. A fentiekhez hasonló eredményt kaptunk V és

VAG oszlopok esetében is.

Irodalmi adatok alapján várható volt, hogy a PIM alkalmazása α-aminosavak

esetében T és TAG állófázisokon jelentős szelektivitás javulást eredményez [16].

52

4.4. Táblázat. Triciklusos ß-laktámok és biciklusos ß-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), szabadentalpiaváltozás különbség értékei (∆(∆G°)298K valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Chirobiotic T, TAG, V, VAG, R és Cyclobond DMP oszlopokon poláris-szerves és poláris-ionos elválasztások esetén

Vegyület KÁF Mozgófázis k1' αααα Rs -∆(∆∆(∆∆(∆∆(∆GO)298K (kJ mol-1)

Elúciós sorrend

T a 1,00 1,15 0,70 0,3 1R,5R<1S,5S

T b 1,00 1,16 1,17 0,4 1R,5R<1S,5S

TAG a 1,27 1,76 4,57 1,4 1R,5R<1S,5S 8

TAG b 1,36 1,74 5,54 1,4 1R,5R<1S,5S

T a 0,87 1,00 0,00 0,0 -

T b 0,95 1,00 0,00 0,0 -

TAG a 1,09 1,09 1,09 0,2 1R,6R<1S,6S

TAG b 1,12 1,08 0,50 0,2 1R,6R<1S,6S

9

R b 0,19 1,21 0,52 0,5 -

T a 0,88 1,09 0,77 0,2 1R,7R<1S,7S

T b 0,95 1,08 <0,40 0,2 1R,7R<1S,7S

T c 0,95 1,08 0,80 0,2 1R,7R<1S,7S

TAG a 1,11 1,58 3,56 1,1 1R,7R<1S,7S

TAG b 1,13 1,60 1,79 1,2 1R,7R<1S,7S

10

TAG c 1,14 1,59 2,93 1,1 1R,7R<1S,7S

T a 6,24 1,06 0,68 0,1 1R,2R<1S,2S

T b 6,41 1,06 0,76 0,1 1R,2R<1S,2S

TAG a 6,33 1,11 0,67 0,3 1R,2R<1S,2S

TAG b 9,44 1,10 0,98 0,2 1R,2R<1S,2S

TAG c 8,20 1,11 1,00 0,3 1R,2R<1S,2S

R a 2,41 1,16 0,86 0,4 1R,2R<1S,2S

R b 1,92 1,18 1,08 0,4 1R,2R<1S,2S

V b 0,99 1,09 0,91 0,2 1S,2S<1R,2R

11

VAG b 1,05 1,13 1,67 0,3 1S,2S<1R,2R

T a 5,02 1,25 1,95 0,6 1R,2R<1S,2S

T b 5,19 1,34 2,10 0,7 1R,2R<1S,2S

TAG a 6,03 1,90 4,33 1,6 1R,2R<1S,2S

TAG b 7,84 1,71 3,85 1,3 1R,2R<1S,2S

TAG c 6,77 1,77 3,92 0,4 1R,2R<1S,2S

R a 2,80 1,78 4,25 1,4 1S,2S<1R,2R

12

R b 2,32 1,92 4,00 1,6 1S,2S<1R,2R Kromatográfiás körülmények: oszlop, Chirobiotic T (T), Chirobiotic TAG (TAG), Chirobiotic V (V) és Chirobiotic VAG (VAG); eluens, a, MeOH 100%, b, MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01 (v/v/v) és c, MeOH/AcOH/TEA=100/0,1/0,01 (v/v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

53

4.4. Táblázat (folytatás). Triciklusos ß-laktámok és biciklusos ß-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), szabadentalpiaváltozás különbség értékei (∆(∆G°)298K valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Chirobiotic T, TAG, V, VAG, R és Cyclobond DMP oszlopokon poláris-szerves és poláris-ionos elválasztások esetén

Vegyület KÁF Mozgófázis k1' αααα Rs -∆(∆∆(∆∆(∆∆(∆GO)298K (kJ mol-1)

Elúciós sorrend

T a 5,42 1,46 3,46 0,9 1R,2R<1S,2S

T b 4,66 1,40 2,00 0,8 1R,2R<1S,2S

TAG a 8,55 1,29 1,18 0,6 1R,2R<1S,2S

TAG b 8,55 1,27 1,65 0,6 1R,2R<1S,2S

TAG c 8,64 1,27 1,70 0,6 1R,2R<1S,2S

R a 3,55 1,05 <0.40 0,1 -

R b 2,57 1,05 <0,40 0,1 1S,2S<1R,2R

V a 1,74 1,47 3,15 1,0 1R,2R<1S,2S

V b 1,32 1,56 3,18 1,1 1R,2R<1S,2S

VAG a 0,79 1,24 2,08 0,5 1R,2R<1S,2S

13

VAG b 1,60 0,12 2,50 0,4 1R,2R<1S,2S Kromatográfiás körülmények: oszlop (KÁF), Chirobiotic T (T), Chirobiotic TAG (TAG), Chirobiotic V (V) és Chirobiotic VAG (VAG); eluens, a, MeOH 100%, b, MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01 (v/v/v) és c, MeOH/AcOH/TEA=100/0,1/0,01 (v/v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Az általunk vizsgált két vegyületcsoport esetében az α értékeket összehasonlítva a

fordított fázisú (0,1% TEAA (pH 6,5)/MeOH), poláris-szerves (MeOH) és a poláris-ionos

(MeOH/AcOH/TEA) mérések között nem tapasztaltunk jelentős különbséget a

makrociklusos állófázisok között.

A teicoplanin királis szelektoron található cukorrész hatását a királis elválasztásra

igen jól szemlélteti a

∆TAG-T∆(∆Go)=∆(∆G

o)TAG-∆(∆Go)T (24)

különbség.

Ha ez a különbség negatívnak adódik, akkor az adott vegyület enantiomerjei jobban

elválaszthatók az aglikon szelektoron. Azonban, ha ez az érték pozitív, akkor a

cukorrészeket tartalmazó szelektor a hatékonyabb az adott vegyület optikai izomerjeinek

elválasztásában. A 4.3. ábrán POM (a) PIM (b) és normál fázisú (c) mérések

eredményéből számolt ∆TAG-T∆(∆Go) értékek láthatóak mind a két vegyületcsoportra

vonatkozóan. A POM és PIM körülmények között a 13 ß-aminosav kivételével negatív

értékeket kaptunk, ami a cukorrészek kedvezőtlen hatását mutatja a királis felismerésre. A

8 és 10 (és 12) vegyületek esetében a különbség meghaladja az 1,0 kJ/mol ∆(∆GO) értéket.

Normál fázisú körülmények között csak a 8, 9 és 10 vegyületeket sikerült elválasztani

54

Chirobiotic T és TAG oszlopokon. A cukorrészek kedvezőtlen hatása a királis

megkülönböztetési folyamatban alapvetően kétféle úton nyilvánulhat meg:

sztérikusan gátolhatja a kosár belsejéhez való hozzájutásukat,

meggátolhatja a lehetséges kölcsönhatás kialakítását az aglikon két fenolos és

egy alkoholos hidroxilcsoportjaival, amelyeken keresztül a három cukorrész

kapcsolódik a natív teicoplanin esetén [24]

A Cyclobond DMP állófázis fordított fázisú alkalmazásakor csak a 8-11

vegyületeknél figyeltünk meg királis megkülönböztetést a 8, 9 és 10 vegyületek esetében

alapvonalra történő elválasztást kaptunk 1,76, 2,46 és 1,49 felbontás értékekkel. A 10 ß-

laktám valószínűleg már nem tudott megfelelően illeszkedni a hozzávetőleg 0,78 nm

átmérőjű ciklodextrin gyűrűben, így nem tudott létrejönni a királis felismeréshez

elengedhetetlen zárványkomplex.

a

-1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6 1,1 1,6

8

9

10

11

12

13

Veg

yü

lete

k

∆∆∆∆TAG-T∆∆∆∆(∆∆∆∆Go) / KJ mol

-1

13

12

11

10

9

8

b

-1,2 -0,8 -0,4 0 0,4 0,8 1,2 1,6

8

9

10

11

12

13

Veg

yü

lete

k

∆∆∆∆TAG-T∆∆∆∆(∆∆∆∆Go) / KJ mol

-1

13

12

11

10

9

8

4.3. ábra

A teicoplanin és teicoplanin aglikon állófázisok enantioszelektivitása közti különbség

POM (a) és PIM (b) körülmények között Kromatográfiás körülmények: oszlop, Chirobiotic T (T) és Chirobiotic TAG (TAG); eluens, a, MeOH 100%,

b, MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01 (v/v/v), c, hexán/IPA=90/10 (v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

55

c

-1,2 -0,8 -0,4 0 0,4 0,8 1,2 1,6

8

9

10

Veg

yü

lete

k

∆∆∆∆TAG-T∆∆∆∆(∆∆∆∆Go) / KJ mol

-1

10

9

8

4.3. ábra folytatása

A teicoplanin és teicoplanin aglikon állófázisok enantioszelektivitása közti különbség

normál fázisú (c) körülmények között Kromatográfiás körülmények: oszlop, Chirobiotic T (T) és Chirobiotic TAG (TAG); eluens, a, MeOH 100%,

b, MeOH/AcOH/TEA=100/0,01/0,01 (v/v/v), c, hexán/IPA=90/10 (v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

A 8-10 vegyületek esetében a Cyclobond DMP oszlop normál fázisban is hatékonynak

bizonyult, ami a π-π kölcsönhatásra alkalmas 3,5-dimetilfenilkarbamoil módosítás királis

felismerésre gyakorolt hozzájárulásának köszönhető.

Meghatároztuk az enantiomerek elúciós sorrendjét is azokban az esetekben, amikor

az elválasztás megfelelő volt (4.3. és 4.4. táblázat). A Chirobiotic T és TAG

állófázisoknál egységesen R,R<S,S sorrendet kaptunk a hat vegyületre vonatkozóan, a 12

és 13 β-aminosavaknál R oszlopon, illetve 10 vegyület esetében a V, VAG és DMP

állófázisoknál elúciós sorrendváltozást 1S,2S<1R,2R figyeltünk meg.

Összefoglalásként elmondható, hogy a vizsgált ß-aminosav és ß-laktám

enantiomereket sikerült alapvonalra elválasztani fordított és normál fázisú (csak β-

laktámok), illetve poláris-szerves és poláris-ionos körülmények között makrociklusos

glikopeptid és ciklodextrin alapú királis állófázisokon. A vizsgált makrociklusos

glikopeptid szelektorok közül a TAG esetében kaptuk a legnagyobb szelektivitás és

felbontás értékeket. A számolt ∆TAG-T∆(∆Go) értékek jól mutatták, hogy a vizsgált hat

vegyület esetében (a 13 kivételével) a cukorrészek a szelektoron kedvezőtlenül

befolyásolták a királis megkülönböztetési folyamatokat.

A Cyclobond DMP oszlop mind fordított, mind normál fázisban igen jó elválasztást

mutatott a 8, 9 ß-laktámok és a 11 ß-aminosav vizsgálatakor.

Az enantiomerek elúciós sorrendjét meghatároztuk, és három ß-aminosav esetén

sorrendbeli változást figyeltünk meg különböző állófázisokon.

56

4.2. Elválasztások koronaéter alapú királis állófázisokon

A királis koronaéter szelektort tartalmazó állófázisok szerkezeti sajátságukból

adódóan alkalmasak primer amino funkcióscsoportot tartalmazó enantiomerek

elválasztására. A ß3-aminosavak primer amincsoportjaik révén komplexet képezhetnek a

koronaéter gyűrűjében. Vizsgálataink kiterjedtek alkil, aromás és heterociklusos

oldalláncot tartalmazó ß3-aminosav enantiomerek elválasztási mechanizmusának

tanulmányozására koronaéter állófázison. Két típusú állófázist alkalmaztunk, mind a kettő

azonos (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav királis szelektort tartalmazott úgymint

a Korona 1 (2.9. ábra) és Korona 2 (2.11. ábra). A szintézis módjából adódóan a

Korona 1 szabad szilanolcsoportokkal rendelkezik, szemben a Korona 2 oszloppal, ahol

a szilonolcsoportot etoxicsoporttá alakították. Az állófázis hozzájárulása mellett vizsgáltuk

az eluens összetételnek, az eluensbe adagolt savak minőségének és mennyiségének,

továbbá a ß3-aminosavak szerkezetének hatását a királis elválasztásra. A könnyebb

áttekinthetőség végett a vizsgált vegyületeket három csoportra osztottuk, külön

fejezetekben tárgyalva azokat.

4.2.1. Aromás ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 1 állófázison

Az általunk vizsgált tizennégy 3-arilszubsztituált ß-aminosav a 14 kivételével az

aromás gyűrűn eltérő pozícióban különböző szubsztituenseket tartalmaz (3.3. Táblázat).

Alapvegyületnek a szubsztituálatlan 3-fenil-propánsavat (14) választottuk, így azonos

kromatográfiás körülmények között összevethető a szubsztituensek hozzájárulása a királis

megkülönböztetési folyamathoz Korona 1 állófázison. Az eluensösszetétel változtatása

mellett vizsgáltuk a szerves és ásványi savak minőségének és mennyiségének hatását is.

Koronaéter állófázisokon az ammóniumion-koronaéter komplex létrejötte az egyik

legfontosabb kölcsönhatás a szelektor és a protonált primeramint tartalmazó vegyületek

között. Az aminocsoportok protonálódása meghatározó folyamat, ennek érdekében az

eluenshez ecetsavat adagoltunk. A vizsgálatok elején a mozgófázis szerves összetevőként

acetonitrilt vagy metanolt tartalmazott; a MeOH-tartalmú eluenssel nagyobb szelektivitási

értékeket és szebb csúcsalakokat kaptunk, így a további kísérletek során MeOH-t

használtunk szerves komponensként. Eleuns összetételnek a H2O/MeOH=80/20, 50/50 és

20/80 (v/v) választottunk, melyhez 5, vagy 10 mM AcOH-at adagoltunk a primer

aminocsoport protonálása érdekében. A mérések eredményét a 4.5. Táblázat tartalmazza.

Az eluensösszetétel hatását vizsgálva a visszatartásra, az elsőként eluálódó

57

komponens retenciós faktorai H2O/MeOH=80/20 (v/v) + 10,0 mM AcOH mozgófázisban

1,31-8,97 illetve H2O/MeOH=20/80 (v/v) + 10,0 mM AcOH eluens esetén 2,71-24,35

tartományba estek. A 4.5. Táblázat adatai alapján megállapítható, hogy a szerves

komponens mennyiségének növelésével nőtt a visszatartás. A 4.4. ábra a 14, 15, 17, 22, 23

és 24 vegyületek kromatográfiás paramétereinek eluensösszetétel függését mutatja, ahol a

15 vegyület kivételével egységesen nőtt a k1’ a MeOH-tartalom növelésével. Ez a

viselkedés valószínűleg az eluens poláris jellegének csökkenésével függ össze, amely a

poláris kölcsönhatások erősségének csökkenését vonja maga után a mozgófázisban, ezáltal

nagyobb visszatartást eredményezve.

4.5. Táblázat. Aromás ß3-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Korona 1 oszlopon fordított fázisú elválasztások esetén

Vegyület Mozgófázis

(v/v) k1’ k2’ αααα RS

Elúciós sorrend

80/20, a 2,27 2,94 1,30 1,44 20/80, b 8,66 9,89 1,14 1,13 14 50/50, c 2,98 3,93 1,32 1,77

R<S

80/20, a 2,96 3,71 1,26 0,85 20/80, b 6,85 8,21 1,20 1,06 15 50/50, c 2,86 3,63 1,27 1,46

R<S

80/20, a 4,16 5,68 1,36 0,90 20/80, b 17,87 23,55 1,32 2,38 16 50/50, c 3,52 5,33 1,51 1,97

-

80/20, a 2,66 3,43 1,29 1,31 20/80, b 7,09 8,56 1,21 1,05 17 50/50, c 2,92 3,83 1,31 1,73

-

80/20, a 3,60 4,51 1,25 1,45 20/80, b 10,50 12,28 1,17 1,00 18 50/50, c 3,83 5,02 1,31 1,71

-

80/20, a 1,31 1,31 1,00 0,00 20/80, b 2,71 2,71 1,00 0,00 19 50/50, c 1,36 1,36 1,00 0,00

-

80/20, a 3,06 3,94 1,29 1,43 20/80, b 17,44 21,30 1,22 1,84 20 50/50, c 4,43 5,68 1,28 1,88

-

80/20, a 2,84 4,02 1,42 1,97 20/80, b 10,74 13,72 1,28 1,58 21 50/50, c 3,25 4,53 1,39 1,59

R<S

80/20, a 4,24 6,06 1,43 1,86 20/80, b 10,39 13,84 1,34 2,03 22 50/50, c 3,18 4,62 1,45 1,73

R<S

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, a, H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10,0 mM AcOH, b, H2O/MeOH=20/80 (v/v)+10,0 mM AcOH, c, H2O/MeOH=50/50 (v/v)+ 5,0 mM AcOH; detektálás, 210 nm;

áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K

58

4.5. Táblázat folytatása. Aromás ß3-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Korona 1 oszlopon fordított fázisú

elválasztások esetén

Vegyület Mozgófázis

(v/v) k1’ k2’ αααα RS

Elúciós sorrend

80/20, a 5,40 8,09 1,50 1,79 20/80, b 12,27 18,64 1,52 2,40 23 50/50, c 5,69 9,19 1,62 2,53

R<S

80/20, a 1,81 1,81 1,00 <0,40 20/80, b 3,04 3,47 1,14 1,06 24 50/50, c 1,73 1,94 1,12 0,69

R<S

80/20, a 8,97 14,95 1,62 2,27 20/80, b 24,35 39,70 1,63 2,40 25 50/50, c 6,27 7,66 1,22 1,91

-

80/20, a 3,80 5,61 1,48 1,54 20/80, b 14,58 20,15 1,38 2,32 26 50/50, c 3,56 5,26 1,48 1,91

R<S

80/20, a 5,78 8,83 1,53 1,87 20/80, b 22,30 34,52 1,55 1,80 27 50/50, c 6,66 11,32 1,70 3,07

-

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, a, H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10,0 mM AcOH, b, H2O/MeOH=20/80 (v/v)+10,0 mM AcOH, c, H2O/MeOH=50/50 (v/v)+ 5,0 mM AcOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Az eluensösszetétel hatását vizsgálva a MeOH-tartalom csökkenésével az α

kismértékben növekedett (14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 és 22) vagy alig változott (23, 25 és

27), míg a 24 minta esetén kismértékű csökkenés volt megfigyelhető. A MeOH-tartalom

csökkenésével a hidrofób-hidrofób kölcsönhatások váltak kedvezményezetté, amelynek

mértéke a két enantiomerre nézve eltérően változott, ezáltal növekedést okozva a

szelektivitásban (és a felbontásban). A 24 minta esetében a MeOH-tartalom csökkenésével

csökkent a szelektivítás. Ennek valószínű oka az orto-helyzetű klóratom sztérikus hatása. A

felbontás változása nem mindig követte a szelektivitás változását a MeOH-tartalom

változtatásával.

A ß3-aminosavak szerkezetének a királis felismerésre gyakorolt hatását a retenciós

faktor, a szelektivitási tényező és a felbontás változásán keresztül szemléltetjük. Egy adott

eluensösszetételnél (H2O/MeOH=50/50 (v/v) + 5 mM AcOH) vizsgálva a k1’ értékek az

elsőként eluálódó enantiomerekre nézve 1,31-8,97 tartományba esnek. A para-helyzetű

szubsztituensek hozzájárulását vizsgálva a visszatartásra a következő sorrendet kaptuk

CH3-<CH3O-<(14)<Cl-≈F-<CF3-<Br-. Összehasonlítva a nem szubsztituált aromás

gyűrűvel rendelkező 14 vegyülettel a metil- és a metoxicsoport a fenilgyűrűn csökkentette,

illetve alig változtatta, addig a többi szubsztituens növelte a retenciós időt.

59

20 40 60 80

12

1

8

6

4

2

RS

k1' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

20 40 60 80

42

1

8

6

4

2

RS

k1' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

20 40 60 80

9

2

1

10

8

6

4

2

RS

k1 ' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

20 40 60 80

10

2

1

12

10

8

6

4

2

RS

k1' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

20 40 60 80

11

1

3

2

1

0

4

2

RS

k1' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

20 40 60 80

22

1

8

6

4

2

RS

k1' a

nd

α

MeOH (%)

k1'

α

RS

k1’ és

α

k1’ és

α

k1’ és

α

k1’ és

α

k1’ és

α

k1’ és

α

RS

RS

RS

RS

RS RS

4.4. ábra ß

3-aminosavak retenciós faktorának, szelektivitásának és felbontásának függése az

eluens összetételétől Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH=80/20, 60/40, 40/60, 20/80 (v/v)+10

mM AcOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Hasonlóan a monoszubsztituált vegyületekhez a diszubsztituált fenilgyűrűvel

rendelkező vegyületekre (20 és 25) CH3O-<Cl- sorrendet kaptunk, értékét tekintve a két

szubsztituens a gyűrűn tovább növelte a visszatartást. Ezek az eredmények a H-híd

kölcsönhatások jelentőségére hívják fel a figyelmet abban az esetben, amikor nagy

elektronegativitású atom kapcsolódik a fenilgyűrűhöz, akkor azok H-híd kötést képesek

kialakítani a szelektor protonált karboxilcsoportjaival. Ennek köszönhető, hogy az orto-

helyzetben szubsztituált vegyületeknél kaptuk a legkisebb visszatartást (orto<para<meta),

hiszen a kialakuló hidrogénkötés sztérikusan gátolt lehet a koronaéter-aminosav komplex

kialakulásában.

A szelektivitás és a felbontás változása és a minta kémiai szerkezete közti

összefüggésre szintén a 4.5. Táblázat adataiból vonhatunk le következtetéseket. A

H2O/MeOH=50/50 (v/v) + 5 mM AcOH mozgófázis összetételnél a szubsztituálatlan

fenilgyűrűt tartalmazó 14 vegyület esetén α=1,32 és Rs=1,77. Para-helyzetű halogén

szubsztitúció esetében (21, 22 és 26) nagyobb szelektivitás értékeket kaptunk, α=1,39-1,48,

14 15 17

22 23 24

60

amely a H-híd és dipól-dipól kölcsönhatások hozzájárulásának köszönhető. A para-

helyzetű metilcsoport kismértékű csökkenést (α=1,27), a trifluorocsoport növekedést

(α=1,51) eredményezett, a metoxicsoport esetén nem tapasztaltunk jelentős változást. A

diszubsztituált aromás gyűrűt tartalmazó 20 és 25 vegyületek esetén a szelektivitás

értékekben kismértékű csökkenést, a felbontásokban pedig növekedést figyeltünk meg. A

kismértékű szelektivitás csökkenésnek valószínűleg sztérikus okai vannak, a két

enantiomer hozzáférése a szelektorhoz kevésbé különbözik, míg az Rs értékek növekedése

a csúcsszélesség csökkenéséből adódik. A metoxicsoport helyzetének vizsgálatakor (17, 18

és 19) meta- és para-helyzetben nem tapasztaltunk jelentős eltérést, orto-helyzetben

azonban nem történt királis felismerés. Az orto-helyzet kedvezőtlen sztérikus szerepére

példa a klór szubsztituált 24 vegyület is (a=1,12; RS=0,69). Míg a para- és meta-helyzetű

halogén szubsztitúció H-híd és poláris kölcsönhatások révén igen kedvező a királis

felismerésre, addig az orto-helyzet sztérikusan kedvezőtlen, a retenciós faktor, a

szelektivitási tényező és a felbontás is csökken a nem szubsztituált analóghoz viszonyítva.

Mint már ennek a fejezetnek a bevezetőjében említettem a koronaéter-NH3+-ion

komplex létrejötte alapvető a hárompontos kölcsönhatás kialakulásához. A ß3-aminosavak

primer aminocsoportjának protonálása, valamint a Korona 1 állófázison található szabad

propilamincsoportok protonálása érdekében öt különböző minőségű savat adagoltunk a

H2O/MeOH=50/50 (v/v) összetételű mozgófázishoz, úgymint ecetsav (AcOH),

trifluorecetsav, perklórsas, kénsav és foszforsav. A mérések eredményeit a 4.6. Táblázat

foglalja össze. A 19, 22 és 24 minta esetén azonos 5 mM savkoncentráció mellett a

legnagyobb retenciós faktorokat AcOH esetében figyeltük meg, az erősebb savak

jelentősen csökkentették a visszatartást. A vizsgált savak pK értékei a következőképpen

alakulnak: pK(AcOH)=4,74; pK(H3PO4)=2,12 (7,21; 12,32); pK(TFA)=-0,25; pK(H2SO4)=-3,00

(1,99); pK(HClO4)=-10. Az adatokból kiderült, hogy önmagában nemcsak a savak erőssége

befolyásolja a visszatartást, hiszen a 19 és 24 ß3-aminosavaknál TFA esetében kaptuk a

legkisebb visszatartást (a trifluoroacetát- és foszfát-anionok igen jó ionpárképzők). Ez az

eltérés azzal magyarázható, hogy a savak disszociációja során keletkezett anionok (adott

sav konjugált bázisa) az aminosav ammóniumionjával és a szelektor koronaéter gyűrűjével

egy terner rendszert alakítanak ki, és ennek a terner rendszernek a stabilitása befolyásolja a

visszatartás erősségét. Ezt a hatást nevezzük ellenion hatásnak.

Önmagában nemcsak az ellenion, hanem az aminosavak hozzájárulása is

meghatározó. Ezt támasztja alá, hogy 22 vegyület esetében foszforsavnál kaptuk a

61

legkisebb k1’-t. A savak koncentrációjának növelésével visszatartás csökkenést figyeltünk

meg (4.5. ábra), ami egyrészről a ß3-aminosav karboxilcsoportja disszociációjának

visszaszorulásával (pK=1,7-1,3) magyarázható, ezáltal csökkentve az állófázis protonált

szabad propilamincsoportjaival kialakuló elektrosztatikus kölcsönhatás erősségét, továbbá

a koronaéter karboxilcsoportjainak a disszociációja (pK=2,1-4,9) is visszaszorul, ami

csökkenti a terner rendszer stabilitását, ezáltal a visszatartás erősségét.

A HClO4, H2SO4, H3PO4, TFA és AcOH alkalmazása azonos koncentrációban az

ionerősségben (I) jelentős eltérést eredményez a mozgófázisban. Figyelembe véve a savi

disszociációs állandó értékeket, a mozgófázis ionerősségét állandó értéken tartottuk

(I=0,85) és az eredményeket a 28 minta példáján a 4.7. Táblázatban mutatom be. A mérési

adatok jól tükrözik, hogy amíg állandó koncentráció mellett a k1’ értéke a gyenge savnak

számító AcOH esetén 3,03, addig a középerős és erős savak esetén a 0,03-0,14

tatományban esett. Azonban állandó ionerősség mellett az elsőként eluálódó enantiomerek

retenciós faktora már egy jóval szűkebb tartományban változott (k1’:1,66-4,59). A kénsav

esetén kaptuk a legnagyobb visszatartást, ami a kialakult terner rendszer nagyobb

stabiltására utal, összehasonlítva a többi ellenionnal. A TFA valószínűleg viszonylag nagy

térkitöltésének köszönhetően rontotta az aminosav-ellenion-koronaéter rendszer

stabilitását, a legkisebb visszatartást eredményezve.

Az alkalmazott savak minősége és koncentrációja befolyásolja az α és RS értékeket is

(4.6. Táblázat). Azonos savkoncentráció mellett általában az AcOH vagy H2SO4

alkalmazásával tapasztaltunk nagyobb α és RS értékeket. Amíg a visszatartásban a sav

koncentráció növelésével jelentős változást figyeltünk meg, addig a szelektivitásban és a

felbontásban ez a változás kisebb mértékű. Érdekes módon állandó ionerősség alkalmazása

mellett a felbontás értékek (RS: 1,2-2,4) jelentősen meghaladták az állandó savkoncentráció

mellett mérteket (RS: 0,3-1,2) és viszonylag szűk tartományba estek (4.7. Táblázat). Az

eredmények arra utalnak, hogy állandó ionerősség mellett különböző anyagi minőségű

savak alkalmazásával is viszonylag hasonló kromatográfiás adatokhoz juthatunk. Azonban

ezek az adatok erősen függnek a vizsgálandó vegyület szerkezeti sajátosságától is. A 14,

15, 21, 22, 23, 24 és 26 vegyületek esetén rendelkezésre állt tiszta enantiomer, így az

elúciós sorrendeket meghatároztuk: egységesen R<S sorrendet kaptunk.

62

4.6. Táblázat. Aromás ß3-aminosavak kromatográfiás paramétereinek (k1’, α, RS) függése az alkalmazott savak minőségétől és mennyiségétől Korona 1 oszlopon

Vegyület Sav Sav koncentráció

k1’ αααα RS

AcOH 5,0 2,18 1,00 0,00 HClO4 5,0 0,78 1,00 0,00 HClO4 10,0 0,02 1,10 0,60 H2SO4 5,0 0,18 1,50 0,60 H3PO4 5,0 0,23 1,00 0,00 H3PO4 10,0 0,20 1,25 <0,40

19

TFA 5,0 0,00 1,00 0,00 AcOH 1,0 8,84 1,45 2,41 AcOH 5,0 6,82 1,45 2,40 AcOH 10,0 5,70 1,45 2,38 AcOH 20,0 4,58 1,45 2,20 HClO4 5,0 1,28 1,16 0,64 H2SO4 5,0 2,65 1,32 1,56 H3PO4 5,0 0,71 1,00 0,00

22

TFA 5,0 0,97 1,23 0,75 AcOH 1,0 3,27 1,11 0,70 AcOH 5,0 2,51 1,10 0,85 AcOH 10,0 2,01 1,10 0,70 AcOH 20,0 1,64 1,11 0,70 HClO4 5,0 0,20 1,00 0,00 H2SO4 5,0 0,35 1,00 0,00 H3PO4 5,0 0,71 1,00 0,00

24

TFA 5,0 0,10 1,00 0,00 Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH=50/50 (v/v)+1,0-20,0 mM sav; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K. 4.7. Táblázat. A 28 vegyület kromatográfiás paramétereinek (k1’, α, RS) függése az alkalmazott savak minőségétől és mennyiségétől állandó koncentráció illetve ionerősség mellet Korona 1 oszlopon

Vegyület Sav Sav

koncentráció (mM)

k1’ αααα RS

AcOH 10,0 3,03 1,31 1,20 H3PO4 10,0 0,14 1,30 0,80 HClO4 10,0 0,13 1,31 0,50 H2SO4 10,0 0,21 1,29 0,50

28

TFA 10,0 0,03 1,29 <0,4 Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH=50/50 (v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K

63

4.7. Táblázat folytatása. A 28 vegyület kromatográfiás paramétereinek (k1’, α, RS) függése az alkalmazott savak minőségétől és mennyiségétől állandó koncentráció illetve ionerősség mellet Korona 1 oszlopon

Vegyület Sav Ionerősség (mM)

k1’ αααα RS

AcOH 0,85 3,03 1,31 1,2 H3PO4 0,85 2,53 1,38 2,0 HClO4 0,85 2,73 1,32 2,1 H2SO4 0,85 4,59 1,37 2,4

28

TFA 0,85 1,66 1,40 1,9 Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH=50/50 (v/v); detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

k1'

1 5 10 20

cAcOH / mM

4.5. ábra

A 19 ß3-aminosav retenciós faktorának függése az eluenshez adagolt ecetsav

mennyiségétől Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH=50/50 (v/v)+1-20 mM AcOH;

detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Összefoglalásként elmondható, hogy a mozgófázisban a MeOH-tartalom növelésével

nőtt a visszatartás, azonban ez a hatás kedvezőtlenül befolyásolta a királis

megkülönböztetési folyamatot, a szelektivitás és a felbontás értékekben csökkenést idézve

elő. A mozgófázishoz adagolt sav koncentráció növelésével jelentős retenciócsökkenést

tapasztaltunk. Ezt a ß3-aminosav és a szelektor karboxilcsoportja disszociációjának

visszaszorulásával és a savból származó anion ellenion hatásával értelmeztük. Azonos

koncentrációjú savak alkalmazásakor ezek a folyamatok a k1’ és RS értékeket jelentősen, az

α értékeket alig befolyásolták. Állandó ionerősség alkalmazásával hasonló kromatográfiás

paraméterek (k1’, α és RS) nyerhetők. A vegyületek szerkezetének hatását vizsgálva az

aromás gyűrűn para-helyzetű F-, Cl-, Br- és CF3-szubsztitúció növelte a visszatartást, a

szelektivitást és a felbontást. A metoxi- és metilcsoport nem, vagy kis mértékben

64

csökkentette a királis szelektivitást. A szubsztituensek helyzetét vizsgálva, a meta- és a

para-helyzetű szubsztitució bizonyult a legkedvezőbbnek, míg az orto-szubsztituált

vegyületek, valószínűleg sztérikus okok miatt, nehezen voltak elválaszthatók. Hat vegyület

esetében az enantiomerek elúciós sorrendjét is meghatároztuk, egységesen R<S sorrendet

tapasztaltunk. A 14-17, 21, 22 és 26 vegyületek kiválasztott kromatogramjai a 10.2.

Függelékben találhatók.

4.2.2. Alifás és aliciklusos ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 1

állófázison

A vizsgált vegyületek közül a C-3 szénatomhoz kapcsolódó alifás csoportokat

tekintve hat telített (29-34), kettő pedig telítetlen (35, 36). A két aliciklusos β-aminosav

esetén a C-3 szénatomhoz ciklohexán- (37) illetve ciklohexéngyűrű (38) kapcsolódik (3.4.

Táblázat). Az enantiomerek elválasztása során a mozgófázisban lévő szerves oldószer és

sav minőségének és mennyiségének hatása mellett vizsgáltuk a királis elválasztási

folyamat a molekulák szerkezetétől való függését.

Az eluensösszetétel függésének vizsgálatakor, hasonlóan az előző fejezetben tárgyalt

aromás ß-aminosavakhoz, a MeOH-tartalom növelésével nőtt a visszatartás (4.6. ábra, 4.8.

Táblázat). Hasonló tendencia volt megfigyelhető EtOH alkalmazásakor is, azonban a

visszatartás mértéke jelentősen meghaladta a MeOH esetében mért értékeket. Ez a poláris

kölcsönhatások csökkenésével magyarázható a nagy szerves tartalmú eluens és a poláris ß-

aminosavak között: az enantiomereknek állófázissal való kölcsönhatása kedvezőbbé vált.

A szelektivitást tekintve a mozgófázis szerves komponensének növekedésével nőtt α

értéke, a magasabb alkohol tartalom mellett a királis kölcsönhatások váltak

kedvezményezetté (4.6. ábra). A szerves oldószerek minőségének változtatásával, a

poláris jelleg csökkenésével visszatartás növekedést tapasztaltunk a

MeOH<EtOH<PrOH<2-PrOH<t-BuOH sorrendben (4.7. ábra). 2-PrOH és t-BuOH

esetében még kifejezettebb volt a retenció növekedés, amely az apoláris jelleg

növekedésével és sztérikus okokkal magyarázható: a nagy térkitöltésű, apoláris alkoholok

a mozgófázisban nem szívesen lépnek kölcsönhatásba a poláris aminosavakkal. A

mozgófázisban levő alkohol minősége, szemben a k1’ értékekkel a szelektivitást kisebb

mértékben befolyásolta. Azonos összetételű, de eltérő szénatomszámú alkoholt tartalmazó

mozgófázisoknál a 31 vegyület esetében (4.7. ábra), hasonlóan a többi vegyülethez, az

EtOH használatakor kaptuk a legnagyobb α értékeket. Az alkohol minőségének a felbontás

65

értékére gyakorolt hatása a vártnál kedvezőbben alakult: a szénatomszám növekedésével az

alkoholok viszkozitása is jelentősen nő, amely anyagátadási gátlást, ezáltal csúcsszélesedét

idézhet elő, azonban nem tapasztaltuk a felbontás csökkenését PrOH, 2-PrOH és t-BuOH

alkalmazása esetében.

4.8. Táblázat. Alifás és aliciklusos ß3-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS), valamint az enantiomerek elúciós sorrendje Korona 1 oszlopon fordított fázisú elválasztások esetén

Vegyület Mozgófázis

(v/v) k1’ k2’ αααα RS

Elúciós sorrend

30/70, a 5,75 7,40 1,29 1,30 50/50, b 2,48 3,0 1,21 1,70 29

50/25/25, c 2,04 2,54 1,25 1,75 S<R

30/70, a 2,37 3,25 1,37 1,80 50/50, b 1,38 1,92 1,39 2,40 30

50/25/25, c 1,12 1,55 1,38 2,10 -

30/70, a 1,19 1,65 1,38 1,20 50/50, b 0,75 1,02 1,36 1,30 31

50/25/25, c 0,71 0,97 1,37 1,25 -

30/70, a 0,40 0,63 1,57 <0,60 50/50, b 0,88 0,92 1,05 <0,40 32

50/25/25, c 0,43 0,52 1,21 <0,40 -

30/70, a 0,90 1,11 1,23 <0,60 50/50, b 0,86 0,86 1,00 <0,40 33

50/25/25, c 0,71 0,83 1,17 <0,40 -

30/70, a 0,72 1,23 1,71 1,25 50/50, b 0,73 0,98 1,34 1,35 34

50/25/25, c 0,86 1,38 1,60 2,05 -

30/70, a 2,30 3,06 1,33 1,70 50/50, b 0,90 1,13 1,25 1,05 35

50/25/25, c 1,17 1,67 1,42 2,25 S<R

30/70, a 2,40 3,49 1,45 1,55 50/50, b 0,80 0,99 1,24 1,85 36

50/25/25, c 1,05 1,39 1,32 1,65 S<R

30/70, a 1,13 1,69 1,50 1,40 50/50, b 0,93 1,30 1,39 1,55 37

50/25/25, c 0,68 1,05 1,54 2,00 -

30/70, a 1,19 1,89 1,59 1,65 50/50, b 0,96 1,49 1,55 1,75 38

50/25/25, c 0,84 1,28 1,54 1,40 -

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, a, H2O/MeOH=30/70 (v/v)+5,0 mM AcOH, b, H2O/EtOH=50/50 (v/v)+5,0 mM AcOH, c, H2O/MeOH/EtOH=50/25/25 (v/v/v)+5,0 mM AcOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K. Az előző fejezetben már rámutattunk az eluensben lévő savak minőségének és

mennyiségének a retencióra gyakorolt hatására. H2SO4, H3PO4 és AcOH vizsgálatakor

hasonlóan az aromás ß3-aminosavakhoz a savi disszociációs állandó csökkenésével

66

párhuzamosan nőtt a retenciós faktor értéke. A felbontás és szelektivitás minden esetben

szintén AcOH alkalmazása esetén volt a legnagyobb.

0 20 40 60 80 1000,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

1

k1' αααα, R

S

MeOH (%)

k1'

αααα

RS

0 20 40 60 80 1000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3,0

3,3

1

k1' αααα, R

S

EtOH (%)

k1'

αααα

RS

0 20 40 60 80 1000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3,0

3

k1' αααα, R

S

MeOH (%)

k1'

αααα

RS

0 20 40 60 80 1000,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

0,0

0,6

1,2

1,7

2,3

2,9

3,5

3

k1' αααα, R

S

EtOH (%)

k1'

αααα

RS

0 20 40 60 80 1000,0

1 ,0

2 ,0

3 ,0

4 ,0

5 ,0

6 ,0

7 ,0

8 ,0

9 ,0

10 ,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

7

k1' αααα , R

S

M eO H (% )

k1'

αααα

RS

0 20 40 60 80 1000,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

0,0

0,2

0,5

0,7

1,0

1,2

1,5

1,7

2,0

2,2

2,5

2,7

7

k1' αααα, R

S

EtOH (%)

k1'

αααα

RS

4.6. ábra

A 29, 31 és 35 ß3-aminosavak retenciós faktorának, szelektivitásának és

felbontásának függése az eluens összetételtől Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/MeOH és H2O/EtOH=90/10, 70/30, 60/40,

50/50, 30/70, 10/90 (v/v)+5 mM AcOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

A ß

3-aminosavak szerkezetének hatását vizsgálva H2O/MeOH=30/70 (v/v) + 5,0 mM

AcOH, H2O/EtOH=50/50 (v/v) + 5,0 mM AcOH és H2O/MeOH/EtOH=50/25/25 (v/v/v) +

5,0 mM AcOH eluens összetétel mellett az elsőként eluálódó enantiomerek retenciós

faktorai rendre nagyobbnak adódtak a 29, 30, 35 és 36 enantiomerek esetén, mint a 31-34,

37 és 38 enantiomerekre (4.8. Táblázat).

29 29

31 31

35 35

67

4.7. ábra A 31 ß

3-aminosav k1’, α, RS függése az eluens szerves fázisától függően

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, H2O/alkohol=30/70 (v/v)+5 mM AcOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 278 K.

A 31-34 enantiomerek hosszabb és elágazó oldallánca (különösen a 32 minta esetén)

csökkenti az állófázissal történő poláris és sztérikus kölcsönhatások valószínűségét, ezért

k1’ csökken. Összehasonlítva a 35 és 36 vegyületeket a 31-34 enantiomer párokkal és a 37

és 38 vegyületpárt, a nagyobb retenciós faktorok a 35, 36 és 38 vegyületek esetén a π-

kötést tartalmazó minták és az állófázis közti poláris kölcsönhatások meglétének

tulajdoníthatók. Ez a retenció növekedés azonban többnyire nem párosult a szelektivitás

növekedésével. A H2O/MeOH=30/70 (v/v) + 5,0 mM AcOH eluensösszetétel esetében a

szelektivitás (1,23-1,71) és a felbontás (<0,4-1,80) között változott. A szelektivitás

összehasonlításakor az alifás vegyületeknél 32 és 34 esetében kaptuk a legnagyobb

értékeket; amíg a nagy térkitöltésű csoportok csökkentették az állófázissal való

kölcsönhatás lehetőségét, kisebb visszatartást eredményezve, addig a királis

megkülönböztetési folyamatot kedvezően befolyásolták. A 35 és 36 vegyületek kettős és a

hármas kötésük révén a szelektorral való dipól-dipól kölcsönhatás kialakításával segítették

az elválasztást. Az aliciklusos 37 és 38 vegyületek esetében a gyűrűben lévő kettőskötés

révén a 38 minta mutatott nagyobb szelektivitást.

Három ß3-aminosav 29, 35 és 36 esetén állt rendelkezésünkre tiszta enantiomer,

amelyeknél egységesen S<R elúciós sorrendet kaptunk.

MeOH EtOH PrOH 2-PrOH t-BuOH

Eluens szerves fázis összetevője

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

k1’

αααα

RS

k1’

αααα

RS

68

Összefoglalásként elmondható, hogy az eluensösszetétel hatásának vizsgálatakor a

mozgófázis nagyobb szerves módosító tartalma nagyobb visszatartást, szelektivitást és

felbontást eredményezett. Az eluensben alkalmazott alkoholok szénatomszámának

növekedésével k’ növekedést tapasztaltunk. Ez a tendencia már nem volt megfigyelhető a

királis megkülönböztetési folyamatban, ugyanis nem a t-BuOH hanem az EtOH esetében

kaptuk a legnagyobb α értékeket. Az enantiomerek szerkezetének szerepét vizsgálva a

visszatartásban és a királis megkülönböztetésben megállapítottuk, hogy az aminosavak

nagyobb térkitöltésű alifás oldalláncai jelentősen csökkentették az enantiomer-koronaéter

komplex stabilitását, kisebb retenciót eredményezve, viszont kedvezően befolyásolták az

enantiomerek királis megkülönböztetését. A 29, 35 és 36 enantiomer párok esetében S<R

elúciós sorrendet kaptunk.

4.2.3. Alifás és aromás ß3-aminosav enantiomerek elválasztása Korona 2 állófázison

A korábbi két fejezetben (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav királis

szelektor a szintézisből adódóan szabad szilanolcsoportokkal rendelkezik. Ezen a K1

állófázison aromás, alifás és aliciklusos ß3-aminosav enantiomerek kromatográfiás

elválasztását tanulmányoztuk (3.6. és 3.7. Táblázat). Ebben a fejezetben alifás és aromás

ß2-aminosav enantiomerek kromatográfiás viselkedése kerül tárgyalásra a 2.11. ábrán

feltüntetett szabad szilanolcsoportot nem tartalmazó módosított aminopropil szilikagélhez

kötött szintén (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav szelektorral rendelkező Korona

2 oszlopon.

Az eluens szerves módosító tartalmának vizsgálatakor, hasonlóan a K1 oszlopnál

tapasztaltakkal, itt is a mozgófázisban lévő alkohol mennyiségének növelésével a retenciós

faktor nőtt: a poláris molekula szívesebben tartózkodik a poláris állófázisban, mint a

kevésbé poláris mozgófázisban (4.8. ábra). A szerves fázis arányának növekedése az

aromás ß2-aminosavaknál alig befolyásolta, az alifás oldalláncúak esetében pedig

jelentősen csökkentette a felbontást és a szelektivitási tényezőt (4.8. ábra). Az alkohol

szénatom számának növekedésével szintén nőtt a visszatartás. A 40 vegyület esetében

H2O/alkohol=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4 eluensösszetétel mellett a különböző alkohol

tartalmú eluensben mért retenciós faktorok: MeOH k1’=0,32; EtOH k1’=0,35; PrOH

k1’=1,18; 2-PrOH k1’=1,25, azaz az alkoholok poláris jellegének csökkenésével nőtt a

kölcsönhatás erőssége az állófázissal. Az alkohol szénatom számának növekedése a

szelektivitást előnyösen befolyásolta: a 40 vegyület esetén az α értéke a MeOH, EtOH,

69

PrOH, 2-PrOH sorban α=1,22-1,34, míg a 45 vegyület esetén α=1,21-1,45 tartományban

növekedett.

0 20 40 60 80

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

k'

1

αααα

RS

k'1

αααα

RS

MeOH (%)

0 20 40 60 80 100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

k'1

αααα

RS

k'1

αααα

RS

MeOH (%)

0 20 40 60 80 100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

k'1

αααα

RS

k'1

αααα

RS

MeOH (%)

0 20 40 60 80 1000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

k'1

αααα

RS

k'1

αααα

RS

MeOH (%)

4.8. ábra

40, 44, 45 és 49 ß2-aminosavak retenciós faktorának, szelektivitásának és

felbontásának függése az eluens összetételtől Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 2; eluens, H2O/MeOH=90/10, 80/20, 60/40, 40/60, 20/80

(v/v)+2,0 mM H2SO4; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K. Mint már korábban említettem, az eluensben levő sav minőségének és

mennyiségének meghatározó a szerepe a visszatartásban. A 40 és 45 vegyületek esetén

H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM sav eluens összetétel mellett a legnagyobb visszatartást

AcOH alkalmazásakor, a legkisebbet H3PO4 esetében figyeltük meg. Ennek valószínű oka

a foszforsav igen jó komplexképző (ionpárképző) tulajdonsága, csökkentve a protonált ß-

aminosav-koronaéter komplex stabilitását és ezáltal a retenciót (4.9. Táblázat). Általunk

vizsgált savak AcOH, TFA, HClO4, H2SO4 és H3PO4 savi disszociációs állandója igen

különböző (lásd: 4.2.1. fejezet), koncentrációjuk állandó értéken tartása igen különböző

pH-t eredményez. Ezt kiküszöbölendő, megvizsgáltuk, hogy a különböző savaknál a pH-t

állandó értéken tartva milyen tendencia figyelhető meg a visszatartásban. A 4.9. Táblázat

adatainak elemzésekor feltűnő, hogy míg azonos koncentrációjú savat tartalmazó eluens

alkalmazásakor a retenciós faktor a 40 vegyület esetén (k1’=0,01-1,18) és a 45 vegyület

esetén (k1’=0,63-3,41) széles tartományban változik, addig állandó (pH=3,55) pH mellett a

40 44

45 49

70

retenciós faktorok 40 (k1’=1,07-1,33) és 7 (k1’=3,41-4,24) kisebb tartományban változnak.

Ennek valószínű magyarázata, hogy állandó pH-n a szelektor karboxilcsoportjai (pK=2,1-

4,9) disszociációjának mértéke alig változik, illetve közel azonos koncentrációjú ellenion

van az eluensben. Mind a két vegyületnél a legnagyobb visszatartást perklórsav esetében

kaptuk, ami a perklórsav igen gyenge komplexképző tulajdonságával magyarázható. Az

eluensben levő sav minőségének hozzájárulása a királis megkülönböztetéshez

elhanyagolhatónak tekinthető. Az azonos koncentrációjú illetve pH-jú mérések során

kapott α és RS értékek összehasonlításakor nem kaptunk számottevő különbséget, igazolva,

hogy az ammóniumion – koronaéter komplex a nem királis kölcsönhatások kialakításában

játszik meghatározó szerepet a kromatográfiás elválasztás során.

4.9. Táblázat. A 40 és 45 ß2-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS) Korona 2 oszlopon fordított fázisú elválasztások esetén azonos sav koncentrációjú és pH-jú eluens esetében

40 45 Mozgófázis

k1’ αααα RS k1’ αααα RS H2O/MeOH=80/20+10 mM AcOH (pH=3,55) 1,18 1,06 0,40 3,41 1,02 <0,4 H2O/MeOH=80/20+10 mM H2SO4 (pH=1,91) 0,32 1,22 0,65 1,21 1,28 1,25 H2O/MeOH=80/20+10 mM HClO4 (pH=2,10) 0,13 1,32 0,40 1,24 1,30 0,75 H2O/MeOH=80/20+10 mM TFA (pH=2,11) 0,04 1,00 0,00 1,12 1,21 0,65

H2O/MeOH=80/20+10 mM H3PO4 (pH=3,55) 0,01 1,40 0,40 0,63 1,22 0,60 H2O/MeOH=80/20 + AcOH (pH=3,55) 1,18 1,06 0,40 3,41 1,02 <0,4 H2O/MeOH=80/20 + H2SO4 (pH=3,54) 1,07 1,05 0,50 3,63 1,14 0,75 H2O/MeOH=80/20 + HClO4 (pH=3,55) 1,20 1,08 0,55 4,24 1,04 0,70 H2O/MeOH=80/20 + H3PO4 (pH=3,55) 1,16 1,08 0,50 3,59 1,04 <0,4 H2O/MeOH=80/20 + TFA (pH=3,54) 1,17 1,14 0,65 3,48 1,01 <0,4

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 2; eluens, H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM sav és H2O/MeOH=80/20 (v/v) + sav (pH=3,54-3,55); 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

A ß2-aminosavak (3.6. és 3.7. Táblázat) szerkezetének hatását vizsgálva, jelentős

eltérést tapasztalunk az alifás (39-44) és aromás (45-49) oldalláncot tartalmazó vegyületek

viselkedésében (4.10. Táblázat) H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4 eluens összetétel

mellett 25 °C-on. Aromás ß2-aminosavak esetében a k1’ értékek 1,14-2,02 tartományba

estek, jelentősen meghaladva az alifás oldallánccal rendelkezőkét (k1’: 0,1-0,42). Érdekes

viselkedést figyeltünk meg a 39-44 vegyületeknél: a 39 minta esetén tapasztalt legkisebb

visszatartás a szénatomszám növekedésével nőtt, amely ellenkező irányú az előző

fejezetben tárgyalt ß3-aminosavaknál tapasztaltakkal. Ez azzal magyarázható, hogy a ß

2-

aminosavaknál a protonált aminocsoporttól az oldalláncok egy szénatommal távolabb

helyezkednek el, így azok sztérikusan kevésbé gátolják a komplex kialakulását, valamint

így az oldalláncok további kölcsönhatásba léphetnek az állófázissal.

71

4.10. Táblázat. Alifás és aromás ß2-aminosavak kromatográfiás paraméterei (k1’, α, RS)

Korona 2 oszlopon fordított fázisú elválasztások esetén

Vegyület Hőmérséklet Mozgófázis (v/v)

k1’ αααα RS

25,0 H2O/MeOH, a 0,11 1,00 0,00 7,0 H2O/MeOH, a 0,48 1,00 0,00 39 7,0 H2O/EtOH, b 0,61 1,00 0,00 25,0 H2O/MeOH, a 0,32 1,22 0,65 7,0 H2O/MeOH, a 0,59 1,18 0,50 40 7,0 H2O/EtOH, b 0,69 1,18 0,50 25,0 H2O/MeOH, a 0,25 1,25 0,40 7,0 H2O/MeOH, a 0,75 1,22 0,85 41 7,0 H2O/EtOH, b 0,86 1,22 0,75 25,0 H2O/MeOH, a 0,42 1,20 0,40 7,0 H2O/MeOH, a 1,20 1,08 0,40 42 7,0 H2O/EtOH, b 1,14 1,21 0,70 25,0 H2O/MeOH, a 0,24 1,20 0,40 7,0 H2O/MeOH, a 0,75 1,19 0,40 43 7,0 H2O/EtOH, b 0,87 1,18 0,55 25,0 H2O/MeOH, a 0,32 1,20 0,40 7,0 H2O/MeOH, a 0,82 1,21 0,65 44 7,0 H2O/EtOH, b 0,89 1,22 0,70 25,0 H2O/MeOH, a 1,21 1,28 1,25 7,0 H2O/MeOH, a 2,86 1,37 1,45 45 7,0 H2O/EtOH, b 3,18 1,38 1,50 25,0 H2O/MeOH, a 1,14 1,22 0,80 7,0 H2O/MeOH, a 3,28 1,30 1,35 46 7,0 H2O/EtOH, b 3,57 1,30 1,35 25,0 H2O/MeOH, a 1,14 1,22 1,45 7,0 H2O/MeOH, a 3,53 1,35 1,55 47 7,0 H2O/EtOH, b 4,37 1,33 1,45 25,0 H2O/MeOH, a 1,26 1,25 0,75 7,0 H2O/MeOH, a 4,15 1,32 1,35 48 7,0 H2O/EtOH, b 4,44 1,35 1,35 25,0 H2O/MeOH, a 2,02 1,20 1,16 7,0 H2O/MeOH, a 3,97 1,36 1,40 49 7,0 H2O/EtOH, b 4,88 1,36 1,50

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 2; eluens, a, H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4, b, H2O/EtOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4; 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 280,15 K és

298 K.

A H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4 eluens összetétel mellett 25 °C-on az alifás

oldalláncot tartalmazó vegyületek közül az n-butil-oldallánccal rendelkező 42 minta

esetében kaptuk a legnagyobb visszatartást (k1’=0,42). Aromás vegyületek vizsgálatakor

48 és 49 esetében figyeltük meg a legnagyobb retenciós adatokat, amely valószínűleg az

éter kötésekben lévő oxigének H-híd kialakítására alkalmas tulajdonságával magyarázható.

72

Érdekes módon a fenolos hidroxilcsoportot tartalmazó 46 és 47 esetében összehasonlítva a

szubsztituálatlan fenilgyűrűt tartalmazó 45 vegyülettel retenció csökkenést figyeltünk meg.

Fenol esetében a –OH csoport pK-ja 9,9 (természetesen ez csak közelítő érték a 46 és 47

esetében), így az alkalmazott pH-n nem kell számolni a fenolos –OH disszociációjával.

Ennek ellenére a fenolos –OH csoport valószínűleg mégsem vesz részt visszatartást segítő

H-híd kölcsönhatásokban, hanem sztérikus gátlás révén akadályozza a minta és a szelektor

közti kapcsolatot, ezért a retenció csökken a nem szubsztituált 45 vegyülethez képest.

A ß2-aminosavak esetén a kémiai szerkezet és a kromatográfiás viselkedés közti

összefüggést vizsgálva az alifás illetve aromás oldallánc helyzete jelentős befolyással bírt.

ß2-aminosavak esetében az aminocsoport sztérikusan kevésbé gátolt a komplex

kialakításában a ß3-aminosavakhoz képest, hiszen a kettes szénatomon található az

oldallánc. Ez visszatartásnövekedést eredményezett, azonban a királis megkülönböztetési

folyamatot kedvezőtlenül befolyásolta. Az utóbbi egyik oka lehet, hogy a kiraliás centrum

és a protonált aminocsoport már nem ugyanazon a szénatomon található illetve a sztérikus

gátlás egy meghatározó kölcsönhatás, mely a két enantiomer esetén jelentősen

különbözhet, hozzájárulva a királis felismeréshez. A 4.10. Táblázat adatai alapján a hat

alifás oldalláncú aminosav közül csak egyet sikerült alapvonalra elválasztani, az aromás

oldalláncú ß2-aminosavak elválasztása sikeresebbnek mondható. A 39 vegyület esetében

egyáltalán nem tapasztaltunk elválást, 40-44 esetében nem kaptunk szignifikáns

különbséget a szelektivitási tényezőben (α=1,20-1,25). Aromás oldalláncot tartalmazó

vegyületek esetében a legnagyobb felbontás értéket (RS=1,45) a 47 vegyület esetén kaptuk,

ahol az aromás gyűrű meta-helyzetben szubsztituált, hasonlóan az aromás ß3-

aminosavakhoz.

A hőmérséklet hatásának vizsgálatára 280 és 298 K hőmérséklet tartományban

történtek a mérések. Az általános tapasztalatnak megfelelően, kisebb hőmérsékleteken a

retenció növekedett, amely a hőmozgás csökkenéséből adódó másodlagos kölcsönhatások

erősödésének eredménye. A szelektivitást tekintve a 40-44 vegyületek esetében a

hőmérséklet csökkenésével az α értéke alig változott, vagy csökkent, amely nem tekinthető

klasszikus viselkedésnek. Aromás oldalláncú vegyületeknél a szelektivitási tényezők a

hőmérséklet csökkenésével nőttek.

Összefoglalva, a ß2-aminosavak elválasztása Korona 2 állófázison különböző

körülmények között valósult meg. A szerves komponens minősége és mennyisége eltérő

módon befolyásolta az alifás és aromás oldalláncú enantiomerek elválasztását. A

mozgófázisban lévő sav minősége és koncentrációja csak a nem királis kölcsönhatások

73

kialakítására volt jelentős hatással. A visszatartást tekintve szemben a ß3-aminosavaknál

tapasztaltakkal az alifás oldalláncot tartalmazó vegyületek esetén (39-44) a szénatomszám

növekedésével nőtt a visszatartás; az aromás oldalláncú vegyületek (45-49) nagyobb

retenciós idővel eluálódtak. A királis megkülönböztetési folyamatokat tekintve

megállapítható, hogy az aromás gyűrű részt vesz a királis kölcsönhatások kialakításában,

továbbá a meta-helyzetű szubsztitúció esetében nagyobb szelektivitás és felbontás értékek

voltak megfigyelhetők. A tizenegy ß2-aminosav enantiomerjeinek elválasztásában a

Korona 2 állófázis kevésbé bizonyult hatékonynak. A hőmérséklet szerepét vizsgálva a

kromatográfiás folyamatokra, hasonlóan az eluens összetételre, itt is egymástól eltérő

viselkedést figyeltünk meg a 39-44 és a 45-49 vegyületek esetében. A 45-49 vegyületek

kiválasztott kromatogramjai a 10.3. Függelékben találhatók.

4.3. A ß3-aminosav enantiomerek királis tömegspektrometriás

megkülönböztetése

Ebben a fejezetben királis ß3-aminosav enantiomerek gázfázisú tömegspektrometriás

királis megkülönböztetését ismertetjük az irodalmi részben (2.3. fejezet) bemutatásra

került Cooks kinetikai módszer alapján (3.8. és 3.9. Táblázat). Ugyan gázfázisú

vizsgálatról beszélünk, azonban a méréshez szükséges anyagok H2O/MeOH=50/50 (v/v)

összetételű oldószeres oldatát közvetlen mintabevitellel (direkt infuzióval) 2,5 µL perc-1

áramlási sebességgel vezettük a tömegspektrométerbe. A vizsgált és a referencia

enantiomerek oldatának koncentrációja 50 µmol L-1, az átmeneti fémionok koncentrációja

10 µmol L-1 volt. Más szerves oldószerek is kipróbálásra kerültek, úgymint EtOH és ACN,

de alkalmazásuk kisebb intenzitású jelet eredményezett, összehasonlítva a MeOH-lal.

A módszer rövid ismertetése: a mérés során a ß3-aminosav R és S enantiomerjének

külön oldata (ennél a módszernél szükség van a tiszta R és tiszta S enantiomerre), amely

tartalmazza a referencia enantiomert és a fémiont, külön-külön injektálva a

tömegspektrométerbe, 100-990 m/z tömegtartományban néhány tömegspektrum készült,

majd kiválasztásra került a [MII(ref)2(A)−H]+ komplexnek megfelelő tömegű ion MS/MS

módban. Az ion izolálása után az ütközési energia optimalizálásával a maximális

intenzitású [MII(ref)(AR vagy S)−H]+ és [MII(ref)2−H]+ dimereket kiválasztottuk úgy, hogy

közben más fragmenst adó fragmentációs út ne jelenjen meg. Néhány esetben CO2 vesztés

következett be már viszonylag kis ütközési energia alkalmazásakor, ez a vesztés az

irodalomból jól ismert [114, 115]. Egy-egy aminosav két enantiomerjénél mindig azonos

74

ütközési energiát alkalmaztunk. Az optimalizálást követően 1 percig történt az adatgyűjtés.

Az 56 vegyület két enantiomerjére kapott MS/MS spektrumot mutatja be a 4.9. ábra.

Látható, hogy a 292 m/z [CuII(L-Pro)2−H]+ referencia csúcs intenzitása és 390 m/z-vel

rendelkező [CuII(L-Pro)(56R)−H]+ illetve a másik enantiommernél a [CuII(L-

Pro)(56S)−H]+ intenzitások aránya eltérő a két spektrumon. A kiértékelés a (22), (23) és

(24) összefüggések felhasználásával történt. A kiértékelés során az 505 m/z-vel rendelkező

szülőion [MII(L-Pro)2(56R)−H]+ és [MII(L-Pro)2(56S)−H]+ trimer komplex intenzitásával

nem számoltunk. Hasonlóan jártunk el az összes vizsgált β3-aminosav esetén. A (22) és

(23) összefüggéből kapott RR és RS értékek hányadosából határoztuk meg Rkirális (24)

értékét. Ha RR értéke nagyobb az RS-nél, akkor Rkirális>1, ellenkező esetben Rkirális<1. Mind

a két esetben királis megkülönböztetésről beszélhetünk, azaz, ha Rkirális értéke 1-től eltérő.

4.9. ábra A 56 minta CID spektruma L-Pro referencia anyag jelenlétében: a) [Cu

II(L-Pro)2(56R) -

H]+ and b) [Cu

II(L-Pro)2(56S) - H]

+ komplexeknek

Átmeneti fémionokat a jó komplexképző tulajdonságaik végett alkalmazzák a

kinetikai módszernél, legelterjedtebben a Cu(II) és a Ni(II)ionokat használják [117-121].

Vizsgálataink során mind a két fémet alkalmaztuk (4.11. és 4.12. Táblázat).

Összehasonlítva a két fémion hatását az enantiomer megkülönböztetésben, a Cu(II) L-Pro,

L-Phe, L-Tyr esetében jobbnak bizonyult. Nagy eltérés L-DOPA alkalmazásakor volt

megfigyelhető, amíg a réz komplexek esetében nem kaptunk királis megkülönbözetést,

addig Ni(II) komplexeknél igen.

4.11. Táblázat. ß3-aminosavak CuII komplexének számolt Rkirális értékei különböző

a b

75

referencia enantiomerek alkalmazása esetén Referencia enantiomerek

L-Pro L-Phe L-2´,6´-

diMePhe L-Tyr

L-2´,6´-diMeTyr

L-Phg

L-4´-OH-Phg

Vegyület

Rkirális

50 1,19±0,07 a) 1,06±0,06 0,84±0,10 e)

b)

c)

d)

0,50±0,05 0,90±0,03 0,41±0,11

0,73±0,01 1,13±0,05 0,63±0,01

51 1,28±0,18 0,88±0,11 0,91±0,07 1,30±0,12 e)

b)

c)

d)

0,79±0,02 1,16±0,01 0,53±0,03

0,71±0,04 1,15±0,06 0,55±0,05

52 1,28±0,16 0,87±0,02 e) e) 0,82±0,10

b)

c)

d)

0,63±0,03 1,09±0,10 0,49±0,02

0,54±0,06 1,00±0,12 0,47±0,06

53 1,31±0,17 0,83±0,11 1,19±0,01 e) 0,90±0,08

b)

c)

d)

0,66±0,03 1,24±0,05 0,51±0,02

0,81±0,11 1,60±0,17 0,71±0,10

54 1,28±0,11 0,91±0,01 e) e) e)

b)

c)

d)

0,65±0,07 1,04±0,14 0,54±0,05

0,68±0,02 1,14±0,11 0,62±0,03

55 2,68±0,17 1,10±0,07 a) 1,67±0,30 1,39±0,25

b)

c)

d)

1,70±0,19 0,96±0,08 1,51±0,12

1,25±0,07 1,08±0,04 1,34±0,09

56 1,88±0,02 1,79±0,07 e) 1,56±0,07 1,56±0,35

b)

c)

d)

1,53±0,11 1,37±0,07 1,64±0,14

1,21±0,03 1,12±0,06 1,24±0,04

a) nem számolható az Rkirális értéke a vizsgált ß3-aminosav és a referencia azonos molekulatömege miatt. b) a királis megkülönböztetés [CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ és [CuI(ref)(AR vagy S)]+ komplexek együttes intenzitásával számolva. c) a királis megkülönböztetés a [CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ intenzitásával számolva. d) a királis megkülönböztetés a [CuI(ref)(AR vagy S)]+ intenztitásával számolva. e) Nem volt királis megkülönböztetés. 4.12. Táblázat. ß

3-aminosavak NiII komplexének számolt Rkirális értékei különböző referencia enantiomerek alkalmazása esetén

Referenci enantiomerek

L-Pro L-Phe L-2', 6'- diMePhe

L-Tyr L-2', 6'- diMeTyr

L-DOPA Vegyület

Rkirális

50 1,13±0,09 a) 1,07±0,02 b) 1,22±0,08 1,12±0,08

53 b) 0,86±0,11 b) 1,30±0,06 b) 1,23±0,06

56 1,25±0,15 1,16±0,09 1,19±0,01 0,92±0,10 b) 0,85±0,07 a) Nem számolható az Rkirális értéke a vizsgált ß3-aminosav és a referencia azonos molekulatömege miatt. b) Nem volt királis megkülönböztetés.

76

A gázfázisú királis megkülönböztetési folyamatban a referencia enantiomereknek

jelentős szerepük van. Jellemző kölcsönhatások a referencia enantiomer-vizsgált

enantiomer-fémion komplexben a π-π, sztérikus és π-d kölcsönhatások, amelyek a

koordinatív kötés mellett jelentkeznek. A legnagyobb Rkirális értéket az 55 vegyület esetén

L-Pro alkalmazásával kaptuk, Rkirális=2,68. Az L-Pro α-aminosavak esetén is igen

hatékonynak bizonyult, amit viszonylag merev szerkezetével magyaráztak. A referencia

vegyületek kiválasztásakor döntő, hogy szubsztituált vagy nem szubsztituált aromás gyűrűt

tartalmazzanak, feltételezve, hogy π-π és πsav-πbázis kölcsönhatásba tudnak lépni a vizsgált

aromás ß3-aminosavakkal [98].

L-Phe, L-Tyr, L-2,6-diMeTyr és L-2,6-diMePhe referencia enantiomerek

összehasonlításakor az L-Tyr alkalmazásakor 50, 51 és 55 vegyületek esetében kaptuk a

legnagyobb Rkirális értékeket. Feltételezhető, hogy ez a vizsgált enantiomerek és az L-Tyr

között fellépő πsav-πbázis kölcsönhatásnak tulajdonítható. Az 51 és 55 vegyületek pozitív

indukciós effektussal rendelkező metilszubsztituensnek köszönhetően π-bázisos

karakterűeknek tekinthetőek, míg az L-Tyr π-savas karakterű (fenolos –OH csoport).

Érdekes módon az erősen π-savas L-DOPA esetében nem volt megfigyelhető királis

megkülönböztetés, ez valószínűleg sztérikus okokkal magyarázható. A szelektivitási

értékekből jól látható, hogy a benzilcsoportot tartalmazó α-aminosav enantiomerek (L-

Phe, L-2´,6´-diMePhe, L-Tyr, L-2´,6´-diMeTyr) azon ß3-aminosavak esetében (55,56)

voltak hatékonyak, amelyek királis szénatomjához szintén benzilcsoport kapcsolódik.

Hasonló összefüggést figyeltünk meg a fenilgyűrűt tartalmazó L-Phg és L-4-OHPhg

referencia enantiomerek és ß3-aminosavak (1-5) között. A fémion szerepének jelentőségét

mutatja, hogy Ni(II) esetében ez a szerkezeti hatás nem volt megfigyelhető.

A vizsgált ß3-aminosavakat fenil- (50-54) és benzilcsoportjuk (55,56) alapján

elkülönítve megállapítható, hogy amíg 50-54 esetében a fenilgyűrűn található szubsztituens

minősége és helyzete alig befolyásolta a királis megkülönböztetést, kivéve L-Phg és L-4-

OHPhg referencia enantiomerek alkalmazásakor (ahol az előbbi az 50, az utóbbi az 52

minta esetében bizonyult a legjobbnak), addig az 55 és 56 vegyület esetében a para-

helyzetű metil- illetve kloridcsoport jelenléte L-Pro referenciaként való alkalmazásakor

kedvezően befolyásolta a királis megkülönböztetést.

L-Phg és L-4-OHPhg alkalmazásakor Cu(II) esetében az összes ß3-aminosavnál

érdekes viselkedést figyeltünk meg a [CuII(ref)2(A)−H]+ komplex fragmentációjakor. A

várt dimer komplex mellet [CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ 1 Da-nal nagyobb tömegnél megjelent

77

egy csúcs, amely a Cu(II) redukciójából adódóan [CuI(ref)(AR vagy S)]+ szerkezettel

magyarázható (4.9. és 4.10. ábra). Ni(II) esetében nem tapasztaltunk redukciót.

4.9. ábra a) [Cu

II(L-Phg)2(54R) - H]

+ és b) [Cu

II(L-Phg)2(54S) - H]

+ komplexek CID

tömegspektruma .

NH2

O

O-

H2N

O

HO

Cl

NH2

O

HO

CuII

+

NH2

O

O-

CuII

+

Cl

H2N

OH

O NH2

O

O-

H2N

OHO

CuII

+

NH2

HO

O

CuI

+

Cl

H2N

OH

O

4.10. ábra a, [Cu

II(L-Phg)2(54R) - H]

+ komplex fragmentációja során keletkezett

b, [CuII(L-Phg)(54R) - H]

+, c, [Cu

II(L-Phg)2 - H]

+ és d, [Cu

I(L-Phg)(54R)]

+ dimer

komplexek lehetséges szerkezetei

A szelektivitás a Cu(II) redukcióját feltételezve háromféle képpen került kiszámításra:

[CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ és [CuI(ref)(AR vagy S)]+ komplexek együttes

intenzitásának,

[CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ intenzitásának,

a b

a

c b

d

78

[CuI(ref)(AR vagy S)]+ intenztitásának felhasználásával.

A kapott Rkirális értékek tanulmányozásakor megállapítható, hogy a szokásos

[CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ intenzitásával történő számolás esetén a többi referencia esetében

mértekkel összevethető szelektivitás értékeket kaptunk (4.11. Táblázat). Azonban az

együttes illetve a redukált forma intenzitásával számolt szelektivitás értékek az 50, 53 és

54 esetén kiugróan jobbak. Összehasonlítva a két fenilcsoportot tartalmazó referencia

enantiomert, L-Phg esetén nagyobb Rkirális értékek voltak megfigyelhetők, kivéve a 51 és

52 vegyületeket.

A redukciós mechanizmus vizsgálatakor felmerült, hogy miért csak az α pozícióban

fenilgyűrűt tartalmazó L-Phg és L-4-OHPhg esetében lép fel és miért nem tapasztalható a

benzil analógoknál? További érdekesség, hogy normál esetben neutrális vesztés

formájában egy referencia molekula kilép, azonban a redukció során egy gyökvesztés lép

fel L-Phg-H· és L-4-OHPhg-H· formájában. Ez a kilépés a gyök stabil rezonancia

szerkezetével magyarázható. A gyök a benzil oldallánc esetén is kialakulhat, azonban a

fenil oldallánc esetében további három lehetséges rezonancia szerkezet alakulhat ki (4.11.

ábra). Ez egyben megmagyarázza, hogy miért nem volt megfigyelhető a redukció

[CuII(ref)2]+ dimer komplex esetében, hiszen a kilépő ß

3-aminosav gyököknél nem

alakulhat ki ez a rezonancia stabilizált szerkezetet. Legvégül a és szerint számolt

Rkirális értékek 50-54 esetében <1,0, amely arra utal, hogy S ß3-aminosav enantiomerek

esetében a [CuI(ref)(AS)]+/[CuII(ref)2]+ intenzitásának aránya nagyobb volt, mint az R

enantiomer [CuI(ref)(AR)]+/[CuII(ref)2]+ esetében, tehát a redukció kedvezményezettebb

volt az S enantiomer esetében. Az Rkirális 55 és 56 esetében >1-nek adódott, ezt a Cahn-

Ingold-Prelog (C.I.P.) szabály magyarázhatja.

4.11. ábra L-Phg-H · gyök lehetséges rezonancia szerkezetei

Összefoglalásként elmondható, hogy hét ß3-aminosav tömegspektrometriás kinetikus

módszerrel való vizsgálata során a [MII(ref)2(A)−H]+ trimer komplexek fragmentálása után

kapott [MII(ref)(AR vagy S)−H]+ és [MII(ref)2−H]+ dimer komplexek intenzitás arányából

meghatározható a királis szelektivitás. A vizsgált ß3-aminosavak, a referenciaként

79

alkalmazott α-aminosavak és a fémion hozzájárulását vizsgálva a királis

megkülönböztetési folyamathoz megállapítottuk, hogy a fenilcsoportot tartalmazó α-

aminosav enantiomerek (L-Phg és L-4-OHPhg) azon ß3-aminosavak esetében (50-54)

voltak hatékonyak, amelyek királis szénatomjához szintén fenilcsoport kapcsolódott.

Hasonló összefüggést figyeltünk meg a benzilgyűrűt tartalmazó (L-Phe, L-2´,6´-diMePhe,

L-Tyr, L-2´,6´-diMeTyr) referencia enantiomerek és ß3-aminosavak (55,56) között. A

vizsgált ß3-aminosavak aromás gyűrűjén található szubsztituens tulajdonságának és

helyzetének a királis szelektivitást befolyásoló szerepe erősen függött az alkalmazott

referencia enantiomertől. Kitértünk a komplex központi fémion tulajdonságának a királis

szelektivitásban betöltött szerepére Cu(II) és Ni(II) komplexek példáján keresztül. Legvégül

L-Phg és L-4-OHPhg vizsgálatakor a [CuII(ref)(AR vagy S)−H]+ komplexben lévő Cu(II)ion

redukcióját figyeltük, amely [CuI(ref)(AR vagy S)]+ komplexet eredményezett MS/MS mérés

során, és ennek hátterét vizsgáltuk rezonancia szerkezetek segítségével.

80

5. Összefoglalás

Munkánk során ß-laktám, ß-, ß2- és ß

3-aminosav enantiomerek királis

folyadékkromatográfiás elválasztására dolgoztunk ki módszereket illetve tanulmányoztuk

ß3-aminosav enantiomerek gázfázisú királis megkülönböztetési folyamatát.

1. Hét aromás ß-laktám (3.1. Táblázat) enantiomerjeit makrociklusos glikopeptid

alapú Chirobiotic T és TAG királis állófázisokon választottuk el. Összehasonlítva a két

oszlopot, Chirobiotic TAG esetében nagyobb szelektivitási tényező és felbontás értékeket

kaptunk. Vizsgálataink kitértek az eluensösszetétel és a hőmérséklet változásának a királis

elválasztásra gyakorolt hatására. Megállapítottuk, hogy a szerves komponens növelésével

jelentősen csökkent az enantiomerek visszatartása mind a két állófázison. A szelektivitási

tényező enyhe maximum görbe szerint változott, a felbontás 100% MeOH esetén volt a

legjobb. A hőmérsékletváltozás adataiból termodinamikai paramétereket számoltunk,

amelyek a királis felismerési folyamatban a szelektorok és a vizsgált vegyületek szerkezeti

hozzájárulása közti kapcsolat értelmezését segítették. Az elválasztás során enantiomerek

elúciós sorrendjét is meghatároztuk, egységesen S<R sorrendet kaptunk.

2. A kondenzált gyűrűs ß-laktám és ß-aminosav enantiomerek elválasztását (3.2. és

3.3. Táblázat) öt makrociklusos glikopeptid alapú teicoplanin (Chirobiotic T), teicoplanin

aglikon (Chirobiotic TAG), vankomicin (Chirobiotic V), vankomicin aglikon (Chirobiotic

VAG), ristocetin A (Chirobiotic R) és 3,5-dimetilfenilkarbamoil ß-ciklodextrin

(Cyclobond DMP) királis szelektort tartalmazó királis állófázisokon oldottuk meg. A

vizsgálatok fordított fázisú, poláris-szerves és poláris-ionos körülmények között történtek.

A makrociklusos glikopeptid szelektorok közül ismét a Chirobiotic TAG esetében kaptuk

a legnagyobb szelektivitás és felbontás értékeket. Az elválasztási tényezőkből számolt

∆TAG-T∆(∆Go) értékek jól mutatták, hogy Chirobiotic T esetében a szelektoron található

cukorrészek a 13 vegyület kivételével kedvezőtlenül befolyásolták a királis

megkülönböztetést. A Cyclobond DMP oszlop mind fordított, mind normál fázisban igen

jó elválasztást mutatott a 8 és 9 β-laktámok valamint a 11 ß-aminosav enantiomerek

elválasztásakor. Az enantiomerek elúciós sorrendje meghatározásra került, a különböző

állófázisokon a három ß-aminosav esetén elúciós sorrendváltozást figyeltünk meg.

81

3. A (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav királis szelektort tartalmazó

koronaéter állófázison (Korona 1) ß3- és ß

2-aminosav enantiomerek elválasztását

tanulmányoztuk. Az első vegyületcsoport tizenöt 3-aril-szubsztituált ß3–aminosavat foglalt

magában. Az eluensösszetétel vizsgálatakor a mozgófázisban a MeOH-tartalom

növelésével nőtt a visszatartás, azonban ez a hatás kedvezőtlenül befolyásolta a királis

megkülönböztetési folyamatot, kisebb szelektivitás és a felbontás értékeket eredményezett.

A mozgófázishoz adagolt sav koncentrációjának növelésével jelentős retenciócsökkenést

tapasztaltunk, amit a ß3-aminosav és a szelektor karboxilcsoportja disszociációjának

visszaszorulásával és a savból származó anion ellenion hatásával értelmeztünk. A

vegyületek szerkezetének és a kromatográfiás viselkedésének kapcsolatát vizsgálva az

aromás gyűrűn para-helyzetű F-, Cl-, Br- és CF3-szubsztitució növelte a visszatartást, a

szelektivitást és a felbontást. A metoxi- és metilcsoport nem, vagy kis mértékben

csökkentette a királis szelektivitást. A szubsztituensek helyzetét vizsgálva, a meta- és a

para-helyzetű szubsztitució bizonyult a legkedvezőbbnek, míg az orto-szubsztituált

vegyületek enantiomerjei, valószínűleg sztérikus gátlás miatt, nehezen voltak

elválaszthatók. A tizenöt vizsgált vegyület közül mindössze a 19 és 24 enantiomerjei

mutattak részleges elválást (3.4. Táblázat). Hat vegyület esetében az enantiomerek elúciós

sorrendje is meghatározásra került, egységesen R<S sorrendet eredményezve.

4. Az alifás és aliciklusos ß3–aminosav enantiomerek (3.5. Táblázat) elválasztásának

módszerét szintén Korona 1 állófázison dolgoztuk ki. Az eluensösszetétel hatásának

vizsgálatakor a mozgófázis nagyobb szerves módosító tartalma nagyobb visszatartást,

szelektivitást és felbontást eredményezett. Vizsgáltuk az eluensben alkalmazott alkoholok

szénatomszámának hatását és egységesen a hosszabb szénláncú alkoholok esetében k’

növekedést tapasztaltunk. Az alkoholok szénatomszámának hatása a királis

megkülönböztetési folyamatra nem volt egyértelmű, ugyanis az EtOH esetében kaptuk a

legnagyobb α értékeket. A visszatartásban és a királis megkülönböztetési folyamatban az

aminosavak nagyobb térkitöltésű alifás oldalláncai jelentősen csökkentették az enantiomer-

koronaéter komplex stabilitását, kisebb retenciót eredményezve, azonban a kialakuló

gyengébb nemkirális kölcsönhatások nem csökkentették az enantioszelektivitást, a kisebb

retenciós faktorok ellenére a két enantiomer kölcsönhatása közti különbség megmaradt. A

29, 35 és 36 vegyületek esetében rendelkezésre állt a tiszta enantiomer, egységesen S<R

elúciós sorrendet kaptunk.

5. Az alifás és aromás ß2-aminosav enantiomerek (3.6. és 3.7. Táblázat)

82

elválasztására Korona 2 állófázison dolgoztunk ki módszereket. A Korona 2 hasonlóan a

Korona 1-hez (+)-(18-korona-6)-2,3,11,12-tetrakarbonsav királis szelektort tartalmaz, a

különbség a hordozóban van: a királis szelektor módosított aminopropil szilikagélhez van

kötve, melyen a szilanolcsoportok védettek (endcapped). Az eluensösszetétel vizsgálatakor

megállapítottuk, hogy a szerves komponens minősége és mennyisége eltérő módon

befolyásolta az alifás és aromás oldalláncú enantiomerek elválasztását. A mozgófázisban

lévő sav minősége és koncentrációja csak a nem királis kölcsönhatások kialakítására volt

jelentős hatással. A visszatartás a ß3-aminosavaknál tapasztaltaktól eltérően mind az alifás

(39-44), mind az aromás (45-49) oldalláncot tartalmazó vegyületek esetén a szénatomszám

növekedésével nőtt. A királis megkülönböztetési folyamat és az enantiomerek szerkezete

közötti kapcsolat vizsgálatakor megállapítottuk, hogy az aromás gyűrű meghatározó a

királis kölcsönhatások kialakításában, tovább a meta-helyzetű szubsztitúció esetében

nagyobb szelektivitás és felbontás értékek voltak megfigyelhetők. A hőmérséklet szerepét

vizsgálva az enantiomerek elválasztása során, hasonlóan az eluens összetétel hatásának

tanulmányozásakor itt is egymástól eltérő viselkedést figyeltünk meg az alifás és az aromás

ß2-aminosavak között. A Korona 2 állófázison az aromás oldalláncú ß

2-aminosavak

elválasztása sikeresebbnek mondható.

6. A ß3-aminosavak (3.9. Táblázat) gázfázisú királis megkülönböztetési folyamatát

ioncsapda tömegspektrométerrel vizsgáltuk, α-aminosav referens enantiomerek (ref)

segítségével (3.8. Táblázat), amelyek a CuII és NiII központi fémiont tartalmazó

[MII(ref)2(AR vagy S)−H]+ trimer komplexekben a királis környezet megteremtéséhez

szükségesek (ahol: „A” vizsgált ß-aminosav). Megállapítottuk, hogy a fenilcsoportot

tartalmazó α-aminosav enantiomerek (L-Phg és L-4-OHPhg) azon ß3-aminosavak

esetében (50-54) voltak hatékonyak, amelyek királis szénatomjához szintén fenilcsoport

kapcsolódott. Hasonló összefüggést találtunk a benzilgyűrűt tartalmazó (L-Phe, L-2´,6´-

diMePhe, L-Tyr, L-2´,6´-diMeTyr) referencia enantiomerek és a szintén benzilgyűrűt

tartalmazó 55 és 56 ß3-aminosavak között. A vizsgált ß

3-aminosavak aromás gyűrűjén

található szubsztituens tulajdonságának és helyzetének a királis szelektivitást befolyásoló

szerepe erősen függött az alkalmazott referencia enantiomertől. A komplex központi

fémion tulajdonságának a királis szelektivitásában betöltött szerepét Cu(II) és Ni(II)

komplexek példáján mutattuk be. Az L-Phg és L-4-OHPhg vizsgálatakor a [CuII(ref)(AR

vagy S)−H]+ komplexben lévő Cu(II)ion redukcióját figyeltük, amely az MS/MS mérés során

[CuI(ref)(AR vagy S)]+ komplexet eredményezett. A CuII–CuI redukció hátterét vizsgáltuk

rezonancia-szerkezetek segítségével.

83

6. Summary

We developed methods for the separatation of ß-lactam, ß-, ß2- és ß

3-amino acid

enantiomers by using chiral liquid chromatography, and we have investigated the process

of gas phase chiral discrimination of ß3-amino acid enantiomers. The summary of the part

on liquid chromatography is divided according to applied stationer phases and the

compounds, similarly to the main part of the thesis.

1. Enantiomers of seven aromatic ß-lactams (Table 3.1) were separated on chiral

stationer phases containing macrocyclic glycopeptide antibiotic teicoplanin (Chirobiotic T)

and teicoplanin aglycone (Chirobiotic TAG). Upon comparing the two columns, both the

selectivity factor and the resolution value were larger in the case of the Chirobiotic TAG.

This investigation also covered the effects of eluent composition and changes in

temperature on chiral separation. We have concluded that upon increasing the organic

component, the retention of enantiomers decreased significantly in both stationer phases.

The separation factor (α) changed on a slight maximum curve; the resolution (Rs) was the

best in the case of MeOH. Based on the data of temperature changes, we calculated

thermodynamic parameters, which helped to understand the relationship between the

structure of the selectors and the studied compounds during the chiral recognition process.

We also determined the elution sequence of the enantiomers, what consistently proved to

be S<R.

2. The direct separation of tricyclic ß-lactam and bicyclic ß-amino acids enantiomers

(Tables 3.2. and 3.3.) was achieved on five macrocyclic glicopeptide-based colums

teicoplanin (Chirobiotic T), teicoplanin aglycone (Chirobiotic TAG), vancomycin

(Chirobiotic V), vancomycin aglycone (Chirobiotic VAG), ristocetin A (Chirobiotic R)

and 3,5-dimethylphenyl carbamate-derivatized ß-cyclodextrin (Cyclobond DMP) based

column. The results achieved with the different methods (POM, PIM and reversed-phase

mode), were compared in systematic chromatographic examinations. Among the

macrocyclic glycopeptide selectors, the highest separation factor and resolution were

observed in the case of chirobiotic TAG. The ∆TAG-T∆(∆Go) value calculated from the α

clearly showed that in the case of chirobiotic T the carbohydrate moieties found on the

selector have always influenced the chiral discrimination negatively except in the case of

the 13 compounds. The Cyclobond DMP column indicated good separation of 8 and 9 β-

lactams and the 11 ß-amino acid both in reversed- and normal-phase mode. The elution

sequence was determined in all cases and a general rule was established for the sequence

84

of elution of the stereoisomers. We witnessed a change of elutional order in different

stationer phase in the case of the three ß-amino acids.

3. High-performance liquid chromatographic methods were developed for the

separation of enantiomers of ß2- and ß

3-amino acids on a chiral stationary phase containing

(+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid as a chiral selector. The chromatographic

retention and the resolution behavior of fifteen 3-aryl substituted ß3-amino acids was found

to be dependent in different way on the mobile phase composition. An increase in the

content of MeOH in the aqueous mobile phase increases the retention while the α and RS

decreases. The retention factors continuously decreased with increasing the concentration

of acidic modifier in the aqueous mobile phase. It may be explained by the lower

dissociation of the carboxylic group of amino acid and the crown ether moreover effect of

the counter ion of acid. The nature and position of the substituents had substantial effects

on the retention, but the α changed to a much lower extent than the retention. Higher k1’, α

and RS were observed for the analytes containing the F-, Cl-, Br- és CF3- substituents in

para positions on the aromatic ring comparing with ortho and meta substituted analogs.

Ortho position of the substituents was unfavorable regarding the enantioseparation. The

elution sequence was determined, what proved to be was R<S.

4. Chiral separation of enantiomers of aliphatic and alicyclic ß3-amino acids was

studied on a chiral stationary phase also containing (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-

tetracarboxylic acid as a chiral selector. The chromatographic data of different mobile

phase composition revealed that an increase in the content of MeOH in the aqueous mobile

phase increased the retention, the selectivity and the resolution. The nature of alcoholic

modifier had substantial effects on the retention, but the selectivity changed to much lower

extent than the k value. At constant mobile phase composition the longer aliphatic chain or

branching structure of the substituents on the ß-carbon atom resulted in lower retention, but

the selectivity and the resolution did not decrease. At 29, 35 and 36 compounds the elution

sequence was S<R.

5. High-performance liquid chromatographic methods were developed for the

separation of enantiomers of aliphatic and alicyclic ß2-amino acids on a endcapped chiral

stationary phase containing (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid as a chiral

selector. The chromatographic data of the analytes revealed that elevation of the content of

MeOH in the aqueous mobile phase increased the retention. The nature of acidic modifier

influenced substantially only the non-chiral chromatographic process. The nature of the

85

substituent on the α-carbon atom of the analyte exerted a substantial effect on the

retention, but the selectivity changed to a much lower extent than the k’ value. Different

chromatographic behavior was observed at aliphatic ß2-amino acids comparing with

aromatic ones using different mobile phase composition. The analytes with aromatic side-

chains exhibited better resolution on this type of selector than that for the analytes with

aliphatic side-chains. The change of temperature exerted different effects on the β2-

homoamino acids with either aliphatic or aromatic side-chains (Table 2). The lowering of

the temperature increased the retention factor in all cases, while the α values for the amino

acids with aliphatic side-chains slightly decreased, and those for the amino acids with

aromatic side-chains increased with decreasing temperature. The RS values in most cases

increased with decreasing temperature.

6. Chiral discrimination of seven enantiomeric pairs of ß3-amino acids (AR or S) was

studied by using the kinetic method and trimeric metal-bound complexes [MII(ref)2(AR or

S)−H]+, with natural and unnatural α-amino acids as chiral reference (ref) compounds and

divalent metal ions CuII and NiII as the center ions (MII). The highest enantioselectivities

were achieved for the analytes with benzyl side chain, ß3-amino acids. Benzyl side chain

makes the analytes (enantiomers of interest) more flexible allowing more effective π –π

interactions between the analyte and reference molecules. The highest enantioselectivities

were obtained using L-Pro, L-Phg and L-4-OHPhg as reference compounds, so the

combination of relatively rigid reference compound and more flexible analyte generates

the optimal environment for chiral discrimination. For all the analytes studied, interesting

behavior was noticed, the CuII reduced to CuI when L-Phg and L-4-OHPhg were used as

reference compounds and copper as the central metal ion.

86

7. Hivatkozások

[1] Y.K. Agrawal, H.G Bhatt, H.G. Raval, P.M. Oza, P.J. Gogoi, Mini-Reviews in

Medicinal Chemistry, 7 (2007) 451.

[2] E.J. Äriens, Eur. J. Clin. Pharmacol. 26 (1984) 663.

[3] E.J. Ariëns, W. Soudijn, P. Timmermans (Eds.), Stereochemistry and Biological

Activity of Drugs, Blackwell, Oxford, 1983.

[4] H. Caner, E. Groner, L. Levy, I. Agranat, Drug Discovery Today, 9 (2004) 105.

[5] S. Görög, M. Gazdag, J. Chromatogr. B 659 (1994) 51.

[6] L.H. Easson, E. Stedman, Biochem. J. 27 (1933) 1257.

[7] C.E. Dalgliesh, J. Chem. Soc. 137 (1952) 3940.

[8] W.H. Pirkle, T. C. Pochapsky, Chem. Rev. 89 (1989) 347.

[9] A.M.A. van Wageningen, P.N. Kirkpatrick, D.H. Williams, B.R. Harris, J.K. Kershaw,

N.J. Lennard, M. Jones, S.J.M. Jones, P.J. Solenberg, Chem. Biol. 5 (1998) 155.

[10] D.W. Armstrong, Pittsburg Conference Abstracts, Pittcon, 1994, p. 572.

[11] D.W. Armstrong, Y. Tang, S. Chen, Y. Zhou, C. Bagwill, J.-R. Chen, Anal. Chem. 66

(1994) 1473.

[12] D.W. Armstrong, Y. Liu, K.H. Ekborg-Ott, Chirality 7 (1995) 474.

[13] M.P. Gasper, A. Berthod, U.B. Nair, D.W. Armstrong, Anal. Chem. 68 (1996) 2501.

[14] D.W. Armstrong, LC-GC (1997) S20.

[15] D.W. Armstrong, U.B. Nair, Electrophoresis 18 (1997) 2331.

[16] Chirobiotic Handbook, Advanced Separation Technologies Inc., 07981, Whyppany,

NJ, USA, 4th Edition (2002)].

[17] I. Ilisz, R. Berkecz, A. Péter, J. Sep. Sci. 29 (2006) 1305.

[18] G.K. Best, N.H. Best, N.N. Durham, Antimicrob. Agents Chemometr. 4 (1968) 115.

[19] U.B. Nair, S.S.C. Chang, D.W. Armstrong,Y.Y. Rawjee, D.S. Eggleston, J.V.

McArdle, Chirality, 8 (1996) 590.

[20] J.C.J. Barna, D.H. Williams, D.J.M. Stone, T.-W.C. Leung, D.M. Dodrell, J. Amer.

Chem. Soc. 106 (1984) 4895.

[21] A. Berthod, Y. Liu, C. Bagwill, D.W. Armstrong, J. Chromatogr. A 731 (1996) 123.

[22] S. Somma, L. Gastaldo, A. Corti, Antimicrob. Agents Chemother. 26 (1984) 917.

[23] P. Arriaga, J. Laynez, M. Menendez, J. Cañada, F. Garcia-Blanco, Biochem. J. 265

(1990) 69.

87

[24] A. Berthod, X. Chen, J.P. Kullman, D.W Armstrong, F. Gasparrini, I. D’Acquarica, C.

Villani, Anal. Chem. 72 (2000) 1767.

[25] A. Péter, A. Árki, E. Vékes, D. Tourwé, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, J.

Chromatogr. A 1031 (2004) 159.

[26] K.H. Ekborg-Ott, Y. Liu, D.W. Armstrong, Chirality 10 (1998) 434.

[27] C.J. Pedersen, J. Amer. Chem. Soc. 89 (1967) 7017.

[28] E. P. Kyba, L.R. Koga, L.R. Sousa, H.G. Siegel, D.J. Cram, J. Amer. Chem. Soc. 95

(1973) 2692.

[29] T. Shinbo, T. Yamaguchi, K. Nishimura, M. Sugiura, J. Chromatogr. 405 (1987) 145.

[30] T. Shinbo, T. Yamaguchi, H. Yanagishita, D. Kitamoto, K. Sakaki, M. Sigiura, J.

Chromatogr. A 625 (1992) 101.

[31] H.K. Frensdorff, J. Amer. Chem. Soc, 93 (1971) 600.

[32] R. Kuhn, C. Steinmetz, T. Bereuter, P. Haas, F. Erni, J. Chromatogr. A 666 (1994)

367.

[33] C. Dejsupa, Y. Liang, J.S. Bradshaw, R.M. Izatt, D.V. Dearden, J. Amer. Chem. Soc.

119 (1997) 353.

[34] D.J. Cram, R.C. Helgeson, L. R.Sousa, J.M. Timko, M. Newcomb, P. Moreau, F. de

Jong, G.W. Gokel, D.H. Hoffman, L.A. Domeier, S.C. Peacock, K. Madan, L.

Kaplan, Pure Appl. Chem. 43 (1975) 327.

[35]. Helgeson, R. C.; Koga, K.; Timko, J. M.; Cram, D. J. J. Amer. Chem. Soc. 95 (1973)

3021.

[36] R.M. Izatt, T. Wang, J.K. Hathaway, X.X. Zhang, J.C. Curtis, J.S. Bradshaw, C.Y.

Zhu, J. Inclusion Phenom. Mol.Recognit. Chem. 17 (1994) 157.

[37] M. Sawada, Y. Takai, H. Yamada, T. Kaneda, K. Kamada, T. Mizooku, K. Hirose, Y.

Tobe, K. Naemura, J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1997) 2497.

[38] W.H. Pirkle, C.J. Welch, J. Chromatogr. A 683 (1994) 347.

[39] S.M. Han, D.W. Armstrong, In Chiral Separations by HPLC; Krstulovic, A. M., Ed.;

Ellis Horwood Limited: Chichester, 1989;Chapter 10.

[40] W.C. Still, J.D. Kilburn, P.E.J. Sanderson, R. Liu, M.R. Wiley, F.P. Hollinger, R.C.

Hawley, M. Nakajima, A. Bernardi, J.-I. Hong, S.K. Namgoong, Isr. J. Chem. 32

(1992) 41.

[41] X.X. Zhang, J.S. Bradshaw, R.M. Izatt, Chem. Rev. 97 (1997) 3313.

[42] R. Kuhn, F. Erni, T. Bereuter, J. Heusler, Anal. Chem. 64 (1992) 2815.

88

[43] Y. Machida, H. Nishi, K. Nakamura, H. Nakai, T. Sato, J. Chromatogr. A 805 (1998)

85.

[44] M.H. Hyun, J.S. Jin, W. Lee, Bull. Kor. Chem. Soc. 19 (1998) 819.

[45] J.P. Behr, J.M. Lehn, D. Moras, J.C. Thierry, J. Amer. Chem. Soc. 103 (198) 701.

[46] M.H. Hyun, J.S. Jin, W. Lee, J. Chromatogr. A 822 (1998) 155.

[47] M.H. Hyun, J.S. Jin, H.J. Koo, W.J. Lee, J. Chromatogr. A 837 (1999) 75.

[48] J.S. Jin, A.M. Stalcup, M.H. Hyun, J. Chromatogr. A 933 (2001) 83.

[49] J.M. Lin, Lin, T. Nakamura, T. Hobo, Chromatographia 42 (1996) 559.

[50] D.C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, 5th ed., W.H. Freeman, New York,

1998.

[51] J.S. Jin, A.M. Stalcup, M.H. Hyun, J. Chromatogr. A 933 (2001) 83.

[52] M.H. Hyun, Y.J. Cho, J.S. Jin, J. Sep. Sci. 25 (2002) 648.

[53] R.A. Thompson, Z. Ge, N. Grinberg, D, Ellison, P. Tway, Anal. Chem., 67 (1995)

1580.

[54] M.H. Hyun,, J.S. Jin, W. Lee, J. Chromatogr. A 822 (1998) 155.

[55] M.H. Hyun, S.C. Han, J.S. Jin, W. Lee, Chromatographia 52 (2000) 473.

[56] M.H. Hyun, S.C. Han, Y.J. Cho, J.S. Jin, W. Lee, Biomed. Chromatogr. 16 (2002)

356.

[57] M.H. Hyun, Y.H. Kim, Y.J. Cho, Bull. Korean Chem. Soc. 25 (2004) 400.

[58] M.H. Hyun, Y.J. Cho, J. Sep. Sci. 28 (2005) 31.

[59] H. Nishi, K. Nakamura, H. Nakai, T. Sato, J. Chromatogr. A 757 (1997) 225.

[60] A. Shibukawa, in: A.M. Krstulovic (Ed.), Chiral Separations by HPLC: Applications

to Pharmaceutical Compunds, Ellis Horwood, Chichester, 1989, Chapter 16

[61] M.H. Hyun, H.J. Choi, B.S. Kang, G. Tan, Y.J. Cho, Bull. Korean Chem. Soc. 27

(2006) 1775.

[62] D. Gehin, P.A. Kollmann, G.J. Wipff, J. Amer. Chem. Soc. 111 (1989) 3011.

[63] M.H. Hyun, Y.J. Cho, J.A.Kim, J.S. Jin, J. Liquid Chromatogr. Rel. Technol. 26

(2003) 1083.

[64] M.H. Hyun, H.J. Min, Y.J. Cho, Bull. Korean Chem. Soc. 24 (2003) 911.

[65] M.H. Hyun, Y.J. Cho, J.A. Kim, J.S. Jin, J. Chromatogr. A, 984 (2003) 163.

[66] M.H. Hyun, D.H. Kim, Chirality 16 (2004) 294.

[67] M.H. Hyun, D.H. Kim, Y.J. Cho, J.S. Jin, J. Sep. Sci. 28 (2005) 421.

[68] M.H. Hyun, Y.J. Cho, Y. Song, H.J. Choi, B.S. Kang, Chirality 19 (2007) 74

[69] L.M. Bender, M. Komiyama, Cyclodextrin Chemistry, 1978, Springer-Verlag, Berlin.

89

[70] J.A. Thoma and L. Stewart, in Starch; Chemistry and Technology, Vol. 1, R. L.

Whistler and E. F. Paschall, Eds., Academic Press, New York, 1965, 209.

[71] F. Cramer, W. Saenger, H.C. Spatz, J. Amer. Chem. Soc., 89 (1967) 14.

[72] P.V. Demarco, A.L. Thakker, Chem. Commun. (1970) 2.

[73] F. Cramer, W. Dietsche, Chem. Ber., 92, 378 (1959).

[74] C.A. Chang, Q. Wu, D.W. Armstrong, J. Chromatogr. 354 (1986) 454.

[75] C.A. Chang, Q. Wu, L. Tan, J. Chromatogr. 361 (1986) 199.

[76] D.W. Armstrong, H. L. Jin, J. Chromatogr. 462 (1989) 219.

[77] S.C. Chang, G.L. III. Reid, S. Chang, C.D. Chang, D.W. Armstrong, Trends Anal.

Chem. 12, 144.

[78] D.W. Armstrong, A.M. Stalcup, M.L. Hilton, J.D. Duncan, J.R. Faulkner, S.C. Chang,

Anal. Chem. 62 (1190) 1610.

[79] Cyclobond Handbook: A guide to using cyclodextrin bonded phases for chiral LC

Separations, Advanced Separation Technologies, 7th ed. Whippany, NJ, 2005

[80] T. Takeichi, H. Toriyama, S. Shimura, Y. Takayama, M. Morikawa, J. High Resolut.

Chromatogr. 18 (1995) 179.

[81] X.Y. Shi, M. Wang, G.R. Chen, R.N. Fu, J.L. Gu, Anal. Chim. Acta 445 (2001) 221.

[82] D. Rong, V. T. D’Souza, Tetrahedron Lett. 31 (1990) 4275.

[83] A. Harada, M. Furue, S. I. NozakuraJ. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 16 (1978) 189.

[84] C. Mitchel, M. Desai, R. McCulla, W. Jenks, D. W. Armstrong, Chromatographia 56

(2002) 127.

[85] D.W. Armstrong, A.M. Stalcup, M.L. Hilton, J.D. Duncan, J.R. Faulkner, Jr., S.C.

Chang, Anal. Chem. 62 (1990) 1610.

[86] Q. Zhong, L. He, T.E. Beesley, W.S. Trahanovsky, P. Sun, C. Wang, D.W.

Armstrong, J. Chromatogr. A, 1115 (2006) 19.

[87] Q. Zhong, L. He, T.E. Beesley, W.S. Trahanovsky, P. Sun, C. Wang, D.W.

Armstrong, Chromatographia 64 (2006) 147.

[88] R. Török, R. Berkecz, A. Péter, J. Chromatogr. A, 1120 (2006) 61.

[89] H. Chen, Cs. Horváth, J. Chromatogr. A 705 (1995) 3.

[90] P.L. Zhu, J.W. Dolan, L.R. Snyder, N.M. Djordjevic, D.W. Hill, J.-T. Lin, L.C.

Sander, L. van Heukelem, J. Chromatogr. A 756 (1996) 63.

[91] A. Péter, G. Török, D.W. Armstrong, G. Tóth, D. Tourwé, J. Chromatogr. A 828

(1998) 177.

90

[92] A. Filippi, A. Giardini, S. Piccirillo, M. Speranza, Int. J. Mass. Spectrom. 198 (2000)

137.

[93] W.A. Tao, R.G. Cooks, Anal. Chem. 75 (2003) 25A.

[94] R.G. Cooks, J.S. Patrick, T. Kotiaho, S.A. McLuckey, Mass Spectrom. Rev. 13 (1994)

287.

[95] R.G. Cooks, P.S.H. Wong, Acc. Chem. Res. 31 (1998) 379.

[96] W.A. Tao, D. Zhang, E.N. Nikoalev, R.G. Cooks, J. Am. Chem. Soc. 122 (2000)

10598.

[97] D. Zhang, W.A. Tao, R.G. Cooks, Int. J. Mass Spectrom. 204 (2001) 159.

[98] S. Kumari, S. Prabhakar, M. Vairamani, C.L. Deci, G.K. Chaitanya, J. Am. Soc.

Mass. Spectrom. 18 (2007) 1516.

[99] L. Ming, L. Zhiqiang, C. Huanwen, L. Shiying, J. Qinhan, J. Mass Spectrom. 2005,

40, 1072.

[100] D.V. Augusti, R. Augusti, Tetrahedron Asym. 16 (2005) 1881.

[101] W.A. Tao, F. G. Gozzo, R.G. Cooks, Anal. Chem. 73 (2001) 1692.

[102] L. Wu, R. G. Cooks, Anal. Chem. 75 (2003) 678.

[103] W.A. Tao, D. Zhang, F. Wang, P.D. Thomas, R.G. Cooks, Anal. Chem. 71 (1999)

4427.

[104] L. Salem, X. Chapuisat, G. Segal, P. C. Hiberty, C. Minot, C. Leforestier, P. Sautet,

J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 2887.

[105] A.R.M. Hyyryläinen, J.M.H. Pakarinen, E. Forró, F. Fülöp, P. Vainiotalo, J. Mass

Spectrom. 45 (2010) 198.

[106] W.A. Tao, R. L. Clark, R.G. Cooks, Anal. Chem. 74 (2002) 3783.

[107] L.Wu, R.G. Cooks, Eur. J. Mass Spectrom. 11 (2005) 231.

[108] L. Wu, R.G. Cooks, Anal. Chem. 75 (2003) 678.

[109] G. Grigorean, C. B. Lebrilla, Anal. Chem. 73 (2001) 1684.

[110] S. Ahn, J. Ramirez, G. Grigorean, C.B. Lebrilla, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12

(2001) 278.

[111] J.F. Gal, M. Stone, C.B. Lebrilla, Int. J. Mass Spectrom. 222 (2003) 259.

[112] O. Lapr´evote, P. Ducrot, C. Thal, L. Serani, B. C. Das, J. Mass. Spectrom. 31

(1996) 1149.

[113] G. Giorgi, M. Speranza, Int. J. Mass Spectrom. 249–250 (2006) 112.

[114] F. Tureĉek, Mass Spectrom. Rev. 26 (2007) 563

[115] P. Wang, G. Ohanessian, C. Wesdemiotics, J. Mass Spectrom. 15 (2009) 325.

91

[116] G. Guiochon, S.G. Shirazi, A.M. Katti, Fundamentals of Preparative and Nonlinear

Chromatography, Academic Press, Boston (1994)

92

8. Közlemények listája

8.1. Az értekezés alapját képező közlemények

1. R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter, LC enantioseparation of aryl-substituted ß-lactams using variable-temperature conditions Chromatographia 63 (2006) S29. Impakt faktor: 1,171 2. R. Berkecz, R. Török, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter LC enantioseparation of ß-lactam and ß-amino acid stereoisomers and a comparison of macrocyclic glycopeptide- and ß-cyclodextrin-based columns, Chromatographia 63 (2006) S37. Impakt faktor: 1,171 3. R. Berkecz, A. Sztojkov-Ivanov, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, M.H. Hyun, A. Péter, High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß-amino acid stereoisomers on a (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid-based chiral stationary phase, J. Chromatogr. A 1125 (2006) 138. Impakt faktor: 3,554 4. R. Berkecz, I. Ilisz, F. Fülöp, M.H. Hyun, A. Péter, High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß3

--amino acid stereoisomers on a (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid-based chiral stationary phase, J. Chromatogr. A 1189 (2008) 285. Impakt faktor: 3,756 5. R. Berkecz, I. Ilisz, Z. Pataj, F. Fülöp, H.J. Choi, M.H. Hyun, A. Péter LC enantioseparation of ß-amino acids on a crown ether-based stationary phase, Chromatographia 68 (2008) S13. Impakt faktor: 1,312 6. R. Berkecz, I. Ilisz, A. Misicka, D. Tymecka, F. Fülöp, H.J. Choi, M.H. Hyun, A. Péter HPLC enantioseparation of ß

2-amino acids using crown ether-based stationary phase, J. Sep. Sci. 32 (2009) 981. Impakt faktor: 2,746 7. R. Berkecz, A.R.M. Hyyrylainen, F. Fülöp, A. Péter, T. Janáky, P. Vainiotalo, J.M.H. Pakarinen, Chiral discrimination of ß

3--amino acids using the kinetic method, J. Mass Spectrom. 45 (2010) 1312. Impakt faktor(2009): 2,940 Összes impakt faktor: 16,650

93

8.2. Az értekezés témájához kapcsolódó az értekezésben fel nem használt

közlemények

1. R. Török, R. Berkecz, A. Péter, High-performance liquid chromatographic enantioseparation of alpha-substituted glycine analogs on a quinine-based anion-exchanger chiral stationary phase under variable temperature conditions, J. Chromatogr. A 1120 (2006), 61. Impakt faktor: 3,554 2. I. Ilisz, R. Berkecz, A. Péter, HPLC separation of amino acid enantiomers and small peptides on macrocyclic antibiotic-based chiral stationary phases: a review, J. Sep. Sci. 29 (2006) 1305. Impakt faktor: 2,535 3. R. Török, R. Berkecz, A. Péter, Enantioseparation of phenylalanine analogs on a quinine-based anion-exchanger chiral stationary phase: structure and temperature effects, J. Sep. Sci. 29 (2006) 2523. Impakt faktor: 2,535 4. I. Ilisz, R. Berkecz, A. Péter, Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review, J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (2008) 1. Impakt faktor: 2,629 5. Z. Pataj, I. Ilisz, R. Berkecz, A. Misicka, D. Tymecka, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter, Comparison of performance of Chirobiotic T, T2 and TAG columns in the separation of ß2- and ß3-amino acids, J. Sep. Sci. 31 (2008) 3688. Impakt faktor: 2,746 6. R. Berkecz, I. Ilisz, G. Benedek, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter, High-performance liquid chromatographic enantioseparation of 2-aminomono- and dihydroxycyclopentanecarboxylic and 2-aminodihydroxycyclohexanecarboxylic acids on macrocyclic glycopeptide-based phases, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 927. Impakt faktor: 3,756 7. I. Ilisz, R. Berkecz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter, The role of pi-acidic and pi-basic chiral stationary phases in the high-performance liquid chromatographic enantioseparation of unusual beta-amino acids, Chirality 21 (2009) 339. Impakt faktor: 2,212 8. I. Ilisz, R. Berkecz, A. Péter, Retention mechanism of high-performance liquid chromatographic enantioseparation on macrocyclic glycopeptide-based chiral stationary phases, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1845. Impakt faktor: 3,756 9. I. Ilisz,. G. Fodor, R. Berkecz, R. Iványi, L. Szente, A. Péter, Enantioseparation of beta-substituted tryptophan analogues with modified cyclodextrins by capillary zone electrophoresis, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 3360. Impakt faktor: 3,756

94

10. Z. Pataj, R. Berkecz, I. Ilisz, A. Misicka, D. Tymecka, F. Fülöp. W.D. Armstrong, A. Péter, High-performance liquid chromatographic chiral separation of ß

2-amino acids, Chirality 21 (2009) 787. Impakt faktor: 2,212 11. Z. Pataj, I. Ilisz, R. Berkecz, E. Forró, F. Fülöp, A. Péter Comparison of separation performances of amylose- and cellulose-based stationary phases in the high-performance liquid chromatographic enantioseparation of stereoisomers of beta-lactams, Chirality 22 (2010) 120. Impakt faktor: 2,212 12. I. Ilisz, Z. Pataj, R. Berkecz, A. Misicka, D. Tymecka, F. Fülöp. J.H. Choi, M.H. Hyun, A. Péter, High-performance liquid chromatographic enantioseparation of beta(2)-amino acids using a long-tethered (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid-based chiral stationary phase, J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 1075. Impakt faktor: 3,756 13 I. Ilisz, Z. Pataj, R. Berkecz, I. Szatmári, F. Fülöp, A. Péter High-performance liquid chromatographic enantioseparation of aminonaphthol analogs on polysaccharide-based chiral stationary phases, J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 2980. Impakt faktor: 3,756 Összes impakt faktor: 39,415

8.3. Poszterek

High-performance liquid chromatographic enantioseparation of aryl-substituted ß-lactams R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter 6th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods, 2005. Szeptember 7-9.,

Magyarország Siófok.

High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß-lactam and ß–amino acid stereoisomers R. Török, R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter 6th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods, 2005. Szeptember 7-9.,

Magyarország, Siófok.

High-performance liquid chromatographic enantioseparation of aryl-substituted ß-lactams on macrocyclic glycopeptide antibiotic-based columns R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter The 12

th Symposium on Analytical and Environmental Problems, 2005. Szeptember 26.,

Magyarország, Szeged.

High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß-lactam and ß–amino acid stereoisomers R. Török, R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter The 12

th Symposium on Analytical and Environmental Problems, 2005. Szeptember 26.,

Magyarország, Szeged.

95

High performance liquid chromatographic enantioseparation of aryl substituted ß-lactams R. Berkecz, I. Ilisz, E. Forró, F. Fülöp, D.W. Armstrong, A. Péter In Peptides 2006, Proceedings of the 29th European Peptide Symposium, eds.: K. Rolka, P. Rekowski, J. Silberring, KENES International, 2007 Svájc, Genf, 298. High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß3-amino acid stereoisomers on a (+)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid-based chiral stationary phase A. Péter, R. Berkecz, I. Ilisz, F. Fülöp, G. Hauspie, M.H. Hyun 31st International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC 2007., Belgium, Gent.

8.4. Előadások

High-performance liquid chromatographic enantioseparation of ß-amino acid stereoisomers on a crown-ether based chiral stationary phase Workshop on International Cooperation in Science & Technology between Flanders-

Hungary , 2006. október 20., Belgium, Brüsszel. Királis ß-aminosavak vizsgálata tömegspektrometriás módszerrel

A XXXIX. Kromatográfiás Továbbképző Tanfolyam, 2008. január 28., Magyarország, Szeged.

Királis ß3-aminosavak vizsgálata tömegspektrometriás módszerrel Ifjú Szerves Kémikusok Támogatásáért Alapítvány Előadóülése, 2008., Magyarország, Szeged.

96

9. Köszönetnyilvánítás

Hálásan köszönöm Péter Antal egyetemi tanárnak, hogy mind szakmailag mind

emberileg segítette és irányította munkámat. Köszönöm, hogy bármikor fordulhattam

hozzá segítségért és fáradtságot nem ismerve mindig rendelkezésemre állt.

Ezúton szeretném megköszönni Dr. Ilisz Istvánnak a munkámhoz nyújtott szakmai és

baráti segítségét.

Köszönettel tartozom Fülöp Ferenc egyetemi tanárnak, hogy szakmai támogatásával

segítette a doktori munkámat és segítségével eljuthattam Finnországba, ahol a kutatás

mellett megismerhettem Európa legszebb országát.

Dr. Janáky Tamásnak szeretném megköszönni, hogy támogatott és ösztönzött a

dolgozatom megírásában.

Köszönöm Halasiné Varga Ilona technikusnak a segítséget, amelyet kísérleti

munkámhoz adott.

Köszönöm kedvesemnek Kovács Líviának, hogy türelemmel viselte a dolgozatom

megírásának nehéz időszakát és mikor szükségem volt rá, akkor erőt adva bíztatott.

Legvégül, de nem utolsó sorban édesanyámnak, édesapámnak és nővéremnek

szeretném kifejezeni hálámat és csodálatomat, hogy erejük felett segítettek és támogattak,

hogy ez a dolgozat elkészüljön. Köszönöm.

97

10. Függelék

10.1. Néhány kiválasztott arilszubsztituált ß-laktám kromatogramja

1

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

2

-0.02

0.08

0.18

0.28

0.38

0.48

0.58

0.68

0.78

0.88

0.98

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

3

-0.02

0.08

0.18

0.28

0.38

0.48

0.58

0.68

0.78

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

4

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

5

-0.05

0.15

0.35

0.55

0.75

0.95

1.15

1.35

1.55

1.75

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

6

-0.05

0.05

0.15

0.25

0.35

0.45

0.55

0.65

0.75

0.85

0.95

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

7

-0.01

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5

t / min

A

Kromatográfiás körülmények: oszlop, TAG; eluens, 100% MeOH; detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet, 298 K.

Idő / perc Idő / perc

Idő / perc Idő / perc

Idő / perc Idő / perc

Idő / perc Idő / perc

Idő / perc

98

10.2. Néhány kiválasztott aril szubsztituált ß3-aminosav kromatogramja

14

-0,02

0,04

0,09

0,14

0,19

0,24

0,29

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Idő / perc

A

15

-0,02

0,08

0,18

0,28

0,38

0,48

0,58

0,68

0,78

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Idő / perc

A

16

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Idő / perc

A

17

-0,01

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Idő / perc

A

21

-0,01

0,09

0,19

0,29

0,39

0,49

0,59

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Idő (perc)

A

22

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Idő / perc

A

26

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Idő / perc

A

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 1; eluens, 16-17 H2O/MeOH=50/50 (v/v)+5 mM AcOH, 21-22, 26 H2O/MeOH=20/80 (v/v)+10 mM AcOH, detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1; hőmérséklet,

298 K.

99

10.3. Néhány kiválasztott aril szubsztituált ß2-aminosav kromatogramja

Kromatográfiás körülmények: oszlop, Korona 2; eluens, 45-46 H2O/MeOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4, 47-49, H2O/EtOH=80/20 (v/v)+10 mM H2SO4, detektálás, 210 nm; áramlási sebesség, 0,5 mL perc-1;

hőmérséklet, 280 K.