ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMIZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU.WODORU.

Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy kwasu Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy kwasu fenylopirogronowego znakowanego izotopami wodoru w pozycji trzeciej. fenylopirogronowego znakowanego izotopami wodoru w pozycji trzeciej. Wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny katalizowaną Wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny katalizowaną przez enzym dehydrogenazę fenyloalaninową (PheDH, przez enzym dehydrogenazę fenyloalaninową (PheDH, Phenylalanine Phenylalanine Dehydrogenase, EC 1.4.1.20). Dehydrogenase, EC 1.4.1.20).

WSTĘP I ZAŁOŻENIA PRACYWSTĘP I ZAŁOŻENIA PRACYKwas fenylopirogronowy jest metabolitem fenyloalaniny, który pojawia się we krwi Kwas fenylopirogronowy jest metabolitem fenyloalaniny, który pojawia się we krwi

u chorych na fenyloketonurię. Fenyloketonuria to genetycznie uwarunkowana choroba u chorych na fenyloketonurię. Fenyloketonuria to genetycznie uwarunkowana choroba metaboliczna. Polega na uszkodzeniu genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową, metaboliczna. Polega na uszkodzeniu genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową, enzymu, który bierze udział w metaboliźmie fenyloalaniny. Defekt tego enzymu enzymu, który bierze udział w metaboliźmie fenyloalaniny. Defekt tego enzymu powoduje, że na etapie przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (prekursora powoduje, że na etapie przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (prekursora hormonów, barwników) pojawia się blokada i fenyloalanina gromadzi się we krwi. hormonów, barwników) pojawia się blokada i fenyloalanina gromadzi się we krwi. Nadmierne jej stężenie, a tym samym jej pochodnych, czyli głównie kwasu Nadmierne jej stężenie, a tym samym jej pochodnych, czyli głównie kwasu fenylopirogronowego, jest przyczyną upośledzenia rozwoju fizycznego i intelektualnego.fenylopirogronowego, jest przyczyną upośledzenia rozwoju fizycznego i intelektualnego.

Rys.1. Schemat przedstawiający metabolizm fenyloalaniny.

Praca magisterska wykonana w Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Pracowni Peptydów Wydziału Chemii UWUWPromotor pracy:Promotor pracy: prof. dr hab. Marianna prof. dr hab. Marianna KańskaKańskaOpiekun pracy: mgr Katarzyna SkoweraOpiekun pracy: mgr Katarzyna Skowera

Ilona Ilona ZiąbskaZiąbska

kwas E-cynamonowy [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina

Rys.4. Schemat reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego.

Enzymem katalizującym tę reakcję jest liaza fenyloalaninowa (PAL, Enzymem katalizującym tę reakcję jest liaza fenyloalaninowa (PAL, Phenylalanine Ammonia Lyase EC 4.3.1.5)Phenylalanine Ammonia Lyase EC 4.3.1.5). Jest to enzym powszechnie . Jest to enzym powszechnie występujący w roślinach wyższych oraz niektórych gatunkach grzybów. W występujący w roślinach wyższych oraz niektórych gatunkach grzybów. W reakcji addycji amoniaku do kwasu Ereakcji addycji amoniaku do kwasu E--cynamonowwego, PAL przyłącza cynamonowwego, PAL przyłącza wodór ze środowiska do trzeciego atomu węgla wodór ze środowiska do trzeciego atomu węgla w pozycji pro-S, natomiast wodór w pozycji 3-pro-R pochodzi od kwasu w pozycji pro-S, natomiast wodór w pozycji 3-pro-R pochodzi od kwasu cynamonowego.cynamonowego.

Rys.5. Model liazy fenyloalaninowej (PAL).

SYNTEZA [3(S)-D(T)]-KWASU FENYLOPIROGRONOWEGOSYNTEZA [3(S)-D(T)]-KWASU FENYLOPIROGRONOWEGODo syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego wykorzystałam Do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego wykorzystałam

reakcję oksydacyjnej deaminacji znakowanej L-fenyloalaniny.reakcję oksydacyjnej deaminacji znakowanej L-fenyloalaniny.

COOH

H D(T)

NH2

COOH

H D(T)

O

P heD H , N AD +

bufor g licynow y, pH 10,7tem p. pok., m ieszan ie, 2h

Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza fenyloalaninowa (PheDH, Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza fenyloalaninowa (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase EC 1.4.1.20). Phenylalanine Dehydrogenase EC 1.4.1.20). Enzym ten należy do klasy Enzym ten należy do klasy oksyreduktaz. Charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do oksyreduktaz. Charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do fenyloalaniny, a także do tyrozyny. Katalizuje również reakcję odwrotną.fenyloalaniny, a także do tyrozyny. Katalizuje również reakcję odwrotną.

Rys.6. Schemat oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego.

Rys.7. Model dehydrogenazy fenyloalaninowej (PheDH).

Kofaktorem dla dehydrogenazy fenyloalaninowej jest utleniona forma Kofaktorem dla dehydrogenazy fenyloalaninowej jest utleniona forma NADNAD++, która podczas reakcji ulega redukcji, dając NADH. NADH wykazuje , która podczas reakcji ulega redukcji, dając NADH. NADH wykazuje maksimum absorpcji przy 340 nm, dzięki temu przebieg reakcji można maksimum absorpcji przy 340 nm, dzięki temu przebieg reakcji można kontrolować spektrofotometrycznie.kontrolować spektrofotometrycznie.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 5 10 15 20 25 30 35

czas (min.)

abso

rban

cja

3mM 4mM 6mM 7mM 8mM 9mM

0

0,1

0,2

0,30,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30 35

czas (min.)

abso

rban

cja

3mM 4mM 6mM 7mM 8mM 9mM

BADANIA KINETYCZNEBADANIA KINETYCZNESpektrofotometryczna kontrola przebiegu reakcji oksydacyjnej deaminacji Spektrofotometryczna kontrola przebiegu reakcji oksydacyjnej deaminacji

L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego pozwoliła na L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego pozwoliła na wyznaczenie kinetycznych parametrów tej reakcji, czyli szybkości maksymalnej wyznaczenie kinetycznych parametrów tej reakcji, czyli szybkości maksymalnej (V(Vmaxmax) oraz stałej Michaelisa (K) oraz stałej Michaelisa (Kmm). Porównanie tych wielkości wyznaczonych z ). Porównanie tych wielkości wyznaczonych z przebiegu reakcji w buforze sporządzonym na bazie Hprzebiegu reakcji w buforze sporządzonym na bazie H22O oraz na bazie DO oraz na bazie D22O, O, daje możliwość wyznaczenia rozpuszczalnikowego efektu izotopowego (SIE). daje możliwość wyznaczenia rozpuszczalnikowego efektu izotopowego (SIE). Wykonałam serie pomiarów dla obydwu rozpuszczalników, po Wykonałam serie pomiarów dla obydwu rozpuszczalników, po uśrednieniu wyników wyliczyłam stosunek (uśrednieniu wyników wyliczyłam stosunek (kk) V) Vmaxmax((śr.śr.)) do K do Kmm((śrśr.).) w w HH22OO do do

VVmaxmax((śr.śr.)) do Kdo Kmm((śr.śr.)) w Dw D22OO..

kk=1,91=1,91

Wynik ten wskazuje jednoznacznie, że rozpuszczalnikowy efekt izotopowy Wynik ten wskazuje jednoznacznie, że rozpuszczalnikowy efekt izotopowy rzeczywiście występuje.rzeczywiście występuje.

 

   HH22OO DD22OO

VVmaxmax((śr.śr.

))6,55*106,55*1022 3,92*103,92*1022

KKmm((śr.śr.)) 1,23*101,23*1011 1,41*101,41*1011

 

Rys.8. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w H2O.

Rys.9. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w D2O.

Tab.1. Parametry kinetyczne reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego.

COOH

NH2

COOH

NH2OH

kwas2-hydroksyfenylooctowy

kwasfenylopirogronowy

fenyloalanina

hydroksylazafenyloalaninowa

tyrozyna

Otrzymany kwas fenylopirogronowy redukuje się enzymatycznie do kwasu Otrzymany kwas fenylopirogronowy redukuje się enzymatycznie do kwasu fenylomlekowego przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH, fenylomlekowego przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH, Lactic Lactic Dehydrogenase EC 1.1.1.27).Dehydrogenase EC 1.1.1.27).

L-fenyloalanina kwas fenylopirogronowy

Rys.2. Reakcja oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego.

Rys.3. Reakcja redukcji kwasu fenylopirogronowego do kwasu fenylomlekowego.

kwas fenylopirogronowy kwas fenylomlekowy

Mechanizmy reakcji katalizowanych przez dehydrogenazę fenyloalaninową Mechanizmy reakcji katalizowanych przez dehydrogenazę fenyloalaninową i dehydrogenazę mleczanową nie zostały jeszcze do końca poznane. Ich i dehydrogenazę mleczanową nie zostały jeszcze do końca poznane. Ich wyjaśnienie jest możliwe dzięki zastosowaniu metod izotopowych, a w wyjaśnienie jest możliwe dzięki zastosowaniu metod izotopowych, a w szczególności metody kinetycznych efektów izotopowych (KEI). Aby móc ją szczególności metody kinetycznych efektów izotopowych (KEI). Aby móc ją zastosować, potrzebne są związki znakowane zastosować, potrzebne są związki znakowane i dlatego w ramach mojej pracy magisterskiej postanowiłam zająć się ich i dlatego w ramach mojej pracy magisterskiej postanowiłam zająć się ich syntezą.syntezą.

[3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina [3(S)-D(T)]-kwas fenylopirogronowy

SYNTEZA [3(S)-D(T)]-L-FENYLOALANINYSYNTEZA [3(S)-D(T)]-L-FENYLOALANINYSubstratem do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego była Substratem do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego była

znakowanaznakowanaL-fenyloalanina, którą otrzymałam w wyniku enzymatycznej addycji amoniaku L-fenyloalanina, którą otrzymałam w wyniku enzymatycznej addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego. Zastosowałam w niej bufor amonowy, do kwasu E-cynamonowego. Zastosowałam w niej bufor amonowy, wzbogacony wodą deuterowo-trytową, jednocześnie jako źródło amoniaku, wzbogacony wodą deuterowo-trytową, jednocześnie jako źródło amoniaku, izotopów wodoru oraz medium reakcji.izotopów wodoru oraz medium reakcji.

BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA1. 1. W. Hummel, H. Schutte, M.R. Kula, W. Hummel, H. Schutte, M.R. Kula, Anal. Biochem.Anal. Biochem., 1988, , 1988, 170170, 397-401., 397-401.2. I. F2. I. Føølling, lling, Acta PActa Pæædiatr.diatr., 1994, Suppl., 1994, Suppl. 407 407, 4-10. , 4-10. 3. W. Hummel, N. Weiss, M.R. Kula, 3. W. Hummel, N. Weiss, M.R. Kula, Arch. Microbiol.Arch. Microbiol., 1984, , 1984, 137137, 47-52., 47-52.4. Y. Asano, A. Nakazawa, K. Endo, 4. Y. Asano, A. Nakazawa, K. Endo, J. Biol. Chem.J. Biol. Chem., 1987, , 1987, 262262, 10346-10354., 10346-10354.5. J.L. Vanhooke, J.B. Thoden, N.M. Brunhuber, J.S. Blanchard, H.M. Holden, 5. J.L. Vanhooke, J.B. Thoden, N.M. Brunhuber, J.S. Blanchard, H.M. Holden, BiochemistryBiochemistry,, 1999, 1999, 3838, 2326-2339., 2326-2339.6. K. Kataoka, K. Tanizawa, T. Fukui, H. Ueno, T. Yoshimura, N. Esaki, K. Soda, 6. K. Kataoka, K. Tanizawa, T. Fukui, H. Ueno, T. Yoshimura, N. Esaki, K. Soda, J. J. BiochemBiochem,, 1994, 1994, 116116, 1370-1376., 1370-1376.7. K.C. Dooley, 7. K.C. Dooley, Clin. Biochem.Clin. Biochem., 1992, , 1992, 2525, 271-275., 271-275.8. M.A. Vilaseca, C. Ferr8. M.A. Vilaseca, C. Ferréé, F. Ram, F. Ramóón, n, Clin. Chem.Clin. Chem., 1993, , 1993, 3939, 129-131., 129-131.9. L.R. Feksa, A.R. Cornelio, C.S. Dutra-Filho, A.T. de Souza Wyse, M. Wajner, C.M. Duval 9. L.R. Feksa, A.R. Cornelio, C.S. Dutra-Filho, A.T. de Souza Wyse, M. Wajner, C.M. Duval Wannmacher, Wannmacher, Brain ResearchBrain Research, 2003, , 2003, 968968, 199-205., 199-205.10. P.W.K. Wang, M.E. O’Flynn, T. Inouye, 10. P.W.K. Wang, M.E. O’Flynn, T. Inouye, Clin. Chem.Clin. Chem., 1964, , 1964, 1010, 1098-1105., 1098-1105.11. J. Oberdoerster, M. Guizzetti, L.G. Costa, 11. J. Oberdoerster, M. Guizzetti, L.G. Costa, J. Pharmacol. Experiment. Therapeut.J. Pharmacol. Experiment. Therapeut., , 2000,2000, 295295, 295-301., 295-301.

COOH

NH2

COOH

O

P heD H , N AD +

bufor g licynow y, pH 10,7

COOH

O

COOH

OH

LD H , N AD H

bufor fosforanow y, pH 8

COOH COOH

H D(T)

NH2

PAL, N H 4Cl/ D 2O , pD 9

DT O , 30 °C, 7 dn i