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Enzimologia
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
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A vida e a energia para a vida• Duas condições fundamentais:
1. Autorreplicação2. Metabolismo
• Catálise enzimática
• A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos
• Um saco de açúcar pode permane-cer anos na prateleira do supermercado– A prateleira não tem enzimas!
• Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos– Reações catalíticas promovem a oxidação
da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
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Participam das vias bioquímicas
• Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular
• O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica
• Permitem resposta e adaptação a ummeio em mudança
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O que são as enzimas?• Proteínas notáveis, altamente especializadas
– Alto grau de especificidade com substratos• Poder catalítico extraordinário
– Muito maior do que catalisadores sintéticos• Aceleram reações químicas
– Em condições suaves de temperatura e pH• São o centro e o objeto de estudo principal da
bioquímica– Atuando de forma organizada catalisam
centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias
• Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem
• Como os cientistas descobriram as enzimas?
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LOUIS PASTEUR
1835: Berzelius, conceito de catálise 1885: fermentação do acúcar por lêvedos,
gerando álcool
Vitalismo: o mágico élan vital 1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num
extrato de lêvedo sem vida!
Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores
Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
Louis Pasteur1822-1895
Um pouco de história...
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EMIL FISCHER
Sacarase Quebra da sacarose em glicose e frutose
Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava
Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase
Modelo de ação enzimática chave-e-fechadura
Hermann Emil Fischer1852 - 1919
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Enzimas são proteínas?
Qual a natureza das enzimas? O químico orgânico alemão Richard
Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pela estrutura da clorofila – conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas! Willstater criticou os resultados…
James Batcheller Sumner1887-1955
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SIM! Mas como funcionam?
Kunitz e Northrop Eletroforese e centrifugação: enzimas
estão na fração protéica! Mesmo em quantidades proteícas
indetectáveis pelos métodos, as enzimas continuavam tendo atividades
Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
John Howard Northrop1891-1987
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Finalmente, Sanger
1952 Publica a primeira estrutura primária
de uma proteína: a Insulina, com 51aminoácidos
O trabalho mostrava também que a estrutura das proteínas poderia serdescrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal
A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
Frederick Sanger13 August 1918
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CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA
As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras
Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos
A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica)
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
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Toda enzima é proteína?!• Não!, há alguns RNAs que
funcionam enquanto enzimas também
• Componente químico adicional necessário para a função– Cofator: íons inorgânicos– Coenzima: moléculas orgânicas
complexas– Se liga muito firmemente: grupo
prostético
• Enzima completa: holoenzima– Parte protéica: apoenzima ou
apoproteína
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Nomenclaturase das enzimases• Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do
substrato ou à atividade realizada– Urease – hidrolisa a uréia– DNA-polimerase – polimeriza DNA– Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
• Sistema de classificaçãoenzimático – EC number– Quatro números: 2.7.1.1
• 2: transferase• 7: fosfotransferase• 1: transfere P para grupo OH-
• 1: tem D-glicose com aceptor
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Reação enzimática
• Reação se dá em fases: • Enzima aumenta a velocidade das reações• Os catalisadores aumentam a velocidade das
reações por que diminuem a energia de ativação
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Equilíbrio químico• As enzimas realizam, muitas
vezes, as reações nos dois sentidos
• A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações
• Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato– Interações fracas entre ES são
otimizadas no estado de transição
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Bastonase• Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato
• ET não é forma estável
• Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática
• Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes
Estabiliza o substrato
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Especificidade enzimática
• Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico
• Redução da entropia pela ligação– Dessolvatação do substrato– Ajuste induzido, proteína
tbm muda de conformação
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Grupos catalíticos
• Catálise geral ácido-base– Transferência de prótons
• Catálise covalente– Formação de lig. covalente
transitória entre E e S• Ativação do substrato
• Catálise por íons metálicos– Estabilizam estados de transição– 1/3 das enzimas conhecidas usam íons
metálicos nas reações catalíticas
• Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina
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Cinética enzimática• Experimentos de mutagênese sítio-
dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica
• A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas
• Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato
• Constante de Michaelis– kM = [S] correspondente a ½ Vmax;
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Reações com 2 ou mais substratos
• Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra
• Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH– Maior velocidade está
normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua
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Inibição reversível
• Inibição competitiva– Inibidor compete pela ligação ao sítio
ativo
• A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta
• Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima– Podem ser usados como drogas
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Exemplos de reações enzimáticas
• Quimiotripsina• Lisozima
• Hexocinase• Enolase
• Beta-lactamases• Proteases do HIV
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A quimiotripsina
• Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr)
• Forma intermediário acil-enzima covalente
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A hexocinase
• Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato• Fosforila um resíduo de glicose
• Primeiro passo da via glicolítica• Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que
ela fosforile a água
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A enolase• Realiza desidratação reversível
de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato– Dímero com 436aa
• Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição– Interações estabilizam
intermediário (enolato)– Ligações de H com outros aa’s do
sítio ativo contribuem para o mecanismo geral
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A lisozima• Agente antibacteriano
natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo– Peptideoglicano da
parede de bactérias é seu substrato• Constituinte da parede
microbiana que protege da lise osmótica
– Enzima rompe ligação glicosídica
• Monômero com 129 aa’s• Mecanismo específico
de ação enzimática ainda é controverso
“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. Albert Einstein
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Medicamentos• Muitos são inibidores de enzimas são
usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS
• Penicilina (Alexander Fleming, 1928)– Peptideoglicano: polímero de açúcares
e D-aa’s da parede bacteriana– Penicilina interfere na síntese do
peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala
– Inibem reação de transpeptidase
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Os Beta-lactâmicos• Penicilina: degradada no
ambiente do estômago• Penicilina V: estável em meio
ácido pode ser administrada em via oral
• Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito
• O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível– Transpeptidase inativa!– Bloqueia síntese da parede bacteriana
• Rompe-se devido à pressão osmótica
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As Beta-lactamases
• Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
• Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva– O mau uso dos antibióticos
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Guerra contra as bactérias
• Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases
• Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico
• Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
• Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
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Os antivirais: (1) o que é um vírus?
• Anatomia molecular viral– Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de
proteínas (capsídeo)– Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou
dupla (fita positiva ou negativa)
• Genomas compactos– Contêm apenas as proteínas
necessárias à replicação viral– Genomas da ordem de Kb
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Parasitismo intra-celular
• O vírus não tem metabolismo próprio– Não é um organismo de vida-livre– Parasita intra-celular obrigatório
• Forma de cristal• Sequestra a maquinaria molecular da célula– Mecanismo moleculares de
produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)
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Variedades virais
• Vírus de DNA– Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente
transcritos em RNA
• Vírus de RNA– Podem atuar no citoplasma
• Vírus de RNA com transcrição reversa– Acontece a transcrição reversa do RNA
em DNA e o DNA é normalmente integrado ao genoma do hospedeiro
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HIV
• SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana– Pandemia– Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos
• Retrovírus (lentivirus)– 2 cópias de um RNA fita simples (fita +)– Nove genes– Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24
• 0,6% da população humana está infectada
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AZT (azidotimidina)
• Mimetiza um nucleotídeo de timina– Azida no lugar de hidroxila
• Prejudica a ação da transcriptase reversa• Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que,
aos poucos o vírus se torne resistente
Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT
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Outros tratamentos• Inibidores de protease
– Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros
• Inibidores de integrase– Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro
• Inibidores de fusão– Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam
receptores celulares de ligação ao HIV
• Coquetel anti-AIDS– dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de
ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
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Proteases do HIV• O RNA do vírus é traduzido em grandes
proteínas– Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em
proteínas individuais do capsídeo
• A protease do HIV é uma aspartil-protease– 2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à
ligação peptídica
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Inibidores de proteases• Drogas que formam complexos não-covalentes
com a protease do HIV– Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis
• Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil– Grupo hidroxil mimetiza a água– Resto da estrutura encaixa nas fendas da
enzima
• Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição– Sucesso terapêutico– Aumentou longevidade e qualidade de vida dos
doentes
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Enzimas regulatórias• Possui atividade catalítica aumentada
ou diminuída em resposta a certos sinais– Ajustes na velocidade da via
metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação
• Tipos mais comuns– Enzimas alostéricas (ligações
reversíveis a compostos)– Modificações covalentes– Ativadas por remoção de segmentos
peptídicos (irreversível)
• Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
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Enzimas alostéricas• Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato
(hemoglobina)• Heterotrópicas: outro ativador
• Enzimas alostéricas– Mais de um sítio regulatório
• Cada um específico para um regulador• Aspartato-transcarbamoilase– 12 cadeias polipeptídicas– Azul: catalíticas– Vermelho/Amarelo: regulatórias
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Enzimas alostéricas são reguladoras
• ... de vias bioquímicas• Normalmente são o primeiro passo da
via– “economiza” a execução das outras
reações– Único passo de regulação da via
• Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo
• Inibição alostérica heterotrópica
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Regulação por modificações covalentes
• 500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos
• Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo– Ubiquitinilação marca proteína para degradação– Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares
• Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima
• Fosforilação é a mudança mais comum– Podem haver vários sítios fosforiláveis
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Proteínas cinases e fosfatases• Cinases: adicionam grupo fosforil
a resíduos de Ser, Thr ou Tyr– Básicas: fosforilam resíduos
de vizinhança básica– Preferências por resíduos
próximos a Pro
• Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína– Reestabiliza a proteína
estruturalmente
• Atuam em cascatas de sinalização celular
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Cinases sítio-específicas
• Fosforilações são sítio-específicas
• Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de S, T ou Y
• Sítio de reconhecimento
• Sítio de fosforilação
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Fosforilações múltiplas• São possíveis e
permitem controle requintado da regulação
• Glicogênio sintase– Catalisa a união de
glicoses para formar glicogênio
– Fosforila em vários sítios (ver figura)
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Proteólise de precursores• Proteases não podem ser
produzidas em estado ativo– Do contrário destruiriam as
proteínas celulares...• Zimogênios são precursores
das proteínases– Só funcionam depois da
ativação por proteínas – Ativação irreversível
• Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas
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Conclusões
• A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas
• O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação
• A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva
• Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos
• As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação
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• Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox)
• Capítulo 6Enzimas