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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA:Bioquímica y Métodos

Diagnósticos

Directores:M.A. Pisarev (CNEA, UBA, CONICET) y R.S. Calandra (UNLP, CONICET)

Coordinadores: M.O. Suescun (UNLP, CONICET) y G. J. Juvenal (CNEA, CONICET)

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Los conceptos que se expresan en esta publicación son exclusiva responsabilidad de su autor y no involucran necesariamente el pensamiento del editor.

SEPARATA MONTPELLIERPublicada por Química Montpellier S.A.Virrey Liniers 673 - Buenos AiresDirector: Dr. Héctor Ascierto

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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos

Introducción

Con este tercer fascículo continúa la publicación de una serie que intenta abarcar los conceptos más actualizados acerca de la Fisiopatología Endocrinológica, en sus aspectos bioquímicos y diagnósticos. Esta Especialidad ha realizado avances notables, en función de los nuevos conocimientos que incluyen entre otros, la Bioquímica, la Biología Celular y Molecular y los Métodos Diagnósticos no invasivos.

Esta serie de fascículos está basada en la Maestría del mismo nombre que se dicta a nivel de postgrado. El creciente y constante interés y apoyo de numerosos colegas nos ha impulsado a emprender esta tarea, que no sería posible sin la invalorable colaboración de los numerosos co-autores, que son al mismo tiempo docentes de la Maestría.

Para la concreción de este esfuerzo ha sido de fundamental importancia el entusiasta apoyo que nos brindaron las autoridades de Química Montpellier S.A., sin cuya participación esta Obra no se habría concretado.

A todos ellos nuestro más sincero y profundo agradecimiento.

El presente trabajo no tendría sentido si no contáramos con la cálida recepción de nuestros colegas de las diferentes profesiones y estudiantes avanzados vinculados a la Endocrinología. Es a ellos a quienes está dedicada la misma.

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• Principios del Metabolismo Celular.

• Principios de Bioquímica y Genética Molecular en Eucariotes. Modelos Transgénicos.

• Bases de la Genética en Endocrinología. Genoma.

• Bases de la Inmunología en Endocrinología. Interacciones Inmuno-Endocrinas.

• Introducción a la Endocrinología. Estructura y Función de las Hormonas. Secreción,

Producción, Cinética y Transporte Hormonal. Cronobiología en Endocrinología.

• Hormonas. Mecanismos de acción hormonal. Evaluación de un sistema hormona-

receptor.

• Exploración de la Función endocrina. Tipos de Ensayos. Control de Calidad. Tests

Funcionales. Radioisótopos. Valores normales y Pruebas Funcionales.

• Hormonas Digestivas. Fisiopatología y Diagnóstico.

• Bases Moleculares de la Tumorigénesis. Oncogenes. Factores de Crecimiento.

• Neuroendocrinología. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Corteza Suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Metabolismo Hidrosalino. Hormonas: Hipotálamicas, Adrenal y

Cardiovasculares. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Médula suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Tiroides. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico

• Metabolismo del Calcio. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Función Reproductiva Femenina. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Menopausia y Climaterio. Riesgos, Complicaciones y Laboratorio.

• Función Reproductiva Masculina. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Biología de la Reproducción. Fertilización e Implantación. Reproducción Asistida. Unidad

Fetoplacentaria. Anticoncepción.

• Endocrinología Pediátrica. Desarrollo Normal. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Cánceres Hormonodependientes. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Páncreas Endocrino. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

• Trastornos de la Alimentación. Tejido Adiposo. Fisiopatología Hormonal. Obesidad, Anorexia

y Bulimia.

• Imágenes en el Diagnóstico de la Patología Endocrina.

Contenido de la Obra:


Fascículo III :

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*Conceptos elementales del uso de radioisótopos.

Mario Alberto Pisarev (CNEA; CONICET; Facultad de Medicina, UBA)

*Evaluación de la función endocrina.María Olga Suescun (IMBICE; Facultad de Ciencias Exactas, UNLP),

Silvia Inés Gonzalez Calvar (IBYME; Facultad de Medicina, UBA)

*Control de Calidad de los InmunoanálisisZulema Farinati, Silvia Quiroga, Martha Torres (CEMIC)

*Pruebas Funcionales y Valores Normales Laura E. Boero (Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA),

Cecilia A. Fenili (Lab. Bioanalítica), Sergio Damilano (Hospital Francés),

Mirta S. Gurfinkiel (Hospital Francés),

Alberto G. Del Río (Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA)



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Conceptos elementales del uso de radioisótopos

Mario Alberto Pisarev

Estructura del átomo

Un átomo está constituído por una masa central, el núcleo, rodeada por electrones orbitales. Estos últimos son partículas cargadas negativamente que se distribuyen en órbitas. Cada una de estas órbitas se caracteriza por poseer un nivel de energía característico. Los electrones ubicados en la órbita exterior se denominan electrones de valencia y determinan principalmente las propiedades químicas del átomo. Cuando un electrón cambia de órbita gana o pierde energía. Cuando un electrón sale de su órbita el «agujero» o espacio vacante es inmediatamente llenado por otro electrón que se origina en una órbita inmediata anterior, con la liberación de energía generalmente en forma de una radiación electromagnética (fotón). El electrón eyectado se denomina electrón Auger.

El núcleo está constituído por protones y neutrones, los primeros con carga positiva, en tanto que los neutrones no poseen carga. El número atómico (Z) está dado por el número de protones, en tanto que la suma de protones y neutrones constituye el número de masa (A). Los isótopos de un elemento tienen el mismo número atómico (= Z) y diferente número de masa (A). En los núcleos

con valores bajos de número atómico la cantidad de protones es igual a la de neutrones (relación n:p = 1). A medida que el número atómico aumenta la cantidad de neutrones en núcleos estables es mayor que la de protones (relación n:p > 1), y el átomo se convierte en inestable, emitiendo radiación de diferente energía.

Isótopos

Cuando un núcleo de alta masa se separa (fisiona) en dos partes se libera energía. Algunos elementos como el 235 U, 239 Pu , pueden fisionarse espontáneamente cuando absorben un neutrón de movimiento lento. Esto genera productos de fisión y energía. Esta última se libera primariamente como radiación γ.

Con la excepción del 209 Bi los núcleos con número atómico mayor de 82 son inestables, y algunos con un valor menor también lo son. Estos núcleos inestables sufren transiciones como la fisión o el decaimiento radiactivo, liberando energía. Las radiaciones que se generan pueden ser de tres

La Endocrinología ha sido una de las Especialidades que más precozmente se benefició por el uso de los radioisótopos en el diagnóstico y tratamiento de diferentes afecciones. Estas aplicaciones se basan en la propiedad de los radioisótopos de comportarse bioquímicamente igual que las moléculas no radiactivas, y al mismo tiempo de emitir radiaciones que pueden se detectadas por medios adecuados (utilidad diagnóstica) o que tienen efectos sobre los sistemas biológicos (acción terapéutica).



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tipos: α, β y/o γ. En general los isótopos radiactivos decaen liberando diferentes proporciones de estas radiaciones. En ocasiones además la desintegración radiactiva puede generar otros isótopos (el isótopo original se denomina «madre» y el que se genera de ella «hija»). Al atravesar la materia estas radiaciones interaccionan con sus átomos constituyentes, liberando electrones, vale decir, ionizándola. La capacidad o poder de ionización (ionización específica) se define como la cantidad de pares de iones que genera cada radiación en su trayecto. Vale decir la cantidad de pares de iones generados por cm de recorrido. Esto varía según se trate de aire o de tejidos biológicos. La transferencia linear de energía, LET (Linear Energy Transfer), es el promedio de la pérdida de energía por unidad de recorrido. Existe una relación inversa entre el alcance de una partícula (vale decir el trayecto que puede alcanzar hasta extinguirse o ser detenida) y su capacidad de ionización. Así, las partículas α tienen un alto poder de ionización y un bajo alcance (en tejidos biológicos alrededor de 10 μm). La radiación γ está en la situación opuesta: gran alcance (metros) y bajo poder de ionización, en tanto que la β posee características intermedias. La ionización específica y la LET no son constantes a lo largo del trayecto de una partícula monoenergética atravesando un medio homogéneo. A medida que la velocidad de la partícula disminuye la ionización específica aumenta, debido a que los átomos cercanos son influenciados por un período mayor de tiempo. Esta región de ionización específica aumentada se denomina «pico de Bragg».

Detección y Medición de las Radiaciones

La medición de la radiactividad se basa en las propiedades arriba mencionadas. En el caso de la radiación γ se aprovecha su largo alcance y la capacidad de atravesar diferentes tipos de materia (p.ej.: son detenidas por blindajes de plomo). Para detectarla y medirla se utilizan cámaras de ionización, que son instrumentos que tienen un tubo de vacío que contiene un gas inerte. Presentan dos electrodos, uno central al cilindro y el otro ubicado en las paredes del mismo. Merced a una corriente eléctrica se establece una diferencia de potencial entre ambos electrodos. Una ventana de mica o similar permite la entrada de las radiaciones. La interacción de una radiación γ determina un desequilibrio que se traduce por la alteración del potencial que es transmitido a un sistema

integrador que lo evidencia como una descarga («cuenta»). De esta forma se tiene una relación entre el número de desintegraciones (radiación γ en este caso) emitida por el radioisótopo y el número de cuentas. La relación entre el número absoluto de desintegraciones/minuto (dpm) y el número de cuentas/minuto (cpm) detectadas por el instrumento determina la eficiencia del mismo. La eficiencia depende, dentro de ciertos límites, de la diferencia de potencial aplicada a los electrodos. Existe un rango de desintegraciones/minuto (dpm) en el que hay una proporcionalidad con las cpm medidas. Pasado ese límite el instrumento se satura y la proporcionalidad se pierde (zona de parálisis).

Eficiencia = cpm x 100 dpm

En el caso de la radiación β, dado que es detenida por el vidrio en que está en solución, las mediciones se realizan en forma indirecta. La solución homogénea conteniendo el emisor β beta a medir, se mezcla con un líquido que contiene material que emite una radiación fluorescente secundaria a la interacción de la radiación β con el mismo. Esta fluorescencia puede ser detectada y constituye el fundamento del contador de centelleo líquido. La solución del emisor con el líquido centelleador debe ser totalmente traslúcida, pues en caso contrario se absorbe la radiación secundaria y disminuye o se altera la eficiencia del contaje («quenching»).

Conociendo la eficiencia del equipo de medición en uso es posible calcular la actividad absoluta (dpm) del radioisótopo.

En general en Medicina y Bioquímica se utilizan para las determinaciones “in vitro” o estudios “in vivo”, los isótopos que emiten radiación γ gamma y/o β.

Características y propiedades de los radioisótopos

El tiempo que demora un radioisótopo en desintegrarse a la mitad de su valor a tiempo inicial se denomina vida media (T1/2). Esta es variable para cada radionucleído, algunos tienen T1/2 muy

cortos, del orden de minutos (18 F), otros de días 131 I) o aún de años (14 C). La cantidad de material radiactivo presente en una muestra se ha definido en las siguientes unidades:

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Curie (Ci): es igual a 2.2 x 1012 dpm. Sus sub-ubnidades son el milicurie (mCi) y el microcurie (μCi).

Para la medición de los efectos de las radiaciones se han establecido unidades de dosimetría: La unidad es el Rad que es la cantidad de radiación que determina la absorción de una energía de 100 ergios por gramo de material. Otra unidad es el Gray (Gy) que es igual a 100 rads.

Otros Métodos de Detección de las Radiaciones

Además de los métodos de medición ya mencionados existen otras formas de detección que pueden ser semi o no cuantitativas. Se han desarrollado dosímetros químicos y luminiscentes. En el caso de estos últimos se basan en el uso de fluoruro de litio que tiene un coeficiente de absorción similar al de los tejidos biológicos, emitiendo luz cuya intensidad puede medirse. Se utiliza en dosimetría en el curso de radioterapia. En el caso de los detectores químicos se basan en el uso de un detector férrico/ferroso que se oxida por acción de la radiación y la cantidad de iones férricos generados se mide por espectrofotometría ultravioleta.

Las películas radiográficas precipitan las sales de plata en forma proporcional a la cantidad de radiación recibida y constituyen la base de los «films-monitores» usados en la dosimetría del personal que trabaja con material radiante. Además, cuando el film es de una sensibilidad mayor se utiliza para determinar la distribución de radiactividad en muestras biológicas macro o microscópicas (autorradiografía).

Uso de Moléculas Radiactivas en Biología y Medicina

Si bien el uso de los radioisótopos se basa en que su comportamiento es igual al del elemento no radiactivo deben tenerse en cuenta una serie de factores.

Existe una relación, para cada muestra o preparación de un radioisótopo, entre el número de moléculas radiactivas y el de las no radiactivas presentes en la misma. A esta relación se la denomina actividad específica. Para que el material radiactivo pueda ser detectado en una muestra debe superar el límite inferior de sensibilidad

del equipo de medición y la radiactividad ambiente («fondo» ó «background»). Pero al mismo tiempo no se puede introducir en un sistema biológico una muestra radiactiva cuya masa de material no radiactivo supere las concentraciones fisiológicas del mismo. Es por lo tanto importante utilizar trazadores con una actividad específica adecuada.

Dado que los radioisótopos se comportan bioquímicamente igual que sus congéneres no radiactivos, se los ha utilizado para estudiar su metabolismo. Para estos fines, se debe considerar si se utiliza un material inorgánico (sales de un determinado isótopo, p.ej. 131INa) u orgánico (moléculas de mayor complejidad: aminoácidos, proteínas, lípidos). En este último caso la introducción del radioisótopo a la molécula puede realizarse por sustitución (cambio de un C o H no radiactivo por su similar radiactivo) o por adición (agregado de un átomo radiactivo a una molécula que normalmente no la contiene (por ejemplo adición de un átomo de iodo radiactivo a una hormona proteica que normalmente no es iodada). Para poder confiar en la información que se obtendrá en éste último caso debe asegurarse primero que el comportamiento biológico de la molécula «marcada» es aceptablemente similar a la de su congénere natural (no radiactiva).

Cuando se introduce una molécula radiactiva en un sistema biológico ésta se mezcla en forma homogénea con sus similares no radiactivas. En el caso de los estudios «in vitro» esto se realiza casi instantáneamente. En cambio cuando se trata de estudios «in vivo» existe un tiempo que demora en establecerse esta homogeinización, que se denomina tiempo de equilibrio. Cuando la molécula en cuestión se distribuye en por lo menos dos compartimientos biológicos (por ejemplo, sangre y algún tejido u órgano) una vez logrado el equilibrio existe una relación proporcional entre la actividad específica de la molécula en el primer compartimiento (sangre) y en el segundo (tejido u órgano):

μCi sangre = μCi tejido

mg mg

Este es el principio en que se basa el análisis por dilución isotópìca. Si por ejemplo para una molécula determinada se puede determinar su actividad específica en sangre y medir la concentración de radiactividad en el tejido en cuestión, se puede calcular la cantidad total de molécula no radiactiva presente en el mismo.

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Efectos biológicos de las radiaciones

Los efectos de las radiaciones sobre los sistemas biológicos son debidos a su capacidad de generar ionización o radicales libres de las moléculas que los

componen. La radiación γ gamma o X (bajo LET) generan daño tisular por radicales libres, en tanto que las de alto LET (protones, partículas alfa) inducen ionización. Los radicales libres se caracterizan por presentar un electrón no apareado y su generación aumenta en presencia de oxígeno. La energía liberada por ionización es suficiente para romper uniones químicas.

Las acciones biológicas de las radiaciones se ejercen sobre las diferentes estructuras celulares: núcleo, membranas, etc. El daño inducido puede ser letal: muerte celular, o subletal. En éste último caso, se puede alterar la estrucutura del ADN por rupturas de cadena simple o doble, lo que pone en juego los mecanismos de reparación. Para que ésto

tenga lugar se detiene el ciclo celular y se repara el daño. En ocasiones falla este proceso y se produce una reparación errónea, dando lugar a mutaciones, deleciones, sustituciones o recombinaciones alteradas, base de la acción carcinogénica y mutagénica de las radiaciones.

No todos los tejidos presentan la misma radiosensibilidad. Aquellos con activa proliferación o menor grado de diferenciación son más radiosen-sibles, como la médula ósea, tracto gastrointestinal, gonadas. Además hay variaciones en la radiosensi-bilidad entre diferentes especies (Tabla 1). El tipo de daño depende también de la dosis de radiación administrada. Existen mecanismos iintracelulares que modulan la mayor o menor radiosensibilidad (señales de transducción a través de nucleótidos cíclicos, ceramida), así como fármacos capaces de tener el mismo efecto por sus acciones sobre los mecanismos intracelulares: fármacos radioprotectores o radiosensibilizadores. Existen además compuestos que reproducen los efectos de las radiaciones: compuestos radiomiméticos.

Tabla 1. Dosis letal 50 (DL50) de diferentes especies animales*

Especie DL50 (Rads)

Hombre 250

Rata 900

Ratón 900

Cerdo 200

Oveja 150

Perro 260

Conejo 850

Criceto 900

Mono 400

Cobayo 250

Burro 150

* según Prasad (ob.cit) con modificaciones.

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Aplicaciones de los Radioisóto-pos en Bioquímica y Medicina

La introducción de los radioisótopos significó en su momento un avance que revolucionó el diagnóstico y la terapia. En el campo de la Endocrinología el desarrollo del radioinmunoanálisis (RIA) permitió dosar, en fluidos biológicos, hormonas y compuestos relacionados que, por su muy baja concentración, no eran detectables con las técnicas bioquímicas clásicas. Por otra parte, los estudios de Medicina Nuclear permitieron la posibilidad de realizar diagnósticos anatómicos y funcionales (p.ej.: centelleografía tiroidea) así como el uso de los radioisótopos con fines terapéuticos (p.ej.: tratamiento del Hipertiroidismo y del Cáncer diferenciado de tiroides con iodo radiactivo). Finalmente, a nivel experimental el uso de los radioisótopos dio lugar a considerables progresos en el conocimiento de las vías metabólicas y su regulación. Además, mediante el uso de moléculas marcadas ha sido posible determinar la producción diaria, secreción, metabolismo y degradación de numerosas hormonas.

Bibliografía

1. Prasad K.N.: Handbook of Radiobiology, 2nd. Edition. CRC Press, New York, 1995

2. Hall E.J.: Radiobiology for the radiologist, JB Lippincott Co, Philadelphia, 1994.

3. Tubiana M, Dutreix J, Wambersie A: Introduction to Radiobiology, Taylor & Francis, London, 1990.

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INTRODUCCIÓN

El desarrollo de la Bioquímica Clínica está íntimamente ligado al perfeccionamiento continuo de las técnicas experimentales.Históricamente, la cuantificación en las determinaciones del laboratorio clínico comenzó a principios del siglo XX. El gran desarrollo del equipamiento de laboratorio así como el de métodos más sensibles y específicos, principalmente con la incorporación de compuestos radioactivos y técnicas inmunológicas y de biología molecular, ha permitido avanzar en la detección temprana y el seguimiento de un gran número de patologías. En esta Sección se hará un resumen de los principales métodos empleados en la valoración del laboratorio endocrino.

El primer concepto a considerar cuando se intenta evaluar los niveles hormonales es analizar cuál es la naturaleza química y la concentración de la hormona en estudio. Las hormonas presentan estructuras químicas muy diferentes: pueden ser aminoácidos, aminas, estructuras cíclicas, polipép-tidos, proteínas. Por otro lado, el rango de concentra-ciones varía ampliamente dependiendo del fluido o tejido a analizar. Así, el método de elección será aquel que contemple ambos factores, pero además debe ser preciso, exacto, específico y sensible. Los métodos de determinación se pueden clasificar en:

a) Químicos: son aquellas técnicas que se basan en la determinación colorimétrica o fluorimétrica de los analitos. Los métodos colorimétricos se emplean para la evaluación de compuestos en

fluidos biológicos que se encuentran en el rango de los mg. En cambio, los métodos fluorimétricos son más sensibles y pueden ser utilizados en la detección de compuestos que se encuentran en el rango de los μg.

b) Físicos: donde se incluye a una extensa variedad de métodos cromatográficos, y permite la valoración de compuestos presentes en bajas concentraciones (ng/ml - pg/ml).

c) Inmunológicos o inmunoensayos: actual-mente es la metodología más ampliamente utilizada debido a su gran sensibilidad y practicidad.

d) Biológicos o bioensayos: los cuales evalúan la actividad biológica de una hormona.

En la medida que se ha podido disponer de ins-trumental analítico más sensible, se han desarro-llado un mayor número de técnicas. Así, es común encontrar que un determinado analito puede ser evaluado por varias metodologías, cada una de ellas limitada por su especificidad, sensibilidad, reprodu-cibilidad, exactitud, enfoque práctico y costo. Además, es interesante observar que este avance en las determinaciones analíticas se ha logrado por una combinación de distintas técnicas básicas. Como ejemplo, podemos citar la combinación de métodos inmunológicos y colorimétricos logrado en el ensayo de ELISA, como se describirá más adelante.

Exploración de la Función Endocrina.

Tipos de EnsayosMaría Olga Suescun, Silvia Inés Gonzalez Calvar

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Ensayos en plasma y orina

Los ensayos hormonales en sangre (suero o plasma), indican el nivel de la hormona en el momento de la toma de muestra. Esta medición puede ser representativa del estado hormonal para hormonas con una vida media larga, cuyos niveles no cambian rápidamente (por ej., tiroxina), pero no para hormonas con una vida media muy corta, como adrenalina o cortisol. Los ensayos realizados en orina, ya sea de una muestra al azar o de recolección de 24 horas, reflejan además, el filtrado renal de la hormona. Las mediciones hormonales urinarias se utilizaron más frecuentemente en el pasado, principalmente debido a la cantidad de hormona que podía ser obtenida. Sin embargo, con la alta sensibilidad de los ensayos inmunológicos actuales, habitualmente se prefieren las determinaciones en muestras sanguíneas, salvo situaciones particulares que se describirán en cada una de las patologías.

Métodos Químicos

Todas las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas de una frecuencia o de un intervalo de frecuencias característico de cada molécula. La utilidad de la absorción de la radiación electromagnética en química analítica se basa en esta capacidad y en la relación que existe entre el número de moléculas capaces de absorber y la canti-dad de energía absorbida por ellas. En espectros-copia de absorción molecular (espectrofotometría) se puede emplear cualquier longitud de onda del espectro electromagnético, pero las que se utilizan con más frecuencia en el laboratorio clínico son las de las regiones visible y ultravioleta.

Por otro lado, si la absorción de una radiación luminosa de determinada longitud de onda, es capaz de producir una excitación electrónica en la molécula, puede producirse el fenómeno de fluorescencia o emisión de luz de una frecuencia distinta a la luz incidente. La intensidad de la luz emitida será proporcional al número de moléculas excitadas.

Las determinaciones espectrofotométricas han permitido la determinación cuantitativa de un número importante de compuestos. Esta técnica ha sido utilizada desde hace años por ser de fácil manejo y bajo costo. Así, mediante este tipo de metodología se ha podido evaluar una gran variedad de hormonas y sus metabolitos, de las cuales sólo describiremos algunas de ellas a modo de ejemplo.

Los 17-ceto-esteroides urinarios conforman un grupo de metabolitos secretados principalmente por la glándula suprarrenal, y además por los testículos y en cierta proporción por el ovario. Dentro de este grupo de compuestos se incluyen a la epiandros-terona, etiocolanolona, dehidroepiandrosterona, 11-ceto y 11-hidroxi androsterona, 11-ceto y 11-hidroxi etiocolanolona. La determinación de los 17-ceto-esteroides se realiza con el propósito de evaluar la producción de andrógenos suprarrenales. Sin embargo, no todos los 17-ceto-esteroides son andrógenos y no todos los andrógenos son 17-ceto-esteroides. De todas maneras, esta determinación resulta útil en el diagnóstico de ciertas patologías de los ejes suprarrenal y gonadal.

La determinación de 17-ceto-esteroides se realiza por la reacción de Zimmerman. Para ello, se realiza

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una hidrólisis ácida de los productos conjugados antes de la extracción y reacción con meta-dinitro-benceno en medio alcalino alcohólico, para obtener un producto rojizo que se detecta espectrofoto-métricamente a 530 nm. Los 17-ceto-esteroides neutros y los 17-ceto-génicoesteroides también pueden evaluarse por esta técnica previa oxidación con bismutato de sodio.

Otra reacción colorimétrica que se realiza habitualmente es la determinación de 17-hidroxicor-ticosteroides. Este grupo de metabolitos están aumentados en el Síndrome de Cushing y disminui-dos en la Insuficiencia Suprarrenal Primaria o Secundaria. Son excretados en orina, en general, en el rango de 3-8 mg/día en su mayor parte como derivados glucuronidados. Por lo tanto, para proceder a su evaluación se debe realizar, previamente, una hidrólisis con beta-glucuronidasa y luego extraer los 17-hidroxicorticosteroides con cloruro de metileno. Esta fase orgánica es lavada con medio alcalino y agua y luego se desarrolla la reacción de color (cromógenos de Porter-Silber) utilizando clorhidrato de fenilahidrazina como sustrato. El producto formado debe ser extraído a una solución acuosa, donde se mide la absorbancia a 410 nm.

Los métodos colorimétricos han sido también utilizados para evaluar ciertos marcadores de la resorción ósea, como por ej. hidroxiprolina. Este metabolito es un producto post-transduccional de la hidroxilación de prolina-catalizada por la enzima prolilhidroxilasa y se encuentra normalmente en orina en concentración menor a 1,3 mg%. Se considera que este amino ácido está presente casi exclusivamente en las fibras de colágeno del tejido conectivo. Por lo tanto, el metabolismo del colágeno y su regulación es estudiado convenientemente midiendo los niveles de hidroxiprolina en un número de situaciones clínicas tales como invasión tumoral (Metástasis), Artritis Reumatoidea, Diabetes Mellitus, Distrofia Muscular y Ulceras Crónicas. La determi-nación de hidroxiprolina en varios tejidos, plasma y orina, es posible por métodos colorimétricos, cromatografía líquida de alta presión y resolución (HPLC), cromatografía gaseosa / espectrometría de masa. Todos los métodos tienen en común la hidrólisis de la muestra con ácidos o bases fuertes

y la detección del imino ácido libre por métodos colorimétricos, fluorimétricos o HPLC. Los diversos procedimientos de ensayos para la hidroxiprolina presentan diferente especificidad y sensibilidad. En general, la mayoría de los procedimientos son laboriosos e involucran variados y prolongados pasos. La técnica colorimétrica para medir hidroxi-prolina se basa en la oxidación con cloramina T en medio alcalino y posterior tratamiento con calor. El pirrol obtenido puede reaccionar con el reactivo de Erlich para dar un compuesto que se detecta a 560 nm. Si bien en la actualidad se dispone de técnicas más sensibles y precisas para detectar otros marcadores de resorción ósea más específicos, la determinación de hidroxiprolina aún se sigue usando por ser un método de muy bajo costo.

Otro ejemplo, interesante es la determinación de cortisol que puede ser evaluado por diferentes técnicas que abarcan desde las colorimétricas, como el ensayo de cromógenos de Porter-Silber, hasta las fluorimétricas e inmunológicas, siendo ésta última la más sensible y utilizada en la actualidad. El análisis fluorimétrico del cortisol sérico consiste en la extracción del suero mediante diclorometano, y luego de la adición de una mezcla de ácido sulfúrico y etanol se determina la fluorescencia.

Otra serie de compuestos que pueden ser eva-luados por métodos colorimétricas son los metabolitos de la catecolaminas, es decir metanefrinas y acido vainillin mandelico (AVM). Por ello, en el diagnóstico de tumores productores de catecolaminas es habitual evaluar estos compuestos en orina. En particular, el AVM, presenta una excreción menor a 10 mg diarios y puede cuantificarse espectrofotométricamente por el método de Pissano mediante su oxidación a vainillina con periodato bajo condiciones alcalinas. Este compuesto tiene una absorbancia máxima a 360 nm. En general, es conveniente eliminar previamente ciertas interferencias por tratamiento con resinas de intercambio aniónicas. Sin embargo, dada su mayor sensibilidad, el método de elección para la medición de adrenalina y noradrenalina es el método fluorimétrico. La extracción de las catecolaminas se puede realizar mediante adsorción en columna de alúmina y luego estos compuestos pueden oxidarse a adrenocromos los que se convierten en lutinas fluorescentes por acción de un álcali fuerte.

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Métodos Físicos

La cromatografía es un método físico de separa-ción de compuestos que resulta ser muy versátil y poderoso en el aislamiento y cuantificación de muchos analitos clínicamente relevantes.La cromato-grafía abarca distintos mecanismos de separación entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (sólida o líquida), mientras que la otra (gaseosa o líquida) se mueve en una dirección determinada. Así, se han desarrollado la cromatografía de adsorción, afinidad, intercambio iónico, de partición, cromato-grafía de alta presión y resolución (HPLC), aparea-miento de iones, exclusión o filtración por geles, etc.

La separación de compuestos por cromatografía de adsorción se basa en las interacciones electros-táticas entre una molécula y el adsorbente. Este tipo de cromatografía puede ser gaseosa o líquida según la fase móvil. Su principal desventaja es la dificultad de obtener un soporte con una distribución homo-génea de los sitios de adsorción. Consecuentemente, estos problemas técnicos asociados con la reproduci-bilidad de los resultados han limitado su aplicación clínica. Sin embargo, puede ser ventajosa para separar esteroides antes de realizar un inmuno-ensayo si sólo se dispone de anticuerpos con una reactividad cruzada inaceptable.

La cromatografía de exclusión estérica o cromatografía de filtración por geles separa solutos en base a sus pesos moleculares. Además de su aplicación preparativa, esta técnica se ha usado en el laboratorio clínico para determinar los pesos moleculares de macromoléculas y eliminar las sales de bajo peso molecular de soluciones proteicas.

La cromatografía de afinidad se define como una técnica de cromatografía líquida que utiliza una interacción biológica para la separación y análisis de analitos específicos dentro de una muestra. Ejemplos de estas interacciones incluyen la unión de una enzima con un inhibidor o de un anticuerpo con su antígeno. Así, se debe disponer de un ligando que selectivamente interactúe con el analito deseado. Este ligando deberá estar unido covalente-mente a un soporte sólido dentro de una columna. El ligando inmovilizado es el punto clave que determina el éxito de cualquier cromatografía de afinidad. Un ligando muy selectivo lo constituyen las lectinas, las cuales forman un grupo de proteínas que poseen la habilidad de reaccionar con residuos azúcares específicos, permitiendo el fraccionamiento de glicoproteínas en función del tipo y número del residuo hidrocarbonado. Las lectinas más comun-mente utilizadas en cromatografías de afinidad son la concanavalina A, que une residuos de alfa-D-

manosa y alfa-D-glucosa, y la aglutinina de germen de trigo que une residuos de D-N-acetil-glucosamina. Las hormonas proteicas (ej. LH, TSH), son glicopro-teínas que se presentan en una variedad de isoformas que difieren, precisamente, en la porción glucídica. Estas diferentes isoformas pueden presentar distinta bioactividad y tasa metabólica y es por ello que resulta interesante el análisis de la microheterogeneidad molecular en distintas situaciones hormonales fisio y/o patológicas. La cromatografía de afinidad con lectinas inmovilizadas, como la Concanavalina A, resulta una técnica muy útil para separar las diferentes isoformas de hormonas tales como FSH, LH, PRL. También, una combinación de columnas de concanavalina A y aglutinina de germen de trigo se han utilizado para caracterizar los cambios de la porción hidrocar-bonada de la fosfatasa ácida prostática humana en el Cáncer de Próstata.

Los métodos de cromatografía de afinidad que usan ácido borónico o boronatos como ligandos son un grupo de técnicas cromatográficas que han sido usadas exitosamente con muestras clínicas. La cromatografía de afinidad con boronatos incluye una de las más viejas aplicaciones cuantitativas de la cromatografía de afinidad al laboratorio clínico, esto es, la determinación de glicohemoglobinas para la evaluación a largo plazo de la Diabetes Mellitus. A un pH por encima de 8, todos los boronatos forman un enlace covalente con compuestos que contienen cis-dioles en su estructura. Dado que los azúcares, tales como glucosa, poseen grupos cis-dioles, los boronatos son útiles para resolver glicoproteinas (por ej la glicohemoglobina (HbA1c) de proteínas no-glicadas (por ej. Hemoglobina A (HbA)). Cuando se pasa por una columna de boronato una lisado de glóbulos rojos, la Hb A1c queda retenida y luego es eluída por desplazamiento con sorbitol. Desde el punto de vista metodológico presenta una enorme ventaja, debido a que no es necesario que el paciente esté en ayunas o bien si previamente recibió una dosis de insulina, ya que no depende de la concentración de glucosa circulante en el momento de la determinación.

La HbA1c también puede ser cuantificada por cromatografia de intercambio iónico. En este tipo de cromatografía los solutos se separan por su diferencia en el tipo y magnitud de la carga iónica. Los compuestos retenidos pueden ser eluídos por variación del pH o bien de la fuerza iónica de la fase móvil. Actualmente se dispone comercialmente de una gran variedad de resinas intercambiadoras catiónicas y aniónicas.

La cromatografía líquida comprende un grupo

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de técnicas de gran importancia en el laboratorio clínico moderno. En los últimos años la técnica de preferencia para separar y cuantificar hormonas ha sido la HPLC. Muchos soportes sólidos o fases estacionarias se han desarrollados para esta metodología. La recuperación de los analitos es alta y la reproducibilidad y resolución son mejores que con otras técnicas cromatográficas como las de papel o geles. Las formas más comunes de cromatografía líquida incluyen la cromatografía en fase reversa y fase normal, de exclusión molecular, intercambio

iónico y la cromatografia de afinidad. Desde el desarrollo de la HPLC, la determinación

de catecolaminas por los métodos colorimétricos o fluorimétricos se han convertido en obsoletos. Inclusive el método de radiotrazador, a pesar de haber contribuido ampliamente al conocimiento de la función simpatomedular, debido a que insume mucho tiempo, es de alto costo y baja sensibilidad, ha sido desplazado por la técnica de HPLC. La misma permite la separación de las catecolaminas y sus metabolitos utilizando columnas de fase reversa. Este sistema depende de la partición de los analitos entre una fase estacionaria no-polar, hidrofóbica y una fase móvil acuosa que contiene una determinada proporción de un solvente orgánico como metanol, acetonitrilo o propanol. En el caso de las cateco-laminas se requiere la purificación previa de la muestra por adsorción en alúmina para lograr una adecuada sensibilidad. La detección es electro-química y se basa en la óxido-reducción reversible del grupo catecol, lo cual genera una corriente eléctrica que puede ser detectada. Por esta metodología se pueden medir, además de catecolaminas, todos sus metabolitos variando la fase móvil y las condiciones de detección.

La cromatografia de apareamiento de iones es usada en separaciones de compuestos de bajo peso molecular con una carga neta. En este sistema se agrega un contraión a la fase móvil. Así, el analito y el contraión forman un complejo que se particiona entre la fase móvil y la estacionaria. Con esta técnica se han podido determinar esteroides y péptidos.

La necesidad de realizar diagnósticos urgentes ha llevado al desarrollo de análisis automáticos que pueden ser completados en un breve tiempo y a un costo razonable. Uno de tales métodos es la electro-foresis capilar por inmunoafinidad. Esta tecnología emergente es un híbrido de 2 poderosas técnicas acopladas permitiendo una determinación rápida y directa de los analitos presentes en fluidos biológicos. La primera técnica, la inmunoafinidad, permite la extracción selectiva de moléculas presentes en matriz

compleja, utilizando un dispositivo con forma de cámara en microescala. El analito a determinar es capturado por un anticuerpo específico inmovilizado a través de su unión a un soporte sólido (esferas de vidrio o alguna estructura porosa apropiada) de una microcámara. La segunda técnica, la electroforesis capilar, es usada para la separación analítica de alta resolución eluyendo de la microcámara los analitos a ser determinados. Con esta técnica, se ha podido evaluar la hormona o factor liberador de gonado-trofinas inmunoreactiva (GnRH).

Con el propósito de lograr separaciones y caracterizaciones más versátiles se han desarrollado técnicas donde se acopla un método separativo, como puede ser la cromatografía gaseosa, electro-foresis capilar o HPLC, a un espectrómetro de masas. Este ultimo, es un instrumento analítico que primero ioniza grandes moléculas y luego las separa y evalúa la masa del ión y sus fragmentos. Esta poderosa herramienta se ha utilizado en la separación y carac-terización de hormonas peptídicas y componentes urinarios.

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INMUNOENSAYOS

Los Inmunoensayos son métodos que evalúan la concentración de un analito basados funda-mentalmente en la alta afinidad y especificidad de la reacción de reconocimiento entre el anticuerpo y un determinante antigénico de dicho analito.

Introducción

Los inmunoensayos revolucionaron la rutina clínica en numerosas áreas, particularmente en la Endocrinología. Dichas técnicas inmunológicas permiten evaluar un gran número de sustancias provenientes de diferentes muestras: suero, plasma, orina, saliva, heces, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, etc. La gran variabilidad en la producción de anticuerpos y la capacidad de los anticuerpos para unir diferentes epitopes de los antígenos, con alta afinidad y especificidad, posibilita su uso en determinaciones analíticas de numerosos compuestos y en particular de las hormonas. Los inmunoensayos pueden considerarse como ensayos con especificidad estructural, a diferencia de los bioensayos que evalúan la actividad biológica de las hormonas. Pese a que el ensayo ideal para una hormona debería ser la cuantificación de la respuesta fisiológica final de su acción en un órgano blanco, en general, este tipo de ensayos son más laboriosos, caros y consumen más tiempo, lo que constituye un inconveniente para ser adaptados al diagnóstico en el análisis de rutina.

La utilización de moléculas marcadas en uno de los componentes de la reacción inmunológica permite un monitoreo de la unión, más fácil y más sensible. Al respecto, el advenimiento de las marcas radioactivas con su potente sensibilidad tuvo un impacto enorme en la evolución de los inmuno-ensayos. El desarrollo simultáneo de instrumentos automatizados para detectar la radioactividad ofreció un método confiable y sencillo para el diagnóstico clínico que rápidamente reemplazó a los bioensayos utilizados con anterioridad. Si bien algunas desventajas inherentes a la radiactividad promovieron la investigación hacia marcas alternativas no radioactivas, las técnicas isotópicas conservan su importancia hasta la actualidad, fundamentalmente en el área de investigación y como ensayos de referencia, por un número de ventajas incuestionables como la detección bien definida, sensible y no susceptible a interferencias en la muestra.

Durante las décadas de los años 60 y 70 se desarrollaron ampliamente los ensayos de unión al ligando, competitivos o de saturación. Esta primera generación de métodos competitivos radioisotópicos culminó con los trabajos de Berson y Yallow que desarrollaron el radioinmunoanálisis (RIA) para insulina utilizando la hormona marcada con I125 como trazador y un anticuerpo (Ac) anti-insulina como ligando. Su utilización fue rápida-mente aplicada a otras hormonas revolucionando el diagnóstico de los desórdenes endócrinos. Casi simultáneamente Ekins, desarrolló el método de competición proteica para tiroxina sérica (T4), utilizando la proteína transportadora para hormonas tiroideas (TBG) en lugar de un Ac. Ambos tipos de ensayos pertenecen al tipo de análisis por saturación donde el compuesto que se desea determinar satura progresivamente al ligando. Al respecto, los ensayos de radioreceptor descriptos inicialmente para evaluar la concentración de ACTH en los años 70, se basaron en un análisis muy similar, en cuyo caso el ligando es un receptor hormonal específico.

Los ensayos competitivos fueron sucedidos por los no competitivos o inmunométricos, descriptos por Miles y Hales en 1968, aunque no fueron adoptados masivamente hasta mediados de 1970 cuando se implementó la tecnología de tubo recubierto y se desarrollaron los anticuerpos mono-clonales.Posteriormente, la utilización de marcas no isotópicas (enzimáticas, fluorescentes y quimiolumi-niscentes) de alta actividad específica, aumentó la sensibilidad de los mismos. Por consiguiente, se logró mejorar y diversificar los inmunoensayos. Además se implementaron otras tecnologías como los ensayos homogéneos, que evitan la separación de las fracciones unida y libre.

A mediados de los años 80 se diseñaron los ensayos fluorométricos a tiempo resuelto, ultrasen-sibles, denominados DELFIA (Dissociation-Enhanced Lanthanide FluoroImmunoAssay). A partir de ese momento, la mayoría de los kits comerciales adoptaron esas tecnologías que fueron el punto de partida para la automatización o semiautomatización con intervalos de tiempo menores para completar las reacciones. También se desarrollaron técnicas combinadas mucho más rápidas y más sensibles aún, de tercera y cuarta generación como la electroqui-mioluminiscencia (ECLIA).

Actualmente los ensayos miniaturizados con numerosas determinaciones simultáneas como la tecnología de microordenamientos (microarray) están en pleno desarrollo.

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Diseño y clasificación de los In-munoensayos

En los inmunoensayos es fundamental considerar las características de la reacción antígeno-anticuerpo y los requisitos que debe cumplir la hormona a medir. Esta deberá ser antigénica, induciendo la formación de anticuerpos, los cuales deben reaccionar específicamente con el antígeno u hormona que indujo su formación en una reacción saturable y reversible. Por consiguiente, para cada ensayo, se puede plantear la reacción de equilibrio: (Ac) + (Ag) (AgAc), donde (Ac) es la concentración molar del anticuerpo y (Ag) es la concentración molar del antígeno (hormona marcada, hormona

presente en la muestra u hormona estándard). Esta reacción responde a la ley de acción de masas: Ka = (AcAg)/ (Ac) (Ag). La constante Ka es una medida de la afinidad del anticuerpo por el antígeno y ella determina la cantidad de complejo (AgAc) que se forma en el equilibrio, para una concentración inicial de (Ag) y (Ac). Es claro entonces, que los inmuno-ensayos dependen de la cantidad de sitios del anticuerpo ocupados por el antígeno, es decir de la “fracción de ocupación” del anticuerpo.

De acuerdo al diseño aplicado para medir la fracción de ocupación del anticuerpo los Inmunoensayos se clasifican en :A) Competitivos y B) No competitivos.

Figura 1

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A) Ensayos Competitivos: En estos ensayos conocidos como Inmunoanálisis, se miden los sitios del anticuerpo sin ocupar, es decir sitios libres del analito; y por lo tanto los sitios ocupados por la hormona son calculados implícitamente. Los sitios del anticuerpo no ocupados se evidencian por unir la misma hormona marcada, o en ciertos casos utili-zando anticuerpos antiidiotipos (Figura 1). Se esta-blece una competencia entre una cantidad trazadora de la hormona marcada y la hormona “fría” (no marcada) presente en la muestra, por un número limitado de sitios de unión al anticuerpo. En este tipo de ensayos, el anticuerpo está siempre en defecto y para obtener una sensibilidad máxima la concentración del anticuerpo debe tender a cero; por consiguiente, una parte de la hormona en la muestra permanece siempre sin reaccionar. (Figura 1).

B) Ensayos No Competitivos o Inmuno-métricos: En estos ensayos se miden directamente los sitios del anticuerpo que están ocupados por la hormona, y se utilizan concentraciones relativamente grandes del anticuerpo. Inicialmente los ensayos no competitivos fueron de un solo sitio. Sin embargo, para evaluar la fracción ocupada del anticuerpo,

generalmente se utiliza un segundo anticuerpo, que también tiene alta afinidad por la hormona, pero está dirigido contra un epitope diferente del que une el primer anticuerpo. En la mayoría de los ensayos no competitivos el reactivo que se marca es el anticuerpo y se forma un “sandwich” entre la hormona y los dos anticuerpos. Los ensayos “sandwich” de dos sitios requieren la reacción simultánea de todo el analito disponible con el anticuerpo marcado y con un exceso de un segundo anticuerpo no marcado. Estos ensayos se denominan inmunométricos porque reacciona toda la hormona presente en la muestra. (Figura 1)

Las condiciones óptimas para un ensayo inmunométrico son diferentes de las de los ensayos competitivos. La máxima sensibilidad se alcanza con altas concentraciones de anticuerpo, es decir cuando el mismo tiende a infinito. La ventaja de los ensayos inmunométricos, con exceso de anticuerpo, es que los errores del pipeteo no son críticos y que la reacción puede completarse en tiempos menores.

Por otra parte los inmunoensayos pueden clasificarse en Heterogéneos y Homogéneos según requieran o no separación de las fracciones de hormona libre y unida.

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Técnicas de separación:

Todos los ensayos heterogéneos requieren una correcta separación entre la fracción unida y libre. Los métodos de separación se basan en las diferencias físico-químicas e inmunológicas existentes entre el antígeno y el complejo antígeno-anticuerpo. Las más utilizadas para la separación incluyen las diferencias en la carga, tamaño, solubilidad, determinantes inmunológicos y adsorción a materiales sólidos.

La técnica ideal debería permitir la separación completa del antígeno unido y libre sin alterar el equilibrio de la reacción y sin modificar los componentes de la muestra. Las técnicas comúnmente utilizadas incluyen: a) método del doble anticuerpo, en el cual un segundo anticuerpo de una especie diferente es utilizado para precipitar el complejo primario antígeno-anticuerpo; b) tubos o placas recubiertas, donde los tubos de reacción o las microplacas son recubiertas con el anticuerpo primario; c) fase sólida, constituída por celulosa, Sephadex, perlas de poliestireno o partículas magnéticas a las cuales se une el anticuerpo utilizado; d) adsorción, en la cual el antígeno libre es adsorbido, por ejemplo, con carbón mientras el unido permanece en solución; e) solventes o sales, como por ejemplo polietilenglicol (PEG), que favorecen la precipitación de alguno de los componentes del sistema, y f) columnas de separación: intercambio iónico o filtración por geles.

Ensayos Heterogéneos Competitivos: involucran la unión del antígeno al anticuerpo seguida de una separación física de la hormona unida al anticuerpo (AgAc) y la hormona no unida (Ag). El sistema de detección a utilizar dependerá del tipo de sustancia marcadora elegida. Si se utiliza un elemento radiactivo el ensayo se denomina Radioin-munoanálisis (RIA). Si se utiliza una enzima, Enzimoinmunoanálisis (EIA), en el caso de una sustancia fluorescente, Fluoroinmunoanálisis (FIA) y cuando se utiliza una sustancia quimioluminiscente, Quimioinmunoanálisis (QIA).

Ensayos Heterogéneos No competitivos: Los ensayos inmunométricos heterogéneos involu-cran la separación de las fracciones libre y unida. El método de detección de la señal dependerá del tipo de sustancia marcadora utilizada. Si se trata de un radioisótopo, el ensayo se denomina Inmunoradio-métrico (IRMA), en el caso de una enzima Inmuno-enzimométrico (IEMA), si es una sustancia fluorescente Fluoroinmunométrico (IFMA) y cuando se utiliza una sustancia quimioluminiscente, Quimioinmunométrico (ICMA).

Ensayos Competitivos Homogéneos: Los ensayos competitivos homogéneos también involucran la unión del antígeno al anticuerpo pero no requieren separación del complejo (Ag-Ac) y el (Ag) libre. La mayoría de los ensayos homogéneos desarrollados utilizan marcas enzimáticas: EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) o fluorescentes: FPIA (Fluorescence Polarization ImmunoAssay). Este tipo de ensayos es apto para su aplicación en sistemas completamente automatizados de uso habitual en el laboratorio clínico. Si el antígeno es una molécula pequeña, el complejo antígeno-anticuerpo es mas grande que el antígeno solo. La mayoría de los inmunoensayos homogéneos toman la ventaja de esta diferencia en tamaño o propiedad física y por consiguiente se utilizan para cuantificar analitos que son moléculas pequeñas. Como se indicará mas adelante, en el diseño de este tipo de ensayos, no se requiere separación de las fracciones libre y unida debido a que luego de la unión Ag-Ac ocurre alguno de los siguientes cambios: a) cambios conformacionales de las enzimas; b) inhibición de la actividad enzimática c) sustrato marcado con fluorescencia y d) transferencia de energía fluorescente, protección o polarización.

A continuación se describen algunas caracterís-ticas de los diferentes tipos de ensayos mencionados (competitivos, inmunométricos, homogéneos o heterogéneos) que utilizan diferentes tipos de marcas 1) radioactivas, 2) enzimáticas, 3) fluorescentes 4) quimioluminiscentes o 5) electroquimiolumi-niscentes.

1) Ensayos que utilizan como marca un radioisótopo: (ver Sección Conceptos elementales del uso de radioisótopos).

Radioinmunoanálisis (RIA): Es el ejemplo clásico de los ensayos competitivos. Se basa en una reacción antígeno-anticuerpo donde están presentes simultáneamente dos formas del antíge-no, la hormona fría y la hormona marcada con un radioisótopo, como por ejemplo el 125I ó 3H. La concentración de la hormona fría presente en la mezcla de reacción está inversamente relacionada con la cantidad de hormona marcada que forma parte del complejo antígeno-anticuerpo (Ag*-Ac) y puede ser estimada refiriéndola a una curva de calibración realizada con estándares de concentraciones conocidas.

El tratamiento matemático de la reacción Ag-Ac conduce a la obtención de un gráfico de Scatchard. Para ello, se deben asumir las siguientes consideraciones teóricas: a) el Ag y el Ac están presentes en forma homogénea en una sola especie química; b) ambos son univalentes; c)

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los Ag marcados y no marcados tienen similares propiedades fisicoquímicas; d) la reacción alcanza el equilibrio; e) la separación del Ag unido y libre es perfecta y no altera el equilibrio y e) la relación Ag-Ac/Ag puede ser perfectamente calculada (ver Sección Interacción Ligando-Receptor en el Fascículo 2).

Quizá la mayor discrepancia entre los modelos desarrollados por Berson y Yallow y simultánea- mente por Ekins, mencionados en la Introducción, fue el criterio utilizado para definir y mejorar la sensibilidad de los ensayos. Los primeros definen a la sensibilidad como la máxima pendiente de la curva estándar, independientemente del error experimental. Ekins, en tanto, la define como la mínima dosis detectable, la que está limitada por la constante Ka y el error experimental.

Pese a que los ensayos inmunométricos son 10 veces mas sensibles y claramente superaron al RIA para la evaluación de péptidos y hormonas proteicas, esta tecnología no siempre es aplicable a moléculas pequeñas como los esteroides y hormonas tiroideas, y así en algunos casos aún se prefiere el diseño competitivo (RIA).

Los inmunoensayos, particularmente los RIAs, pueden sufrir interferencias por factores presentes en el suero o en el plasma. La causa de este “efecto matriz” se atribuye al plasma, proteínas séricas y en algunos casos a anticuerpos circulantes. Dicho efecto se pone en evidencia al comprobar que las curvas dosis-respuesta de la hormona en solución buffer y en fluidos biológicos no resultan paralelas. Para evitar estas interferencias, algunos ensayos fueron desarrollados luego de la extraccción del analito, por ejemplo el péptido natriurético atrial (PNA), que requiere la separación previa de las proteínas séricas. La presencia de proteínas transportadoras de algunas hormonas puede influir en la actividad biológica de las mismas. Por consiguiente, la evaluación de las hormonas libres es de mayor valor en el diagnóstico clínico que la cuantificación de la hormona total. Se han desarrollado kits comerciales con diferentes estrategias para la medida directa de hormonas libres en suero ( T

3L, T

4L, Testosterona libre, etc) ,

utilizando por ejemplo, un análogo de la hormona marcada, que se une al Ac pero no a la proteína transportadora.

Algunas hormonas de bajo peso molecular como las esteroideas y tiroideas son haptenos, es decir que por su tamaño no resultan inmunogénicas y deben ser acoplados a péptidos para inducir una respuesta inmunológica. Sin embargo, los anticuerpos poli o monoclonales frecuentemente presentan reacción cruzada, probablemente debido a las reacciones de acoplamiento. Aún cuando la reacción cruzada es

débil se podría invalidar el ensayo, como es el caso de la determinación de T

3, que coexiste en sangre

con un exceso 100 veces molar de T4.

La elección del Ag puede ser crítica en el desar-rollo de un inmunoensayo, como es el caso de la Inhibina, que durante largo tiempo se evaluó con anticuerpos policlonales dirigidos contra la sub-unidad α y no a la subunidad β de la hormona. Posteriormente se demostró la secreción gonadal y extragonadal de la subunidad α libre, sin acción bi-ológica conocida. Este hecho, explica la falta de cor-relación con la clínica. Actualmente, se desarrollaron ensayos específicos para Inhibina A o B utilizando dos anticuerpos dirigidos a ambas subunidades α y β (βA o βB respectivamente).

Ensayo Inmunoradiométrico (IRMA): Como se mencionó anteriormente, en la mayoría de estos ensayos se utilizan dos Ac monoclonales dirigidos contra dos epitopes de una molécula de hormona y uno de ellos se marca con un compuesto radioactivo

(125I). La concentración de los anticuerpos requeri-dos para un IRMA puede ser 50 a 100 veces mas elevada que si el ensayo se realizara por RIA, por consiguiente, ha sido ventajoso producir anticuer-pos monoclonales que pueden ser preparados en grandes cantidades. Otra ventaja inherente a este tipo de ensayos, es que las inmunoglobulinas purifi-cadas pueden reaccionar con derivados de la biotina, aportando sitios para la unión de varios equivalentes molares de avidina. Esta a su vez, puede ser marcada con alta actividad específica sin perder su afinidad por la biotina. Así, la actividad específica del com-plejo (y por consiguiente la sensibilidad del ensayo) puede aumentar varias veces respecto de utilizar

la inmunoglobulina marcada con 125I o incluso con otro tipo de marcas. Por otra parte, los IRMAs fueron en general más dificultosos de desarrollar que los RIAs y presentan la desventaja del efecto “hook” o de dosis alta presentes en la muestra. Así, en los IRMAs que requieren un paso simple de incubación, las concentraciones del analito por encima de ciertos valores críticos pueden saturar a los anticuerpos. Este hecho, puede mostrar inconvenientes en el diagnóstico de tumores tales como los prolactino-mas, los cuales pueden secretar Prolactina (PRL) en cantidad suficiente que exceda el rango de trabajo de un IRMA, el que entonces debe ser optimizado con respecto al rango de referencia. Esta desventaja de los IRMAs se presenta en general en todos los ensayos inmunométricos independientemente de la marca utilizada,.No obstante, actualmente algunas técnicas automa-tizadas (ej. MEIA , EQLIA) están diseñadas para evitar el efecto “hook” o de dosis alta. (ver mas adelante)

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2) Enzimoinmunoensayos

Las enzimas y los compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, fueron introducidos como al-ternativas a los radioisótopos. Esto se ha basado en la premisa que cada miembro de esta población de moléculas pueda, cuando se activa, generar al menos una señal cuantificable en un tiempo aceptable.

La ventaja de utilizar enzimas como sustancias marcadoras es el elevado número de moléculas de sustrato convertidos a producto por sitio de enzima por unidad de tiempo. Es decir, la amplificación por la reacción enzima/sustrato es 1/1000 por segundo. Es-tas moléculas son reactivos de vida útil prolongada, económicos y pueden ser detectadas de diferentes maneras. La desventaja es que son susceptibles a interferencias y a los cambios en las condiciones del ensayo durante la generación de la señal. Se deben controlar dos tiempos de incubación, el de la reacción Ag-Ac y el de la generación de la señal. Los criterios de selección para la elección de las enzimas son: a) un número elevado de moléculas de sustrato convertidas a producto por sitios de enzima por unidad de tiempo; b) alto grado de pureza; c) sensibilidad; d) no debe estar presente en el medio a examinar; e) debe poseer grupos reac-tivos potenciales; f) económica; g) soluble; h) para los ensayos heterogéneos debe ser estable, es decir, debe conservar su actividad luego de la conjugación y en las condiciones del test; i) facilidad y rapidez de detección.

Los enzimoinmunoensayos heterogéneos: más comunes son los ELISA (Enzyme-Linked Im-munosorbent Assay), ensayos en los que la enzima está unida al inmunoadsorbente como a una placa. Estos ensayos, pueden ser competitivos, con Ag

o Ac conjungados con la enzima, no competiti-vos (inmunoenzimométricos) o indirectos para medir Ac.

Los enzimoinmunoensayos homogéneos: Son menos sensibles que los anteriores y adaptables a la automatización. En estos ensayos la reacción Ag-Ac afecta la actividad de la enzima y por lo tanto no requieren técnicas de separación. A diferencia de los enzimoinmunoensayos heterogéneos, donde la enzima marcada juega un rol pasivo en la reacción, en los enzimoinmunoensayos homogéneos las enzi-mas juegan un rol mucho más activo. El cambio de señal es dependiente de la inhibición de la actividad enzimática, activación o cambio conformacional. Algunos ejemplos de estos ensayos son: EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), SFLIA (Substrate Labelled Fluorescence Immu-noAssay), y CEDIA (Cloned Enzyme Directed ImmunoAssay).

EMIT: Este tipo de ensayos competitivo homo-géneos utilizan una enzima en calidad de marcador, como la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), malato-deshidrogenasa (MDH) o lisozima. La enzima marcada es acoplada a un derivado de una droga u hormona a medir. La forma no unida de la droga u hormona marcada con la enzima es capaz de conservar intacta la actividad enzimática y, por lo tanto, puede actuar sobre el sustrato para formar el producto. Luego de la unión a un anticuerpo, la actividad de la enzima disminuye como consecuencia de una inactivación o de un cambio conformacional. Esta diferencia en la actividad enzimática entre el derivado de la hormona libre y la unida al anticuerpo es medida por la concentración de NADH a 340 nm en un espectrofotómetro (Figura 2 y 3).

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3) Fluoroinmunoensayos:Las sustancias fluorescentes, cuando son excita-

das por luz de una longitud de onda adecuada, son capaces de emitir una parte de esa energía como luz de longitud de onda mayor, para retornar así a su es-tado inicial. En la fluorescencia, la emisión de luz cesa luego de suprimida la absorción. En la fosforescencia en cambio, la emisión de luz continúa aún después de suprimida la absorción (fluorescencia demorada). Las variables que afectan la fluorescencia son el rendimiento cuántico, la fluorescencia de fondo, la estructura del compuesto, el quenching (depende de sustancias disueltas, concentración, temperatura, pH), la dispersión de la luz, y la diferencia entre los espectros de excitación y emisión. Un marcador fluorescente debe poseer una alta intensidad de emisión, la misma deberá ser claramente distinguible del fondo y deberá poseer un corrimiento de Stokes (diferencia de energía entre el pico de excitación y el de emisión) importante. Asimismo, la marca no de-bería afectar las propiedades inmunológicas y reac-tivas del sistema; deberá ser soluble en agua y tener buena estabilidad aún conjugado. La sensibilidad de los ensayos fluorescentes está entonces limitada por las interferencias. Por consiguiente, es fundamental que la sustancia trazadora tenga un largo tiempo de decaimiento de la luz emitida. Así, los lantánidos

(Eu+3 ) y sus quelatos tienen 103 -106 nanosegundos (ns) en relación al fluoroisotiocianato o la albúmina que presentan, aproximadamente, 4-4.5 ns. Otra ventaja, es que no se superponen los espectros de excitación (340 nm) con los de emisión de Eu+3 y Tb+3, (613 y 545 nm), respectivamente. Además, los lantánidos no existen en los fluidos biológicos y no interaccionan con la muestra. Es difícil combinar la fuerte capacidad quelante con una buena absorción y transferencia de energía. El Ac es marcado con Eu+3 para seguir la inmunoreacción. Posteriormente, el Eu+3 es liberado y acoplado a otro quelante, que resulta en una fluorescencia intensa. La medida del conjugado Ag-Ac es realizada luego de un paso de separación por el agregado de otro agente quelante denominado solución resaltadora. Esta solución di-socia al ión Eu+3 del complejo quelato-anticuerpo, y forma un quelato- Eu+3 betadicetona, que posee alta fluorescencia. La intensidad de la luz emitida es afectada por la naturaleza del solvente que ro-dea al quelato del ión Eu+3. En solución acuosa se observa un efecto quenching debido a la pérdida de energía como calor del complejo al rodearse de moléculas de agua. Esto se logra utilizando un detergente no iónico, como el Tritón X 100, el cual disuelve el componente orgánico y excluye el agua

Figura 2

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del quelato del ión Eu+3. El óxido de trioctilfosfina optimiza la reacción.

Se han utilizado diferentes recursos para mejorar la sensibilidad de los ensayos fluorescentes:

a) El principio de resolución temporal para separar las interferencias del fondo, desarrollado en los ensayos DELFIA (Dissociation-Enhanced Lanthanide FluoroImmunoAssay) que utilizan lantánidos, fundamentalmente Eu+3, como sustan-cia marcadora. Pueden ser competitivos (FIA) y no competitivos (IFMA).

(Ver http://las.perkinelmer.com/content/featured/DELFIAliterature.html)

b) los ensayos fluorescentes que amplifican la señal utilizando enzimas como la fosfatasa. Así, se han desarrollado los ensayos MEIA (Microparticle Enzyme ImmunoAssay) en los cuales, durante la incubación, los analitos se unen a micropartículas esféricas con el propósito de aumentar la superficie de contacto. Forman un complejo inmune conjugado con la enzima que se separa por fijación a una matriz de fibra de vidrio inerte y se evidencia mediante el agregado de 4metil-umbelinfosfato (4-MUP) con excitación a 365 nm que libera 4MU a 448 nm ,

fluorescente. Son ensayos heterogéneos, inmuno-métricos o competitivos (Figura 4).

(Ver: www.abbottlabs.com.au/html/add/medcond/meia.html)

c) otros fluoroensayos competitivos homogéneos denominados FPIA (Fluorescence Polarization Im-munoAssay) se basan en la disminución de la inten-sidad de la luz polarizada en presencia del complejo inmune. Cuando una molécula fluores-cente es ex-citada con luz polarizada, la emisión depende de la propiedad rotacional de la molécula. Una pequeña molécula tal como un antígeno marcado con fluores-cencia, rota mas rápidamente en solución que una gran molécula, tal como un complejo antígeno-anti-cuerpo. Cuando la luz polarizada excita una pequeña molécula, la cual está rotando rápidamente, la señal de polarización disminuye más que aquella que in-cide en una gran molécula. En un FPIA competitivo, el agregado del antígeno no marcado compite con el antígeno marcado con fluorescencia por los sitios de unión del anticuerpo. Al aumentar la concentración del Ag no marcado, se detecta mayor cantidad de Ag marcado con fluorescencia. Por lo tanto, la señal de polarización disminuye (Figura 5).

(Ver: www.abbottlabs.com.au/html/add/medcond/fpia.html)

Figura 3


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4) Quimioinmunoensayos

Las sustancias luminiscentes son aquellas que si son excitadas electrónicamente disipan energía en forma de luz. Tienen el potencial de lograr una mejor sensibilidad y el límite de detección de los compues-tos luminiscentes alcanza el rango submolar.

La luminiscencia está basada en el principio que una molécula es promovida a un estado excitado y cuando éste regresa al estado basal, la luz es emi-tida. La evaluación de la emisión de luz es la base de la medida cuantitativa. Los ensayos luminiscentes utilizan marcas bioluminiscentes (BL) o quimiolumi-niscentes (QL).

En las luciérnagas, la bioluminiscencia es pro-ducida por la oxidación, dependiente de ATP, de la luciferina por luciferasa. Este sistema se ha tratado de aplicar a los inmunoensayos, sin embargo, la mayoría de los mismos utilizan quimioluminiscen-cia. La quimioluminiscencia directa es la medida de la luz emitida y la quimioluminiscencia indirecta utiliza el estado excitado para transferir su exceso de energía a otra sustancia, la cual emite luz. La mayoría de los sistemas quimioluminiscentes utilizan algún sistema indirecto de quimioluminiscencia. Esto permite aumentar la sensibilidad por la utilización de un fluoróforo eficiente como aceptor de energía. La sustancias marcadoras para quimioluminiscencia

pueden ser una especie emisora de luz como el lu-minol, isoluminol o ésteres de acridina o una enzima que cataliza la reacción quimioluminiscente, como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa.

5) Electroquimioinmunoanálisis (ECLIA) Esta técnica se desarrolló cuando había transcu-

rrido casi una década del desarrollo de los ensayos lu-miniscentes, basados en la emisión de luz producida por una reacción luminiscente. Está basada en una reacción quimioluminiscente en la que se generan especies altamente reactivas en la superficie de un electrodo a partir de precursores estables luego de aplicar una diferencia de potencial. En este sentido, un ejemplo es la interacción entre un quelato de rutenio (trisbipiridil-rutenio) y la tripopilamina sobre la superficie de un electrodo de platino. El quelato de rutenio produce sales estables que pueden ser acopladas a proteínas, péptidos o haptenos. Debido al bajo peso molecular del quelato de rutenio, se pueden obtener conjugados con alta actividad específica. Las mayores ventajas de este sistema re-sponden a la gran capacidad de amplificación de la señal a partir de una molécula marcadora que puede ser excitada repetidas veces. Este hecho, permite límites muy bajos de detección y amplios intervalos de medición en procesos rápidos, con tiempos cortos

Figura 4

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de reacción. Este sistema utiliza una combinación de marcadores electroquimioluminiscentes con una fase sólida de alto rendimiento (micropartículas paramag-néticas recubiertas con estreptavidina), permitiendo la fijación de reactivos biotinilados. La dinámica de la reacción permite además eliminar las partículas de estreptavidina fuera de la célula de reacción antes de la generación de la señal, eliminando de este modo posibles interferencias por el efecto matriz. Este hecho y el amplio intervalo de medición dis-minuyen la probabilidad de errores por el llamado efecto hook o de dosis alta, que suelen presentarse en los ensayos no competitivos (cuando se pierde la condición de exceso de anticuerpo debido a los altos niveles de hormona presentes en la muestra (ej, Prolactinoma).

(Ver : http:www.polliklinika-analiza.hr/index.php)

Finalmente y como se mencionó anteriormente actualmente se están desarrollando un nuevo tipo de inmunoensayos que permiten realizar numerosas determinaciones simultáneamente con volúmenes muy pequeños de muestras: los ensayos miniatu-rizados llamados microordenamientos (microar-ray) que también pueden ser competitivos o no competitivos (Figura 6).

Figura 5

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Los bioensayos son sistemas en los cuales se evalúa la actividad biológica de una hormona a través de una respuesta fisiológica, la cual puede ser cuantificada. La respuesta medida resulta de una modificación funcional en una célula o agregado de células metabólicamente activas.

Previo al desarrollo de los inmunoensayos, al final de los años 60, los bioensayos permitieron la identificación de la mayoría de las hormonas y extractos glandulares en animales de laboratorio. Posteriormente se utilizaron en la estandarización de los inmunoensayos para diferentes hormonas, especialmente las que no podían obtenerse comple-tamente puras.

Se desarrollaron dos tipos de bioensayos : “in vivo” e “in vitro”.

En los bioensayos “in vivo” se utilizan ani-males intactos o pretratados de modo de lograr una mayor respuesta hormonal. Se evalúan las respuestas fisiológicas complejas que se completan en días o semanas y dependen de la distribución, metabo-lismo, vida media e interacción con otras hormonas. La desventaja de estos bioensayos in vivo es que poseen baja sensibilidad, no son completamente específicos, tienen un costo elevado y es imposible

aplicarlos a volúmenes pequeños y a múltiples determinaciones. A continuación, se citan algunos ejemplos de bioensayos “in vivo”: 1) el crecimiento de la tibia en ratas hipofisectomizadas en respuesta a la administración de somatotrofina (GH), depen-diente del nivel de hormonas tiroideas circulantes; 2) la liberación de radioiodo tiroideo a sangre en ratón como respuesta a la TSH; 3) la hipoglucemia inducida en el ratón en respuesta a la insulina; 4) el crecimiento del buche de la paloma luego de la administración de PRL; 5) el incremento en el peso ovárico en ratas inmaduras en respuesta a FSH; 6) el aumento en el tamaño de las vesículas seminales y el lóbulo anterior de la próstata de rata, mediado por el aumento de los andrógenos gonadales, en respuesta a la LH.

Los bioensayos “in vitro”, pueden completarse en horas o minutos y utilizan tejidos endócrinos, cultivos primarios, líneas celulares establecidas, membranas u organelas. Estos bioensayos pueden agruparse según la naturaleza de la respuesta que evalúan. En la mayoría de los ensayos se cuantifica una respuesta proximal, como el aumento de AMPcí-clico o la estimulación de la actividad de la adenilato ciclasa, ambos aplicables a una amplia variedad de

ENSAYOS BIOLÓGICOS O BIOENSAYOS

Figura 6

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el diseño de una nueva generación de bioensayos. En particular, para determinar la bioactividad de las gonadotrofinas se utilizan distintas líneas celulares transfectadas con genes de receptores para FSH o LH humanos. De este modo, cuando se evalúan sueros de pacientes, se evita la utilización de culti-vos primarios de células (granulosa, Sertoli o Leydig) murinas no homológas.

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20. http:www.abbottlabs.com.au/html/add/medcond/meia.html21. http: www.abbottlabs.com.au/html/add/medcond/fpia.html 22. http:www.polliklinika-analiza.hr/index.php

tejidos endocrinos. El incremento en AMP cíclico puede ser cuantificado por RIA o directamente con un luminómetro, si previamente las células son cotransfectadas con un gen reporter (luciferasa) que posea elementos respondedores a AMPcíclico (CREs) en su promotor. Al respecto, el clonado de los (cADNs) de receptores para Gn permite la evaluación no isotópica de la bioactividad de dichas hormonas mediante líneas celulares que expresan receptores humanos co-transfectadas con un gen reporter (luciferasa) para AMPcíclico. La sensibilidad en esta nueva generación de bioensayos es similar a los anteriores , sin embargo se ha logrado disminuir considerablemente las interferencias por el suero.

En otros casos se analizan respuestas distales al segundo mensajero, como la producción de testos-terona por células de Leydig en respuesta a LH / hCG, la capacidad de la FSH para estimular la actividad de la enzima aromatasa en las células de Sertoli o bien la conversión de testosterona a estradiol en células de la granulosa de rata. Algunos bioensayos evalúan respuestas mitogénicas. Por ejemplo, la prolactina (PRL) y la tirotrofina (TSH) estimulan respectivamente el crecimiento celular en una línea celular linfoide NB2 y en la línea celular (FRTL-5 de tiroides de rata). Cuando se analizan respuestas citoquímicas mediante microdensitometría se logran ensayos con mayor sensibilidad aunque muy laborio-sos y con cierta imprecisión. Algunos ejemplos son: la estimulación de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en condrocitos aislados en respuesta a la parathormona (PTH) y el aumento en la pene-tración de 2-naftilamida a los lisosomas tiroideos.

Ciertas hormonas en circulación exhiben consid-erable microheterogeneidad debida, por ejemplo, al diferente grado de glicosilación. Específicamente, en el caso de las gonadotrofinas, la relación entre LH y FSH bioactivas (B) e inmunoreactivas (I), relación B/I se utiliza como un indicador de la calidad de dichas moléculas. Sin embargo, recientemente se desarrol-laron bioensayos e inmunoensayos muy sensibles que muestran una menor discrepancia entre B e I.

Es importante la validación de los bioensayos, debido principalmente a la presencia de sustancias estimulatorias o inhibitorias presentes en los fluidos biológicos que pueden interferir en la especificidad de los mismos. Por consiguiente, es indispensable en todos los casos comprobar la neutralización de la respuesta biológica in vitro en presencia de anticuerpos antihormonas. En la validación de un bioensayo para insulina, se comprobó que los anticuerpos anti-insulina no lograban la neutraliza-ción completa de la respuesta fisiológica y esta observación permitió la descripción de los factores insulino-similes, IGF

1 e IGF

2.

El desarrollo de las técnicas de biología mo-lecular, como el clonado de receptores, permitió

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En los Inmunoanálisis, como en toda técnica analítica, el conjunto de operaciones de un ensayo culmina en la obtención de un resultado numérico acompañado de la unidad correspondiente. Cada resultado está afectado de un error proveniente de varias fuentes, entre las que podemos mencionar como relevantes la calibración defectuosa del in-strumental, la deficiente calidad de los reactivos o su conservación inadecuada, defectos propios del proceso en sí, la falta de entrenamiento del profe-sional o del técnico a cargo del ensayo y los errores de cálculo al transformar las lecturas finales en uni-dades de concentración del analito medido.

Cualquiera sea su fuente, estadísticamente los errores se clasifican en casuales y sistemáticos. Los casuales responden a la ley de distribución de errores de Gauss y sus parámetros de estimación son la media y la desviación estándar. La media o promedio de resultados (X) es el valor represen-tativo del conjunto de datos, que se distribuyen simétrica-mente a ambos lados del promedio con una desviación estándar (DE) que puede calcularse mediante la fórmula: ______

__________

DE = √ Σ (Xi – X)2 / (n – 1)

En control de calidad es útil independizarse de las unidades de medición de DE recurriendo al por-centaje de error casual, denominado en este caso coeficiente de variación CV:

CV % = DE . 100 / X

Los errores sistemáticos tienen en común su valor constante, en número y dirección, ya que se cometen por exceso o por defecto. Pueden ser positivos o negativos y provienen de la presencia constante de un factor equivocado en el proceso, la lectura o los cálculos. P. Ej., error en la calibración del instrumental, en la concentración de un reactivo, en la aplicación de un factor numérico de multi-pli-cación, etc.- Su parámetro representativo es la desviación B que se utiliza en porcentaje:

B % = Σ (Xi – X) . 100 / X

La exactitud Ex del resultado final depende del aporte de ambos errores: _____

___________

Ex = √ (CV %)2 + (B%)2

Ambos tipos de errores, casuales y sistemáticos, se cometen en cada ensayo: error intra-ensayo, entre ensayos consecutivos: error entre-ensayos y entre laboratorios. Los dos primeros son los enfocados por el Control Interno y el último en el Control Externo.

Control Interno: Las herramientas utilizadas en su control incluyen el conocimiento del Perfil de Precisión del ensayo y las Cartas de Control entre-ensayos.

El Perfil de Precisión es la relación entre el co-eficiente de variación (CV %) y las concentraciones del analito medido en el ensayo, utilizadas en la confección de la curva dosis-respuesta. El perfil de

Control de Calidad de losInmunoanálisis

Zulema Farinati; Silvia Quiroga; Martha Torres

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Conviene contar con muestras testigo de valores normales y de valores patológicos, o de valores que correspondan a distintas zonas de la curva dosis-respuesta. Con los resultados obtenidos se lleva una tabla de valores y gráficos que representen esos va-lores en función de cada ensayo, identificado por un número o la fecha de procesamiento. Los gráficos permiten verificar si los resultados obtenidos en cada ensayo están dentro de los límites de error casual permitidos – habitualmente dos veces la desviación estándar – y si no se cometen errores sistemáticos.

precisión permite apreciar que todo ensayo tiene una zona media de concentraciones para las cuales el error de precisión es menor, y que este error es mayor en ambos extremos de la curva dosis-respuesta. Los valores bajos y los muy altos de los ensayos están pues afectados de mayor error. En la preparación de los reactivos y en la metodología o proceso del ensayo se trata de lograr que la zona intermedia de menor error sea lo suficientemente extensa para asegurar un buen ensayo en un rango amplio de concentraciones. En esa zona el error debe ser menor del 5%, valor que se alcanza en ensayos manuales si se tienen en cuenta los requisitos de calibración, calidad de reactivos, procesos controla-dos y operador entrenado. Los valores para ensayos obtenidos en autoanalizadores bien calibrados son aún menores.

En la obtención de un perfil de precisión se utiliza un parámetro matemático intermedio que es útil de por sí como señal de buen análisis. Se trata del RER, o “relación error-respuesta”, que se define como la relación entre la sumatoria de las diferencias de duplicados en valor absoluto y la sumatoria de los promedios de duplicados. El valor del RER no debe ser mayor de 0,04.

Las Cartas de Control son de gran utilidad en el Control Interno. Se confeccionan utilizando los resultados de muestras testigos incluidas en cada ensayo como si se tratara de otra muestra más. Estas muestras se preparan ex profeso con un material similar al de las muestras dosadas habitualmente: suero, plasma, orina, etc.- Se conservan en alícuotas de volumen conveniente al número de veces en que se incluirán en cada ensayo, congeladas o liofilizadas.

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Para que la cuantificación de una hormona refleje verdaderamente su concentración y el resultado sea comparable al obtenido por otros laboratorios/métodos, la estandarización del método debe incluir la trazabilidad del estándar utilizado.

Para la comprensión del concepto incluimos algunas definiciones metrológicas utilizadas en trazabilidad:

Medición: Serie de operaciones que tienen por objeto determinar el valor de una cantidad.

Resultado de una medición: Valor atribuido al mesurando obtenido por la medición.

Trazabilidad Definición ISO

Propiedad del resultado de una medición o del valor de un estándar por la cual puede ser relacionado a referencias establecidas, usualmente estándares nacionales o internacionales, a través de una cadena no interrumpida de comparaciones que tengan incertidumbre establecida. El concepto se expresa a través del adjetivo TRACEABLE. La cadena no interrumpida de comparaciones se conoce como CADENA DE TRAZABILIDAD

Trazabilidad: Implica la seguridad de transferir valores acordados a partir de materiales que ocupan la posición más alta en el campo de los resultados de los métodos de rutina. Clave para la comparación de métodos para todos los analitos

Conmutabilidad: Capacidad de un material de referencia para mostrar propiedades interensayos comparables con las mostradas por muestras clínicas auténticas; y Capacidad de un material de producir la misma relación numérica (entre resultados de mediciones por un dado grupo de procedimientos de medición propuestos para medir la misma cantidad mensurable) que la producida cuando se aplican los mismos procedimientos a otros materiales relevantes.

Método de referencia: Método profundamente investigado, descri-

biendo clara y exactamente las condiciones nece-sarias y procedimientos, para la medición de uno o más valores de una propiedad, que ha demostrado tener exactitud y precisión apropiadas para su uso, que en consecuencia puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros métodos para la misma medición, particularmente para permitir la caracterización de un material de referencia

Material de referencia (RM o SRM): Material o sustancia, una o más de cuyos valores de propiedades son suficientemente homogéneos y bien establecidos para ser usados para la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medición, o para asignar valores a otros materiales.

Material de referencia certificado (CRM): Material de referencia acompañado por un certi-ficado, una o más de cuyos valores de propiedades son certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad a las unidades en las que el valor de la propiedad se expresa, para lo cual cada valor certificado está acompañado por su incerteza a un nivel de confianza establecido.

Estándar: Medición de un material, instrumento de medición, material de referencia, o sistema de medición utilizado para definir, realizar, conservar o reproducir una unidad o uno o más valores de una

cantidad a servir de referencia.

Estándar primario: Aquel que se designa o es conocido por tener las cualidades metrológicas más elevadas y cuyo valor es aceptado sin referencia a otros estándares de la misma cantidad.

Estándar secundario: Aquel cuyo valor es asignado por comparación con un estándar primario de la misma cantidad.

Unidades SI son independientes del procedimiento de medida.

Unidades IU están definidas por materiales de referencia y métodos de medición apropiados o métodos estándar

TRAZABILIDAD Y ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS EN INMUNOENSAYOS

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Hormonas:

Cuando se realiza un inmunoensayo de hormonas hay que tener en cuenta las siguientes características de las mismas que influirán en su cuantificación.

• Algunas no están todavía completamente

caracterizadas• Pueden expresarse genéticamente diferentes

formas • Existen cambios post-translacionales, como glico-

silación, sialilación, agregación o degradación• La proporción de las distintas variedades varía

con el estadio fisiológico• Se pueden formar isoformas durante la

enfermedad• A menudo la respuesta inmunológica y la

bioactividad de las diferentes formas no son correspondientes

• Actualmente no se dispone de formas puras• La purificación puede llevar a una degradación

parcial resultante en no-conmutabilidad de los materiales de referencia con muestras nativas

• Los compuestos puros preparados por técnicas recombinantes pueden tener estructuras alteradas, con alta probabilidad de efectos de matriz

• Cuando un analito es definido por un único epi-tope los métodos de referencia podrían usar “anticuerpos de referencia” seleccionados en base a su reactividad hacia las regiones antigénicas por las cuales ha sido definido el analito.

• Esto requeriría mayor investigación de la naturaleza química del analito y la caracterización de los anticuerpos (mapeo de epitopes) usados en los métodos de rutina

• Actualmente la armonización de métodos de rutina sólo se puede hacer por acuerdo con un método de consenso (método más efectivo para resolver cuestiones clínicas disponibles al presente).

Control de Calidad Externo

Como se ha dicho, el error casual y el error sistemático contribuyen al error total del análisis. Ambos tipos de error se observan en el control interno, y pueden reducirse al mínimo tanto en el error intra-análisis como en el error entre-análisis, controlando cuidadosamente el instrumental y los reactivos y optimizando el análisis. Pero existe un aspecto del error que con el control interno no se puede evaluar: si el resultado de un laboratorio es o

no comparable con el de otros laboratorios.Con la contribución de resultados de un número

suficiente de laboratorios, puede obtenerse valores promedio para la misma muestra que son en sí una mejor estimación del «valor verdadero» de la misma, es decir, obtener el «valor más probable». Los laboratorios que deseen incluirse en un programa de control externo procesan todas las mismas muestras y los resultados se reúnen y se analizan estadísticamente. El análisis estadístico de todos los laboratorios en general y de cada laboratorio en particular, individualmente y en su relación con el conjunto, se informan periódicamente en forma confidencial. Los laboratorios pueden trabajar o no con el mismo tipo de reactivos. Aún en el primer caso, las desviaciones entre laboratorios son altas. Esto es debido al «ambiente» diferente de cada laboratorio, «ambiente» que incluye diferente instrumental, diferentes calidades de reactivos secundarios (p. ej. el agua destilada que cada uno utiliza), formas propias de desarrollar la metodología, laboratoristas, procesamiento de resultados, etc. Esta particularidad individual determina el error sistemático propio de cada laboratorio con respecto a la media de todos los laboratorios del programa.

El laboratorio organizador prepara y envía las muestras de control de calidad, junto con cartillas de instrucciones y fechas de envío de resultados. Las muestras en general se envían liofilizadas y envasadas adecuadamente para que sufran el menor deterioro posible en el viaje y en el tiempo. Los resultados son devueltos al laboratorio central en las fichas confeccionadas para ese fin, fichas que contienen otro tipo de informaciones útiles, como p. ej. los reactivos usados, la metodología, etc. Los resultados se procesan en el laboratorio central, y se devuelven periódicamente. Al concluir una ronda del programa se da un informe final con el cual se extraen conclusiones de utilidad para todos los participantes.

El Control de Calidad Externo es parte de un paquete de medidas de aseguramiento de la calidad que garantizan la provisión y el mantenimiento de resultados de investigación y diagnósticos de alta calidad. La función más importante del Control de Calidad Externo es controlar y promover la comparabilidad de los resultados de los laboratorios, permitiendo el intercambio de datos entre instituciones, uso de rangos comunes de referencia y diagnósticos, y comparación de resultados obtenidos por varios centros involucrados en proyectos de investigación multicéntricos. El Control de Calidad Externo también permite la evaluación retrospectiva del comportamiento de

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un laboratorio y del comportamiento de métodos particulares o equipos de ensayo. Los esquemas en los participantes usan distintos métodos proveen una información valiosa del comportamiento relativo de los métodos.

Los esquemas del Control de Calidad Externo complementan los datos obtenidos por los procedimientos de control de calidad interno del laboratorio ya que el control de calidad externo puede sólo proveer datos retrospectivos del comportamiento de laboratorio y comparara los resultados obtenidos por los diferentes partici-pantes. Dichas comparaciones son de gran valor para el personal del laboratorio porque proveen incentivo para mejorar si los resultados no han sido satisfactorios y confianza en sí mismos y satisfacción si el comportamiento analítico ha sido bueno. Está en el interés de los laboratorios el participar de un esquema de control de calidad externo. Este interés propio significa que la mayoría de los laboratorios se asocian a un programa voluntariamente. Sin embargo, en algunos países uno de los criterios para acreditar un laboratorio para proveer de resultados a las instituciones de salud es que presente resultados satisfactorios en un Control de Calidad Externo. En dichos casos, la participación es mandatoria.

La frecuencia de las corridas de Control de Calidad Externo varía entre los esquemas, y refleja las necesidades del esquema y sus usuarios. En un esquema, las muestras deben ser analizadas cada 15 días, mientras que en otro se solicita una sola inclusión cada seis meses. La primera puede ser útil para laboratorios con un alto número de muestras de pacientes. El último esquema es probablemente apropiado para laboratorios con ensayos infrecuentes.

Para poder controlar la variación entre análisis dentro del laboratorio es necesario ensayar las mezclas de suero en forma repetida. Cada mezcla debe contener todos los analitos que van a ser controlados en el esquema, y las mezclas deben cubrir todas las concentraciones relevantes para cada analito.

Se utilizan una serie de parámetros estadísticas (medias, medianas, desviaciones estándar, coeficien-tes de variación) como criterios de desempeño del laboratorio. El establecimiento de un valor asignado para una muestra es la base de los demás cálculos del Control de Calidad Externo. El valor asignado puede considerarse como un valor asignado por un método de referencia, o como la media de los resultados obtenidos de referencia. Puede estar influida por la presencia de resultados fuera de rango. Estos resultados fuera de población se remueven por un método simple pero eficiente llamado acotamiento, que consiste en descartar simétricamente cierto porcentaje de resultados altos y bajos. La media acotada se calcula entonces a partir de los resultados no descartados.

Los desvíos de los resultados individuales se calculan como porcentajes del resultado relacionado a la media apropiada, y que pueden ser positivos o negativos.

La imprecisión entre laboratorios describe la variación entre los resultados de todos los laboratorios participantes. Esta es una característica importante del método de ensayo.

La mejoría de la metodología de ensayo debería ayudar a disminuir este tipo de imprecisión.

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Introducción

Los análisis hormonales desempeñan un rol fundamental en la práctica médica endocrinológica. Se utilizan para confirmar una impresión clínica, descar-tar o establecer un diagnóstico, determinar la etiología en algunas endocrinopatías y controlar un tratamiento.

En los últimos años se han desarrollado métodos de laboratorio basados en técnicas de Inmuno-análisis, que utilizan diferentes tipos de marca (radioactiva, enzimática, quimioluminiscente, etc.) que son cada vez más sensibles y precisos. Algunos de ellos utilizan equipos totalmente automatizados que permiten el informe de los análisis en tiempos más cortos.

Es importante que el Laboratorio cumpla en todos los casos con los requisitos pre-analíticos de la hormona a analizar. Éstos comprenden el

conocimiento de las correspondientes variables fisiopatológicas y farmacológicas que afectan la realización de una adecuada toma de muestra y un conveniente almacenamiento de la misma hasta su procesamiento.

En la fase analítica es imprescindible realizar una correcta selección de los reactivos e instrumental a utilizar y generar las condiciones de trabajo que permitan cubrir los requerimientos asistenciales. El Laboratorio debe seguir estrictos procedimientos de Control de Calidad en todas sus áreas de desempeño (ver Capítulo sobre Control de Calidad).

En este Capítulo se consideran algunos aspectos del análisis de las hormonas Somatomamotróficas y de las hormonas involucradas en el estudio de los ejes: tiroideo, corticosuprarrenal y gonadales femenino y masculino.

Pruebas Funcionales y Valores NormalesLaura E. Boero, Cecilia A. Fenili, Sergio Damilano,

Mirta S. Gurfinkel, Alberto G. Del Río

LABORATORIO ENDOCRINOLOGICO

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Prolactina

La prolactina humana (Prl) es un polipéptido de aproximadamente 23 kD, sintetizado y secretado por los lactotropos de la hipófisis anterior. Consta de 199 aminoácidos y tres puentes disulfuro(s). El 16% de los aminoácidos son homólogos con los de la hormona de crecimiento (hGH).

La Prl es secretada por la hipófisis de manera episódica y está sujeta a variaciones circadianas. La frecuencia de pulsos es de aproximadamente 90 minutos. Los niveles más elevados se encuentran durante el sueño y al despertar, disminuyendo durante las horas de la tarde. En el recién nacido, los niveles son elevados, disminuyen rápidamente luego del nacimiento, se mantienen bajos hasta la pubertad y a partir de ese momento son ligeramente más elevados en la mujer que en el varón, debido a los estrógenos circulantes. En la mujer embarazada los niveles séricos de Prl comienzan a elevarse en el primer trimestre y se observa un incremento de hasta

diez veces al término del embarazo1.Teniendo en cuenta la secreción episódica de la

Prl y a los fines de evitar esa variabilidad, se sugiere realizar la determinación basal de la misma en un “pool” de al menos tres muestras obtenidas cada 30 minutos, en las primeras horas de la mañana y habiendo transcurrido al menos una hora del despertar. Debido a que diferentes tipos de estrés (físico o emocional) pueden producir un incremento en los niveles de Prl, resulta conveniente que el paciente permanezca en un ambiente tranquilo y confortable, al menos una hora antes de realizar(se) la extracción de sangre.

El rango de referencia de la Prl sérica basal, que puede variar según la metodología usada, es en la mujer y en el varón adulto, entre 3 y 24 ng/mL y entre 3 y 18ng/mL , respectivamente (IRMA WHO 3rd I.St 84/500).

En la circulación, la Prl presenta una gran heterogeneidad molecular. Además de la forma monomérica de 23 kD ó “little” (pequeña) Prl, se han identificado la “big” (mediana) Prl de 56 kD, que correspondería a dímeros del monómero y la “big-big” (grande) Prl (macroprolactina) probable-mente por formación de complejos del monómero o “little” Prl unido a una inmunoglobulina de aproxi-madamente 100 kD. La “little” Prl representa aproximadamente el 80% de la Prl circulante en condiciones normales, y es la variante molecular de mayor actividad biológica2,3.

Los diferentes inmunoensayos disponibles para determinar la concentración sérica de Prl utilizan anticuerpos cuya especificidad es variable pudiendo detectar o no las variantes de mayor tamaño molecular. Esto constituye una fuente importante de variación en la medición de Prl, ya que en algunos ensayos se reduce el espectro de moléculas de Prl que son reconocidas4,5 .

Con el objeto de conocer cuál es la cantidad de Prl biológicamente activa (“little”) presente en una muestra, se utilizan métodos que permiten determinar el porcentaje de las diferentes isoformas. La cromatografía por filtración en geles, que separa moléculas teniendo en cuenta el tamaño molecular, es considerada un método patrón pero presenta la desventaja de ser una técnica costosa y laboriosa. Otro método sencillo y económico que sirve de screening, se basa en la precipitación de la “big-big”PRL con polietilenglicol (PEG) 6000 al 25% p/v, lo cual permite su separación de la “big” y de la “little” Prl. El inconveniente que se presenta con esta última metodología es establecer un valor de corte adecuado que permita discriminar la presencia o ausencia de la “big-big” Prl. Así, se encuentran en la literatura valores de recuperación post- precipita-ción con PEG, que varían entre un 58% a un 65% y descartan la presencia de macroprolactina, valores entre 35% y 40% que se relacionan a su presencia y una zona de incertidumbre entre 35% y 60% que debe ser confirmada por cromatografía6,7,8.

Es posible también determinar la actividad biológica de la Prl utilizando un bioensayo en cultivo que emplea la línea celular Nb

2 y la incorporación

de timidina-3H.La Prl es la única hormona de la hipófisis

anterior que se encuentra bajo control hipotalámico inhibitorio tónico, y es ejercido fundamentalmente por la dopamina. Por otra parte, su secreción no está sujeta a un sistema de retroalimentación largo dependiente de hormonas periféricas. La dopamina actúa sobre los receptores D

2 hipofisarios, los cuales

están acoplados a la proteína Gα inhibitoria, disminuyendo tanto la síntesis como la liberación de la Prl. Existen, por otro lado, factores capaces de producir su liberación, de los cuales, el más importante es la hormona liberadora de tirotrofina o TRH.

El TRH es utilizado para evaluar la reserva hipofisaria de la hormona Prl. Para ello, se

HORMONAS SOMATOMAMOTRÓFICASLaura E. Boero.

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administran 200 μg por vía intravenosa, realizando una determinación de Prl basal y otras a los 20 y 40 minutos posteriores al estímulo. En una respuesta normal se obtiene un incremento máximo en los niveles de Prl a los 20 minutos que representa como mínimo un 100% del valor basal. Los pacientes con hiperprolactinemias funcionales, cuyos niveles basales se encuentran ligeramente elevados, presentan un incremento similar a los normales. En el Hipotiroidismo Primario, la Prl puede responder al TRH con valores por encima del rango normal (hiper-repuestas) y en la mayoría de los pacientes portadores de un prolactinoma, la respuesta es menor al 100% o al 50% (hiporespuesta o repuesta

nula) 9.Existe una gran cantidad de fármacos que

pueden ocasionar un incremento o una disminución en la secreción de Prl, ya sea porque actúan como antagonistas o agonistas de la dopamina. Algunos interfieren con la síntesis, metabolismo, recaptación o unión al receptor de dopamina reduciendo la disponibilidad de la misma y en consecuencia producen hipersecreción de Prl (Ej. antidepresivos tricíclicos y benzodiazepinas). Otras drogas con actividad agonista dopaminérgica, actúan promoviendo la síntesis de dopamina o interactúan con los sitios receptores de la misma, suprimiendo la liberación de Prl, por ejemplo la bromoergocriptina, un derivado del ergot que se une a los receptores D2 en los lactotropos normales y adenomatosos y, la cabergolina que presenta una alta afinidad por los receptores D2 hipofisarios y mayor vida media que la anterior. El tratamiento previo con bromoergocriptina inhibe la respuesta de Prl al TRH, excepto durante el puerperio, posiblemente por la marcada reserva hipofisaria que existe en ese período.

Cabe resaltar, por todo lo expuesto, la importancia de conocer bajo qué condiciones se encuentra el paciente para poder interpretar de manera adecuada los resultados que se obtienen al evaluar el eje prolactínico.

Hormona de Crecimiento

La hormona de crecimiento humana (hGH) es una proteína no glicosilada de 191 aminoácidos, con 2 puentes disulfuro(s) y un peso molecular de 22 kD. La GH que se produce en la hipófisis y sobre todo la que circula en plasma, es una mezcla heterogénea de variantes moleculares10.

Los mecanismos que controlan su síntesis y secreción son muy complejos, dando como resultado final una secreción episódica con pulsos de mayor amplitud durante la noche.

La cuantificación de GH puede realizarse por diferentes metodologías: 1) bioensayos, 2) ensayos de radiorreceptor y 3) inmunoensayos.

Los bioensayos tienen la ventaja de determinar específicamente la hormona que es biológicamente activa, pero presentan el inconveniente de poseer baja sensibilidad, ser costosos, imprecisos, no aplica-bles a pequeños volúmenes de muestras ni a múlti-ples determinaciones. Los ensayos de radiorreceptor se basan en la capacidad de la hormona de unirse a su receptor fisiológico11, pero su utilización está prácticamente restringida a la investigación básica. Dentro de los inmunoensayos se deben considerar los métodos competitivos, como el clásico radioin-munoensayo (RIA), los no competitivos como el método radioinmunométrico (IRMA) y los inmuno-funcionales (IFA). Este último, es básicamente un ensayo no competitivo en el cual se realiza en primer lugar, una incubación de la muestra con un anticuerpo monoclonal y, en un segundo paso una incubación con una GHBP (proteína transportadora de la hGH) recombinante12. En el IFA sólo se reconocen las formas moleculares de hGH que poseen los dos sitios de unión al receptor y que por lo tanto son capaces de producir su dimerización. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, la capacidad de una molécula de producir dimerización de su receptor no presupone que los pasos que suceden a la interacción hormona–receptor sean adecuados y culminen con un determinado efecto biológico.

Debido a la secreción pulsátil y circadiana de hGH y en consecuencia, a que las concentraciones en sangre fluctúan dentro de un amplio rango, la utili-dad de una determinación basal de hGH es muy escasa, sobre todo en el diagnóstico de déficit de hGH. Este hecho ha determinado la necesidad de recurrir a pruebas capaces de inducir su secreción, ya sea por estímulos fisiológicos (ejercicio, sueño o secreción integrada de hGH) o farmacológicos

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(hipoglucemia insulínica, clonidina, arginina, hormona liberadora de hGH (GHRH), entre otros)13. Los diferentes fármacos utilizados para evaluar el eje somatotrófico actuarían estimulando la liberación de GHRH y/o inhibiendo la liberación de somatostatina (SS) de manera directa o a través de neuropéptidos o neurotransmisores, que modulan la secreción de GHRH o SS. Se asume como normal una respuesta de hGH mayor o igual a 10 ng/ml, utilizando como metodología un RIA, y se considera un déficit total cuando la respuesta a dos pruebas farmacológicas es inferior a 5 ng/ml y parcial cuando los valores varían entre 5 y 10 ng/ml14. Sin embargo, los criterios a tener en cuenta para considerar adecuada una respuesta del eje somatotrófico frente a una prueba de estímulo son controvertidos y se encuentran en constante revisión. Esto es debido a que dicha respuesta está influenciada por diversos factores como la edad, el sexo, el estadío puberal, el tipo de prueba y la metodología utilizada para la cuantificación de hGH. La US Food and Drug Administration ha definido una deficiencia de hGH en adultos, cuando el pico máximo de hGH sérica en una prueba es menor a 5 ng/ml por RIA o menor a 2,5 ng/ml por IRMA. La Obesidad, el Hipotiroidismo y el Hipercortisolismo, pueden bloquear la respuesta de hGH tanto a estímulos fisiológicos como farmacológicos, mientras que los esteroides sexuales la incrementan, por lo que en numerosos casos se administran previamente a la prueba de estimulo15. El estrés puede elevar los valores basales de hGH y bloquear la respuesta hormonal por lo que resulta conveniente que el paciente repose en un ambiente calmo entre 30 a 60 minutos antes de realizar la prueba.

Entre los estudios utilizados para evaluar un déficit de hGH, la prueba de la hipoglucemia indu-cida por insulina, es considerada el gold standard, pero su uso es limitado ya que implica una rigurosa vigilancia del paciente frente a riesgos severos de hipoglucemia. Se ha sugerido, por lo tanto, la utilización de otras pruebas de estímulo como la administración de GHRH con el agregado de un agente inhibidor de la SS, como la piridostigmina, la clonidina o la arginina. Este tipo de prueba podría ser de elección no sólo por su capacidad y potencia para evaluar la reserva hipofisaria, sino también por carecer de efectos secundarios13;16.

Por otro lado, para el diagnóstico de hipersecre-ción de hGH, la prueba más utilizada es la sobrecarga oral de glucosa, la cual en un individuo normal, arroja valores séricos de hGH (determinados por IRMA) iguales o menores a 1,0 ng/ml17. En el Gigantismo y la Acromegalia, la concentración sérica de hGH puede disminuir, permanecer igual o aumentar

paradójicamente luego de la administración de glucosa y en consecuencia los resultados son poco uniformes y confiables.

Por todo lo expuesto, se deduce la importancia en seleccionar el tipo de prueba y ensayo para evaluar el eje somatotrófico.

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11. Ilondo MM, Wanderschueren-Lodeweyckx M, De Meyts P. Eggermont E. Serum growth hormone levels measured by radioimmunoassay and radiorreceptor assay: a useful diagnostic tool in children with growth disorders. J. Clin. Endocrinol. Metab. 70:1445 – 1451, 1990.

12. Strasburger CJ, Wu Z, Pflaum CD, Dressendorfer RA. Immunofuntional assay of human growth hormone (hGH) in serum: a possible consensus for quantitative hGH measurement. J Clin. Endocrinol. Metab. 81: 2613 – 2620, 1996.

13. Ghigo E, Bellone J, Aimaretti G, Bellone S, Loche S, Cappa M, Bartolotta E, Dammacco F, Camanni F. Reliability of provocative tests to assess growth hormone secretory status. Study in 472 normally growing children. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 3323 – 3327, 1996.

14. Drug and Therapeutics Committee of the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society. Guidelines for the use of growth hormone in children with short stature. J. Pediatr. 127: 857 – 867, 1995.

15. Marin G, Domene HM, Barnes KM, Blackwell BJ, Cassorla FG, Cutler GBJr. The effects of estrogen priming and puberty on the growth hormone response to standardized treadmill exercise and arginine- insuline in normal girls and boys. J Clin. Endocrinol. Metab. 79: 537 – 541, 1994.

16. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. Vol 30, Nº 3. pp: 550, Septiembre 2001

17. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. Vol 30, Nº 3. pp: 570, Septiembre 2001.

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Introducción

El eje hipotálamo-hipófiso-tiroideo está regulado por diferentes hormonas que se describen a continuación. La hormona liberadora de TSH (TRH), es un tripéptido de origen hipotalámico que transportado vía el sistema porta-hipofisario, llega a la adenohipófisis donde estimula la síntesis y la liberación de tirotrofina (TSH). La TSH actúa sobre la glándula tiroides induciendo la biosíntesis y liberación de tiroxina (T4) y triiodotironina (T3).

En condiciones normales el eje se halla en equilibrio, a tráves de una retroalimentación negativa, en la que la T4 y la T3 inhiben la síntesis y liberación de TRH y TSH.

Las patologías que afectan al eje pueden provo-car hipofunción (primaria o secundaria) o hiperfun-ción primaria. La hiperfunción secundaria es muy poco frecuente. Las alteraciones primarias, por lo general están asociadas a procesos autoinmunes que conducen al Hipo o al Hipertiroidismo. En la Tabla 2-1 se reseñan las modificaciones de los parámetros de laboratorio descriptas en las diferentes tiroideopatías1; 2.

Unidad Hipotálamo-Hipofisiaria

El TRH se halla en muy bajas concentraciones en la circulación general y no se han podido implementar métodos confiables para su análisis.

La TSH es una glicoproteína de 28 kD secretada por las células tirotropas de la adenohipófisis. Está formada por la unión no-covalente de dos cadenas polipeptídicas (α y β). La cadena α es común a TSH, LH, FSH y hCG, mientras que la cadena β confiere la especificidad biológica e inmunológica a cada una de las hormonas. Su vida media en la sangre es de aproximadamente 60 minutos.

El análisis de la TSH se realiza en muestras séricas matinales3, dado que se ha descripto un ritmo circadiano en su liberación4, con valores máximos durante la noche y mínimos en la tarde. Se utilizan métodos inmunométricos, isotópicos o no-isotópicos, manuales o automatizados. Según su sensibilidad funcional (sf), los métodos se clasifican como de primera generación (sf = 1,0 UI/L), de segunda (sf = 0,1 UI/L) o de tercera generación (sf = 0,01 UI/L)5.En líneas generales, los métodos utilizados en la actualidad para la medición de TSH

son comparables entre si, pues están calibrados con respecto al mismo patrón de referencia (IRP 80/558).

En la Tabla 2-2 se muestran los valores de referencia de diferentes parámetros de laboratorio relacionados con el eje tiroideo.

La TSH se encuentra inhibida en el Hipertiroi-dismo y aumentada en el Hipotiroidismo Primario. Los niveles de TSH disminuyen luego de la adminis-tración de T

4 y/o T

3, altas dosis de glucocorticoides

y análogos de la dopamina. La TSH puede aumentar por: hipofunción tiroidea, recuperación de una enfermedad no tiroidea severa, tumores hipofisarios secretantes de TSH (raros), secreción de formas moleculares de TSH con menor actividad biológica, al interrumpir la medicación con fármacos antitiroideos o bien en la resistencia generalizada a las hormonas tiroideas.

El análisis de la TSH está expuesto a la interfe-rencia generada por anticuerpos heterófilos de alta afinidad6. Dichos anticuerpos humanos anti-inmunoglobulinas de animal (HAAA) o específi-camente anti-inmunoglobulinas de ratón (HAMA), son inducidos por infecciones, exposición a animales o a terapias con anticuerpos monoclonales. Tanto los HAMA como los HAAA , afectan a los métodos inmunométricos, pues forman un puente espúreo entre el reactivo de captura y el marcado, generando un resultado falsamente elevado.

Se ha descripto una variación intraindividuo en el ensayo de TSH de hasta 2 UI/L, y esta variación debe tenerse en cuenta, en especial en la interpreta-ción clínica de los valores próximos al límite superior normal. En los cuadros subclínicos, dado que la TSH muestra concentraciones intermedias se realiza la prueba de estímulo con TRH para confirmar el diagnóstico.

La prueba de TRH 7 se realiza suministrando por vía intravenosa, durante 30 segundos, 200 μg de TRH y realizando mediciones de TSH basales y a los 20, 40 y 60 minutos post-estímulo. La prueba se considera normal cuando el valor máximo se alcanza a los 20 minutos y el mismo está comprendido entre 5,0 y 25 Ul/L. En el Hipertiroidismo Subclínico, se obtienen valores inferiores a 5,0 UI/L y a la inversa, en el Hipotiroidismo Subclínico Primario se obtienen valores superiores a 25 Ul/L. En el Hipotiroidismo Secundario la respuesta del TSH al TRH es nula o está disminuida8 y en el Hipotiroidismo Terciario

EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-TIROIDEO Cecilia Andrea Fenili.

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(hipotalámico) la respuesta, siempre en valores bajos, está retrasada. En la mayor parte de los casos es suficiente realizar una prueba corta de TRH con valoración de TSH basal y a los 25 minutos post-estímulo.

La TSH neonatal (TSH-NN) 9 es uno de los análisis que se realizan como parte del programa de pesquisa integral de Enfermedades Congénitas en laboratorios vinculados a Centros especializados para el tratamiento de los casos detectados. Se recomienda realizar la toma de la muestra antes del alta de la maternidad, pero luego de las 48 hs del nacimiento, o como máximo a los 7 días de vida. La TSH-NN permite diagnosticar el Hipotiroidismo Neonatal que puede ser congénito por alteraciones tiroideas, o secundario a afecciones maternas o a la ingestión de fármacos inhibitorios a la madre. (Hipotiroidismo Congénito). En el 85% de los casos es causado por defectos tiroideos tales como aplasia, hipoplasia o localización ectópica del tejido tiroideo. Otras causas son: mutaciones inactivantes del receptor de TSH (resistencia a TSH parcial o severa) o mutaciones en genes que codifican para los factores de transcripción tiroideos (TTF-1, TTF-2 y PAX-8).

Hormonas Tiroideas

La T4 es la principal hormona tiroidea, se sintetiza en su totalidad en la glándula tiroides y tiene acción biológica por si misma y como pro-hormona de la T3. En la sangre, en una pequeña fracción (0,02 %), la T

4 circula libre (T4 libre) y la mayor parte unida a

proteínas de transporte: TBG (60-70%), prealbú-mina / transtiretina (15-30%) y albúmina (~ 10%) 10; 11. Las variaciones en la concentración de TBG (valores normales en adultos: 1,7 – 3,6 mg/dL), inciden sobre los niveles mensurables de T

4 total,

pero no modifican los niveles de T4

libre. Esto, se pone de manifiesto en diferentes situaciones. Por ejemplo, a lo largo del embarazo el aumento de los estrógenos provoca un aumento progresivo en los niveles circulantes de TBG, de tal forma que en el tercer trimestre del embarazo, los niveles de T

4 total

se hallan elevados (9,0 a 17 μg/dL), sin alterar los niveles de T

4 libre (0,7 a 2,1 ng/dL) 12. Del mismo

modo, la administración de estrógenos aumenta los niveles de T

4 total sin modificar los de T

4 libre, y por

lo tanto, no se modifica la concentración sérica de TSH. Los niveles bajos de T

4 total y T

4 libre están

asociados a un Hipotiroidismo o a la ingestión de T

3, mientras que los valores normales de T

4 libre con

valores bajos de T4 ,

indican deficiencia de proteínas de transporte o enfermedad grave no tiroidea (NTI, Non Thyroidal Illness).

La T3 circula en la sangre en concentraciones

inferiores a la T4 (relación 1/60 -1/90) y posee mayor

actividad biológica (relación 3/1-5/1) (que la T4). La

mayor parte (66%) de la T3 es producida por la

conversión periférica (5´-monodeiodinación) de la T

4 y sólo el (20) 33 % de la T

3 circulante proviene

de la biosíntesis tiroidea. La unión de la T3 a las

proteínas trasnportadoras es 10 veces menor que la de la T

4. La T

3 es transportada por la TBG y la

albúmina, no se une a la prealbúmina y su fracción libre (T3 libre) constituye aproximadamente el 0.2% del total. Los niveles circulantes de T

3 se modifican

en las diferentes etapas de la vida, y por lo tanto, sus valores normales son dependientes de la edad13. En los primeros tres días de vida sus niveles son elevados (100-740 ng/dL), mientras que disminuyen en la niñez a 100-245 ng/dL, y en el adulto están en un rango de 80-200 ng/dL, siendo aún más bajos en la tercera edad. La T

3 aumenta precozmente en

el Hipertiroidismo; y por el contrario, valores bajos de T

3 se observan tardíamente en el Hipotiroidismo

y en pacientes eutiroideos crónicamente enfermos 14 o con deficiencia de TBG.

En las diferentes patologías tiroideas, la T3 y la

T4 se modifican conjuntamente. No obstante, en el

Hipertiroidismo el ascenso de la T3 puede preceder

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al aumento de la T4 y a la inversa, en el Hipotiroi-

dismo el descenso de la T4 precede al de la T

3. La

T3 es particularmente útil en el diagnóstico de la

Tirotoxicosis por T3.

La T4 y la T

3 totales y sus respectivas fracciones

libres se analizan en muestras séricas sin restricciones de horario, en cuanto a que no muestran variaciones circadianas. Para su medición se utilizan inmuno-ensayos competitivos, isotópicos (RIE) o no-isotó-picos, manuales o automatizados. Las hormonas tiroideas son estables a temperatura ambiente (días), refrigeradas (meses) o congeladas (años).

La hemólisis y la hiperbilirrubinemia no generan interferencias importantes. Los ácidos grasos libres desplazan a la T

4 de sus proteínas de unión y ello

altera la medición de las fracciones libres en la mayor parte de métodos. Los inmunoensayos para la medición de hormonas tiroideas están calibrados con estándares preparados gravimétricamente a partir de hormona de alta pureza y ello facilita la comparación de resultados obtenidos por diferentes métodos.

La discordancia entre los resultados de T4 y

de T3 obtenidos por inmunoensayos y el estado

clínico del paciente alerta sobre la presencia de autoanticuerpos anti- T4 y anti- T3 15. Estos autoanticuerpos se encuentran en aproximadamente 1/2500 de los sueros analizados y se observan con mayor frecuencia en pacientes que presentan enfermedades autoinmunes, con o sin alteraciones tiroideas. Habitualmente acompañan a los niveles elevados de anticuerpos antitiroglobulina. Estos autoanticuerpos distorsionan los resultados de T

4,

T3, T

4 libre y T

3 libre en una forma no previsible y

con una intensidad variable según el método que se emplee para el análisis.

Diferentes fármacos alteran los niveles circulantes de T

4 y de T

3 : el propranolol inhibe la conversión

periférica de T4 a T

3. La amiodarona, por su alto

contenido de iodo, provoca frecuentemente altera-ciones tiroideas que llevan al Hipo o al Hipertiroi-dismo16. Las drogas antitiroideas, metilmercap-toimidazol (MMI) y propiltiouracilo (PTU)17 inhiben la iodinación de la tiroglobulina mediada por la peroxidasa tiroidea y la reacción de acoplamiento de las iodotirosinas. El PTU además inhibe la conversión de T

4 a T

3, de modo que es eficaz para

normalizar con mayor rapidez las concentraciones de la hormona más activa (T

3).

El ácido triiodotiroacético (TRIAC) da reacción cruzada en la mayor parte de los inmunoensayos de T

3. La administración de litio altera la captación

tiroidea de iodo y causa Hipo o Hipertiroidismo en el 10 % de los pacientes tratados, especialmente en aquellos que cursan con ATPO positivos 18.

La fenitoína, la carbamacepina19 o la furosemida 20 desplazan a la T

4 de sus sitios de unión a las

proteínas plasmáticas originando valores bajos circulantes de la misma.

Hormonas Libres

La T4 libre y la T3 libre, son los parámetros de elección cuando los niveles de T

4 y T

3 se ven

afectados por alteraciones (fisiológicas o patológicas, congénitas o adquiridas) de las proteínas de transporte.

La fracción libre de T4 y de T

3 puede medirse por

diferentes métodos21. Algunos métodos requieren la separación física de la hormona libre y de la unida, en una etapa previa a la realización del inmunoensayo. Dicha separación puede realizarse por diálisis22, por ultrafiltración23 o mediante columnas de Sephadex LH-20. Otros métodos, denominados directos 24

miden la fracción libre de la hormona en presencia de las proteínas transportadoras, sin requerir la etapa previa de separación física de las fracciones. Entre estos últimos, se han descripto métodos de un paso con un análogo marcado (afectados por la concentración de albúmina y de ácidos grasos libres), métodos de dos pasos con hormona marcada (son menos afectados por la concentración de albúmina) y métodos con anticuerpo marcado (aptos para procesos automatizados).

Los métodos que utilizan diálisis previa son más laboriosos, y por su costo no son viables para fines asistenciales, utilizandose como referencia en la puesta a punto de los otros métodos arriba citados. La administración de heparina activa a la lipopro-teinlipasa, generando ácidos grasos libres que provocan disminuciones espúreas en los valores de hormonas libres obtenidos por los métodos que involucran análogos 25.

La determinación de “T3 Uptake” (“Captación

de T3 in vitro”), permite corregir las variaciones de la

T4 atribuibles a las proteínas de transporte y de esa

forma permite realizar una estimación de la T4 libre

circulante. No obstante, por su mayor practi-cidad se prefiere la medición directa de la T

4 libre.

Las fracciones libres de T4 y T

3 son las

biológica-mente activas incluyendo en dicho rol, la retroalimentación negativa que ejercen sobre la unidad hipotálamo-hipofisaria con respecto a la liberación de TSH. Existe una relación inversa entre TSH y T

4, y está descripto que cuando la T

4 cae a la

mitad de su valor inicial, la TSH aumenta cien veces. Por el contrario, en el Hipertiroidismo Primario esta inhibida la producción de TSH. Ambos fenómenos evidencian el poder amplificador que tiene la TSH como señal del estado tiroideo.

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Anticuerpos Antitiroideos 26. Los anticuerpos anti-tiroglobulina (ATg) son

autoanticuerpos dirigidos contra la tiroglobulina (Tg). Los anticuerpos anti-tiroperoxidasa (ATPO, anteriormente denominados anti-fracción microsomal tiroidea) son autoanticuerpos citotóxicos dirigidos contra la peroxidasa involucrada en la síntesis de las hormonas tiroideas. Ambos anticuerpos se detectan en la mayor parte de los pacientes con Enfermedad de Graves y en los pacientes con Tiroiditis de Hashimoto, . La incidencia de positividad es mayor para los ATPO y su aparición en circulación, generalmente precede el desarrollo de la disfunción tiroidea.

Ambos anticuerpos tradicionalmente se midieron por aglutinación; sin embargo, en la actualidad dichas técnicas han sido reemplazadas por otras con mayor sensibilidad (inmunoensayos ultrasensibles). La estandarización es uno de los requisitos ineludibles para mejorar la calidad de los análisis de anticuerpos. La diversidad de ensayos basados en diferentes metodologías es un escollo para lograr resultados equiparables. Se han descripto diferentes métodos (competitivos, no competitivos), con diferentes señales (isotópicas, no isotópicas) y diferentes calibradores. Se agrega a ésto la dificultad inherente a todos los análisis de autoanticuerpos, relacionada al reconocimiento de los diferentes epitopes del autoantígeno. Todo ello, redunda en discrepancias en los resultados y/o dificultades en la interpretación clínica de los mismos. Los valores normales de estos anticuerpos dependen del método y del estándar de referencia utilizado, variando de <0.3 a 20 UI/mL para ATPO y de <0.3 a 30 UI/mL para ATg.

Los anticuerpos anti-receptor tiroideo de TSH (TBII o TRAB) 27, son utilizados para el seguimiento, pronóstico y control del tratamiento de los pacientes con Enfermedad de Graves. Son autoanticuerpos heterogéneos, aun en la misma muestra del paciente, que inhiben la unión de la TSH a su receptor, y pueden variar a través del tiempo. Durante el embarazo, como resultado del pasaje transplacentario, su presencia es capaz de originar un Hipertiroidismo Neonatal.

El análisis de los TRAB, se realiza por un método radiocompetitivo donde los anticuerpos presentes en la muestra compiten con la TSH radioiodada por los sitios de unión del receptor de TSH presente en una fracción solubilizada de membranas tiroideas. Se utiliza receptor de origen animal (generalmente porcino) o humano (recombinante) 28. Este méto-

do permite conocer la capacidad de unión de las inmunoglobulinas circulantes al receptor de TSH y no permite conocer la capacidad biológica, estimulante o inhibitoria de las mismas. Se considera como valor de referencia: hasta 15%, mientras que en individuos normales se observan generalmente valores inferiores al 5%.

Como una primera aproximación y para facilitar la comparación de los resultados obtenidos por diferentes métodos para auto-anticuerpos antitiroideos, se han preparado patrones de referencia internacionales de estandarización: MRC 65/93 para ATUS, MRC 66/387 para ATPO y MRC 90/672 para TRAb.

En la Enfermedad de Graves existen en sangre anticuerpos tiroestimulantes (TSAb) cuya determi-nación requiere la utilización de métodos biológicos que utilizan como parámetro final la medición de la producción de AMP cíclico o de las hormonas tiroideas. Por su complejidad son de escaso valor práctico.

La prueba de TRH, los análisis de TSH, de hormonas tiroideas y la determinación de anticuerpos antitiroideos, permiten describir el estado funcional del eje tiroideo. A ellos, se agregan otros parámetros como la Tg y la calcitonina, que cumplen un rol relevante en el diagnóstico y seguimiento de determinados cuadros clínicos.

Tiroglobulina

El análisis de la Tg sérica se utiliza para seguir la evolución de los pacientes con Cáncer de Tiroides29. Su concentración en sangre periférica se relaciona con la masa de glándula tiroides presente. Los valores normales de Tg correspondientes a una masa de glándula tiroides de 10-15 gramos son de 3,0 a 40 ng/mL. En pacientes con supresión por T

4 exógena

y masa tiroidea conservada se informan valores inferiores a 10 ng/mL y en pacientes atireóticos se esperan valores inferiores a 1,0 ng/mL. La Tg se puede medir en muestras séricas obtenidas por venopunción en condiciones basales por métodos radiocompetitivos (RIA) o inmunométricos, manuales o automatizados 30. Al realizar el análisis se debe descartar la presencia de ATg en la muestra, pues los mismos dan interferencia, que en algunos casos puede detectarse por ensayos denominados de recuperación 31. La recuperación es un análisis adicional que verifica el comportamiento del suero ante el agregado de una cantidad conocida de Tg pura. Se consideran normales los valores comprendidos entre 80 y 120 %.

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Calcitonina

La calcitonina es sintetizada por las células C (parafoliculares) de la tiroides e interviene junto con la paratohormona en la homeostasis del calcio. Es un polipéptido lábil de 32 aminoácidos 32, cuyo análisis en suero se realiza por RIA o IRMA 33. El valor de referencia para la población normal es <10 pg/mL.

Los niveles circulantes de calcitonina aumentan en la hiperplasia de las células C y en el Carcinoma Medular de Tiroides (CMT) 34. Con el fin de optimizar el diagnóstico del CMT por medio de la calcitonina, se realiza una prueba que consiste en la administración endovenosa de calcio y / o de pentagastrina.

Prueba de estímulo con pentagastrina 35: La pentagastrina es suministrada (0.5 µg/Kg peso) por vía endovenosa durante 5 segundos y las extracciones de sangre se realizan a los 1, 2, 5 y 10 minutos. La prueba se considera normal cuando la

calcitonina en el pico de respuesta es inferior a 10 pg/mL Si la respuesta es superior a 100 pg/mL indica alta probabilidad de CMT.

Prueba de estímulo con sobrecarga de calcio: se suministran 2.5 mg/Kg de gluconato de calcio en 30 segundos, con extracciones de sangre basal y al 1, 2 y 5 minutos post-estímulo. Si la calcitonina llega a valores de 100 ng/mL, se sospecha hiperplasia de células C. Esta prueba es menos sensible que la de pentagastrina para el diagnóstico de CMT.

La prueba combinada de pentagastrina y calcio ofrece mayor sensibilidad diagnóstica que ambas realizadas en forma independiente. Un pico > 300 pg/mL indica alta probabilidad de CMT.

En la actualidad, se cuenta con determinaciones que se basan en técnicas de biología molecular, entre las que puede mencionarse el estudio de mutaciones en el proto-oncogen RET, para detectar sujetos pertenecientes a familias en riesgo de padecer CMT 36.

TABLA 2-1. PARAMETROS de LABORATORIO en DIFERENTES TIROIDEOPATIAS.

TIROIDEOPATÍAS TSH T4 T3 T4L Tg ATPO TRAB

HIPOTIROIDISMO PRIMARIO A B N-B B B N-A N-A

HIPOTIROIDISMO SECUNDARIO N-B B B B B N N

TIROIDITIS de HASHIMOTO N-A V V V V A N-A

RESISTENCIA PERIFERICA A T4 A A A A A N N

DISHORMONOGENESIS TIROIDEA A B B B V N N

ENFERMEDAD de GRAVES B A A A A A A

ADENOMA PRODUCTOR de TSH N-A A A A A N N

ENFERM.CRONICAS NO-TIROIDEAS N V V N N N N

NOTA: N = nivel sérico dentro del rango de referencia, B =nivel sérico bajo, A = nivel sérico alto, V = nivel sérico variable, según el caso y/o el momento evolutivo de la enfermedad.

TABLA 2-2. VALORES de REFERENCIA para el EJE TIROIDEO.

HORMONA ADULTOS NIÑOS EMBARAZO UNIDADES

20 a 40 años 2 a 8 años 3° trimestre

TIROTROFINA 0, 3 - 5,0 0.6 – 6,0 0,3 – 5,5 UI/L

TIROXINA total (T4) 4,5 -12,5 6,4 – 14 9,0 - 17 µg/dL

TIROXINA LIBRE 0,8 - 2,0 0,6 – 2,9 0,7 – 2,2 ng/dL

TRIIODOTIRONINA (T3) 0,9 - 1,9 0,8 – 2,2 - ng/mL

TRIIODOTIRONINA LIBRE 1,4 - 4,4 - 1,7 – 4,6 pg/mL

TIROGLOBULINA no atireóticos < 45 2,0 - 65 - ng/mL

TIROGLOBULINA atireóticos < 1,0 < 1,0 - ng/mL

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Introducción

En la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-corticosuprarrenal intervienen diferentes hormonas que se detallan a continuación.

El factor u hormona liberador/a de cortico-trofina (CRH) es un péptido de 41 aminoácidos de origen hipotalámico, que regula la biosíntesis y la liberación a nivel hipofisario de la adrenocorti-cotrofina (ACTH). La ACTH a su vez actúa sobre la glándula suprarrenal, estimulando la esteroido-génesis de glucocorticoides (cortisol), mineralocorti-coides (aldosterona) y andrógenos (dehidroepian-

drosterona)1. El cortisol es el esteroide que ejerce la retroalimentación negativa de este eje sobre la unidad hipotálamo-hipofisaria.

En la Tabla 3.1 se muestran los valores de referencia para los parámetros de laboratorio involucrados con este eje y en la Tabla 3.2 se describen los niveles hormonales observados en las diferentes patologías del eje.

Se han descripto una serie de patologías que provocan hipo o hiperfunción suprarrenal. La hipofunción, según su origen sea suprarrenal o hipofisario, se la denomina Primaria (Enfermedad de Addison) o Secundaria respectivamente. De la misma forma la hiperfunción o Síndrome de Cushing, de origen suprarrenal se denomina Primaria; por el contrario, si su origen es hipofisario (Enfermedad de Cushing) o ectópico se denomina Secundaria. La presentación bioquímica y clínica del Síndrome de Cushing, frecuentemente se superpone con la observada en estados llamados pseudo-Cushing, como lo constituyen la Obesidad, la Depresión y el Alcoholismo.

Unidad Hipotálamo-Hipofisaria

El CRH, pese a ser determinado en plasma 2, no ofrece información adicional sobre la fisiopatología del eje a la brindada por la cuantificación de los niveles circulantes de ACTH y cortisol. El CRH humano de origen recombinante se utiliza en una prueba de estímulo4 que permite diferenciar el origen hipofisario o ectópico del ACTH en el Síndrome de Cushing. Se administran por vía endovenosa 100 µg de CRH y se analizan los niveles de ACTH y cortisol en muestras obtenidas a tiempo cero y cada 15 minutos durante las 2 horas siguientes. En la Enfermedad de Cushing, se observa un aumento exagerado del cortisol. En el Cushing generado por una secreción de ACTH ectópica, la ACTH y el cortisol no responden al estímulo con CRH. La eficiencia diagnóstica de esta prueba aumenta cuando se realizan determinaciones de ACTH en muestras bilaterales del seno petroso inferior obtenidas por cateterismo5. En este caso, la prueba también ayuda a lateralizar la fuente hipofisaria de ACTH y de esa forma, guiar su posterior resección quirúrgica.

La ACTH es una hormona peptídica de 39 aminoácidos (4.5 kD.), que se origina junto con la β-LPH a partir del clivaje de la propiomelanocortina (28.5 kD.). La secreción de ACTH es episódica, tiene una vida media breve en plasma (7-12 minutos) y se metaboliza a α-MSH y CLIP 6.

Los análisis basales matinales de ACTH y cortisol brindan una primera orientación para establecer el origen Primario o Secundario de los diferentes cuadros de hipo o hipercortisolismo. Por lo tanto, son los primeros análisis a encarar para realizar el diagnóstico diferencial del Síndrome de Cushing. La ACTH presenta un ritmo circadiano que determina una liberación similar en el cortisol con un máximo matinal (pico entre las 5-9 am) y un mínimo a medianoche (nadir) para ambas hormonas7. Por ese motivo, para su análisis se ha normatizado la extracción de sangre entre las 8 y 9 hs.

La determinación de ACTH ofrece dificultades por cuanto: la hormona se halla en bajas concentraciones en la circulación, ser muy inestable en plasma y tener una alta homología estructural con su familia de péptidos. La ACTH se adhiere con avidez al vidrio, por ello desde la extracción de sangre, hasta su análisis deben utilizarse jeringas y tubos de plástico

EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-CORTICOSUPRARRENALSergio Damilano, Cecilia Andrea Fenili.

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en frío y con anticoagulante (EDTA). La muestra de sangre debe ser centrifugada inmediatamente a 4°C y el plasma debe ser separado de inmediato y congelado hasta su procesamiento.

La ACTH se analiza por RIE 8, IRMA 9 o ICMA. Los métodos RIE utilizan anticuerpos policlonales y tienen la ventaja de detectar las diferentes formas moleculares de ACTH que producen los tumores. Los IRMA e ICMA, al usar anticuerpos monoclonales, son más específicos para detectar la hormona de 39 aminoácidos y más aún, los que emplean anticuerpos

dirigidos a la secuencia 1-24 de aminoácidos (ACTH1-

24), región de la molécula donde reside su actividad

biológica. En el Síndrome de Cushing provocado por un Carcinoma o Adenoma Suprarrenal se obtienen valores de ACTH inferiores a 5 pg/mL. La Enfermedad de Cushing cursa con valores ligeramente elevados, y por el contrario, el Síndrome de Cushing debido a la secreción de ACTH ectópica, cursa con valores de ACTH francamente aumentados (>200 pg/mL). En la Insuficiencia Suprarrenal originada en un déficit hipofisario, los niveles de ACTH son muy bajos ó indetectables. Por el contrario, la Insuficiencia Suprarrenal Primaria cursa con valores de ACTH elevados (>200 pg/ml).

Glucocorticoides

El cortisol circula en la sangre en concentra-ciones relativamente elevadas y lo hace unido a una proteína específica de transporte denominada globulina transportadora de cortico-esteroides (CBG) o Transcortina (70%) y a la Albúmina (20%) 10. Es una hormona afectada por el estrés, por lo que aumenta en individuos en grave estado, durante cirugías o luego de un traumatismo. El cortisol también aumenta en la Depresión endógena, la Inanición, la Anorexia Nerviosa, el Alcoholismo y la Insuficiencia Renal Crónica.

El análisis matinal de cortisol se realiza en suero o plasma y, dado que presenta un ritmo circadiano, la muestra debe obtenerse entre las 8 y 9 hs, previo reposo de 30 minutos. En la Insuficiencia Suprarrenal se hallan valores de cortisol inferiores a 10 µg/dL. En la hiperfunción, el cortisol puede hallarse elevado o dentro del rango de valores normales. En estos casos, es útil el estudio de la variación circadiana de los niveles de cortisol sérico. Para ello, se realizan dos tomas de sangre: a las 8 y a las 23 hs. Los pacientes con Síndrome de Cushing muestran a las 23 hs, valores de cortisol superiores a 5 µg/dL.

La CBG (50 kD), es una glicoproteína producida por el hígado y se une al cortisol con gran afinidad. El resto de los esteroides endógenos no alteran la unión del cortisol con la CBG, con excepción de la progesterona en la fase final del embarazo. Entre los esteroides sintéticos solamente la prednisona y su metabolito la prednisolona, muestran una afinidad significativa por la CBG. Los valores de CBG aumentan en estados de hiperestrogenismo (Embarazo, uso de estrógenos o anticonceptivos orales), Hipertiroidismo, Diabetes Mellitus y algunas enfermedades hematológicas. Los valores de CBG disminuyen en estados de deficiencia de esta globulina de índole familiar, en el Hipotiroidismo y en la Hipoproteinemia, como es el caso de las Hepatopatías graves o el Síndrome Nefrótico.

La cantidad de cortisol que circula libre es pequeña y puede ser cuantificada, previa separación de la unida a CBG, por diálisis o bien se puede tener una apreciación indirecta de dicha fracción libre por la determinación del cortisol presente en la orina o saliva.

El cortisol libre urinario (CLU) es un buen indicador de la producción suprarrenal de cortisol y no es afectado por las modificaciones que pudieran darse en la concentración de las proteínas plasmá-ticas de transporte 11. Ante la sospecha de un Síndrome de Cushing o bien cuando se hacen ajustes de dosis en pacientes bajo terapia crónica

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con hidrotisona, se realiza la determinación de cortisol libre urinario (recolección de orina de 24 hs). Es difícil definir los valores de referencia para CLU, ya que los mismos dependen del método que se elija para su medición. No obstante, como regla general, se consideran patológicos los valores que duplican el límite superior normal.

Ante la dificultad de obtener sangre cercana a la finalización del día (23 hs), la medición de CLU colectado durante 1 hora (22-23 hs), resulta ser un eficaz sustituto del cortisol sérico nocturno. En este caso, se informa la relación cortisol libre/creatinina urinaria.

El cortisol y el CLU se cuantifican por RIE con o sin extracción previa con solventes. En estos ensayos debe tenerse presente la reacción cruzada por parte de la prednisona y de la prednisolona; por el contrario, la dexametasona no presenta reacción cruzada.

El cortisol en saliva (SAF) es un buen indi-cador de la producción suprarrenal de cortisol y es representativo de su fracción libre12. La toma de muestra se debe realizar previo reposo de 30 minutos y está contraindicado realizar ejercicio, ingerir alcohol, te o café, antes de la toma de la muestra. La hemólisis (sangrado de encías) interfiere en los ensayos. Los pacientes bajo tratamiento con estatinas, por inhibición de la 11-β dehidrogenasa (disminuye la conversión a cortisona) y en conse-cuencia presentan SAF elevados. El cortisol se encuentra en bajas concentraciones en la saliva y por lo tanto, las mediciones de SAF se realizan con métodos de alta sensibilidad.

Entre los precursores de la biosíntesis de cortisol, se destaca la 17-hidroxiprogesterona. Dicho esteroide aumenta en los déficit enzimáticos de la esteroidogenesis suprarrenal (por ej.: el déficit congénito de 21-hidroxilasa) 13. En las pacientes con ciclo menstrual conservado se debe medir en la fase folicular y en algunos casos el déficit enzimático se pone de manifesto mediante la prueba aguda de estímulo con ACTH.

El laboratorio cumple un rol muy importante en el diagnóstico de la patología del eje corticosupra-rrenal. Al respecto, en la Tabla 3.314 se muestra la eficiencia diagnóstica de diferentes análisis hormo-nales utilizados para el diagnóstico del Síndrome de Cushing. La Tabla 3.414 muestra la eficiencia diagnós-tica de los parámetros utilizados para discriminar el origen Primario o Secundario del mismo.

En el estudio de la Insuficiencia Suprarrenal se han implementado diferentes pruebas funcionales que evalúan la reserva de glucocorticoides. Del mismo modo, se han establecido otras pruebas funcionales con el objeto de complementar la información brindada por la valoración basal de ACTH, cortisol, CLU y SAF en el estudio del Síndrome de Cushing.

Pruebas para evaluar la reserva de Glucocorticoides

n Prueba de estímulo agudo con ACTH16.

Se administra ACTH1-24

sintética (Cortrosyn, Synacthen), 0.25 mg por vía intravenosa y se analiza el cortisol en la muestra basal y 60 minutos post inyección. La prueba se considera normal si el cortisol post-estímulo es superior a 20 µg/dL. Se observan valores inferiores a 20 µg/dL, en la Insuficiencia Suprarrenal Primaria, o en la inhibición suprarrenal crónica por corticoides. El ACTH

1-24 puede ser

reemplazado por ACTH (molécula entera) en cuyo caso, se administra por vía intramuscular y la valoración del cortisol se extiende hasta la tercera hora post-estímulo.

Esta prueba también se utiliza para el diagnóstico de la Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC), midiendo la 17-hidroxiprogesterona en muestras obtenidas a los 0 y 60 minutos post- estímulo con ACTH. El valor post-estímulo permite diferenciar a los individuos normales de los pacientes portadores heterocigotas y homocigotas con deficiencia de 21-hidroxilasa.

n Prueba de hipoglucemia insulínica en el estudio de la reserva de ACTH17.

Luego de la administranción de 0.10 unidades/Kg de peso de insulina, se determinan glucosa, ACTH y cortisol en muestras de sangre basal y obtenidas a los 15, 30, 45, 60 y 90 post-estímulo. La prueba es válida si los valores de glucemia descienden por debajo de 40 mg/dL. Se observa un aumento en los niveles de ACTH de 3 a 5 veces respecto del valor basal y la prueba se considera normal si el cortisol aumenta 1.5 veces respecto del basal con un pico de al menos 18 µg/dL.

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Pruebas para evaluar exceso de Glucocorticoides

n Prueba de inhibición nocturna con dexame-tasona (DXM) a dosis bajas. Test de Nugent18.

Se administra 1 mg de DXM a las 23 hs por vía oral. Al día siguiente, se extrae sangre a las 8-9 hs de la mañana siguiente con el fin de determinar cortisol. Si el cortisol post-DXM es inferior a 5 µg/dL, la supresión del eje está conservada y se descarta el Síndrome de Cushing. Un cortisol igual o mayor a 5 µg/dL es considerado anormal, pero debe ser interpretado con cautela, pues existen falsos positivos en pacientes con pseudo-Cushing, administración de estrógenos, embarazo y terapia con anticonvulsivantes. En pacientes hospitalizados, el estrés puede provocar resultados falsos positivos. En el caso que se evalúe cortisol en saliva post-DXM, el mismo debe ser inferior a 2,0 nmol/L.

n Prueba de inhibición nocturna con dexametasona a altas dosis 18.

Esta prueba está indicada en los pacientes sin respuesta o con respuesta parcial en el Test de Nugent. Se realiza una extracción matinal de sangre para determinar cortisol y ese mismo día se administran 8 mg de DXM vía oral a las 23 hs. Al día siguiente se determina cortisol en una muestra de sangre obtenida entre las 8 y 9 hs de la mañana siguiente. Se calcula la relación entre los valores de cortisol del 2° día / 1° día. Si hubo inhibición (relación menor a 50%), se considera diagnóstico de Enfermedad de Cushing. Una relación mayor o igual a 50% indica la presencia de una fuente ectópica de secreción de ACTH o de un tumor en la glándula suprarrenal.

n Prueba de inhibición con DXM a bajas dosis

(Prueba de Liddle) 19. Se determina CLU en orina de 24 hs (recolectada

desde las 6 hs del día 1 a las 6 hs del día 2 en

condiciones basales). Los días 3 y 4 se administran ocho dosis (una cada 6 horas) de 0.5 mg de DXM. Se determina el CLU en orina de 24 hs. (recolectada desde las 6 hs del día 3 a las 6 hs del día 4) y el cortisol matinal. Se descarta el diagnóstico de Síndrome de Cushing, si el día 3 se observa un CLU inferior al 10% del valor basal o el día 4 un cortisol matinal inferior a 5 µg/dL. La falta de inhibición sugiere el diagnóstico de Síndrome de Cushing, pero se pueden obtener falsos positivos en individuos que metabolizan en forma acelerada a la DXM, tal como se observa bajo las terapias con anticovulsivantes, el alcoholismo, en pacientes depresivos severos o con estrés.

n Prueba de inhibición con DXM a altas dosis (Prueba de Liddle)19.

A continuación de la prueba de Liddle de supresión con bajas dosis de DXM, los días 5 y 6 se administran por vía oral, 2 mg de DXM cada 6 horas. Se determina el CLU en orina de 24 hs. (recolectada desde las 6 hs del día 5 a las 6 hs del día 6) y el cortisol matinal. La respuesta esperada en el Síndrome de Cushing ACTH-dependiente es un descenso en el CLU inferior al 64% respecto del basal (CLU de días 1 y 2) o un cortisol matinal inferior a 5 µg/dL el día 6. Los adenomas suprarrenales, por ser autónomos, no responden a la supresión con altas dosis de DXM.

n Prueba de Metopirona20.

Se administran 750 mg de Metapirona vía oral cada 6 hs., durante 24 horas. Se determina cortisol, 11-desoxicortisol y ACTH en muestras de sangre basal y 24 hs. post-medicación. En condiciones normales, el cortisol plasmático disminuye por bloqueo de su síntesis (a nivel de la 11-β-hidroxilasa) y se incrementan los niveles del desoxicortisol. En la Enfermedad de Cushing el ACTH y el desoxicortisol duplican los valores. Por el contrario, en los tumores suprarrenales la ACTH y los niveles de desoxicortisol no se modifican. Esta prueba no es útil para diferenciar entre secreción ectópica e hipofisaria de ACTH.

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TABLA 3.1. VALORES DE REFERENCIA del EJE CORTICOSUPRARRENAL

ADULTOS UNIDADES

ACTH matinal (8 a 9 hs) < 54 pg/mL

ACTH post-Dexametasona (Nugent) < 5,0 pg/mL

CORTISOL matinal (8 a 9 hs) 5,0 – 25 µg/dL

CORTISOL nocturno (23 hs) < 5,0 µg/dL

CORTISOL post-Dexametasona (Nugent) < 5,0 µg/dL

TRANSCORTINA (CBG) 19 – 45 mg/L

CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU) 30 – 120 µg/24 hs

CLU (7 a 8 hs) 23 – 173 ng/mg Creat

CLU (22 a 23 hs) < 30 ng/mg Creat

CORTISOL matinal en saliva (8 hs) 6.0 - 23 nmol/L

CORTISOL nocturno en saliva (23 hs) <6,0 nmol/L

TABLA 3.2. NIVELES HORMONALES en las PATOLOGÍAS del EJE SUPRARRENAL

ACTH CORTISOL

Insuficiencia suprarrenal A B

Déficit de ACTH N o B B

Resistencia a los glucocorticoides A A

Hiperplasia suprarrenal congénita A N o B

S. de Cushing suprarrenal B A

S. de Cushing Hipofisario N o A A

S. de Cushing Ectópico A A

NOTAS: N = nivel sérico normal, B =nivel sérico bajo, A = nivel sérico alto.

TABLA 3.3. EFICIENCIA DIAGNOSTICA de DIFERENTES ANÁLISIS HORMONALES en el DIAGNOS-TICO del SÍNDROME de CUSHING

Expresado en %

Sensibilidad Especificidad Efic. Diagn.

CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU) 97 100 98

17-HIDROXICORTICOIDES Urinarios 86 90 88

CORTISOL POST-NUGENT de las 8 hs 93 79 86

CORTISOL (F) BASAL de las 8 hs 18 100 56

CORTISOL (F) BASAL de las 23 hs 97 93 95

NOTA : Los valores de corte tomados para esta evaluación son : CLU > 120 µg/24 hs., 17-HO urin.> 8,0 mg/24 hs., Fpost-Nugent > 5,0 µg/dL, F basal de las 8 hs > 25 µg/dL, Fbasal de las 23 hs > 10 µg/dL.

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TABLA 3.4. EFICIENCIA DIAGNOSTICA de DIFERENTES ANALISIS HORMONALES en el DIAGNOSTICO DIFERENCIAL entre ENFERMEDAD de CUSHING vs. TUMOR

CORTICOSUPRARRENAL.

Expresado en %

Sensibilidad Especificidad Efic. Diagn.Inhibición con Dexametasona, 8 mg / día, evaluada con CLU 78 86 81 o evaluada con Cortisol (F) Post (8 hs) 75 100 83

Prueba de Metopirona, 750 mg x 6 dosis,evaluada con 11-Desoxicortisol post (8 hs) 100 100 100

NOTA : Los valores de corte tomados para esta evaluación son: CLU-post > 50 % del basal, F-post > 50 % del basal, 11-Desoxicortisol > 10 µg/dl.

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Introducción

La producción a nivel hipofisario de las gonado-trofinas, hormona luteinizante (LH) y hormona folículoestimulante (FSH), se halla bajo el control del factor liberador hipotalámico, denominado GnRH ó LH-RH.

La FSH y la LH, estimulan la gametogénesis y la esteroidegénesis ovárica. Esta última se evalúa a través de la determinación de los diferentes estró-genos, progestágenos y andrógenos circulantes.

En la Tabla 4-1 se muestran los valores de refer-encia para estas hormonas.

Gonadotrofinas

Durante el periodo fetal, la LH y la FSH se encuentran en muy bajas concentraciones, al igual que el LH-RH. Tras el nacimiento, se produce un incremento en la producción de las gonadotrofinas por la secreción pulsátil de LH-RH, lo que origina fuertes descargas episódicas de las mismas durante el primer año de vida.

El intervalo que va desde los 2 a 3 años de vida hasta poco antes de la pubertad, se caracteriza por una inhibición del eje hipotálamo-hipofiso-gonadal, una baja actividad del generador de pulsos y en los niveles circulantes de gonadotrofinas y esteroides sexuales.

En los meses que preceden al comienzo de la pubertad se produce la activación del eje, con un aumento, en principio nocturno, de la amplitud y frecuencia de los pulsos de LH-RH y de las gonado-trofinas, siendo el ascenso de FSH más temprano que el de LH. Paulatinamente, dicho fenómeno se extiende a todo el día hasta adquirir los patrones de conducta pulsátil de la edad adulta, que serán dife-rentes en ambos sexos. En el hombre se mantienen constantes, en tanto que en la mujer, la secreción gonadotrófica como el ritmo pulsátil, muestran fluc-tuaciones fisiológicas a través del cliclo menstrual (CM), que son reguladas por los esteroides ováricos. Debido a estas características, las muestras iniciales en el estudio del CM deben extraerse en la fase folicular temprana (primeros días del CM).

En general, una determinación aislada es menos representativa que la valoración en un pool de tres sueros obtenidos a lo largo de 2 horas.

Durante el CM se observan importantes modifi-caciones cuantitativas de la secreción de LH y FSH:

en fase folicular temprana, la relación LH/FSH es menor que 1; luego, dicha relación se incrementa en el pico ovulatorio para alcanzar su máximo valor (LH/FSH= 3) y en la fase lutea disminuye, llegando a una relación LH/FSH=1.

En la Pubertad Precoz verdadera se encuentra una hiperactividad prematura del eje, y con excep-ción de este cuadro, las patologías habituales del eje manifiestan hipofunción gonadal que para su estudio pueden requerir algunas de las pruebas funcionales.

La inhibina, activina y folistatina son una familia de péptidos sintetizados por las células de la granulosa del ovario (ver Fascículo sobre ovario).

La inhibina está compuesta por dos cadenas peptídicas diferentes (α y β), unidas por puentes disulfuro. Se han purificado dos formas de inhibina, llamadas A y B. La inhibina y otros péptidos produci-dos en el ovario ejercen un efecto directo de retroali-mentación negativa sobre la síntesis de FSH.

La activina es un péptido relacionado con la inhibina, pero su función es de actividad opuesta, ya que aumenta la liberación de FSH.

La perimenopausia se caracteriza por presentar niveles disminuidos de inhibina A y B y ello induce un aumento en los niveles de FSH. La FSH aumenta a partir de los 40 años y la LH lo hace más tarde y en menor cuantía.

Prolactina

El paso inicial en el estudio del eje ovárico es el análisis de los niveles de prolactina (Prl), dado que las hiperprolactinemias de diferentes orígenes cursan con alteraciones del CM. También es conveniente realizar la determinación de TSH para descartar una posible hiperprolactinemia causada por un Hipotiroidismo Subclínico.

La medición de LH y FSH es prioritaria en el estudio de las Amenorreas, y así poder diferenciar la falla ovárica primaria, de patologías hipotálamo / hipofisarias), en el monitoreo de los tratamientos de inducción de la ovulación y en el estudio de un adenoma productor de gonadotrofinas (poco fre-cuente). Además, es útil en el diagnóstico del Sín-drome de Ovario Poliquístico (PCO), el cual cursa con niveles inapropiadamente altos de LH, mantenidos por pulsos exagerados de LH, mientras que la FSH

EJE HIPOTALAMO HIPOFISO OVARICOMirta S. Gurfinkiel.

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permanece baja. Estos cambios, reflejan alteraciones en la secreción como resultado de una inapropiada retroalimentación del estradiol, proveniente de los andrógenos formados por la estimulación crónica del ovario.

La cuantificación de las gonadotrofinas se realiza por métodos ultrasensibles (inmuno-radiométricos), diseñados con 2 ó más anticuerpos dirigidos a distin-tos epitopes de la molécula. De esta manera se logra una mayor sensibilidad y especificidad en compara-ción con los RIE. Por otro lado, el hecho de utilizar en estos últimos anticuerpos policlonales los cuales presentan reacción cruzada con la gonadotrofina coriónica (hCG), hace que los ensayos inmunora-diométricos sean más específicos y la ventaja sobre los RIE policlonales en no presentar reacción cruzada con la gonadotrofina coriónica humana (hCG).

Pruebas funcionales

Para realizar el diagnóstico etiológico de algunas de las alteraciones del eje ovárico es necesario la realización de pruebas funcionales a varios niveles del eje hipotálamo-hipofiso-ovárico.

n Prueba de estímulo con LH-RH.

Está indicada en casos de Pubertad Retrasada y en Amenorreas Hipotalámicas. En la mujer, en edad fértil, la respuesta está influenciada por el nivel es-trogénico circulante, por lo que se indica realizar la prueba entre el quinto y octavo día del ciclo mens-trual (es decir al inicio de la fase folicular).

Se administran 100 μg de LH-RH sintético por vía intravenosa, con obtención de muestras para el dosaje de LH y FSH a los 0, 30,60 y 90 minutos post-estímulo. La interpretación de la prueba de-pende de la edad de la paciente. La prueba puede ser evaluada por diferentes criterios: área bajo la curva, incremento máximo absoluto, o bien incre-mento porcentual respecto del basal. Para considerar una respuesta normal, los valores de LH entre los 30 y 45 minutos post-estímulo (respuesta máxima) deberán duplicar o triplicar su valor basal, mientras que la FSH a los 60 minutos deberá duplicar su valor basal. Una respuesta normal no excluye una disfunción del eje. La ausencia de respuesta de las gonadotrofinas, siempre indica Insuficiencia Hipo-talámica y/o Hipofisaria.

La respuesta es muy variable, pero un pico de LH mayor de 15 mUI/ml confirma la presencia de células gonadotropas activas. En las alteraciones gonadales con síntesis hormonal disminuida, se observan va-lores basales de gonadotrofinas aumen-tados con re-spuestas exageradas (Menopausia Precoz, Síndrome de Turner, ooforectomia).

Los pacientes con Hipogonadismo Central pre-sentan una respuesta al LH-RH de tipo prepuberal con un pico de LH inferior a 2 mUI/mL. La ausencia del pico de LH indica una destrucción del gonad-otropo o una deprivación crónica de LH-RH.

n Prueba de Clomifeno

El clomifeno es un anti-estrógeno, que bloquea la retroalimentación negativa del estradiol sobre la producción de LH-RH en el hipotálamo y sobre las gonadotrofinas en la hipófisis. Por lo tanto, se utiliza para evaluar la integridad del eje Hipotálamo–Hipo-fiso-Gonadal.

La prueba puede ser realizada en cualquier momento en pacientes amenorreicas, pero debe

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realizarse a partir del quinto día en quienes con-servan el CM.

Se realiza la determinación basal de LH, FSH y estradiol, luego se administran 50-100 mg/día de clomifeno por vía oral, durante 5 dias. Se dosan LH, FSH y estradiol los días 4-7 y 10-post-administración de clomifeno. Se determina la progesterona el día 21 del CM. La LH debe incrementar por lo menos en un 30% su valor respecto del basal y la FSH debe tener un incremento de un 20% o más en el día 10. Se observan respuestas planas en la etapa prepuberal y en pacientes con una inadecuada reserva de gonado-trofinas o una pérdida crónica de la pulsa-tilidad, como suele ocurrir en la Anorexia Nerviosa o en la Hiperprolactinemia. Un nivel de progesterona mayor a 10 ng/mL en el día 21 indica que hubo ovulación y una función lútea normal. También un nivel de FSH entre 10-20 en el día 3 y/o el dia10 es un indicador de Fertilidad Reducida.

Estrógenos

En la mujer, los estrógenos se producen en las células de la granulosa, por aromatización de los precursores (andrógenos) sintetizados en la célula de la teca del ovario.

El estradiol (E2) circulante es representativo de

la biosíntesis de estrógenos, y su análisis se realiza por RIE con o sin extracción previa con solventes. Los métodos no-isotópicos son menos confiables por ser más lábiles a interferencias inespecíficas.

En condiciones normales, los niveles de la Globulina Transportadora de Hormonas Ester-oides (GLAE o SHBG) son estables, y por lo tanto el estradiol circulante que se mide en la sangre es proporcional al estradiol libre que actúa sobre los órganos efectores.

En la Tabla 4.2 se detallan los valores de LH FSH y E

2 hallados en diferentes patologías relacionados

con el eje ovárico. Se debe tener en cuenta que los niveles de E

2

varían a lo largo del CM. Los mismos ascienden gradualmente durante la primera fase del ciclo desde 20-30 pg/mL hasta valores máximos de 400-500 pg/mL en las horas previas a la ovulación. Seguida-mente, se produce un descenso, para luego volver a incrementarse mientras dure la actividad del cuerpo luteo, fase en la que los niveles de E

2 son mayores

que los descriptos en la fase folicular media.En mujeres postmenopáusicas con terapia de

reemplazo hormonal (TRH) oral o transdérmica, el valor de E

2 no supera los 200 pg/mL y los valores

de LH y FSH se mantienen por encima de los valores descriptos en el CM.

El ovario es la principal fuente de E2 circulante, en

cambio la estrona (E1) proviene, en parte, del ovario

y en parte, se origina por transformación periférica de la androstenodiona y del E

2.

En la mujer fértil, la E1 tiene escaso significado

clínico, mientras que en la Menopausia, cuando la producción global de estrógenos disminuye sig-nificativamente, la E

1 se constituye en el estrógeno

predominante.

Progesterona

La progesterona (P4) es producida mayoritaria-

mente por el cuerpo lúteo, y una pequeña cantidad también es producida en la corteza suprarrenal.

Los niveles circulantes de P4 varían a lo largo del

CM. En la fase folicular su concentración es baja, y luego de la ovulación aumenta en forma sostenida, hasta alcanzar su máximo nivel en la mitad de la fase lútea.

Las determinaciones de P4 se utilizan para el

estudio de la fase lútea inadecuada, para verificar inducción de la ovulación, monitorear la terapia de reemplazo, detectar y evaluar los riesgos de aborto durante las primeras semanas de Embarazo.

Un análisis de P4 realizado en la segunda mitad

del ciclo ratifica que hubo ovulación si el valor hal-lado es mayor a 8,0 ng/mL.

17-OH-Progesterona

La 17-OH-progesterona (17-OH-Prog) es de origen mixto, ovárico y suprarrenal. Es de utilidad en el estudio de la Hiperplasia Suprarrenal Congé-nita (HSC), Hirsutismo e Infertilidad. La 17-OH-Prog exhibe un patrón de secreción similar al cortisol con valores más elevados durante la mañana y, al igual que la P

4, se encuentra aumentada en la

fase lútea, por lo tanto para evaluar su producción suprarrenal la extracción de sangre debe realizarse en la fase folicular temprana, con el fin de descartar los niveles circulantes elevados producidos por el cuerpo lúteo.

En el diagnóstico de la Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC), en algunos casos se realiza la prueba de ACTH, considerando normales los va-lores de 17-OH-Prog inferiores a 10 ng/mL a los 60 minutos post-estimulo.

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Andrógenos En los casos de Hirsutismo es importante conocer

cuál es el origen de los andrógenos involucrados en dicha alteración (ovárico, suprarrenal o mixto). Entre los andrógenos se debe diferenciar los 17-β-deriva-dos (dihidrotestosterona, testosterona, andros-tanodioles) de mayor potencia que los 17-ceto-derivados (androstenodiona, dehidro-epiandros-terona, sulfato de dehidroepiandros-terona), siendo estos últimos de origen suprarrenal y no se unen a la GLAE.

La dihidrotestosterona (DHT) es el andrógeno más potente, su concentración sérica es baja y provi-ene de la conversión periférica a partir de la testos-terona por acción de la enzima 5-α-reductasa.

La testosterona (To) en la mujer tiene un ori-gen mixto, debido a que el 50% se origina por la conversión periférica a partir de androstenodiona y el resto se produce por partes iguales en el ovario y la suprarrenal. El 80% de la T

o circulante está unido

a la GLAE. La androstenodiona (Adiona) se origina por

partes iguales en el ovario y en la suprarrenal, y una pequeña fracción proviene de la conversión peri-férica a partir de DHEA. El componente ovárico de ambos andrógenos (T

O y Adiona) se origina en las

células del estroma y de la teca interna y se expresa con niveles máximos en la mitad del ciclo menstrual, coincidiendo con el ascenso preovulatorio del E

2.

La Adiona es el precursor más importante en la síntesis de E

2 en diferentes tejidos (adiposo y otros),

constituyéndose en una fuente relevante de estró-genos en el periodo post-menopáusico.

La DHEA y la DHEA-S son expresión de la síntesis suprarrenal de andrógenos, sus niveles son estables a lo largo del CM y no se unen significativamente a las proteínas plasmáticas de transporte.

Existen varios factores que influencian la concen-tración de la GLAE en la circulación. Las hormonas tiroideas, los estrógenos y el Embarazo la aumentan, mientras que el Hipotiroidismo, los andrógenos, la Obesidad y el Hiperinsulinismo la disminuyen. El estado de Hiperandrogenismo también disminuyen a la GLAE, por lo tanto es menor la concentración plasmática de los esteroides que ella transporta. En ese caso, la determinación de testosterona total estará disminuida y deberá ser reemplazada por la determinación de testosterona libre, que correla-ciona mejor con el cuadro clínico.

La fracción constituida por la TO libre y la T

O

transportada por la albúmina se denomina tes-tosterona biodisponible (To bio) , ya que por su baja constante de afinidad la testosterona unida a

la albúmina también está disponible para actuar en los tejidos efectores.

Se han desarrollado distintos métodos para estimar la testosterona libre o testosterona biodisponible. En la determinación de la fracción libre podemos contar con la medición directa por RIE de trazador análogo o estimarla por cálculo matemático. La To bio se puede determinar con el método de precipitación con sulfato de amonio al 50 % de saturación o se puede estimar con mé-todos matemáticos basados en la ley de acción de masas.

En el estudio de los hiperandrogenismos se de-

termina inicialmente los andrógenos (TO, SDHEA,

y ADIONA), FSH-LH y PRL, y también el cortisol libre urinario (CLU) si se sospecha un Síndrome de Cushing. Estas determinaciones permiten detectar la mayor parte de los hiperandrogenismos, inclusive los de origen suprarrenal u ovárico.

Siempre que se plantee la posibilidad de una HSC se deben determinar los niveles de 17-OH-P

4 y de

CLU. Un aumento en los niveles de la 17-OH-Prog

con un CLU normal indicaría una HSC de aparición tardía. Un nivel de 17-OH-Prog dudoso obliga a realizar un test de ACTH para desenmascarar una HSC leve (ver Tabla 4-3).

Ante la sospecha de un cuadro de Hirsutismo no tumoral hiperandrogénico, y con el fin de con-ocer su origen, se debe realizar una prueba con 1 mg de Dexametasona (DXM) a las 23 hs., y con dosajes matinales post DXM, de cortisol y testos-terona plamática. Si el cortisol post-DXM no es inhibido, es diagnóstico de Síndrome de Cushing. En el caso que el cortisol sea inhibido, se evalúa la testosterona. Si hay inhibición, nos orientamos hacia un Hirsutismo de origen suprarrenal, caso contrario debe considerarse la posibilidad de un Hirsutismo de origen ovárico. El Hirsutismo con niveles normales de andrógenos séricos, puede estar provocado por un incremento en la actividad de la 5-α-reductasa tisular, que transforma la T

o en DHT, debido a una

mayor actividad de la unidad pilosebácea. Con el fin de detectar esta alteración se determina un metabo-lito de la DHT, el glucurónido de androstanodiol (3-α-Diol). Su elevación en presencia de T

o libre

normal indica un Hirsutismo de origen periférico. Sin embargo, esta determinación no es concluyente, debido a que los valores en las mujeres hirsutas se superponen con el rango normal en un 20%.

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TABLA 4.1. VALORES DE REFERENCIA del EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-OVARICO y de ANDROGENOS.

PREPUBER ADULTOS POST- UNIDADES MENOPAUSIA

PROLACTINA 3,0 –17 3,0 - 21 3,0 - 17 ng/mL

LH-LUTEINIZANTE < 3,0 0,6 - 6,2 >20 mUI/mL

FSH-FOLICULOESTIMULANTE < 3,0 3,3 - 8,8 >40 mUl/mL

ESTRADIOL < 15 30 –100 < 25 pg/mL

ESTRONA < 30 30 - 86 16 – 63 pg/mL

PROGESTERONA < 0,6 (8,0 - 28) < 0,7 ng/mL

17-OH-PROGESTERONA < 0,6 0,1- 1,2 < 0,6 ng/mL

DEHIDROEPIANDROST.sulfato < 600 650-3800 < 2000 ng/mL

ANDROSTENODIONA < 0,5 0,9 - 3,8 0,5 - 2,1 ng/mL

TESTOSTERONA total < 0,3 0,3 - 0,9 < 0,5 ng/mL

TESTOSTERONA LIBRE - 2,1 –11 1,0 - 8,7 pmol/L

TESTOSTER. BIODISPONIBLE - < 0,45 - pmo/L

ANDROSTANODIOL Glucurónido - 0,5 - 5,4 0,l - 6,0 ng/mL

GLOB.LIG.ANDR.ESTR.-GLAE 16 – 120 60 - 180 16 – 120 nmol/L

NOTA: En adultos se informan los valores de referencia para la fase folicular temprana, con excepción de la progestero-na, en que se indican los de la fase luteal media.

TABLA 4.2. NIVELES HORMONALES en la PATOLOGIA OVARICA.

LH FSH E2 Otros Parámetros

MENOPAUSIA A A B Estrona: N o B

EMBARAZO B B A hCG: A

FALLA OVÁRICA A A B Inhibina: B

SINDROME de TURNER A A B Cariotipo alterado

DEFICIT de GONADOTROFINAS N o B N o B B Respuesta al LH-RH: B

HIPERPROLACTINEMIA N o B N o B B Prolactina: A

PUBERTAD PRECOZ

Hipotálamo-hipofisiaria N o A N o A A Respuesta al LH-RH: A

Ovárica o suprarrenal (p.p.suorarrenal) B B A DHEA-S: A

Poliquistosis ovárica N o A N o B B Androstenodiona: A

Hiperandrogenismo adrenal N o A N o B N o B B DHEA-S: A

Granulosa o Teca B B A To: A; Inhibina: A

Disgerminoma; Coriocarcinoma B B A To: A; hCG:A

Gonadoblastomas B B A Cariotipo alterado

Estruma Ovárico N N N Tiroxina: N o A

NOTA: N = nivel sérico dentro del rango de referencia, B =nivel sérico bajo, A = nivel sérico alto.

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Referencias:

1. Dons RF, Endocrine and Metabolic Testing Manual. Capítulos 6 y 7. CRC Press, Boca Raton, USA, 1997.

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4. Damilano S.A. y Gurfinkiel M.S., Laboratorio Hormonal. Branco Mautner. Centro editor de la Fundación Faval-oro. Buenos Aires, Argentina. pp: 1320-1326, 1998.

TABLA 4.3. NIVELES HORMONALES en la POLIQUISTOSIS OVARICA, HIPERPLASIA SUPRARRENAL CONGENITA (expresión tardía) e HIRSUTISMO IDIOPATICO.

POLIQUISTOSIS HIPERPLASIA HIRSUTISMO OVÁRICA SUPR. CONGÉNITA IDIOPÁTICO

LUTEINIZANTE (LH) N o A N N

FOLICULOESTIMULANTE (FSH) N o B N N

ESTRADIOL B N N

ESTRONA A N N

CORTISOL N N o B N

17-OH-PROGESTERONA N A N

DEHIDROEPIANDROST. sulfato N o A N o A N

ANDROSTENODIONA A A N

TESTOSTERONA total A N o A N

DIHIDROTESTOSTERONA N N o A N o A

ANDROSTANODIOL glucuronido A A A

NOTA: N = nivel sérico dentro del rango de referencia, B =nivel sérico bajo, A = nivel sérico alto.

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en sangre periférica pueden presentar oscilaciones temporales que complican la interpre-tación de los valores obtenidos mediante una simple muestra. Por lo tanto, se ha sugerido, la obtención de 18 muestras tomadas en un lapso de 6 horas y, de esa manera promediar las mismas para obtener un valor medio. Sin embargo, Goldzieher y col1, indicaron que se pueden obtener informaciones confiables mediante el dosaje de un pool de tres muestras obtenidas con un intervalo de 20 minutos.

Pruebas dinámicas

Dos pruebas son utilizadas para evaluar el func-ionamiento del sector hipotálamo-hipofisario en el eje gonadal masculino. Una involucra la utilización del citrato de clomifeno y la otra la estimulación hipofisiaria mediante la administración de GnRH.

Estimulación con citrato de clomifeno (Genozyn o Serofene).

Este compuesto es un potente antagonista (y débil agonista) estrogénico y su administración pro-voca una inhibición en la retraolimentación negativa que ejerce el estradiol sobre el área hipotalámica pro-ductora de GnRH, lo cual facilita la liberación de LH y FSH. La repuesta de la LH es más rápida y de mayor magnitud que la de FSH. Se explica esta discordancia en que en el gonadotropo, al estimularse frente a un impulso de GnRH, se producen 2 ondas de dife-rente frecuencia. La mayor determina una liberación inmediata de LH, y la menor induce la liberación de FSH en tiempo posteriores a la de LH 2

La prueba consiste en determinar los valores bá-sales de FSH y LH, y luego administrar por vía oral 100 mg de citrato de clomifeno por día, divididos en 2 tomas diarias (50 mg a las 8 y 21 hs), durante 7 días. Al octavo día se toman 3 muestras de sangre (pool) para las determinaciones de LH y FSH.

Interpretación de los resultados: un aumento de LH entre 50 – 150 % y de FSH algo menor se considera normal. También se pueden dosar testosterona, estradiol y 17·-OH-progesterona, y así comprobar una repuesta adecuada y descartar algún eventual bloqueo enzimático.

Cuando el citrato de clomifeno se administra durante un período constante (por ej. 6 semanas), la LH aumenta entre 200-700 % y la FSH entre 70-360 %, alcanzando una meseta en un mes.

En la prueba que utiliza el GnRH sintético (Luteo-

Introducción

La evaluación endocrina de la función testicular involucra el estudio a nivel de:

a) Hipotálamo: GnRH / LHRH (factor liberador de FSH / LH).

b) Hipófisis: FSH y LH. Gonadotrofinas que impactan en sus receptores específicos lo-calizados en el testículo, en las células de Sertoli y Leydig, respectivamente.

c) Testículo: Esteroides: andrógenos y sus me-tabolitos / estradiol; péptidos: inhibina y sus isoformas y activina.

d) Proteínas Ligadoras Periféricas: globulina ligadora de esteroides sexuales (SHBG o GLAE)

a) HIPOTÁLAMO (GnRH)

El GnRH es un decapéptido sintetizado y liberado por las neuronas situadas en el área preóptica del hipotálamo. Estas neuronas tienen un ritmo in-trínseco de actividad conocido como “pulso gen-erador de GnRH”, el cual libera en forma pulsátil el compuesto hacia la circulación porta-hipofisiaria. En el hombre los pulsos acontecen entre 90 a 140 min, y su frecuencia es modulada por factores excitatorios e inhibitorios.

Se han desarrollado métodos para determinar por diversos inmunoensayos el GnRH. Sin embargo, esta molécula se halla en muy pequeña cantidad en la circulación, por lo que su evaluación se lleva a cabo por medio de la realización de pruebas dinámicas de estímulo o de inhibición. En las mismas se determi-nan los niveles séricos de LH / FSH (ver información adicional en el ítem 2).

b) HIPOFISIS (FSH, LH).

Entre los diversos métodos desarrollados para determinar FSH y LH circulantes, los inmunoensayos resultaron adecuados debido a su gran precisión, sensibilidad, especificidad y accesibilidad a labora-torios de alta y mediana complejidad. Sin embargo, es conveniente remarcar que diversas alteraciones moleculares como la presencia de determinantes an-tigénicos aberrantes o modificaciones en los carbo-hidratos en las moléculas pueden alterar estas deter-minaciones. Así, en estos casos es necesario recurrir a pruebas más sofisticadas, como son los bioensayos. Debido fundamentalmente a la secre-ción pulsátil de estas moléculas, las concentraciones de FSH y LH

EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-TESTICULARAlberto Gerardo Del Rio

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liberina, Gonadorlin, Relefact) al igual que que con el citrato de clomifeno, deben conocerce previamente los niveles basales de FSH / LH. Luego de adminis-trar 100 Ïg de GnRH por vía endovenosa, se toman muestras de sangre a los 15, 30, 60 y 120 min. Dos factores inciden en el resultado de este test, por un lado el número de receptores (R-GnRH) presentes en el gonadotropo y por el otro, el grado de sen-sibilización / desensibilización, en que se encuentra el efector. Si éste no fue previamente estimulado, la respuesta mediante una simple inyección es limitada, y en este caso se recomienda administrar GnRH me-diante una bomba de infusión (0,25 μg/min. durante 4 horas) y determinar posteriormente LH y FSH. Una variante, consiste en administrar durante 24 horas GnRH y otra sería mantener una infusión constante durante un período de 36 hs.

En condiciones normales, la administración de una simple inyección produce un incremento de hasta un 200 % de LH a los 30 min., siendo la res-puesta de FSH menor por las razones ya mencionadas.

Niveles elevados de gonadotrofinas sugieren un defecto a nivel testicular y en consecuencia se halla comprometida la retroalimentación negativa que ejercen los hormonas esteroideas y péptidos gonadales a nivel hipotálamo-hipofisario. Elevados valores basales de gonadotrofinas en el adulto están indicando fallas testiculares por la ausencia de una retroalimentación negativa. En varones adultos, con niveles normales y/o bajos de LH y FSH, es importante realizar las pruebas indicadas. Una re-spuesta normal de gonadotrofinas con el estímulo de GnRH y ausencia de estímulo con citrato de clomifeno es indicativo de una posible alteración a nivel hipotalámico. En ausencia de respuesta frente a las pruebas dinámicas, se estaría señalando una alteración hipofisaria.

TESTÍCULOEsteroides: andrógenos

Testosterona. Debido a que este esteroide se encuentra bajo el control rítmico de las gonado-trofinas hipofisiarias, su biosíntesis no es continua, y tampoco su secreción a la circulación periférica. Por lo tanto, para realizar su correcta cuantificación, es necesario realizar la determinación en un pool de por lo menos 3 muestras de sangre con extracciónes con una diferencia de 20 – 30 min. La testosterona, lo mismo que el estradiol y la dihidrotestosterona, circula en parte libre y en parte unida principalmente a dos proteínas de transporte: la albúmina, trans-

portador inespecífico de gran capacidad pero de baja afinidad de unión (Ka=104 M-1) y a una globulina capaz de unir andrógenos y estrógenos denominada globulina ligadora de esteroides sexuales (SHBG ó GLAE), de baja .capacidad pero alta afinidad para unir y transportar esteroides 17β-hidroxilados (tes-tosterona: Ka=109 10 M-1). Se considera que el 44% de la testosterona circula unida específicamente a la GLAE, 50 % inespecíficamente a la albúmina y aproximadamente 3 – 4 % en forma libre. El porcentaje de testosterona circulante se completa con uniones no específicas a otras moléculas cir-culantes, como por ejemplo a la CBG (molécula transportadora de corticoides). La fracción unida a la albúmina de baja afinidad, determina una velocidad de disociación elevada, por lo que junto con la testosterona libre representan las fracciones biológicamente activas en el organismo. La suma de estas 2 fracciones se denomina “testosterona biodisponible”.

Con estos considerandos, evaluaremos los deta-lles técnicos del dosaje de las tres fracciones: testos-terona total (To), libre (ToL) y biodisponible (Tobio).

Testosterona total (To). Diversas firmas ofrecen equipos comerciales

para la determinación de To en plasma o suero y más recientemente se incorporó la determinación en saliva. Los resultados se expresan en ng/ml y para su conversión a nmol/l se debe multiplicar por un factor de 3,467.

Testosterona libre (TL). El método de referencia consiste en una diálisis

en una diálisis, y se apoya en la propiedad de las hor-monas libres en atravesar una membrana de diálisis, mientras que la hormona unida queda retenida en el otro compartimento. Este método requiere utilizar la hormona marcada con tritio y se calcula el porcentaje de esteroide libre en el dializado.

Más accesible a un laboratorio de mediana o alta complejidad, son los equipos basados en un radioinmunoensayo (RIA) que utilizan un trazador análogo, y puede llevarse a cabo en uno o dos pasos. Este método esta basado en que el trazador no se une a las proteínas transportadoras y utilizando anticuerpos con afinidad por la testosterona ligera-mente menor al de la GLAE, sólo la TL compite con el trazador análogo por la unión al anticuerpo. Los coeficientes de variación de estas metodologías son de aproximadamente 2 –7 %.

En 1999 Vermeulen y col3, propusieron un pro-cedimiento para cuantificar la TL basándose en la ley de acción de masas y desarrollando una ecuación cuadrática que considera la constante de asociación

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(Ka) de la testosterona por la albúmina (3.6 x 104 L/mol), la asociación a GLAE (1 x 109 L/mol) y la concentración molar de albúmina, GLAE y la To. Si consideramos una concentración normal de albúmi-na en la población equivalente a 6.2 x 10- 1 mol/L, la fórmula puede ser simplificada4. Debe tenerse en cuenta que la fórmula no es válida en situaciones clínicas donde la concentración de albúmina se modifica, como por ejemplo en las Hepatopatías o en el Síndrome Nefrótico En estos casos, la fórmula puede utilizarse, pero estableciendo la concentración real de albúmina.

Testosterona biodisponible (Tbio). Dos met-odologías fueron diseñadas para determinar la Tbio. La primera, consiste en la precipitación con sulfato de amonio al 50% de saturación y la segunda en métodos matemáticos basados también en la ley de acción de masas.

El primero de los métodos fue desarrollado por Stumpf y col6 y consiste en una incubación del suero a 37°C con 3H-testosterona, y posterior precipitación en frío con sulfato de amonio al 50 % de saturación, proceso que permite una precipitación selectiva de la To unida a la GLAE. La separación se realiza en cen-trífuga refrigerada a 4°C durante 30 min. La cuantifi-cación de la radioactividad del sobrenadante permite obtener el porcentaje de To libre más la unida a albúmina Tbio. El cálculo final se realiza mediante la relación entre la actividad en el sobrenadante frente al total agregado a cada tubo. Para esta metodología se requiere un contador de emisión β.

El otro método proviene también de la fórmula propuesta por Vermeulen3, y permite calcular la con-centración de Tbio. En la bibliografía, como también en trabajos realizados en nuestro país, surge que el método de cálculo, tanto para la TL ToL como para la Tbio, es una alternativa válida para evaluar el estado androgénico en el hombre.

Dihidrotestosterona.

Es el mas potente andrógeno producido por el hombre y la mayor parte proviene de la transfor-mación periférica de la testosterona por acción de la enzima 5α-reductasa, y circula principalmente unida a la GLAE y a la albúmina. A pesar de que se cuenta con equipos para dosar esta hormona, rutinariamente se prefiere evaluar la transformación metabólica de este compuesto en el glucuronato de androstanodiol (3 α- Diol G), compuesto que surge de la conjugación del 3α-androstanodiol con el ácido glucurónico y constituye el metabolito más importante de la dihidrotestosterona. Este andró-

geno presenta una potencia equivalente al 75% de la testosterona.

Para evaluar el funcionamiento de las vías metabólicas testiculares, diversos inmunoensayos han sido desarrollados. Así, pueden determinarse la 17α-OH progesterona, androstenodiona, dehi-droepian-drosterona (DHEA) o su forma sulfatada (DHEAs).

Estrógenos:

17 β-Estradiol.El 20 % circulante proviene de la biosíntesis en el

testículo, el resto de la conversión periférica a partir de testosterona y androstenodiona. El método de elección es el RIA, aunque diversos equipos están disponibles para el dosaje de estradiol (automatiza-dos, RIA doble anticuerpo, RIA tubo recubierto, EIA pocillos sensibilizados, doble anticuerpo ultrasensible de 2da. y 3ra. generación, etc.). La determinación de estradiol en el hombre presenta dificultades debido fundamentalmente a su baja concentración en sangre y se debe tener en cuenta que diferentes fármacos interfieren en la determinación de la hormona.

Prueba dinámicas medianteestimulación con hCG.

La gonadotrofina coriónica humana (hCG), tiene una actividad similar a la LH, por lo que su adminis-tración ocasiona una estimulación de las células de Leydig incrementando la producción de testosterona y pequeñas cantidades de otros ester-oides. Dos tipos de pruebas pueden realizarse y en ambas es necesario conocer los valores basales de To y Estradiol (pool de 3 muestras) Una de ellas, involucra la administración durante 4 días de 1500 UI de hCG y al 5to día se determina To y Estradiol. El segundo tipo de prueba, la más utilizada, consiste en la administración de una única inyección de 5000 UI y se realizan determinaciones de To y Estradiol a las 2, 4 y 72 hs. (pool de 3 muestras).

Una respuesta normal del testículo ante el es-tímulo con hCG, muestra un incremento de To a las 4 horas, posteriormente tiene lugar una pequeña disminución, y a partir de las 12 horas se observa un incremento.constante alcanzando su valor máximo a las 72 horas de la administración del estímulo. El Es-tradiol alcanza el máximo de respuesta a las 24 horas luego de la administración de hCG. La 17α-OH-progesterona y la androstenodiona muestran una curva semejante a la observada para la To. Todos los parámetros citados retornan a los valores normales

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a los 5 días posteriores a la administración.Diversos medicamentos alteran esta Prueba tales

como la administración de estrógenos, andrógenos, progestágenos, corticoides etc., y ocasionan una inhibición en la producción de testosterona. Las respuestas negativas indicarían ausencia o severo daño en la capacidad esteroideogénica de las células de Leydig. Los pacientes con Síndrome de Klinefelter tienen disminuida su respuesta a la hCG, aunque no es raro que presenten niveles basales normales. También tiene valor esta Prueba para diferenciar una torsión testicular de otras patologías y en diferenciar pacientes prepuberales con Criptorquidia bilateral de aquellos con Anorquia Congénita.

Inhibina B. Es una glicoproteína formada por dos subunida-

des diferentes, unidas por puentes disulfuro (α-βB) En el varón el origen más importante de la inhibina son las células de Sertoli y mediante correlaciones entre los niveles de inhibina B circulantes y otros parámetros testiculares como ser el volumen tes-ticular y la concentración espermática, la inhibina B fue propuesta como marcador biológico sistémico

de la actividad de los túbulos seminíferos6. El aislamiento y el desarrollo de las técnicas bio-

químicas para cuantificar este compuesto, pre-sen-taron problemas metodológicos debido funda-men-talmente a la presencia en suero de múltiples precursores de esta molécula. El aislamiento de una inhibina B de 31 Kd, y el desarrollo de anticuerpos monoclonales, posibilitó la realización de ensayos para su identificación en sangre periférica. Así, Groome7 y col., utilizando dos anticuerpos contra distintos epitopes de la molécula, desarrollaron un inmunoensayo con alta especificidad y sensibilidad, en el que se basan los métodos por RIA.

4. Globulina ligadora de andrógenos y

estrógenosGLAE. En la evaluación de perfil endocrinológico mas-

culino, es necesario verificar los valores circulantes de esta proteína, la cual se ha observado que se modifica ante diversas situaciones patológicas. De-bido a que esta proteína es un compuesto de origen hepático, su síntesis, y secreción a la circulación está condicionado al estado funcional del hepatocito y a otras patologías extra-hepáticas (Hiper / Hipotiroid-ismo, Acromegalia, Alcoholismo, Hiperinsulinismo, etc.).

Todos los equipos automatizados existentes en el mercado tienen en su menú las posibilidades del dosaje de este partámetro que puede ser determi-nado mediante ELISA o RIA.

TABLA DE VALORES NORMALES (adultos) :

FSH (1.5 – 12.0 mUI/ml)

LH (1.2 – 8.6 mUI/ml)

TESTOSTERONA TOTAL (2.8 – 8.2 nmoles/ml)

TESTOSTERONA LIBRE ( 60 – 130 pmol/L)

TESTOSTERONA BIODISPONIBLE ( 5.0 – 14.0 pmol/l)

DEHIDROEPIANDROSTERONA ( 1,5 – 8.8 nmoles/ml)

DEHIDROEPIANDROSTERONA (S) (800 – 5500 nmoles/ml)

ANDROSTENODIONA ( 0,6 – 2,8 nmoles/ml)

17β-ESTRADIOL ( Hasta 35 nmoles/ml)

17α-OH PROGESTERONA (0.5 – 3.8 nmoles/ml)

ANDROSTENODIOL (3α- Diol G) ( 3.5 – 22.0 nmoles/ml)

INHIBINA B (≈ 120 pg/ml)

GLAE (SHBG) (15 – 70 nmol/L)

Bibliografía

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Próximos Fascículos

Fascículo IV :

Bases Moleculares de la Tumorigénesis

Oncogenes. Alberto Baldi

Factores de Crecimiento. Patricia Elizalde

Neuroendocrinología. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.

Hipotálamo. Hipófisis: estructura macro y microscópica.Pablo Scacchi

Neurotransmisores. Eduardo Spinedi

Fisiopatología de los tumores hipofisarios.Alberto Chervin

Hormonas DigestivasPablo Scacchi, Daniel Ponzo

Fascículo V :

Corteza suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico

Corteza Suprarrenal: Transporte. Metabolismo. Pruebas funcionalesMaría Olga Suescun

Sindrome adrenogenital, hiperaldosteronismoIgnacio Bergada

Hipercortisolismo , insuficiencia suprarrenal crónicaEsther Pardes

Metabolismo Hidrosalino. Hormonas: Hipotálamicas, Adrenal y Cardiovasculares. Fisiopatología y su Diagnóstico Ricardo Calandra, Sergio Aszpiz

Médula suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su DiagnósticoMartha Barontini

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