Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

• Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed

• Berust op binding tussen antilichaam (Ab) en antigeen (Ag)

96 wells plaat: 8 rijen (A-H) en 12 kolommen (1-12)

Doel van ELISA experiment

Het uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling

• Wat heb je hiervoor nodig?

• Gezuiverd antigeen. In deze practicumproef is dat humaan insuline (Ag)

• Een deel wordt gebruikt voor opwekken antilichamen

• Een deel (1 mg/ml) wordt gebruikt voor calibratie

• Een deel Ag wordt voorzien van biotine groep (AgB)

één putje van een 96-wells plaat

ELISA procedure

• Competitie tussen biotine gelabeld (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag)• Hoeveelheid gebonden AgB wordt bepaald met avidine-gelabeld HRP

Uitvoering

• Allereerst moet het percentage werkzame IgG moleculen worden bepaald.

Dit doe je door bij een variabele IgG concentratie (A-H) te bepalen wat de minimale hoeveelheid Ag (1-12) is waarbij alle AgB nog gebonden blijft.

Antilichaam aan putje binden

Bereken de verdunning die je in moet vullen en noteer alle informatie!

Percentage werkzame antilichamen

Coat IgG: Voeg 100 µl IgG (Ab) toe aan elk putje

Maximale bindingscapaciteit van IgG per putje is 4 µg/ml, dus 100 µl x 4 µg/ml = 400 ng

Niet gebondenantilichaamwegwassen

Alle eiwitbindingsplaatsen

bezetten/blokkeren

Biotine-gelabeld antigeen (AgB) toevoegen

• Per putje 10 µl insuline (AgB), steeds dezelfde concentratie

• Maximaal 1 ng per putje zodat niet alle antilichamen zijn gebonden

Ongelabeld antigeen (Ag) toevoegen

• in elk putje 100 µl ongelabeld antigeen (Ag)

• in elke kolom een andere concentratie (12 kolommen)

• begin met overmaat (bijv. 100 ng) en verdun steeds met factor 2

Ongebondenantigeen

wegwassen

Avidine-peroxidase toevoegen

• Avidine bindt zeer sterk aan biotine

• Peroxidase is een enzym

Ongebondenavidine-peroxidase

wegwassen

Substraat voor peroxidase toevoegen

Peroxidase zet substraat om in kleurstof waarvan de absorptie gemeten kan worden

Stoppen kleurreactie

Absorptiewaarden voor kleurstof

Daar waar de absorptie afneemt treedt competitie op!

Reken uit hoeveel procent van het antilichaam aan het antigen heeft gebonden:(Ag+AgB)*15/(Ab)*100 %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12IgG ng/well

A 0,186 0,297 0,655 1,248 1,713 1,710 1,649 1,690 1,696 1,683 1,692 1,664 250,000B 0,037 0,193 0,366 0,645 1,227 1,668 1,686 1,644 1,668 1,627 1,673 1,665 125,000C 0,053 0,123 0,184 0,352 0,590 1,002 1,402 1,652 1,641 1,634 1,666 1,668 62,500D 0,031 0,056 0,118 0,189 0,252 0,508 0,799 1,167 1,508 1,713 1,702 1,635 31,250E 0,000 0,000 0,015 0,046 0,185 0,222 0,371 0,567 0,763 0,870 0,956 0,981 15,625F 0,000 0,000 0,000 0,043 0,103 0,137 0,205 0,341 0,351 0,475 0,476 0,516 7,813G 0,043 0,000 0,000 0,047 0,020 0,101 0,081 0,169 0,169 0,182 0,240 0,201 3,906H 0,000 0,000 0,000 0,012 0,040 0,023 0,054 0,085 0,063 0,141 0,113 0,102 1,953

AgB (ng/well) 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83

Ag (ng/well) 80,00 40,00 20,00 10,00 5,00 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04Ag + AgB (ng/well) 80,83 40,83 20,83 10,83 5,83 3,33 2,08 1,46 1,14 0,99 0,91 0,87

Voorbeeld van een testcurve

Neem daarna een nieuwe plaat voor het maken van een optimale calibratiecurve

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.000.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

1.800

Absorbance against dilution of Ag at one IgG dilution (one row of the Excel sheet)

Ag + AgB added per well (ng)

Ab

sorb

ance

Test voor een optimale calibratiecurve

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0,150 0,234 0,322 0,424 0,564 0,635 0,860 1,143 1,393 1,818 1,771 1,764B 0,159 0,200 0,340 0,386 0,515 0,654 0,894 1,077 1,359 1,777 1,771 1,776C 0,203 0,269 0,309 0,369 0,536 0,619 0,847 1,127 1,382 1,757 1,837 1,817D 0,149 0,252 0,334 0,383 0,541 0,706 0,886 1,063 1,433 1,764 1,772 1,821E 0,158 0,201 0,325 0,401 0,484 0,702 0,901 1,142 1,386 1,772 1,781 1,772F 0,234 0,206 0,340 0,377 0,560 0,680 0,859 1,141 1,431 1,791 1,826 1,774G 0,234 0,223 0,354 0,423 0,494 0,627 0,814 1,057 1,420 1,801 1,789 1,768H 0,221 0,201 0,271 0,398 0,527 0,628 0,832 1,126 1,439 1,774 1,825 1,799

gem. 0,189 0,223 0,324 0,395 0,528 0,656 0,862 1,110 1,405 1,782 1,797 1,786

Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4 17,4 13,6 10,6 8,4 6,6 5,3

Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55 16,57 12,75 9,81 7,54 5,80 4,46

IgG ng/well dilution250,0 1,0

AgB ng/well0,83 1,0

Ag ng/well80,0 1,3

Test voor de calibratiecurve

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.00.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

1.800

2.000

test for a calibration curve of 6 points

Ag + AgB added per well (ng)

Ab

sorb

ance

Ag concentratie in monster bepalen

Concentratie Ab constant houden

Kolom 1-6: calibratie Kolom 7-12: monster

Ag concentratie in monster bepalen

Kolom 1-6: calibratiecurve

Kolom 7-12: monster

Ab concentratie constant

Ag concentratie in monster bepalen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0,293 0,371 0,517 0,650 0,925 1,192 0,366 0,428 0,590 0,695 0,904 1,189B 0,313 0,374 0,560 0,674 0,879 1,161 0,301 0,391 0,589 0,729 0,923 1,205C 0,319 0,410 0,561 0,742 0,872 1,132 0,368 0,382 0,571 0,698 0,886 1,180D 0,358 0,430 0,587 0,732 0,873 1,118 0,355 0,386 0,572 0,690 0,867 1,170E 0,331 0,457 0,565 0,676 0,857 1,211 0,363 0,380 0,537 0,723 0,857 1,197F 0,285 0,450 0,561 0,704 0,934 1,197 0,287 0,376 0,515 0,728 0,947 1,116G 0,346 0,457 0,531 0,723 0,877 1,193 0,274 0,440 0,558 0,700 0,868 1,176H 0,325 0,444 0,559 0,677 0,942 1,174 0,370 0,415 0,495 0,680 0,879 1,140

gem. 0,321 0,424 0,555 0,697 0,895 1,172 0,336 0,400 0,553 0,705 0,891 1,172

Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4

Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55

Sample (ng/well) 800,00 615,38 473,37 364,13 280,10 215,46

IgG ng/well dilution250,0 1,0

AgB ng/well0,83

Ag ng/well80,0 1,3

Sample ng/well800,0 1,3

Optimale calibratiecurve

10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

f(x) = 25.6264816468876 x^-0.994174742135574

calibration

Ag + AgB added per well (ng)

Ab

so

rba

nc

e

Monster curve

100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

Sample

ng (sample)+ngAgB

Ab

sorb

ance

Berekening hoeveelheid insuline in monster

Sample SampleY-value (absorbance)

X-value (ng sample+ 0.83 ng AgB)

X-value calibration curve

Ag in sample (ng)

mg Ag / mL sample

Getallen trendlijn

a 25,626 0,891 280,1 29,3 28,5 1,017E-01

b -0,994

0,035

-3,359

3,379

y = 25,626x-0,994

Y/aln (Y/a)

ln (Y/a)/be ^ (ln (Y/a) / b)

Opdrachten

- Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat

Vuistregels: zie kader blz. 15

- Testcurve en kwantitative analyse van het insuline monster

Verslag - progress report! - het preparaat dat getest is

- het percentage werkzame antilichamen- de testcurves en de curves van ijklijn en monsterverdunningen- de berekening van de concentratie insuline in het monster

Opdrachten en verslag