enzyme-linked immunosorbent assay による第四...

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奈医誌. (J. Nara Md.Ass.)43 511 1992 (511) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay による第四因子 抑制物質中の IgGsubclass の検討 奈良県立医科大学小児科学教室 津本好克 ANALYSISOFIgGSUBCLASSINFACTOR VIII INHIBITORBY ENZYME-LINKEDIMMUNOSORBENTASSAY YOSHIKATSUSA WAMOTO Department01Pediatrics NaraMedicalUnive i Received September 30 1992 Summary: Semi-quantitativeanalysisforfactorVlll(F. Vlll)-specificIgGsubclassin theplasmaofhemophiliaA withF. V Ul inhibitorwasdevelopedbyenzyme-linkedim- munosorbent assay (E LISA) using immobilized recombinant F. Vlll. The bound F. Vl II-specific IgG subclass was detected by monoclonal anti-IgG! IgG 2 IgG 3 and IgG 4 antibodies followed by peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG. Out of 82 plasma samples from 14 patients withinhibitor 53samplesfrom11patientswerepositiveforonlyIgG 4 Therewasno sample which was positive for only IgG! IgG 2 or IgG 3 Ofthe eleven patients with samples which were positive for only IgG 4 one patient was also positive for only IgG! in one sample four patients were also positive for only IgG 2 in eight samples and one patient was positive foronly IgG 3 in three sampleson differentdates. N oneof F. Vlll-specificIgG subclass was detected in the plasma from27 samples of hemophilia Awithout inhibitor. In conclusion the ELISA system wassuitable notonly for the detection of F. Vlll inhibitor but also for semi quantitativeestimationofchangesintheplasmacontentofF. Vlll-specificIgGsubclass. Furthermore itwasdemonstratedthatthedominantsubclassamongtheinhibitorswas IgG 4 However otherIgGsubclasseswerealsodetectedin somecases. Index Terms hemophiliaA factorVlll(F. VII I), inhibitor IgGsubclass enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) しめる作用を 1Bethesda 単位と規定した Kasper らの 方法2) が一般的に用いられている. 血友病 A患者の出血に対する第V 1 1 1 1 因子補充療法中に F 8 -20 %の頻度で第V I 悶因子に対する抑制物質(αfactoωr vm に諸家により, s 巴叩 phac d x-G200 ゲ/ルレ3 櫨慮過第 2 降(7 inhibitωor; F.V Il一m hib itωor 心〕が発生し,通常の出血管理 Sglo bul lin 1 ο 〉に存在すること,また第VI 間子抑制物質中和 は困難になることが認められている 1). F 川Il -inhibitor 試験法で IgG 分画に属することが報告さわし3)-6) ,その後 添加第四因子の凝固活性を progressive に不活化するの さらに 1970 年代には中和試験法による IgGL 鎖の検索 で,その検出には正常血疑と含抑制物質血祭を等量混合 で, Kappa 鎖, Lambda 鎖,あるいはその両方に存在し し, 2 時間後に正常血築中の第VI 困子活性を 50 %失活せ うること 7) ,また H鎖の検索では大部分が IgGc1 ass

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奈医誌. (J. Nara M巴d.Ass.) 43, 511 ~521, 1992 (511)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assayによる第四因子

抑制物質中の IgGsubclassの検討

奈良県立医科大学小児科学教室

津本好克

ANALYSIS OF IgG SUBCLASS IN FACTOR VIII INHIBITOR BY

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY

YOSHIKATSU SA WAMOTO Department 01 Pediatrics, Nara Medical Unive吋iか

Received September 30, 1992

Summary: Semi-quantitative analysis for factor Vlll (F. Vlll)-specific IgG subclass in

the plasma of hemophilia A with F. VUl inhibitor was developed by enzyme-linked im-

munosorbent assay (ELISA) using immobilized recombinant F. Vlll. The bound F. VlII-specific

IgG subclass was detected by monoclonal anti-IgG!, IgG2, IgG3 and IgG4 antibodies followed

by peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG. Out of 82 plasma samples from 14 patients

with inhibitor, 53 samples from 11 patients were positive for only IgG4・Therewas no

sample which was positive for only IgG!, IgG2 or IgG3・Ofthe eleven patients with samples

which were positive for only IgG4, one patient was also positive for only IgG! in one sample,

four patients were also positive for only IgG2 in eight samples and one patient was positive

for only IgG3 in three samples on different dates. N one of F. Vlll-specific IgG subclass was

detected in the plasma from27 samples of hemophilia A without inhibitor. In conclusion, the

ELISA system was suitable not only for the detection of F. Vlll inhibitor but also for semi

quantitative estimation of changes in the plasma content of F. Vlll-specific IgG subclass.

Furthermore, it was demonstrated that the dominant subclass among the inhibitors was

IgG4・ However,other IgG subclasses were also detected in some cases.

Index Terms

hemophilia A, factor Vlll(F. VIII), inhibitor, IgG subclass, enzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA)

緒 言しめる作用を 1Bethesda単位と規定した Kasperらの

方法2)が一般的に用いられている.

血友病A患者の出血に対する第V川11山11因子補充療法中に F

8 -20 %の頻度で第V川III悶因子に対する抑制物質(αfactoωrvm に諸家により, s巴叩phac凶d巴x-G200ゲ/ルレ3櫨慮過第 2降(7

inhibitωor; F.VIll一m由hib副itωor心〕が発生し,通常の出血管理 S gloぬbul辻lin心1ο〉に存在すること,また第VII間子抑制物質中和

は困難になることが認められている 1).F川Il-inhibitorは 試験法で IgG分画に属することが報告さわし3)-6),その後

添加第四因子の凝固活性を progressiveに不活化するの さらに 1970年代には中和試験法による IgGL鎖の検索

で,その検出には正常血疑と含抑制物質血祭を等量混合 で, Kappa鎖, Lambda鎖,あるいはその両方に存在し

し, 2時間後に正常血築中の第VII困子活性を 50%失活せ うること 7),また H鎖の検索では大部分がIgGc1assで

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(512) 津本好克

IgG4優位と報告されるようになった8). チレン ELISAプレート (Nunc,D巴nmark)のweIlにお

1984年,第VIII因子遺伝子が単離され,その塩基配列 のおの 100μ1(0.03U/w巴11)ずつ分注し, 40Cで一晩静

と,それよりコードされる第VIII因子蛋白は 2332個のアミ 置し固相化した.次いで, 4 %ウ‘ン血清アノレブミン

ノ酸で,ホモロジーより 3個の A ドメイン, 1個の Bド (BSA)加 0.05M炭酸緩衝液にて 3TC2時間ブロッキ

メインおよび 2個の Cドメインより構成されているこ ング後, 0.05 % Tween 20加 0.15M塩化ナトリウム加

とが明らかになった9) 問.また第Vll困子は循環血疑中で O.OlMリン酸緩衝液(PBS/Tw巴巴n)にて洗浄した.

種々のプロテアーゼによる分解をうけ, N末端由来の 90 step 2. r. F川HとF目VllHnhibitorとの反応.各血疑サ

210 KDaのH鎖と C末 端由来の 80KDaのL鎖の ンフ。ルの希釈列を添加し, 40Cにて 1晩反応結合させた.

Ca++結合体として存在していることが知られるように step 3.抗ヒト IgGsubclass マウスモノクローナノレ抗

なった)4). Fu1cherら)5)は第VIII因子と F.VIII-inhibitorの 体との反応:特異性の確認された抗ヒト IgGl> IgG2,

反応を Immunoblot法で検討し,血友病 A患者に発生 IgG, (ICN Immunobiologicals, Inc., Israel)あるいは

した F.VllI-inhibitorのうち第VIII因子 L鎖中の 72KDa IgG4(Biomakor, Inc., Isra巴1)マウスモノクロ一ナノレ抗

fragmentのみ, H鎖中の 44KDa fragmentのみ,ある 体を 1000倍希釈後 100μl添加し,それぞれの上記反応

いは 72KDaと44KDafragm巴ntの両方に反応する例 系にrcにて 1晩反応結合させた.

が存在することを観察した.さらに彼らは lmmunoblot step 4.ベノレオキシダーゼ標識抗マウス IgGF(abつ2法にて F川目ーinhibitorを構成する IgGsubclassを検索 との反応目 1000倍希釈したベノレオキシダーゼ標識抗マ

し, IgG)およびIgG4が検出されることを報告した16). し ウス IgGF(ab')2(TAGO, Inc., Burlingame, CA, USA)

かし Immunoblot法を用いた F.VIII-inhibitor中の IgG を 100μl添加し,3TCにて 2時間反応後,基質として o

subclassの検出については, RIを使用しなければなら フェニレン・ジアミンを添加,室温で正確に 15分間反応

ず,手技が煩雑でかつ定量的解析に困難を有している. 後, 2 N H2S04 100μlを加えて反応を停止させ, O.D

そこで著者は新しい検出法として, Bayer!Cutt巴r社よ 492 nmにて吸光度を測定した.すべての測定は

り提供をうけた recombinantfactor VIII(r. F. VIII, BA Y dupulicateで、行った.

w 6240)を用いて, F目VIII-i由 ibitor中の IgGsubclassを 5.血友病A思者血築中の IgGsubclassの定量・ミ

enzym巴linkedimmunosorbent assay(ELISA)で、検索 ドリ十字より提供を受けた IgGsubclass 測定キットを

した. 用し、,サンドイツチ ELISA法により測定した.

対象および方法

1.対象:F.VIII-inhibitorの発生した血友病A患者 14

例より,すくなくとも数カ月の期聞をおいて経時的に採

取した 82血竣サンプノレと F刊I-inhibitorを有していな

い血友病A患者 27例よりの 27血竣サ γ プノレについて

検索した.なお,健康成人 20例 20血疑サンフツレを対照

とした.

2.第VIII因子活性の測定・第別11因子欠乏血援を基質と

した凝固一段法的によった.

3. F.VIII-inhibitorの力価の測定:Kasperらの方法2)

に準じて,正常血援と被検血援を等量混合し,3TC 2時

間加温後,残存第VII悶子活性を測定した.

4. F.VIII-inhibitor中の IgGsubclassのELISAによ

る測定:F.VIII-inhibitor中の IgGsubclassについて,下

記の stepによる ELISAで検討した.

step 1.第VIII因子の固相化:Bayer!Cutter社より提

供をうけた r.F.V聞を用いた.本剤の表示力価は 500U/パ

イアノレで,添付された注射用蒸留水 5mlで溶解後, 0.05

M炭酸緩衝液(PH9.6)にて 0.3U/mlに希釈し,ポリス

成 績

1. F刊I-inhibitorを構成する IgGsubclassのELISA

による検量線

Kasp巴r法による F.VIII-inhibitor力価(Bethesda単

位〉が比較的高い数例の血友病 A患者血祭サγ フソレをそ

れぞれ 102,10', 10'あるいは 105倍に希釈し各濃度につい

てIgGl> IgG2, IgG,あるいは IgG,のそれぞれに対する

ELISAを行い, O. D. 492nmにおける吸光度を測定し

た.

Bethesda単位 1370を示した Sample39(後述 Tabl巴

l参照〉では IgG)-ELISA測定時の O.Dは102希釈時

1.14, 10'希釈時 0.77,10'希釈時 0.30,105希釈時 0.01と

ほぼ直線関係を示した(Fig.1-a).対照として正常人 20

血祭サンフツレの IgG)-ELISA系の平均 O.D土 2S. D

は102希釈時 0.03士0.07,10'希釈時 0.01士0.03,10'希釈

時 0.00士0.02,105希釈時 0.00士0.02であった.正常人

血援による O.D.+2 S.D. 以上を呈する被検血媛を

ELISA陽性とし, ELISA陽性を示す最大希釈倍数にそ

のO.D.値を乗じたものを ELISA係数(ELISAIndex)

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Enzym巴LinkedImmunosorbent Assayによる第VIII因子抑制物質中のIgGsubclassの検討 (5l3)

Table 1. Inhibitor titers and ELISA indexes in 82 plasma samples from 14 hemophilia A with inhibitor

Cas巴 Sample lnhibitor titer ELISA ind低 Case Sample Inhibitor titer ELISA indほ

N o. N o. (Bethesda units/m1l lor F. VIII-inhibit口r!gGsubclass No. No. (Bethesda units/m1l lorF刊卜inhibitorIgG subclass

1.M. B.

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6.K. 1. 27

7.K. Y. 31

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Plasma dilutions

Fig. 1. Typical dose-response curv巴sfor th巴concentrationof F.VIIl-specific IgG subc1ass measured by ELISA a : IgGj response curv巴 usingsample 39. b : IgG, r巴sponsecurve using sample 31. c : IgG3 respons巴 curveusing sampl巴 74目 d: IgG4 response curve using sample 40.

と定義すると, Sampl巴39のELISA係数は 3000と算定 IgG,-ELISAおよびIgG3-ELISAにおける ELISA係数

された.本例の IgG,-ELISA,IgG3-ELISAおよびIgG4 はそれぞれ 3800,< 9, < 8であった.

-ELISAによる ELISA係数はそれぞれ 54,< 8, 3000 2 .血友病A患者血去最中の F.VIIl-inhibitorを構成する

であった IgGsubc1assのELISAによる検討

Sample 31 (780 Bethesda単位〉の血竣希釈 10'-105時 教室で観察中の F.VIIl-inhibitorの検出された血友病

のIgG,-ELISA系の O.D.は1.11,0.36, 0.04, 0.00で A患者およびF川Il-inhibitorの検出されていない血友

濃度依存性に吸光度は増加した(Fig.1-b).正常人血竣 病 A患者の各血援サンフツレについて, r. F川11に対する特

別サンプノレの 10'-105希 釈 時 の IgG,-ELISA系の 異的 IgGsubc1assの性状を ELISAで検索した.

O.D士 2S. D.はそれぞれ 0.03:t0.06,0.02:t0.04, i) F.VIIl-inhibitorの検出された血友病 A患者血疑

0.02土0.03,0.0l:t0.03であった. したがって Sample 中の F.VIIl-inhibitorIgG subc1assの検討

31のELISA係数は 360と算定された.本例の IgGj- Kasper法で F.VIIl-inhibitorの検出された血友病 A14

ELISA, IgG3-ELISAおよび IgG4-ELISAによる 例について経時的に ELISAで F.VIIl-inhibitorIgG sub-

ELISA係数はそれぞれ<10,< 8, 2600であったc1assの動態を検討した.

Sample 74(1760 Bethesda単位〉の血疑希釈 10'-105 IgGj-ELISA系で IgGjの検出されたのは 3症例 14血

時の IgG3-ELISA系の O.Dは0.45,0.21, 0.03, 0.00 媛サンフソレで, IgGj -ELISA係数は 22-3800に及んで

で他の IgGsubc1ass-ELISA系に比し,各希釈時におけ いた.

る吸光度は{底値であったものの,濃度依存性に明らかに IgG,-ELISA系で IgG,の検出さわしたのは 5症例 10血

増加していた(Fig.1-c).正常人血疑 20サンフ。ノレの 10' 紫サンプノレで IgG,-ELISA係数は 30-360に及んでい

-105希釈時の IgG3-ELISA系の O.D.土 2S. Dはそれ た.

ぞれ 0.04士0.04,0.03士0.04,0.01土0.03,0.0l:t0.03 IgG3-ELISA系で IgG3の検出されたのは 3症例 11血

であった.したがって Sample74のELISA係数は 210 援サンプノレで IgG3-ELISA係数は 16-210に及んでし、

と算定された.本例の IgGj-ELISA,IgG,-ELISAおよ た.

びIgG,-ELISAによる ELISA係数はそれぞれ 2110, IgG4-ELISA系で IgG,の検出されたのは 13症例 79

< 9, 10230であった. 血援サンプノレで IgG4-ELISA係数は 31-22000に及ん

Sampl巴40(1800 Beth巴sda単位〉の血竣希釈 10'-105 でいた.なお Kasp巴r法による F.VIIl-inhibitor力価

時の IgG4-ELISA系の O.D.は0.83,0.68, 0.39, 0.00 (Bethesda単位〉の対数と IgG,-ELISA係数の対数は

で濃度依存性に吸光度は増加していた(Fig.l-d).正常 r=0.84回帰直線 logy=0.761og x十1.24と良好な相

人血去最初サンプノレの 10'-105希釈時の IgG,-ELISA系 関を示していた(Fig.2).

のO.D.はそれぞれ 0.13:t0.12,0.08士0.05,0.02士 各サンフ。ノレごとにみると IgGh IgG,ならびに IgG3そ

0.03, 0.00士0.03であった.したがって Sample40の れぞれの単独陽性サンフツレは存在しなかったが, IgG4単

ELISA係数は 3900と算定された.本例の IgGj-ELISA, 独陽性は 53サンフツレで、あった. IgGjおよびIgG4陽性が

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Enzyme-Linked Immunosorbent Assayによる第VIII因子抑制物質中のIgGsubc1assの検討 (515)

105

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10 102 103

Inhibitor titer ( Bethesda units/ ml )

Fig. 2. Correlation between inhibitor titer and IgG,-ELISA index.

• •

104

The regression line ralating Inhibitor tit巴rto IgG4-ELISA index is log y=O. 76 logx十1.24(r= 0.84).

6サγ フ・ル, IgG2およびIgG4陽性が8サンフ。ル,IgG3お 推移

よびIgG4陽性が3サンフツレ,IgG"IgG2およびIgG4陽性 過去にF川ll-inhibitorが発生し,経過を観察していた

が 1サンフソレ, IgGj, IgG3およびIgG4陽性が 7サンプ 重症血友病A3症例の外科手術時に,第VIII因子製剤によ

ル, IgG2, IgG3およびIgG4陽性が 1サンフツレであり,す る止血管理を行い,その際,F川II-inhibitorおよびF川一

べての IgGsubc1assが陽性を呈するサンフ・ルはなかっ inhibitor中の IgGsubc1assの推移を追求した.

た.また Inhibitorの検出されていた症例で, IgG" 症例 H.A目 5才男児,虫垂切除術, (Table 1 Case

IgG2, IgG3およびIgG,のすべてが検出されなかったのは 11 Sample 47-57) 10ヶ月時奈良医大小児科で重症血

1例 3サンフ。ルであったが,これらの F川ll-inhibitor力 友病Aと診断 3才時左足関節内出血の際, F.VIII-in白

価(Bethesda単位〉はし、ずれも低値であった(Table1). hibitorを検出した.平成元年 12月5日夕刻印才時〉よ

ii) Kasper法で F.VsI-inhibitorの検出されていない り右下腹部痛出現し,急性虫垂炎と診断.翌日,第四因

血友病A患者血築中の F.VIII-inhibitorIgG subc1assの 子製剤補充下に奈良医大第一外科で虫垂切除術を施行さ

検討 れた.

Kasper法でF川II-inhibitorの検出されていない血友 第VIII因子製剤は4日間で計 9回にわたって総量 9000

病 A27例 27血竣サンフ。ルについて ELISAで検討した. 単位を投与された.

すべてのサンフ勺レの IgG"IgG2, IgG3およびIgG4は陰性 Kasper法による F川II-inhibitor力価は,術前の第四I

であった(Table2). 因子製剤投与開始前は1.4B. U./mlであったが,投与開

3.外科手術を施行した F.Vlll-inhibi torを有する血友 始後5日目より上昇しはじめ.10日自には 512B. U./ml

病A患者の術後の F.VIII-inhibitor中の IgGsubc1assの とピークに達した.その後漸次低下し. 120日目には 37

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(516) 津本好克

Table 2. Inhibitor titers and ELISA indexes in 27

plasma samples from 27 hemophilia A

without inhibitor

Cas巴 Sampl巴 Inhibitor titer ELISA indほ

N o. N o. CBethesda units/mIl or F. Vlll-inhibi旬r!gGsubc1a田

IgG, IgG2 IgG3 IgG4

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く10 <9 く8 <25

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く10 <9 く自 <25

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<10 <9 <8 <25

<10 <9 く8 く25

15.K. A 83

16.K. N. 84

17.M. N. 85

18.K. K. 86

19.1. U. 87

20. T. F. 88

2l.S. Y. 89

22.K. M. 90

23.Y. M. 91

24.K. S. 92

25.H. M 93

26.M. H 94

27.Y. K 95

28.N.K. 96

29.S. K. 97

30.K. T 98

3l.T.S 99

32.S. H. 100

33.S. H. 101

34.Y. 1. 102

35.1. N. 103

36.Y.1. 104

37 .A. K. 105

38.Y.N. 106

39.K. N町 107

40.M.1. 108

41.H. K. 109

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B. U./mlとなった.

ELISA による F.Vsl-inhibitor中の IgGsubclassの検

索では, IgG4のELISA係数は術前 57であったが,投与

開始後 5日目 203,7日目 778と漸次上昇し, 19日目に

は4510とピークに達し,その後漸減し, 120日目には 66

となった. IgG,およびIgG2は経過中検出されなかった.

IgG3は術前<8であったが,投与開始後 12日目 25,14

日目 48と上昇しピーグに達した.その後 19日目 31と低

下し, 42日目には<8となり,以後陰性であった(Fig

3). 血築中の IgG"IgG2, IgG3および IgG,は経過中そ

れぞれ 652-791,295-351, 25-38および 6.1-12.1

mg/dlの範囲におよんでおり, F.VIII-inhibitor中の IgG

subclassの変動とは有意の相関を示さなかった.

症例 M.O.49才男性,左耳下腺腫蕩摘出術(Table1

Case 12 Sample 58-68)

20才時長崎大学原研内科で血友病 A と診断. 40才時

左大腿部血腫出現に際し, F. VIII-inhibitorを検出した.昭

和 61年 3月頃(46才時〉より左耳下部に 2.5X3.0cm大

の腫痛に気付くも放置,腫癌はその後徐々に増大し,平

成2年 2月には 6.5X6.5cm大にまで達した.生検もか

ねて平成 2年 2月6日第VIll因子製剤補充下に奈良医大耳

鼻咽喉科で左耳下腺腫蕩摘出術を施行された.第VIII~君子

製剤は 6日間で計 13回にわたって,総量 78000単位投与

された.

Kasper法による F.VIII-inhibitor力価は術前の第VIII因

子製剤投与開始前は 3.1B.U./mlであり,第VIII因子補充

療法により中和され低下したが,投与開始後5日目より

4.0B. U目/mlと上昇しはじめ 10日目には 1570B. U./

mlとピーク に達し,その後,漸次低下し 18日目には

1070 B. U./ml, 104日自には 532B. U./mlとなった.

IgG4のELISA係数は術前 229で,第四因子補充療法

によりいったん低下したものの再び上昇 5日目には

58, 8日目には 1520,10日目には 5820と漸次上昇し,

18日目には 22000とピークに達した.その後漸次低下し

34日自に 7620,76日目に 5310,104日自には 3840とな

った.

IgG" IgG2およびIgG3はそれぞれ<10,< 9, < 8と経

過中つねに陰性であった(Fig目 4).

血築中の IgG"IgG2, IgG3および IgG4は経過中それぞ

れ 659-805,205-311,16-22および 12.1-23.5mg/dl

の範囲におよんでおり, F.VlII-inhibitor中の IgG sub-

classの変動とは有意の相関を示さなかった.

症例 M. N. 21才男性,左大腿骨骨折観血的整復術

(Table 1 Case 13 Sample 69-79)

8才時奈良医大で血友病Aと診断. 14才時肉眼的血

尿出現に際し, F川II-inhibitorを検出した.平成元年 10

月31日夕刻(21才時),単車に乗っていて横転,左大腿骨

穎上骨折を受傷,翌日月 1日奈良医大整形外科にて第VIII

因子製剤補充下に左大腿骨骨折観血的整復術を施行され

た.第VIII因子製剤は 7日間で計 12固にわたって総量

57000単位を投与された.

Kasper法による F刊I-inhibitor力価は術前の第VIII因

子製剤投与開始前は 2.0B. U./mlであったが,投与開始

後 6日目より上昇しはじめ, 16日目には 1760B. U目/ml

とピークに達し,その後漸次低下し, 283日目には 121

B. U./mlとなった.

IgG,の ELISA係数は術前 215であったが,第VII困子

製剤投与開始後 6日目 269,9日目 8110と漸次上昇; 34

日自には 10350とピークに達し,その後漸減し 283日目

には 436となった. IgG,は術前 22であったが 6日目

40, 9日目 1100と漸次上昇, 16日目には 2110とピーク

に達しその後漸減, 283日目にはおとなった.IgG3は術

前<8と陰性であったが 7日目 25,16日目に210とピ

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(517) Enzym巴LinkedImmunosorbent Assayによる第VIII因子抑制物質中のIgGsubclassの検討

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Fig. 3. Changes in Inhibitor titer and ELISA index of Case 11 aft巴rtreatment with factor VIII concentrates ~ : Appendectomy, (0ーや>): Inhibitor titer, (仁子一口): IgG1-ELISA index, (.-一念): IgG,-ELISA index, (争----): IgG,-ELISA index, (・--): IgG4-ELISA index

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Fig. 4. Changes in Inhibitor titer and ELISA index of Case 12 after treatment with factor VIII concentrates. ~:L巴ft parotid gland tumor resection, (かー0): Inhibitor tit巴r, U口--{コ): 1克G,-ELISAindex (.-一企): IgG,-ELISA index, (_・): IgG,-ELISA ind巴x,(昌司): IgG4-ELISA index

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体で中和されることから, IgGに属する同種抗体である

と認識されるようになった.

Hoyerら(1984)8)は凝血学的方法にもとづいた F.VIIト

inhibitor中和試験法により, F.VIII-inhibitor中の IgG

subc1assはIgG4が優位で‘あることを報告している.しか

しF.VllI-inhibitor中和試験法ではF刊Hnhibitor力価が

低値の場合は IgGsubc1assを同定しがたい欠点があっ

た.

Sanch巴z-Cu巴ncaら(1990)'6)はF.VIIHnhibitorの免疫

学的特性を ELISA系で検索し, F刊I-inhibitor力価が

0.156 B. U./mlと低値の場合も測定可能で、あることを

報告した.彼らはマイクロプレート上で抗vWFIgGを

固相化し,市販第VIII因子製剤(Haemate,Behring, Inc.,

West Germany)と反応後, F刊Hnhibitor患者血柴サン

フツレを添加せしめ,ベノレオキシダーゼ標識抗 H鎖あるい

は抗 L鎖抗血清,あるいはアノレカリフォスファターゼ標

識抗 IgGsubc1ass(IgG" IgG" IgG3あるいはIgG4)モノ

クロ一ナノレ抗体とそれぞれ反応せしめた ELISAの系を

樹立した.その測定系で血友病 A inhibitor患者より得

た 8血媛サンフ勺レを測定し 8サンフソレすべての F川H

inhibitor中の IgGsubc1assはIgG4を含み, うち 1サン

フツレは IgAとIgG"IgG,およびIgG3も含むこと, また,

SLE患者に発生した F目VIII-inhibitorはすべての IgG

-f7となりその後漸減, 220日目には<8と陰性化した.

なお IgG,は経過中<9であり陰性であった(Fig.5).

血竣中の IgG"IgG" IgG3および IgG4は経過中それぞ

れ 567-816,211-289,29-45および 23.5-31.2mg/dl

の範囲におよんでおり, F.VIll-inhibitor中の IgG sub.

c1assの変動とは有意の相関を示さなかった.

血液凝固因子の測定に免疫学的手技が導入され Laur回

巴11法(rocket immunoelectrophoresis), radioim.

munoassay (RIA)あるいは enzyme-link巴d im

munosorbent assay(ELISA)などが用いられるように

なったのは, 1970年代以後である.ポリスチレン製マイ

クロプレート上に抗体を固相化し,検体,酵素標識抗体

および酵素基質を反応せしめて吸光度を測定する

ELISA系は Radioisotopeを用いることなく,微量の検

体を感度良く,多数同時に測定しうる利点がある.教室

でも第VIII因子18),第IX因子19),第X因子制21),von Will巴-

brand因子22),Protein C23), Protein S叫 25)などの微量測

定に利用してきた.

緒言で述べたごとく,血友病 A患者の第VIII因子補充療

法中に発生する F.VIII-inhibitorは第VIII因子活性を pro.

gressiveに失活せしめるが,この作用が IgGvこ対する抗

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Enzyme-Linked Immunosorb巴ntAssayによる第VIII因子抑制物質中のIgGsubclassの検討 (519)

subclassを含むことを観察している.

著者は彼らの報告とはまったく independentに,ポリ

スチレン製マイクロプレートの小孔に r.F.VIII製剤を固

相化(step1), F.VllI-inhibitor患者血援の添加(step2),

抗ヒト IgGsubclassマウスモノクロ一ナノレ抗体(IgG1,

IgG2,IgG3あるいは IgG4)と反応(step3)後,ベノレオキシ

ダーゼ標識抗マウス IgGF(ab')2との反応(step4)を行

い,最後に基質の oーフェニレン・ジアミン添加後, O.D.

492nmで吸光度を測定する ELISA系を考案した.

第四因子に特異的に反応する IgGsubclassの定量に

はF.VllI-inhibitorの純化にひきつづいてそれぞれの IgG

subclassの純化物が必要と考えられるが,少量の患者血

竣よりの作製は現実的には困難である.したがって著者

は, Kasper法による F.VIII-inhibitor力価が比較的高い

数例の inhibitor患者血疑サンプノレを 102-10'倍に希釈

し,各濃度について F.VIII-inhibitorを構成する IgG"

IgG2, IgG3および IgG.をELISA系で測定し,正常血援

サシフ。ノレの ELISAによるO.D.値:十 2S.D.をcutoff ii直

とし,それ以上を示した O.D値に希釈倍数を乗じ,

ELISA係数を算定することにした.

教室で F.VID-inhibitorを検出し,観察中の血友病 A14

症例の 82血竣サンプノレについて F.VIll-inhibitor中の

IgG subclassをELISAで測定したところ, IgG4単独検

出例は 11例(53サンプノレ〉であったが, IgG" IgG2, IgG3

それぞれの単独検出例は存在しなかった.IgG4を単独に

検出した 11例のうち 1サンプノレは経過中に IgG1のみ,

4例(8サンフソレ〕はIgG2のみ,また 1例(3サンフaノレ〉は

IgG3のみが IgG4と同時に検出された.

また IgG"IgG,およびIgG4の同時検出例が 1サンプ

ノレ,IgG2, IgG3およびIgG4の同時検出例が 1サンフソレ,

IgG" IgG3およびIgG4の同時検出例が l例c7サンフツレ〉

存在していた.IgG" IgG" IgG3およびIgG4のいずれも

検出しえなかったのは 1例c3サンフ。ル〉で、あったが,そ

のF.VIII-inhibitor力価はし、ずれも低値であった.

以上のごとく F.VIII-inhibitorを有する血友病A患者

血媛中の F.VIIIに特異的な IgGsubclassは大部分が IgG4

であったが,一部の症例で、は経過中に IgG1,IgG,あるい

はIgG3も出現していた.

なお 82血築サンプノレ中, IgG1のELISA係数は

22 -3800, IgG2の係数は 30-360,IgG3の係数は

16-210, IgG4の係数は 31-22000におよんでいた.

また Kasper法による F.VIII-inhibitor力価(Bethesda

単位〉の対数を X軸, IgG4のELISA係数の対数を Y軸

にとると,両者は相関係数 r=O.84回帰直線 log y=

0.761ogx十1.24と良好な相関を示していた (Fig.2)

なお F川I1-inhibitor力価と他の IgGsubclassのELISA

係数との相関は認められなかった.

次に第VIII因子の抗原刺激により F.VIII-inhibitor中の第

VIll因子特異的 IgGsubclassがどのように推移するかを,

第四因子製剤補充下に外科的手術を施行した F川I1-in-

hibitor患者 3例より経時的に血塁走サンプノレを採取し,

ELISAで検討した.

急性虫垂炎の診断で虫垂切除術を施行した 5才男児で

は,術前の F刊I-inhibitor力価は1.4B町 U./mlでIgG4

のELISA係数は 57であったが, IgG" IgG,およびIgG3

は検出しなかった.F.VIII-inhibitor力価は手術日よりの

第VII困子製剤投与開始後, 5日目より上昇しはじめ 10日

目512B. U./mlとなりピーグに達した. IgG4のELISA

係数は投与開始後漸増し, 19日目 4510となりピ-17に

達した. IgG1およびIgG2は経過中,常に陰性であった.

また IgG3は12日目より陽性化, 14日目 48となりピー

クに達し, 42日自に陰性化した(Fig.3).

左耳下腺腰湯摘出術を行った 49才男性の術前の F.VIII

-inhibitor力価は 3.1B. U./ml, IgG4のELISA係数は

229であり, IgG" IgG,およびIgG3は検出しなかった.

F.VIII-inhibitor力価は手術日よりの第VIII因子製剤投与開

始後,中和療法によりいったん低下したものの 5日目よ

り上昇しはじめ, 10日目には 1570B. U./mlとなりピー

クに達した.IgG4は投与開始後漸増し,18日目 22000と

なりピ-17に達した.なお IgG"IgG2およびIgG3は経過

中常に陰性であった(Fig.4).

左大腿骨骨折観血的整復術を行った 21才男性の術前

の F.VIII-inhibitor力価は 2.0B. U./mlで IgG1の

ELISA係数は 22,IgG4は215であり, IgG,およびIgG3

は検出しなかった.F川I1-inhibitor力価は手術日よりの

第VIll因子製剤投与開始後6日目より上昇しはじめ, 16日

目1760B. U./mlとなりピークに達した. IgG1および

IgG3は投与開始後漸増し,16日目に前者は2110,後者は

210となりピークに達した.IgG4は,IgG1およびIgG3の

ピークに遅れて,34日目に 10350となりピークに達し

た.経過中 IgG2は検出しなかった(Fig.5).

3症例とも術後の anamnesticresponseにより F.VIII-

inhibitor力価およびIgG4のELISA係数は著しく上昇

したが,前者のピークは後者のピークに先行して推移し

ていた 3例中 l例は IgG3が一過性にかつ軽度に上昇

し,また l仰jはIgG1およびIgG3が一過性に上昇した.し

たがって IgGsubclassの動態は 3例ともやや異なって

いた. 3症例に対して投与した第VIII因子製剤は同一製剤

であり,おのおのの症例において IgGsubclassの動態が

異なったことは個体差に起因するものと推察された.

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(520) j宰本好 克

なおF.VIII-inhibitorの検出されていない血友病A27 例では第VIII因子特異的 IgGsubc1assはいずれも検出さ

例では第VIII因子特異的 IgGsubc1assはいずれも検出さ れなかった.

れなかった 4.r. F.VIII製剤を用いた ELISA法による IgG sub-

緒言で述べたごとく, F.VIII-inhibitorの発生頻度は血 c1assの検出法は, RIを使用することなく比較的簡便な

友病Aの8~20% とされている.この数値が患者血援 方法と考えられる.

中の第四因子蛋白の欠如に基づくとすれば,血友病A患

者の大部分は何らかの第VIII因子構造を有しているのでは 本論文の要旨は第 51回日本血液学会総会および第 32

ないかと長らく推察されてきた.しかし,第VII困子活性 回日本臨床血液学会で、発表した.

は欠如するも第VIII因子抗原を有すると考えられる症例は

血友病Aの約 10%にすぎず,第四因子活性,抗原とも欠文 献

如する例が大部分である.このようなことから F.VIII-in- 1) Kasper, C. K. : Progr巴ssin Hematology : Man

hibitorの発生を予知することは困難であった. 1984年 ag巴m巴ntof inhibitors to factor VIII(Brown, E. B.,

第VII困子遺伝子が単離され,その塩基配列と第VIII因子蛋 ed.). Vo1. 12, Grune and Stratton, Or1ando, F. L.,

白のアミノ酸配列が明らかになってきたが,血友病Aの p 143, 1981

遺伝的異常についても,点変異,欠失,挿入,重複など のKasper,C. K., Aledort, L. M., Counts, R. B.,

があり,かっそれらの部位,程度も諸種であることが知 Edson, J. R., Fratantoni, J., Green, D.,

られるようになった.これらの遺伝子異常のなかで欠失 Hampton, J. W., HiIgartner, M. W., Lazerson,

およびナンセンス点変異例はinhibitor発生との関連で よ, Levine, P. H., McMillan, C. W., Pool, J. G.,

注目されている.今回,著者はF.VIII-inhibitorを有する血 Shapiro, S. S., Shulman, N. R. and van Eys, J. :

友病A症例について, F.VIII-inhibitor中の IgGsubc1ass A more uniform measurement of factor VIII

の動態を検討したが,今後これらの症例についての遺伝 inhibitors. Thrombos. Diathes. ha巴morrh.34 : 869

子異常との関連性について検討が必要と思われる -872,1975

結 語3) Bidwell, E., Denson, K. W. E., Dike, G. W. R.,

Augustin, R. and Lloyd, G. M. : Antibody natur巴

F. VIlI-inhibi torを有する血友病A患者血竣中の第VIII of the inhibitor to antihaemophilic

因子特異的 IgGsubc1assの動態をr.F.VIll製剤を用いた globulin(factor VIII). Nature 210: 746-747, 1966.

ELISA系で検討した 4)Shapiro, S. S. : Th巴 immunologiccharacter of

1. F.VIII-inhibitor力価(Bethesda単位〕の比較的高い acquired inhibitors of antihemophi1ic globulin

数例の血友病A患者血疑サンフツレを 10'-105倍に希釈 Cfactor VIII) and the kinetics of their int巴raction

し,各濃度についての IgG"IgG" IgG3あるいはIgG4の with factor VIll目J.c1in. Invest. 46 : 147-156, 1967

それぞれに対する ELISA系の検量線を作成した. さら 5) L田 her,J. M., Shuster, J., Evans, R. K. and

tこELISAにおける O.D値より ELISA係数を求めた Poulik,M. D.: Antibody nature of an AHG

2. F刊I-inhibitorの検出されている血友病A14症例 (factor VIll) inhibitor目].Pediat. 72 : 325-331, 1968.

の82血媛サンフツレではIgG4単独検出症例は 11症例(53 6) Andersen, B. R. and Terry, W. D. : Gamma G 4

サンフツレ〉であった.IgG" IgG" IgG3それぞれの単独検 globulin antibody causing inhibition of c10tting

出例は存在しなかった. IgG4を単独に検出した 11例の factor VIII. N ature 217 : 174-175, 1968.

うち 1サンフ。ルは経過中に IgG,のみ,4例(8サンフツレ 7)Robboy, S.J., Lewis, E. J., Schur, P. H. and

はIgG,のみ, また l例(3サンフロノレ〉はIgG3のみが IgG4 Colman, R. W. : Circulating anticoagulants to

と同時に検出された.なお 82血竣サンプノレ中 IgG,の factor VIII. Immunochemical studies and c1inical

ELISA係数は22-3800,IgG,の係数は 30-360,IgG3の response to factor VIII concentrates. Am. ]. Med

係数は 16-210,IgG4の係数は31-22000の範囲におよ 49 : 742-752, 1970.

んでいた.IgG" IgG" IgG3およびIgG4のいずれも検出 8) Hoyer, L. W., Gawryl, M. S. and de la Fuente,

しえなかったのは1例(3サンフ・ル〉で‘あったが,その F. B. : Immunochemical characterization of factor

VIII-inhibitor力価はいずれも低値であった VIllinhibitors : Factor VIII inhibitors(Hoyer, L. W.,

3. F.VllI-inhibitorの検出されていない血友病A27症 巴d.).Alan R. Liss, Inc., New York, p 73,1984.

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