enzim & kinetika
TRANSCRIPT
ENZIM & KINETIKA ENZIM
• Molekul protein yang dihasilkan sel hidup• Katalis reaksi biookimia spesifik• Secara molekuler
merupakan protein yang tersusun atas serangkaian asam amino dalam komposisi dan sekuens yang teratur dan tetap
“SISI AKTIF ” (bag permukaan enzim yang berinteraksi dengan substrat)
• Tata Nama Enzim dan Klasifikasi
• Berdasarkan sumber enzim nama dagang (papain, bromelin)• Berdasarkan jenis reaksi, jenis substrat atau bentuk yang
dihasilkan (+)-ase (lipase, protease)• “International Union of Biochemistry”
E.C. (Enzyme Commision) + 4 bilangan (alkohol dehidrogenase E.C.1.1.1.1)
Contoh : alkohol dehidrogenase (E.C. 1.1.1.1)
• Reaksi Enzim
~ Model Lock & key (Emil Fisher)~ Model Induce Fit (Koshlan) Sisi aktif tidak kaku, substrat & asam amino enzim menginduksi
shg terbentuk struktur ruang yang tepat antara E dg S
• Struktur Enzim
Apoenzim (protein)Koenzim (non protein)
holoenzim
Gugus prostetik (terikat kuat : heme, flavin, biotin)
Kofaktor (terikat kurang kuat ):~ logam (Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, K+, Na+)
metaloenzim
~ turunan vitamin (NAD, FAD, thiamin pirofosfat)
• Aktifitas Enzim
Kerja enzim : mempercepat reaksi dengan menurunkan energi aktivasi (Ea)
Reaksi : E + S ES P + E (E-S) : kompleks aktif
Contoh : pemecahan H2O2 : 18.000 kalori/mol
~ katalis Pt : 11.700~ katalase : 5.500
→ waktu
Energi aktivasi
C (hasil)
B (E–S)
A
Ea
→ e
nerg
i
a. Pengaruh pHpH
pH optimum
Kec. maksimumK
ec. r
eaks
i
suhu
suhu optimum
Kec. maksimum
Kec
. rea
ksi
b. Pengaruh suhu
Kec
. rea
ksi
Kec. maksimum
2mV
Vm
Km
[substrat]
Vm: kec. Reaksi maksimumKm: konstanta Michaelis
c. Pengaruh [substrat]
Pem
bent
uka
n P
rodu
k
Waktu
d. Pengaruh aktivator
enzim
Enzim1 aktivator
Pem
bent
uka
n P
rodu
k
Waktu
d. Pengaruh inhibitor
enzim
Enzim1 inhibitor
Kinetika Enzim• Cabang Enzimologi : membahas faktor-faktor yang
mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis.• Mempelajari sifat-sifat enzim/mekanisme kerja
aplikasi (disain proses) → parameter kinetika
Persamaan Michaelis-Menten
E + S ES E + PK1 K2
K-1
Laju pembentukan produk/pengurangan substrat
1..................ESKdt
sd
dt
pd2
V
Vmaks = K2 [ES]
Konsentrasi enzim yang jenuh oleh S
Keadaan Setimbang
12
T1
TT
12
1
12
121
KK
SESEKES
ESEEESEE
KK
SEKES
ESKK
ESKESKSEK
S
KKK
SEKV T
1
12
2
2................................................SKKK
SEKES
112
T1
Substitusi (1) → (2)
Saat ET = ES Vmaks = K2[ES] = K2[ET]
1
12
K
KKKm
Bila Konstanta Michaelis-Menten
SK
SVV
m
maks
Persamaan Michaelis-Menten
Saat V = ½ Vmaks Km = [S]
Km →[S]
Vmaks
½ Vmaks
Line Weaver-Burk
maks
m
V
KSlope
V
1
mK
1
ba
• Unit Enzim Uadalah : jumlah enzim yang melakukan katalisis, sehingga terjadi perubahan 1 mol substrat per menit (kondisi tertentu)
• Aktivitas Enzim U/mL
• Aktivitas Spesifik U/mg protein enzim
ukuran kemurnian
maksV
1
maksmaks
m
VSV
K
V
11.
1
S1
Contoh :
[S] (Mol) V(mol/L.min) 1/[S] 1/V
8.35 x 10-6 13.8 12 x 104 7.24 x 10-2
1.00 x 10-5 16.0 10 x 104 6.25 x 10-2
1.25 x 10-5 19.1 8 x 104 5.23 x 10-2
1.67 x 10-5 23.8 6 x 104 4.20 x 10-2
2.0 x 10-5 26.7 5 x 104 3.75 x 10-2
2.5 x 10-5 30.8 4 x 104 3.25 x 10-2
3.3 x 10-5 36.2 3 x 104 2.76 x 10-2
5.0 x 10-5 44.5 2 x 104 2.25 x 10-2
1.0 x 10-4 57.2 1 x 104 1.75 x 10-2
2.0 x 10-4 66.7 0.5 x 104 1.50 x 10-2
-6 -4 -2 0 8642 10 12
11/Vmaks = 1.25 x 10-2
Vmaks = 80 mol/L.min
-1/Km = -2.5 x 104
Km = 4 x 10-5 M
1/V( mol/L.min)-1.102
1/[S] (M-1x10-4)
Soal : Hitunglah perubahan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk meningkatkan laju reaksi dari 15 % menjadi 75 % dari laju reaksi maksimum, bila laju reaksi mengikuti HUkum Michaelis-Menten
Jawab
mm
mm
mm
maksmaks
m
maks
KSKS
KS
KS
SK
S
SK
S
VVVV
SK
SVV
31765.025.0
75.0
85.0
15.0
75.015.0
%75%15
.
21
21
2
2
1
1
21
Perubahan konsentrasi S yang dibutuhkan untuk meingkatkan laju reaksi dari V1→V2 = 3 Km/0.1765 Km
=16.9972 kali17 kali
Syarat Penelitian Kinetika Enzim :
1. Substrat, buffer, dll harus murni
2. Tidak boleh ada enzim lain
3. Enzim stabil pada kondisi yang digunakan
4. Harus dicek apakah laju reaksi ~ enzim yang ditambahkan
5. Laju reaksi produk vs t → linier ?
konsumsi substrat
Inhibisi EnzimInhibitor mengurangi laju reaksi yang dikatalisis enzim
Studi inhibisi enzim :• Bagian aktif enzim• Mekanisme kerja enzin• Gugus fungsi aktif• Fisiologi enzim
Jenis penghambatan :• Kompetitif• Non kompetitif• Unkompetitif
Penghambatan :Produk : amiloglukosidase oleh glukosa
invertase oleh glukosa dan fruktosa substrat
Inhibisi Bersaing (kompetitif)S dan I bersaing pada bagian aktif enzimE + S ES → E + PE + I EI Inhibitor dapat dihilangkan dengan S >>
→Km >
1/S
1/V
Tanpa inhibitor
dengan inhibitorAs. Malonat vs as. suksinat s. dehidrogenase as. fumarat
Inhibisi Tidak Bersaing (non kompetitif)S dan I berikatan dengan enzim pada tempat yang berbeda
1/S
1/V
Tanpa inhibitor
dengan inhibitor→Vmaks <
Ion logam berat vs gugus sulfohidril (SH) dari sistein
Inhibisi uncompetitiveterikat secara reversibel ke dalam kompleks ES sehingga dihasilkan ESI inaktif
Km, Vmaks
berubah
1/S
1/V
Tanpa inhibitor
dengan inhibitordenosil metionin vs ATP
KInetika Michaelis-Menten tidak dapat diterapkan pada inhibisi irreversibel I membentuk ikatan dengan mol enzim yang tidak dapat dipisahkan dengan dialisis atau cara sejenis.
Sumber Enzim1. Tanaman (papain, bromelin, ficin)2. Hewan (renin)3. Mikroba
• Perkembangbiakan t <• Rendemen ekonomis• stabil
Enzim Komersial amilase : Aspergillus aryzae
Bacillus subtilis
• Selulase : Aspergillus spTricoderma reesei
• Glukoamilase : A. nigerRhizopus sp
• Lipase : Aspergillus sp.Rhizopus sp.Candida cylindraceae
• Protease : Aspergillus niger]A. oryzaeRhizopus sp.Bacillus sp.
Aplikasi Enzim di Industri1. Industri Non Pangan
• Analisis di Lab glukosa oksidase• Medis penisilin asilase, L-asparaginase, amilase, selulase,
lipase, protease• Kertas amilase• Deterjen protease, amilase, lipase
2. Industri Pangan• Gula Cair amilase, glukoamilase, glukosa isomerase• Keju rennin, lipase• Sari Buah pektinase
3. Biosensor• Biokimia+mikroelektronika
Biosensor (enzim imobil→sinyal fisikokimia) transducer (sinyal elektrokimia) amplifier pengubah sinyal dan pemroses data pencetak data
Golongan Aditif Enzim yang Distabilkan
Substrat dan Senyawa yang sejenis
Mg ATP Glutamat deaminase
Aspartat Glutamat deaminase
NAD, NADP Laktat dehidrogenase
Senyawa Organik dengan BM
Diamin Amilase, protease
Metanol Ribonuklease
Etilen Glikol -Laktanase
Dioksan Tripsin
Gliserol Ribonuklease, katalase, endonuklease
Sukrosa Khimotripsin
Laktosa Ribonuklease
Glukosa Lisozim
As. Askorbat Katalase
Senyawa Karbon Polimer Ca Protease
Na Sitrat Lisozim, Katalase
PEG Invertase
Hidroksi Etil Selulosa -glukosidase
Matil Selulosa Glukosa Oksidase
ENZIM
1. Larut dan tidak stabil Hanya dapat digunakan satu kali dalam larutan bebas
2. Enzim sangat mahal dan merupakan bahan yang sulit diperoleh dalam jumlah memadai
Harus digunakan cara yang ekonomis dan dapat memperpanjang
aktivitas biologisnya
Imobilisasi(membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan)
Struktur granula enzim padat yang stabil dan tidak larut air.
DEFINISI (Chibata, 1978) : Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu.
Metode Imobilisasi :1. “Carrier Binding
• Teknik paling lama dan umum• Enzim diikat pada “carrier” (matriks) yang tidak larut air
luas permukaan diemeter pori→ muatan enzim
• Jenis :a. Adsorbsi fisik
Mudah dilakukan dan ekonomis Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier”
Kelebihan : Kondisi lunak → aktivitas enzim tetap tinggi Dapat diregenerasi
Kelemahan : Kekuatan ikatan lemah
pH atau kekuatan ion berubah → bocor! Enzim dirusak oleh m.o/enzim proteolitik
E
Contoh “Carrier” untuk adsorbsi fisik :
• Karbon aktif • hidroksil apatit• Gelas porous • gel Ca-fosfat• Tanah liat • pati• Kaolinit • gluten• Alumina • butil sepharosa• Silika gel • concana valin A• Bentonit
Karbon aktif
-amilase
Aduk 10 0C, 1 jam Saring
Enzim Imobil
Lar. Pati
Amilase imobil
Gula
b. Ikatan Ionik • Terjadi ikatan ionik antara enzim dengan “carrier” yang tidak larut air dan
mengandung residu penukar ion (R)
R R R R
E
Substrat (camp. a.a.)
DEAE-sephadex + air
+ Aminoasilase + buffer fosfat (pH 7)
Jaket air
Terjadi interaksi antara gugus amine (carrier) yang bermuatan (+) dengan gugus karboksil (enzim) yang bermuatan (-)Setelah 32 hari → keaktifan masih 60 %
c. Ikatan Kovalen• Terbentuk ikatan kovalen antara enzim dengan “carrier” tidak larut dalam air
ikatan kuat & tdk bocor• Gugus fungsional enzim yang berperan :
1 atau -amino2 , , atau -karboksil3) Sulfohidril4) Hidroksil5) Imidazol6) Fenolik
• “Carrier” mengandung gugus reaktif : Diazonium Asam azida Isosianat Halida
• Kelemahan : konformasi berubah → aktivitas hilang
“carrier”
E
2. Cross Linking (Ikatan Silang)• Terjadi ikatan kimia, tetapi tidak digunakan carrier tidak larut air
Pembentukan ikatan melintang inter molekuler antara moleklul enzim dengan pereaksi bifungsional atau multifungsional.
• Pereaksi : glutaraldehid paling banyak digunakan diazobenzidine (atau turunannya) Etil chloroformate N-N-hexamethilene bisiodoasetat dll
Untuk meningkatkan stabilitas cross linking + adsorbsi
• Kopolimerisasi
Epolimer
3. Entrapping (penjeratan)• Lokalisasi enzim dalam kisi matriks atau mikrokapsul (membran
semipermeabel) Enzim tidak terikat pada matriks gel atau membran
dapat digunakan secara luas
tipe kisi
• Kennedy gel entrapmentfibre entrapmentmicrocapsulation
• tipe mikrokapsul
Tipe kisi
1 – 300 m
Membran polimer permanen
Mikrokapsul tidak permanen
Bahan :• Nilon• Poliurea• Etil selulosa• Polistiren• Kolodion• Nitroselulosa• Butil asetat selulosa
Cara Penjeratan Tipe Kisi
ENZIM enzim
Lar. Na-alginat 2 %
Makropipet 2 mL
CaCl2 0.1 M
Skala 4.5
Gel kalsium alginat yang berisi enzim
GEL* Na-alginat 50 mL, 4 % b/v
+50 mL suspensi sel
(25 g bobot sel basah)
dicampur
diteteskan
Lar. CaCl2 0.05 M(pH 6 – 8), 370C
Beads 2 – 8 mm
Diamkan 200C, 1 jam
Bilas dengan air
Rendam dalam CaCl2 0.05 M (semalam) 40C
Siap digunakan
Entrapment Enzim dengan Poliakrilamida (Gel Entrapment)E + CH2=CH + CH2=CH | | CONH2 C=O
|NH |CH2
|NH |C=O |CH=CH2
akrilamidaN,N’-methylene bis-acryl amide
polimerisasi
|NH |CO CONH2
| |-CH2-CH -CH2-CH -CH2-CH -CH2-CH -CH2-
| | CO CO | |NH NH | |CH2 CH2
| |NH NH | |CO CO
| |CH-CH2 - CH-CH2-C - CH2 –CH-CH2-
| |CONH2 CO
Matriks polimer merupakan ikatan silang akrilamida
poliakrilamida
Perubahan Sifat Enzim Terimobilisasi
1. Aktivitas
V1 tidak deaktivasi enzim akibat imobilisasiV2 kemungkinan untuk mengimobilisasi enzim lebih banyak/sedikkit per unit volume katalis
Penyebab penurunan aktivitas :• Konfigurasi enzim menghalangi substrat• Grup reaktif pada sisi aktif enzim ikut terikat pada matriks• Terbentuk konfigurasi tidak aktif• Kondisi reaksi denaturasi
V1(aktivitas relatif) Perbandingan aktivitas enzim imobil vs enzim larut
dalam jumlah sama
V2 (aktivitas spesifik absolut) Kecepatan reaksi per unit berat atau unit volume
seluruh katalis
2. pH optimum enzim imobilPenyebab perubahan pH : distribusi yang tidak seragam dari ion H+, ion OH- dan substrat
bermuatanCarrier bermuatan negatif pH optimum bersifat basa
CMCMaleac anhydride/ethyleneAsam galakturonatAsam poliaspartatAsam porous
Carrier bermuatan positif pH lebih asamDEAE-selulosaPolimer polyornithyl
c a b
Akt
ivita
s R
elat
if (%
)
→ pH4 7
a : enzim chymotripsin larutb : kopolimer chym – anhydride ethylene (-)c : chym – polyornithyl (+)
3. Stabilitas Stabilitas operasi = t1/2 (half-life) = waktu dimana terjadi kehilangan 50 % dari aktivitas enzim semula
E
Elog
t
2.303k
k
0.693t 0
21
k = konstanta kerusakan enzimt = waktu operasiE0 = aktivitas enzim mula-mulaE = aktivitas enzim pada wktu t
Pengukuran Efisiensi Imobilisasi
(Aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga)
• Larutan enzim : aktifitas : 591 U/mLvolume larutan : 40 mL
Total aktifitas : 40 x 591 : 23600 U
• Berat Penyangga : 11 gram
Setelah mobilisasiAktifitas enzim terimobilisasi : 381 U/g penyangga Total aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga = 11 x 381 U = 4191 U
Persentase aktifitas enzim teradsorbsi = 4191/23600 x 100% = 17,8 %
Imobilisasi Sel :• Meningkatkan konsentrasi biomassa produktivitas >• Decoupling konsentrasi sel dengan waktu tinggal• Operasi kontinyu pada residence time pendek, tidak terjadi wash out• Biomassa dapat digunakan kembali• Dapat digunakan tipe bioreaktor lain (fixed bed dan fluidized bed)• Pemisahan biomassa lebih mudah
Metode :1. Carrier biding : E. coli
A. oryzae, dll2. Entraping paling banyak diteliti
Matrik yang digunakan :• Kolagen → tipe membran• Gelatin• Agar• Selulosa triasetat → serat-serat selulosa• Alginat• Poliakrilamida• polistiren
3. Cross linking : e. coli
Aplikasi Enzim Imobil
• Produksi Glukosa dari Pati
Pati Jagung glukosa glukoamilase
imobil
Carrier : keramik SiO2
Bioreaktor : plug flow (sinambung) t1/2 : 40 0C = 900 hari
50 0C = 100 hari 60 0C = 13 hari
• Produksi Fruktosa dari Glukosa
Glukosa FruktosaGlukoisomerase imobil
Intraseluler mahal
• Produksi Asam AminoCampuran DL asan amino (metionin) D + LEnzim L-amino acid : acylaseCarrier : DEAE-Sephadex → kestabilan 2 th.Ukuran reaktor : 1000 mLBiaya 60 % proses batch konvensional
• Aplikasi Analitis→ elektrode enzim
enzim imobil
Bia
ya r
elat
if (%
)
imobil
: DEAE-sephadex: bahan bakar: tenaga kerja: enzim: substrat
Sistem Monitoring Glukosa
Kolom kapiler
Glu.oksidase
Elektroda O2
Recording elektrometer
Contoh (glukosa)
Glukosa O2
Glukoksidase Glukonolakton + H2O2
O2 diukur dengan elektroda