enzimas de restrição. tópicos a abordar diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo i, ii,...
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Enzimas deRestrição
Enzimas deRestrição
Tópicos a abordarTópicos a abordar
Diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo I, II, III)
Enzimas do tipo II e sequências de reconhecimento (4, 6, 8 nts)
Izosquizômeros e enzimas compatíveis
Hidrólises múltiplas
Aplicações em engenharia genética
Mapas de Restrição
Nota HistóricaNota Histórica
1940
1950
~1940 – Experiências com bacteriófagos
~1950 – Diferentes eficácias de infecções por parte dos bacteriófagos. Variações entre estirpes bacterianas.
1953
1953 – Estrutura do DNA (Watson Crick)
1956
1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg)
1966
1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)
1970
1970 – Purifica-se a primeira enzima de restrição tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox)
1972 2006
1972 – Primeiras experiências com DNA recombinante (Berg & Boyer)
1978
1978 – Isolamento e caracterização de mais de 200 enzimas de restrição
Prémio Nobel – W. Arber, H. Smith e D. Nathans
in educar.sc.usp.br
Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição
Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8
bases - palíndromas
in educar.sc.usp.br
Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição
Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de
vírus invasores
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de
bases de DNA
Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de
determinados genes
in 1fiuA-1crf_-active
NomenclaturaNomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia coli 1º enzima a ser descoberta nesta
bactéria
GéneroEstirpe Espécie
Ordem de descoberta
Sistemas de Restrição - Sistemas de Restrição - ModificaçãoModificação
Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA fágico
na célula
Combinação de enzimas de restrição com metilases
hidrólise do DNA “estranho”
protecção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição através da adição de grupos metil às bases A ou C
DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que
os enzimas de restrição
Existem raras exceções em que a metilação pode provocar a
activação do enzima de restrição
Sequências de reconhecimentoSequências de reconhecimento
Não ambíguas
Exemplo:
BamHI - só reconhece a sequência GGATCC
CCTAGG
Ambíguas
Exemplo:
HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas
por GA e que terminem em TC
Tipos de enzimas de restriçãoTipos de enzimas de restrição
Classificação baseada em:
Composição da sequência nucleotídica
Posição de clivagem
Sequência de reconhecimento
Co-fatores envolvidos
Estrutura da enzima em causa
in Lenhinger Principles of Biochemistry
Tipos de enzimas de restriçãoTipos de enzimas de restrição
Tipo I
3 subunidades:
1 subunidade de restrição (“R”)
1 subunidade de metilação (“M”)
1 subunidade de reconhecimento (“S”)
Sequência de reconhecimento é assimétrica
Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
Tipo III
2 subunidades: 1 subunidade de restrição (“R”) 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”)
Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp)
Dupla cadeia de DNA hemimetilada
Local de hidrólise a mais de 24-26 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
Tipo II Duas enzimas:
1 enzima de restrição (Endonuclease)
1 enzima de metilação (Metilase)
Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α
Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts
Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência
reconhecida
Não necessita de ATP, apenas Mg2+
Importantes na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte)
IzosquizômerosIzosquizômeros
Diferentes enzimas de restrição que possuem a
mesma sequência de reconhecimento
Diferem nas condições ótimas de reação, na
estabilidade
Enzimas de restrição
Sequência de reconhecimento
SacIGAGCTC
CTCGAG
SstIGAGCTCCTCGAG
Exemplo:
Enzimas compatíveisEnzimas compatíveis
Produzem extremidades protuberantes compatíveis
Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento
DNA recombinado com sequência híbrida
Enzimas de restrição
Sequência de reconhecimento
BamHIGGATCC
CCTAGG
BglII AGATCTTCTAGA
Exemplo:
Factores que influenciam a Factores que influenciam a atividade das enzimas de atividade das enzimas de
restrição:restrição:Composição do tampão Diferem na força iónica (concentração de sal)
Diferem no catião principal (Na+ ou K+)
Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0)
Digestão com múltiplas enzimas
Influência da metilação no DNA Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
Temperatura de incubação A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a incubação a 20ºC
Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática
As endonucleases de restrição do tipo II ligam-se ao sulco maior da forma b-DNA
A ligação não específica permite à enzima ‘deslizar’ pela cadeia ligada apenas ao ‘backbone’ da molécula de DNA
A ligação específica leva à alteração da dupla hélice de DNA, para aproximar melhor as bases dos centros catalíticos
A metilação de uma base impede a ligação específica e a formação do complexo
Dois tipos de ligação: não específica e específica
Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática
A hidrólise dá-se ao nível das ligações fosfodiéster
Mg2+ é um cofator essencial, mas pode ser substituído por certos cátions divalentes, como Mn2+
Produtos da hidrólise resultam em extremidades 3’-OH e
5’-P
5’
3’
5’
3’
Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática
A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar origem a pontas cegas (“blunt ends”) ou pontas coesivas (“sticky ends”)
Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por uma DNA-ligase, mesmo sendo de origens diferentes
Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a cadeias com sequências complementares
Extremidade cega (blunt ends)
Clivam as duas cadeias de DNA em
ligações fosfodiéster opostas
Extremidade coesiva (sticky ends)
Clivagem assimétrica nas cadeias de
DNA
Pequeno número de nucleotídeos em
cadeia simples, capazes de se associar
por ligações de hidrogénio, com outra
cadeia simples em que a sequência de
bases seja complementar desta
(annealing)
Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática
Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática
A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do número de enzimas utilizadas na obtenção de fragmentos de DNA
Hidrólise múltipla: DNA hidrolisado por mais que uma enzima de restrição Determinação das posições dos fragmentos no DNA, produzidos pelas enzimas, com a ajuda da eletroforese
Hidrólise simples: Digestão do DNA com uma única enzima de restrição Determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear
Aplicações em Engenharia Aplicações em Engenharia GenéticaGenética
O termo “engenharia genética” inclui: métodos para a formação de combinações novas do material genético introdução e replicação do DNA recombinante numa bactéria para amplificar o gene
Análise molecular da estrutura do cromossomo e do genoma (mapeamento, o grau de metilação)
Caracterização fenotípica (manifestos ou latentes) de defeitos genéticos hereditários ao nível do DNA (RFLPs)
Relacionamentos filogenéticos pela comparação de locais selecionados da restrição em genes essenciais.
Clonagem de Genes
Restriction Fragment Length Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Polymorphism (RFLP)
Marcador de DNA
Mutações em 2 alelos específicos de cada individuo em locais
de restrição – polimorfismo: sequências diferentes de restrição
diferentes tamanhos de fragmentos
Muitas doenças humanas prejudiciais ou fatais caem nesta categoria
Restriction Fragment Length Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Polymorphism (RFLP)
Banda igual
Banda igual
Banda comum em pessoas com doença
Banda comum em pessoas saudáveis
Testes padrões do DNA das pessoas com doença
Testes padrões do DNA de pessoas saudáveis (controlo)
A existência de RFLPs fornece a base para estabelecer relacionamentos inequívocos de paternidade
Mapas de RestriçãoMapas de Restrição
As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases
É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte do enzima de restrição ao longo de um segmento clonado do DNA
Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito a manipulá-lo para outras finalidades.
O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição: mapeamento utilizando digestões múltiplas mapeamento utilizando digestões parciais
Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas: Hidrólise do DNA:
separadamente com hidrólises simples e com pares de enzima
Aplicar uma electroforese em gel para os fragmentos obtidos
(Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de RestriçãoM
arca
dore
s
0.51.0
2.5
5.0
8.0
10.0
DNA não
dige
rido
HindIII
SalI
HindI
II +
SalI
7.06.2
5.8 5.8
0.81.2
0.8
0.4
0.8
0.8
1.2
5.8
7.0
7.0
0.8 0.4 5.8
0.8 5.0 1.2
Modelo I
Modelo II
HindIII SalI
HindIII SalI
Mapas de RestriçãoMapas de Restrição
Digestão Parcial com marcação radioativa (32P) dos extremos do DNA
Digestão parcial surge em condições não ótimas para que ocorram
um número limitado de hidrólises:
período de incubação pequeno
incubação a baixas temperaturas
Fragmento de DNA marcado num dos extremos com um radioisótopo
Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrição produzindo
fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam
directamente onde são os locais de clivagem
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
Enzimas Nº de fragmentos Tamanho / kd
XbaI 2 24.0, 24.5
XhoI 2 15.0, 33.5
KpnI 3 1.5, 17.0, 30.0
XbaI + XhoI 3 9.0, 15.0, 24.5
XbaI + KpnI 4 1.5, 6.0, 17.0, 24.0
É linear
Tamanho do fragmento: 48.5 kd
Nº de sítios restrições de:
XbaI – 1
KpnI – 2
XhoI – 1
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
XbaI 24.0, 24.5
XhoI 15.0, 33.5
XbaI + XhoI 9.0, 15.0, 24.5
48.524.0 24.5
XbaI
9.0 15.09.015.0
Todos os locais de restrição do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb, uma vez que o fragmento 24.0 kb continua intacto após a digestão dupla do XbaI-KpnI
A ordem dos fragmentos do KpnI só pode ser determinado pela digestão parcial
XhoI XhoI
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd são produtos da digestão completa
Os fragmentos 18.5 e 31.5kd são produtos da digestão parcial
48.524.5
XbaI
9.015.0
XhoI
6.0
KpnI
18.517.0 1.517.01.5
KpnI’s
Enzima Tamanho / kd
KpnI – digestão parcial 1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5
XbaI + KpnI 1.5, 6.0, 17.0, 24.0
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
EcoRI BamHI HindIII HaeIIEcoRI
+ HaeII
BamHI +
HaeII
HindIII +
HaeII
EcoRI +
HindIII
EcoRI +
BamHI
BamHI +
HindIII
12.0 12.0 12.0 6.0
4.0
2.0
5.0
4.0
2.0
1.0
6.0
4.0
1.5
0.5
6.0
2.5
2.0
1.5
6.5
5.5
10.5
1.5
8.0
4.0
12.0kd
HaeII (6.0)
HaeII(10.0)
HaeII (0/12.0)
EcoRI (1.0)
BamHI (11.5)
HindIII (7.5)
É circular
Tamanho: 12.0kd
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição
RAPD: randomly amplified polymorphic DNA
Size sorted
RAPD: randomly amplified polymorphic DNA
B
AFLP: amplified fragment length polymorphism
Digestão do DNA com 2 enzimas
Ligação de adaptadores nos finais dos fragmentos
PCR com primers adaptadores dos fragmentos
AFLP
VNTR: variable number tandem repeats
• Regiões não codificadoras
• Muitas cópias de uma mesma sequência no genoma
• Alta taxa de variação entre indivíduos no número de cópias
Microssatélites
• VNTRs mais utilizados
• Repetições de 2, 3, ou 4 pares de bases
• Próximo de 100 cópias aleatórias de cada
• Altamente variável
• Muitos loci diferentes de microssatélites (1000s) em diferentes espécies
Microssatélites
Microssatélites
BibliografiaBibliografia
Brown, T.A. (1998) Gene Cloning an introduction 3rd ed., Santley Thorner (Publishers) ltd,
Manchester, UK
Kulg; Cunnings (1997) Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall,
USA
Watson, James D. (1992) Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming,
Harvard University and Cold spring Haba laboratory
Lewin, Benjamin (1997) Genes VI Oxford University Press, Oxford, New York
Gerhartz Wolfgang (1990) Enzymes in Industry – Production and Applications VCH, New
York