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ENZIMAS
• Catalizadores orgánicos.
• Se encuentran prácticamente en todos los tejidos.
• De importancia las enzimas séricas.
– Se han identificado más de 50.
– Se pueden diagnosticar determinadas patologías:
• Enfermedades hepáticas
• Enfermedades pancreáticas
• Enfermedades miocárdicas.
Enzima (Haloenzima) = apoenzima + cofactor
Apoenzima: proporción proteica -desnaturalizable
Cofactor: parte no proteica- dializable, esencial en la actividad catalítica
Sustancia orgánica: coenzima, generalmente
derivadas de las proteínas. (ej. NAD+ en la
reacción de la lactato deshidrogenasa, FAD, la
coenzima A y la C.
Ion inorgánico: activador (ej. Zn2+ , Fe2+ , etc.)
ESTRUCTURA
PROPIEDADES
Las enzimas son proteínas que incrementan la
velocidad de una reacción química y no se
consumen durante la misma (algunos tipos de
ARN pueden actuar como enzimas,
usualmente rompen y sintetizan enlaces
fosfodiester; a estas moléculas se les
denomina “ribozimas” y se encuentran en muy
baja proporción en la naturaleza).
SITIO ACTIVO
Las moléculas de enzimas contienen hendiduras o
cavidades denominadas sitio activo. El sitio activo está
formado por las cadenas laterales de residuos
específicos, lo que ocasiona que tenga un arreglo
tridimensional particular, diferente al resto de la proteína.
Este sitio es afín por la estructura tridimensional del
sustrato:
enzima
+
sustrato
sitio activo
sitio activo
vacío
ocupado
representación de la formación del
complejo enzima-sustrato.
En el sitio activo el enzima (E) se une al substrato (S)formando un complejo enzima-substrato (ES). En elcomplejo ES, E transforma a S en él o los productos,formando el complejo enzima-producto (EP), finalmenteel enzima libera del sitio activo a P, regenerándose.
La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimasson muy eficientes y transcurren desde 106 hasta 1014
veces más rápido que la misma reacción no catalizada.Típicamente, cada molécula de enzima es capaz detransformar cada segundo de 100 a 1000 moléculas desubstrato en producto.
E + S ES E + P
Enzima Velocidad en
ausencia de
enzima
Velocidad de
reacción
catalizada
Rendimiento
Anhidrasa carbónica
Corismato mutasa
Triosafosfato isomerasa
Carboxipeptidasa A
AMP nucleosidasa
Nucleasa estafilococal
1.3 X 10 –1
2.6 X 10 –5
4.3 X 10 –6
3.0 X 10 –9
1.0 X 10 –11
1.7 X 10 -13
1.0 X 106
50
4300
578
60
95
7.7 X 106
1.9 X 106
1.0 X 109
1.9X 1011
6.0 X 1012
5.6 X 1014
Eficiencia de las reacciones
catalizadas por algunas enzimas.
ESPECIFICIDAD
Las enzimas son muy específicas por el substrato de
la reacción que catalizan. Interactúan con una o muy
pocas moléculas y catalizan únicamente un tipo de
reacción, por lo que las moléculas con las que
interactúan deben ser muy parecidas, tanto en
composición, como en estructura tridimensional. Por
ejemplo, en la siguiente figura, en el panel A, se
muestra la reacción catalizada por la enzima
triosafosfato isomerasa (enzima que cataliza el paso 5
de la glucólisis), en el panel B se muestran inhibidores
de la catálisis:
DHAP GAP
O
OHP
H
O
H
H
OOH
P
H
OH
H
Enediol
OO
HP
H
OHH
A
B
Glu 165 Glu 165 Glu 165
His 95 His 95 His 95
Metil glioxal fosfato
O
HP
O
OH
2-fosfoglicolato
(PGA)
H
CH3
OO
Metil glioxal
P
O
CH3
OO
A.- Reacción catalizada por la triosafosfato isomerasa; B.-
Inhibidores de su catálisis.
Nótese el parecido con la estructura de los sustratos y del intermediario
REGULACIÓN
La actividad enzimática puede ser regulada,
esto quiere decir que dependiendo de los
requerimientos metabólicos, las enzimas son
activadas o inhibidas, para acelerar o disminuir
la velocidad con la que catalizan la reacción,
respondiendo así a las diferentes necesidades
de sus productos en la célula. La regulación
más común es modificando la concentración de
su(s) substrato(s).
FACTORES QUE AFECTAN
LA VELOCIDAD DE
REACCIÓN
CONCENTRACIÓN DEL
SUSTRATO
Velocidad máxima: la velocidad de una reacción (v) esel número de moléculas de substrato convertidas enproducto por unidad de tiempo y usualmente se expresaen µmoles de producto formadas por minuto. Lavelocidad de una reacción catalizada por una enzima,aumenta conforme se incrementa la concentración desubstrato hasta que se llega a una velocidad máxima(Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reacción, esindependiente de la cantidad de substrato. El que lavelocidad no pueda seguirse incrementando, refleja lasaturación del sitio activo con el substrato.
0 Substrato
V MAX.Figura: representación de
una cinética típicamente
michaeliana.
Vmax = velocidad de
saturación o máxima.
La mayoría de las enzimas muestran cinéticasdel tipo hipérbola rectangular comodescribieron en 1913 por primera vez LeonorMichaelis y Maud Menten. Este trazo seobtiene al graficar la velocidad de la reacciónenzimática vs. La concentración de Substrato;este comportamiento se describe por ejemplopara la disociación del Oxígeno de lamioglobina. Existen algunas enzimas que sedenominan “alostéricas”, que frecuentementeposeen una curva tipo sigmoide (en forma deS), que es similar a la mostrada para ladisociación del Oxígeno de la hemoglobina.
Hiperbólica (comportamiento cinético michaeliano)
Sigmoide (comportamiento cinético alostérico)
0 Substrato
FORMA HIPERBÓLICA DE LA CURVA DE VELOCIDAD V/S SUSTRATO
Michaelis y Menten propusieron un modelo simple para
explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por
enzimas. En este modelo la enzima se combina
reversiblemente con su substrato para formar el
complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente
se rompe para formar el producto, hecho que regenera a
la enzima. El modelo para una molécula de sustrato se
muestra a continuación:
PEk
ESk
kSE
2
1
1
S: es el substrato
E: es la enzima
ES: es el complejo enzima substrato o
complejo de Michaelis y Menten
k1,k1 y k2 son las constantes de velocidad de
la reacción.
La ecuación de Michaelis y Menten describe
como varía la velocidad de reacción con la
concentración de sustrato:
SKm
SVmaxv0
V0: es la velocidad inicial de la reacción
Vmax: es la velocidad máxima
Km:es la constante de Michaelis y Menten=
S:es la concentración de sustrato
1k
2k1k
CONCLUSIONES IMPORTANTES SOBRE LA
CINÉTICA MICHAELIS-MENTEN
• Características de Km: la constante de Michaelis-Menten es
característica de una enzima y particular para un substrato. Refleja la
afinidad de la enzima por ese substrato. Km es numéricamente igual
a la concentración de substrato a la cual la velocidad de reacción es
la mitad de la Vmax (Km= Vmax/2). Este parámetro, Km no varía con
la concentración de enzima.
• Significado de una Km pequeña: un valor numérico pequeño de Km
refleja una alta afinidad de la enzima por su substrato porque a una
baja concentración del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de
la velocidad máxima.
• Significado de una Km grande: el valor numérico grande de Km
refleja una baja afinidad de la enzima por su substrato porque a una
concentración elevada del mismo, la enzima desarrolla la mitad de la
velocidad máxima.
• Relación de la velocidad con la concentración de enzima: la
velocidad de la reacción es directamente proporcional a la
concentración de la enzima a cualquier concentración de
substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es
disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción (v0) es
reducida también a la mitad de la original.
• Orden de la reacción:
– cuando S es mas pequeña que la Km, la velocidad de lareacción es aproximadamente igual a la concentración desubstrato. La velocidad de reacción se dice en estascondiciones es de primer orden con respecto al substrato.
– Cuando S es mas grande que la Km, la velocidad esconstante e igual a la Vmax. La velocidad de la reacción esindependiente de la concentración de substrato y se dice quees de orden cero con respecto a la concentración desubstrato.
GRÁFICA DE LINEWEAR-BURKE
Se grafica una doble recíproca, es decir, el inverso de la velocidad
(1/v0) contra el inverso de la concentración de substrato (1/S), se
obtiene una línea recta. El regráfico de Lineweaver-Burke, también se
denomina de “dobles recíprocas” y se utiliza para calcular la Km y la
Vmax así como para determinar el mecanismo de acción de los
diversos tipos de inhibidores.
Vmax
1
SVmax
Km
v
1
0
La ecuación describe una recta en donde el intercepto con el
eje de las abscisas es igual a –1/Km y el intercepto con el eje
de las ordenadas es igual a 1/Vmax.
• Incremento de la velocidad con la temperatura:
En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la
temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este
incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en
energía que pueden pasar la barrera energética de estado de
transición, para formar a los productos.
zona de reactivación
máximo de actividad
Zona de
inactivación
0 Temperatura
Decremento de la velocidad con la
temperatura:
La elevación excesiva de la
temperatura del medio que
contiene a las enzimas, resulta en
un decremento de la velocidad
como resultado de la
desnaturalización, es decir, la
pérdida de la estructura
tridimensional de las enzimas.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Efecto del pH en la ionización del
sitio activo
La concentración de H+ afecta la velocidad de la
reacción en muchas formas. Primero el proceso
catalítico usualmente requiere de que la enzima y el
substrato tengan grupos químicos en una forma iónica
particular para poder interactuar. Por ejemplo la
actividad catalítica puede necesitar a un grupo amino,
por ejemplo de una lisina en estado protonado (-NH3+)
o no (-NH2+), el pH modifica este estado y por tanto a
la velocidad de la reacción.
EFECTO DEL pH
Efecto del pH: desnaturalización
de la enzima
pH extremos pueden ocasionar la desnaturalización de las
enzimas, debido a que la estructura con estos cambios es posible
modificar las interacciones iónicas que intervienen en la estabilidad
de la enzima en su estado nativo.
El pH óptimo varía para las diferentes enzimas: el pH al cual las
enzimas adquieren su máxima actividad es diferente para cada una
de ellas y depende de la secuencia de aminoácidos que las
conforman, por supuesto, también está relacionado con el
microambiente celular en el cual desarrollan su catálisis. Por
ejemplo la pepsina que es una enzima digestiva que actúa en el
estómago, posee un pH óptimo de alrededor de 2 unidades, por el
contrario otras enzimas que actúan a pH neutro, se desnaturalizan
a pH alcalino o ácido.
NOMENCLATURA
• La international Union of Biochemistry recomendó en 1964 una
nomenclatura basada en la reacción que catalizan. En 1973
apareció una nueva edición ampliada de esta nomenclatura donde
el nombre científico describe el tipo de reacción, el sustrato, el
coenzima y el producto.
(Ej. LDH: L-lactato:piruvato NAD deshidrogenasa)
• Además a cada enzima se le da un número que deriva de la
nomenclatura, encabezado por las siglas EC (Enzyme Commission).
Así la LDH es la EC 1.1.1.3
• Para una descripción más exacta es necesario indicar la
procedencia del enzima, especie, tejido, localización en el interior o
exterior de la célula dado que existen isoenzimas con el mismo
nombre y N° EC, pero se diferencian en su localización y/o
propiedades físico químicas.
Nomenclatura enzimática
Clase Reacciones que catalizan Ejemplo
Clase 1
Oxido- Reductasas
Catalizan reacciones de oxidación reducción.
A + B A reducido + B oxidado
Deshidrogenasas
Oxidasas
Reductasas
Clase 2
Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de
grupos funcionales, partes de moléculas, etc.,
de un donador a un aceptor.
A –B + C A + B-C
Transaminasas
Clase 3
Hidrolasas
Catalizan reacciones de hidrólisis de enlaces al
añadir una molécula de agua.
A-B + H2O A-H + B-OH
Lipasas
Amilasas
Peptidasas
Clase 4
Liasas
Catalizan reacciones de eliminación o adición
de alguna molécula, grupo funcional, etc.
A-CO2 A + CO2
Descarboxilasa
Clase 5
Isomerasas
Catalizan reacciones de isomerización.
A A´
Epimerasas
Mutarotasas
Clase 6
Ligasas
Catalizan reacciones de condensación de dos
moléculas por formación de un enlace a costa
de la hidrólisis de un trifosfato.
A + B + NTP A-B + NDP + Pi
Sintetasas
ENZIMAS
ANALIZADAS EN
DIAGNÓSTICO
CLINICO
Transaminasa glutámico oxalacética o aspartato
aminotransferasa (GOT o AST). Grupo: Transaminasa
Reacción catalizada Transferencia del grupo amino del ácido aspártico al ácido a-
cetoglutárico, formándose ácido oxalacético y ác. Glutámico.
Presenta como cofactor el piridoxal fosfato (PP). Las
determinaciones suelen hacerse a pH = 7,4
Localización En mitocondrias y citoplasma de tejido cardiaco, hepático
muscular, hematíes, tejido esquelético, renal y uretral, en
concentraciones decrecientes respectivamente.
Patologías Hepatopatías, Miopatías, Procesos cardíacos.
Lactato Deshidrogenasa (LDH). Grupo: oxidorreductasa
Reacción catalizada Transformación reversible de lactato a piruvato (pH=8,3 -8,9) y
de piruvato a lactato (pH = 7,1 – 7,4). No necesita cofactor.
Localización Ampliamente distribuida por los tejidos aunque abunda más en
tejido cardíaco, muscular, renal, hepático, cerebral y los
hematíes.
Patologías Hepatopatías
Procesos cardíacos.
Creatín fosfoquinasa (CPK). Grupo Tranferasa
Reacción catalizada Transformación de fosfocreatina a creatina. (pH=6,8) y de
creatina a fosfocreatina (pH=9,0). Necesita la presencia de
cofactores metálicos (activadores) como el Mg 2+.
Localización Su concentración es muy elevada en músculos esquelético y
cardíaco, encontrándose en el cerebro en concentraciones
también bastante apreciables.
Patologías Miopatías
Procesos cardíacos.
Transaminasa glutámico pirúvica o alanino
aminotransferasa (GPT o ALT). Grupo Transaminasa
Reacción catalizada Transferencia del grupo amino desde la alanina al
cetoglutarato, formando ác. Pirúvico y ác. Glutámico. Presenta
como cofactor el piridoxal fosfato (PP). Las determinaciones
suelen hacerse a pH = 7,4
Localización Su localización es citoplasmática en el tejido hepático aunque
también en bajas concentraciones en tejido muscular, renal y
cardíaco.
Patologías Hepatopatías, Miopatías
g-Glutamiltranspeptidasa (g-GT). Grupo: Transferasas
Reacción catalizada Transferencia de grupos g-glutamil desde un péptido a otro
péptido o a aminoácidos. No necesita la presencia de cofactor.
Localización Se encuentra fundamentalmente en el citoplasma de células
hepáticas, riñón, intestino y páncreas.
Patologías Hepatopatías
A-amilasa. Grupo: Hidrolasas
Reacción catalizada Degradación de moléculas hidrocarbonadas por hidrólisis de
enlaces glicosídicos a 1-4 de los polisacáridos transformándolos
en sus azúcares constitutivos. Necesita calcio como cofactor (es
una de las metaloenzimas.).
Localización Se encuentra fundamentalmente en glándulas salivares y
páncreas exocrino.
Patologías Enfermedades del páncreas.
Lipasa. Grupo: Hidrolasas
Reacción catalizada Junto con los ácidos biliares cataliza la reacción de hidrólisis de
triglicéridos
Localización Su localización es pancreática.
Patologías Enfermedades del páncreas.
Fosfatasa Alcalina (ALP). Grupo Hidrolasas
Reacción catalizada Descomposición de los ésteres monofosfato. Precisa del
cofactor Mg+2. Presenta su actividad óptima a pH alcalinos
cercanos a 9.
Localización Fundamentalmente el huesos pero también en hígado, riñón,
pared intestinal, glándula mamaria y placenta.
Patologías Enfermedades óseas.
Fosfatasa ácida. Grupo: Hidrolasas
Reacción catalizada Descomposición de los ésteres monofosfato. Precisa del
cofactor Mg2+. Presenta su actividad óptima a pH ácidos
cercanos a 5.
Localización Se localiza fundamentalmente en la próstata y en menor
concentración en hígado, hematíes, plaquetas y hueso.
Patologías Carcinoma próstatico.
• DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
• PRINCIPIOS DE ESPECTROSCOPIA
DE ABSORCIÓN MOLECULAR.
PROXIMA SESION