TP Nº 4 PCR y ELISAEnfermedades Infecciosas

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Trabajo Práctico Nº 4

“MÉTODOS MODERNOS DE DIAGNOSTICO: ELISA, PCR.”

Objetivos:

- Conocer los principales conceptos, fundamentos y aplicaciones de los test diagnósticos PCR y ELISA.

Actividades:

- CUESTIONARIO GUÍA: Revisión de las respuestas elaboradas por el alumno del cuestionario presente en la siguiente guía.

I. CONTENIDOS TEÓRICOS

Los siguientes conceptos serán evaluados en el PARCIAL.

El siguiente texto ha sido adaptado de “Principios básicos de la manipulación genética. Ingeniería genética”. Año: 2000. Universidad Nacional de Educación a Distancia (UNED). España.

1. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1.1 INTRODUCCION.

Dos son las estrategias básicas que se aplican para estudiar una secuencia específica de ADN: la clonación del ADN y la hibridación molecular. En la clonación del ADN, el fragmento buscado se amplifica y purifica con el fin de estudiar su estructura y su función. Con la hibridación molecular, lo que se pretende, no es amplificar la secuencia en cuestión, sino detectar el fragmento de interés dentro de una mezcla compleja de muchas secuencias diferentes; con este sistema se puede determinar la posición en el cromosoma, y también alguna información respecto de su estructura.

La amplificación que tiene lugar durante la clonación del ADN se basa en un aumento del número de copias de las secuencias de ADN seleccionadas. En la práctica esto involucra varios ciclos de replicación catalizadas siempre por la enzima ADN polimerasa.

La PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa) es una forma de clonación del ADN, puramente enzimática que se realiza totalmente in vitro. Representa uno de los avances más importantes y actuales de la historia de la biotecnología.

Hasta mediados de los años 80 la única estrategia posible para aislar un gen y disponer de grandes cantidades para su análisis era el clonado celular. En 1986, Kary B. Mullis descubrió la PCR, técnica que permite sintetizar grandes cantidades de ADN in vitro de una manera simple y elegante basándose en el procedimiento de replicación del ADN que la célula emplea in vivo. El descubrimiento le valió a Mullis el Premio Nóbel en 1993. La PCR ha sustituido en gran medida la amplificación de fragmentos por la clonación de células y tiene numerosísimas aplicaciones en diversos aspectos de la biología molecular. Es una técnica fundamental e imprescindible en ingeniería genética.

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La tecnología de la PCR está siendo aplicada en numerosos campos de investigación: gracias a esta técnica se pueden detectar enfermedades víricas, o tomar unas cuantas células fetales de la sangre de una mujer embarazada y realizar un análisis genético. La técnica está siendo ampliamente utilizada en medicina forense para aumentar pequeñas muestras, por ejemplo, de la saliva en el reverso de un sello de correos, y construir huellas de ADN que permitan esclarecer delitos. Los historiadores pueden emplear la técnica para estudiar la evolución, o las enfermedades de épocas pasadas, utilizando fragmentos de ADN de momias u otros restos. Los inspectores de sanidad pueden tomar muestras de hamburguesas, por ejemplo, y descubrir con qué carne fueron hechas, o averiguar a partir de una gota de vino la variedad exacta de uva de la que procede.

1.2 REACCIÓN DE LA PCR ESTÁNDAR: DESCRIPCIÓN.

La PCR es un método rápido de amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas dentro de una muestra. Habitualmente la reacción se diseña para permitir la amplificación selectiva de una o varias secuencias diana de ADN presente en una mezcla compleja de secuencias (por ejemplo ADN genómico total). Para que la amplificación sea posible es absolutamente necesario disponer de un mínimo de información sobre la secuencia a amplificar. Esta información permite la construcción de dos oligonucleótidos (oligos= pocos o algunos), habitualmente de 15 a 30 nucleótidos de longitud, complementarios de los extremos 3' de la secuencia diana, que actuarán como cebadores (iniciadores, en ingles primers) en la reacción.

Cuando se mezclan con ADN genómico desnaturalizado, los primers se unen específicamente a las secuencias complementarias de la región genómica que se quiere amplificar. Los primers están diseñados para que puedan iniciar la reacción de síntesis de ADN en presencia de una ADN polimerasa termoestable adecuada y de los precursores de ADN. Estos están representados por los cuatro desoxinucleótidos trifosfato: adenina (dATP), citocina (dCTP), guanina (dGTP) y timina (dTTP). Cada primer servirá para iniciar la síntesis de una hebra de ADN complementaria a una de las hebras del segmento de la diana, y las dos hebras de nueva síntesis serán complementarias entre sí. Se utiliza una ADN polimerasa termoestable debido a que la reacción pasa por ciclos en los que se cambia la temperatura, de esta manera se evita añadir la enzima manualmente en cada ciclo.

Cada uno de los ciclos consta de las tres etapas siguientes:

- Desnaturalización.- Apareamiento, unión, templado o annealing.- Extensión, síntesis o polimerización.

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1) Desnaturalización del ADN bicatenario presente en la muestra: típicamente calentando la muestra a 93-95 ºC, durante unos 30 segundos, se consigue la separación de la doble hélice en dos cadenas sencillas por ruptura de los enlaces de hidrógeno y consiguiente desapareamiento de las bases complementarias.

2) Unión específica de los primers a las cadenas sencillas mediante complementariedad de bases: a temperaturas que varían entre 50 y 70 ºC, dependiendo de la Tm (temperatura de fusión) del duplex esperado y durante un tiempo aproximado de unos 20 segundos, cada uno de los primers se une a una cadena diferente delimitando la secuencia diana que se pretende amplificar.

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3) Síntesis de ADN: típicamente a 70-75 ºC, comienza a funcionar la replicación incorporando nucleótidos sobre los primers y haciendo una copia completa y exacta de la cadena molde.

4) La PCR es una reacción en cadena porque las hebras de ADN de nueva síntesis sirven a su vez de molde para reacciones de síntesis en los ciclos posteriores.

Tras unos 30 a 40 ciclos, la PCR habrá generado aproximadamente millones de copias de la secuencia diana específica.

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5) Una vez amplificado el ADN, se dispone ya de cantidad suficiente como para que este pueda ser caracterizado. Se pueden analizar los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio y detectarlos como bandas discretas de un tamaño específico.

1.3 CONSIDERACIONES DE LOS REACTIVOS

Algunos microorganismos cuyo hábitat natural son las fuentes hidrotermales han servido como base para la purificación de ADN polimerasas termoestables. Por ejemplo, una de las enzimas más utilizadas, la Taq polimerasa, proviene de la bacteria Thermus aquaticus. Esta enzima es estable hasta 95 ºC, y su temperatura de trabajo óptima es de 80 ºC, requiere magnesio y carece de actividad correctora de errores (exonucleásica 3'→5'), por lo que puede introducir aproximadamente un nucleótido equivocado por cada 1.000 colocados a concentraciones altas de magnesio y uno por cada 1.000.000 colocados, en otras condiciones. Este índice de error no suele presentar problemas en la mayoría de las aplicaciones, pero ha de tenerse en cuenta y

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la magnitud puede ser importante si ocurre en los primeros ciclos de replicación. Otras polimerasas, como la obtenida de Pyrococcus furiosus (Pfu) o la aislada de la bacteria Thermococcus litoralis (Vent), incorporan errores con una frecuencia mucho más baja y pueden copiar fragmentos de mayor longitud que la Taq.

Para que la especificidad sea máxima, se debe evitar que la polimerasa y el resto de componentes estén a temperatura ambiente antes de iniciar el primer ciclo. La polimerasa puede añadirse una vez que se ha producido la primera desnaturalización del ADN. Para ello los reactivos se fraccionan y se mezclan en frío.

1.4 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA PCR COMO MÉTODO DE CLONACIÓN

1.4.1 Principales ventajas de la reacción.

I. Rapidez y sencillez de uso: La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco sofisticados. Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de desnaturalización, apareamiento, síntesis y re-asociación. Cada ciclo dura típicamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un termociclador (Figura) que lleva un microprocesador para programar los cambios de temperaturas y el número de ciclos deseado.

Termociclador

Por supuesto, el diseño y síntesis de los oligonucleótidos (primers) también lleva tiempo, pero este proceso ha sido simplificado gracias a la aparición de programas informáticos para el diseño de los primers (Primer3plus, ver figura) y a la proliferación de laboratorios comerciales especializados en la síntesis de oligonucleótidos (primers) por encargo.

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Programa Primer3Plus para el diseño de primers específicos. En azul se muestra la secuencia de nucleótidos del primer forward (sentido 5’3’), en amarillo el primer

reverse (sentido 3’5’) y en verde la secuencia del fragmento a amplificar.

II. Sensibilidad. La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades ínfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en una sola célula. Esta elevada sensibilidad ha permitido el desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis molecular y la aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense, diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc) donde las muestras pueden contener muy pocas células. Sin embargo, el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminación de la muestra con ADN extraño.

III. Robustez. La PCR permite la amplificación de secuencias específicas de material que contiene ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace problemática su purificación convencional. Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropología y paleontología molecular, por ejemplo para el análisis de ADN recuperado de individuos momificados y para intentar identificar ADN de muestras fósiles que contienen poquísimas células de criaturas extintas hace ya mucho tiempo. El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de muestras de tejidos fijadas con formol, lo cual ha tenido importantes aplicaciones en patología molecular.

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1.4.2 Principales desventajas de la reacción.

I. Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana. Para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como primers, para la amplificación selectiva de una secuencia particular de ADN, se necesita disponer de alguna información previa sobre la secuencia a amplificar. Esto implica, por regla general, que la región de interés ya haya sido parcialmente caracterizada, a menudo mediante la aplicación de métodos de clonación basados en sistemas celulares. Sin embargo, y para casos concretos, se han desarrollado varias técnicas que reducen o incluso hacen desaparecer esta necesidad de disponer de información previa sobre la secuencia del ADN diana, como es el uso de primers universales y la secuenciación de ADN.

II. Tamaño corto de los productos de la PCR. Una desventaja clara de la PCR como método de clonación de ADN ha sido el tamaño de las secuencias de ADN que permite clonar. A diferencia de la clonación de ADN en células, donde pueden clonarse secuencias de hasta 2.000.000 de pares de base, la información de que se dispone sobre la mayor parte de secuencias clonadas por PCR sitúa el tamaño de los fragmentos clonados entre 0 y 5.000 pares de bases. Los fragmentos pequeños se amplifican muy fácilmente, pero conforme aumenta su tamaño se hace más difícil obtener una amplificación eficiente. En la actualidad, sin embargo, ya es posible amplificar secuencias por PCR de tamaños entre 20.000 y 40.000 pares de bases.

Para identificar el tamaño de la secuencia de nucleótidos amplificada se utilizan marcadores de pares de bases. En la Figura se observa en el carril M el desplazamiento del marcador luego de la electroforesis en gel de agarosa. La banda más intensa representa un tamaño de 500 pares de bases. El tamaño de las bandas amplificadas en los carriles 1, 2, 3, 7, 8 y 9 se determina por comparación con el marcador en el carril M. Aproximadamente estas bandas tienen un tamaño de 200 a 250 pares de bases.

III. Infidelidad en la replicación del ADN. La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in vivo, proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia, en la célula, de mecanismos de lectura y corrección de errores. Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro aumenta la tasa de errores cometidos

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

500 pb

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durante el copiado. Ya se ha comentado anteriormente que la Taq polimerasa utilizada en la reacción no tiene actividad exonucleásica (actividad de corrección de errores en la inserción de nucleótidos).

IV. Peligro de contaminación. La facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción. En un tubo en el que se ha realizado una reacción de PCR hay tal cantidad de ADN, que al salir caliente del termociclador y abrir este tubo, el vapor alcanza el ambiente del laboratorio y lo contamina completamente de fragmentos de ADN. Es por ello que se necesita trabajar en un laboratorio correctamente acondicionado para evitar la contaminación. Este laboratorio dispone de áreas definidas para cada actividad.

Para prevenir la contaminación, los laboratorios deben disponer de barreras. Existen dos tipos de barreras: físicas y químicas.

A- Barreras físicas:

1) SEPARACIÓN ESTRICTA de los lugares donde se preparan muestras y reactivos de los lugares, donde se carga el ADN, se produce la amplificación y se realiza el análisis por electroforesis de las secuencias amplificadas. Para ello el laboratorio debe disponer de áreas pre y post PCR (ver Figura).

2) Cada área debe estar EQUIPADA con una dotación propia de guantes, guardapolvos, pipetas libres de aerosoles, tips con filtro y sistemas de ventilación adecuados.

3) Realizar el PREMEZCLADO de reactivos para reducir pasos de pipeteo y ALICUOTADO de los mismos. Esto se realiza en cabinas de flujo laminar especiales (ver Figura) para la realización de estos pasos metodológicos.

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4) CUIDADO en el pipeteo y manejo del producto de amplificación para evitar aerosoles.

B- Barreras químicas:

1) Las áreas pre y post PCR deben deben ser lavadas con hipoclorito de sodio 10%, el cual debe removerse posteriormente con etanol. Estas sustancias producen daño oxidativo a los ácidos nucleicos haciendo que estos NO puedan ser re-amplificados.

2) Realizar esterilización mediante luz UV de los materiales utilizados antes de la realización de la PCR. La luz UV genera inactivación de los ácidos nucleicos.

2. ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

Los siguientes conceptos serán evaluados al comienzo del desarrollo del trabajo práctico Nº 4 (evaluación pre-práctica). El siguiente texto ha sido adaptado de “Principios básicos de la manipulación genética. Ingeniería genética”. Año: 2000. Universidad Nacional de Educación a Distancia (UNED). España.

2.1 FUNDAMENTO.

ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual se utiliza una fase sólida (pocillo) que posee un antígeno inmovilizado por un anticuerpo adherido al pocillo (ver (1) de la figura). Este antígeno inmovilizado (ver (2) en la figura) se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. En ocasiones, con el fin

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de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno (ver (3) en la figura) y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada (ver (4) en la figura). La reacción antígeno-anticuerpo será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico, que al actuar con la enzima adherida al anticuerpo secundario, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro (ver (5) en la figura).

La reacción se realiza en una placa de poliestireno con varios pocillos. En cada pocillo se produce la reacción antígeno-anticuerpo.

Placa con pocillos

3.2 Pasos generales de un ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.

2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.

3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpoo antígeno tapizado en el pocillo.

4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido.

5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima.

6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo.

7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.

8. Adición del substrato

9. Unión del substrato a la enzima.

10. Desarrollo del color

11. Se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.

3.3 Lectura e interpretación de los resultados.

La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimétricamente. A simple vista, pueden ser leídos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificación y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variación de 0,1 de densidad óptica) ya que dicha lectura visual tendrá el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos límite. No obstante, evita la adquisición de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacas.

Lectores de microplaca de ELISA

Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática de microplacas. Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada. Para una mejor compresión de la interpretación de los resultados leer la sección DISCUSIÓN DIRIGIDA de la presente Guía de TP.

3.2 CLASIFICACION DE ELISA

3.2.1 ELISA NO COMPETITIVO:

Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el anticuerpo conjugado con la enzima reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color. Las pruebas de ELISA no competitivas se pueden clasificar en dos grandes grupos:

• ELISA para detectar antígenos: ELISA directo o sándwich. • ELISA para detectar anticuerpos: ELISA indirecto.

3.2.1.1 ELISA DIRECTO o “SANDWICH” NO COMPETITIVO PARA DETECTAR ANTIGENOS

El ELISA sándwich es un ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos. Se utiliza un anticuerpo anti-antígeno primario para detectar al antígeno y un anticuerpo anti-antígeno secundario para marcar al antígeno.

APLICACIÓN EN VETERINARIA

ELISA Captura Inmune: La peste bovina (en alemán = rinderpest) es una de las enfermedades más devastadoras del ganado vacuno. La mortalidad es del 80 al 90% cuando los animales están infectadas con las cepas más virulentas. Los signos clínicos son fiebre, secreciones de la nariz y los ojos, úlceras y otros daños en el aparato digestivo superior y las vías respiratorias. Además cursa con una enteritis caracterizada por diarrea, deshidratación y muerte. El Instituto de Sanidad Animal de Pirbright (Inglaterra) desarrolló un dispositivo similar a las tiras reactivas que se utilizan para las pruebas de embarazo. El método consiste en frotar un hisopo en la conjuntiva ocular del animal. Los hisopos se agitan en un pequeño volumen de un líquido contenido en un recipiente provisto por el kit. La muestra húmeda se aplica entonces en la ventana redonda del dispositivo (ver Figura). Las partículas de virus presentes en la muestra (antígeno), viajan por efecto capilar sobre el soporte sólido. Si el virus está presente, aparece entonces una línea de color, en cuestión de minutos, en la ventana del medio. Esta línea representa la unión del antígeno viral a su anticuerpo específico adherido al soporte sólido y el reconocimiento del antígeno por los anticuerpos adheridos a las partículas de látex (ver Figura). En la parte superior de la ventana aparece la línea control, formada por el atrapamiento y deposito de los anticuerpos adheridos al látex y los anticuerpos especie-específicos adheridos al soporte sólido. Este Instituto de Sanidad Animal ha utilizado esta tecnología para desarrollar un dispositivo similar para la detección rápida del virus de la fiebre aftosa.

3.2.1.2 ELISA INDIRECTO PARA DETECTAR ANTICUERPOS

En este tipo de ELISA el antígeno adherido al pocillo, reacciona con el anticuerpo específico (presente en la muestra problema). El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de los anticuerpos (fracción Fc del anticuerpo). Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos.

APLICACIÓN EN VETERINARIA

Kit ELISA para Neospora caninum : Neospora caninum es un protozoo que fue originalmente descrito como un parásito canino, en el que provoca miositis y

RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN DE

LÁGRIMAS

Partículas de látex recubiertas de anticuerpos.

Anticuerpos específicos del virus Peste Bovina.

Anticuerpos especie específicos.

Virus de la Peste Bovina.

encefalitis. La neosporosis bovina es ahora reconocida como una causa importante de aborto espontáneo en el ganado. Es altamente sospechoso en las explotaciones con abortos a repetición. Una vaca que es seropositiva a N. caninum tiene un riesgo tres veces mayor de abortar que una vaca que es Neospora-negativa. La transmisión vertical es lo más frecuente (al menos el 80% de los terneros nacidos de vacas seropositivas están infectados). Si la prueba serológica se realiza antes que el ternero ingiera calostro se puede detectar la infección pre-natal. Para ello se ha desarrollado un ELISA indirecto que detecta anticuerpos en los animales infectados. El fundamento de esta prueba serológica se observa la figura. La muestra que se utiliza es suero de los bovinos sospechosos que poseen los anticuerpos.

3.2.2 ELISA COMPETITIVO:

En este sistema también es muy utilizado para la detección de anticuerpos específicos. Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal), frente a un antígeno conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la placa. Se denomina de competición ya que los anticuerpos (presentes en el suero problema) son incubados previamente con el antígeno, antes de incubarlo con el anticuerpo fijado en la placa, y por lo tanto compite con él. Los pasos siguientes son la adición e incubación del conjugado (anticuerpo marcado con la enzima), lavado y finalización con el agregado del sustrato y posterior lectura de la intensidad de color en espectrofotómetro.

Fases de la Técnica Elisa de competición. (1) Se incuba el suero problema con el antígeno. (2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un anticuerpo, (3) se añade el conjugado –anticuerpos marcados con enzima- y (4) se agrega el sustrato. En este caso, la ausencia de color sería positiva.

En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el anticuerpo conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

APLICACIÓN EN VETERINARIA

ELISA COMPETITIVO para detección de anticuerpos anti-Brucella: La prueba de ELISA Competitiva en fase sólida (ELISA-C) está diseñada para detectar anticuerpos específicos contra brucelosis en muestras de sueros de diferentes especies animales. El procedimiento de la prueba tiene su fundamento en que las muestras de suero son expuestas a un antígeno lipopolisacárido de Brucella abortus lisa (S-LPS) unido al fondo de los pocillos de una microplaca de poliestireno, conjuntamente con la adición de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para un epítope de una porción del antígeno S-LPS. Este anticuerpo se encuentra marcado con una enzima. Se produce una competencia entre el anticuerpo anti-SLPS del animal sospechoso de brucelosis y el anticuerpo monoclonal del ratón anti-SLPS.