27 dansk kemi, 86, nr. 8, 2005

Ny LC-MS/MS? - Så er det også os!

48 16 62 00 · Gydevang 17-19 · 3450 Allerød

AAS · ICP/MSUV-VIS · LC/MSGC/MS · FT-IR/NIR

Bioteknologi

Et samarbejde mellem BioCentrum-DTU, Institut for Kemitek-nik, DTU og Danisco A/S har udmøntet sig i etableringen af et ph.d.-projekt om udvikling af en enzymkatalyseret proces til fremstilling af monoglycerider ud fra glycerol og olie.

Ph.d.-projektet er finansieret af Danisco A/S med lektor Xue-bing Xu, DTU, som hovedvejleder. Hovedformålet er at belyse forskellige aspekter ved enzymatisk produktion af monoglyceri-der og at udvikle en industriel fordelagtig procesmetode.

Monoglycerider verdens mest anvendte emulgatorerMonoglycerider eller blandinger af mono- og diglycerider udgør hele 75% af den globale emulgatorproduktion, der estimeres til 200-250 mio. tons årligt [1-2]. Monoglycerider har et utal af an-vendelsesmuligheder og bruges kommercielt inden for en lang række industrier såsom levnedsmiddelproduktion, farmaceutisk industri, kosmetik- og malingfremstilling m.v.

I fødevareindustrien er monoglycerider vidt udbredt i eksem-pelvis brødprodukter, margarine, mejeriprodukter og konfek-ture, hvor de har emulgerende, stabiliserende og teksturforbed-rende egenskaber. De er også vigtige komponenter i farmaceu-tiske produkter, hvor de kan transportere virksomme stoffer til bestemte steder i kroppen, hvor de ønskes frigivet. Monogly-cerider kan desuden give konsistensforbedrende egenskaber til cremer og lotioner. Inden for tekstil-, fiber- og plastfremstilling anvendes de pga. deres antistatiske og blødgørende egenskaber [3-7].

Enzymatisk produktion af monoglyceriderEnzymkatalyseret monoglyceridproduktion udgør et stort industrielt potentiale, og kløften mellem forskningsbaserede resultater og industriel anvendelse bliver fortsat mindre

Af Marianne l. Damstrupa, Anker D. Jensenb, Søren Z. kiilb, Flemming V. Sparsøc og Xuebing Xua

aFood Biotechnolgy and engineering, BioCentrum-DtU, binstitut for kemiteknik, DtU, cDanisco A/S

Acylglycerolkemi Monoacylglyceroler (MAG), eller i daglig tale monoglycerider, tilhører gruppen af »neutrale lipider« og består af en glycerol-enhed, hvortil en fedtsyre er esterbundet. De øvrige acylglyce-roler betegnes diacylglycerol (DAG) og triacylglycerol (TAG), afhængig af om der er to eller tre fedtsyrer bundet til glyce-rolenheden. Fedtsyreenhederne på acylglyceroler kan variere i kædelængde (typisk C

12 –C

22), mætningsgrad (antal dob-

Figur 1. Struktur af partielle acylglyceroler. R refererer til en fedtsyre-enhed. α og β refererer til fedtsyrens sn-position på glycerolenheden.

Figur 2. Illustration af forskellige mono- og diglyceridformationer. illustrerer hydrofilt hoved og ---- illustrerer hydrofob hale.

▲

28dansk kemi, 86, nr. 8, 2005

beltbindinger) og placering på glycerolenheden (sn-1- (3) eller sn-2-position). I figur 1 er vist eksempler på forskellige partielle acylglyceroler.

De partielle acylglycerolers store anvendelighed - især pro-dukter med et højt indhold af monoacylglycerol på minimum 90% - skyldes især deres amphiphile struktur, med en hydrofil og en hydrofob gruppe. Ved blanding i en vandig opløsning dan-ner de let miceller, vesikler eller liposomer (figur 2). Miceller, vesikler og liposomer er små kugler i nanoskala med en mem-bran, der er opbygget af et enkelt eller et dobbelt lag af lipidmo-lekyler med hydrofile hoveder og hydrofobe haler [8-9].

Monoglycerider, hvor den polære gruppe er størst, danner for-trinsvis miceller, mens diglycerider, primært danner liposomer og vesikler med dobbelt lag (=bilayer) lipider i membranen [9].

I liposomer er de hydrofobe haler pakket sammen midt inde i membranen, mens de hydrofile hoveder vender ind mod kug-lens indre og ud mod de ydre omgivelser. Normale miceller er

hydrofobe i det indre hulrum og er derfor specielt egnede til transport og indkapsling af fedtopløselige eller hydrofobe medi-kamenter [8].

Fremtidens emulgatorerTraditionel kemisk monoglyceridproduktion er især baseret på hærdet fedt, hvor fedtsyrerne i fedtstoffet er mættet, hvilket gi-ver god produktstabililtet. Anvendelse af umættede fedtsyrer til monoglyceridproduktion er sværere at håndtere procesmæssigt, idet de umættede forbindelser er langt mere ustabile og let oxi-derer, hvorved uønskede frie radikaler kan dannes.

I fødevare-, farmaceutika- og kosmetikindustrien går tidens trend, grundet dokumenterede positive effekter på den humane organisme af de stærkt umættede fedtsyrer, i retning af anven-delse af »sundere fedt« med et højt indhold af umættede fedtsy-rer. Særligt de polyumættede n-3 fedtsyrer eicosapentanoensyre

(EPA C20:5 n-3) og docosahexanoensyre (DHA C22:6 n-3), der især er kendt fra fisk, menes at have vigtige funktioner i bl.a. hjerne og nervevævet og en hæmmende effekt på udvikling af hjerte-kar-sygdomme [10]. I fremtiden er det derfor oplagt at producere monoglycerider af sundere »umættede fedttyper« ud fra olier med vegetabilsk oprindelse eller fra fisk og alger/tang.

I dag er monoglyceridets fedtsyreenhed »tilfældigt« placeret på glycerolenheden (sn-1-(3) eller sn-2-position). Specifikt tilpassede produkter, hvor fedtsyrens placering på glycerolen-heden er kontrolleret, får sandsynligvis stor ernæringsmæssig betydning i fremtiden.

Forskning inden for human ernæring har vist, at 2-monoacyl-glyceroler absorberes direkte i den humane organisme, mens sn-1 (3) monoacylglyceroler hydrolyseres til glycerol og frie fedtsyrer inden optagelse i mave-tarmkanalen. 2-monoacylgly-cerolerne genacyleres overvejende i kroppen til resulterende triacylglyceroler med samme fedtsyresammensætning i sn-

2-position som ved indtagelse [11]. Der-ved indgår 2-MAG især til opbygning af depotfedt, mens 1(3)-MAG overvejende nedbrydes til frie fedtsyrer, der benyttes i diverse syntesereaktioner i cellemembra-ner m.v. i kroppen.

Design af monoglycerider og andre strukturerede lipider med essentielle fedtsyrer på bestemte sn-positioner kan derfor være yderst interessant i fremtidige forsøg på ernæringsmæssigt at forbedre de »fedtstoffer«, vi indtager, og øge funktio-naliteten.

Kommerciel monoglyceridproduktionKemisk syntese er i dag den udbredte kommercielle procesmetode til fremstil-ling af monoglycerider. Der kan benyttes to reaktionsveje: Esterficering og glyce-rolyse, der begge er baseret på kemisk reaktion mellem glycerol og et fedtstof/lipid. Esterficering bygger på reaktion med frie fedtsyrer, mens glycerolyse bygger på brug af triglycerid, der er hovedkompo-nenten i fedt og olie [2,12] (figur 3).

Glycerolysereaktionen, der fokuseres på i dette projekt, katalyseres traditionelt af en uorganisk katalysator såsom NaOH eller Ca(OH)

2 og foregår ved meget høj

temperatur (220-260°C). MAG-indholdet i produktblandingen varierer gerne fra ca. 10-60%, afhængig af anvendt molforhold mellem glycerol og olie. Udbyttet fra

kommerciel produktion via glycerolysereaktionen er typisk 45-55% MAG, 38-45% DAG og 8-12% TAG. Efter bortfiltrering af katalysator og fjernelse af overskydende glycerol separeres MAG fra produktblandingen vha. kortvejsdestillation. Herved er det muligt at opnå et oprenset produkt med et MAG-indhold på 90-95% [2, 12-13]

Hvorfor enzymatisk monoglyceridproduktion?Der hersker ingen tvivl om at eksisterende kommercielle kemi-ske procesmetoder er yderst effektive til monoglyceridproduk-tion og derfor svære at erstatte/udkonkurrere.

Der er imidlertid en række fordele ved enzymkatalyserede processer frem for de traditionelle kemiske procesveje, der gør enzymkatalyseret produktion attraktiv. Den høje temperatur, der benyttes ved den konventionelle glycerolyseproces, giver risiko for uønsket smag, farve og sidereaktioner samt acceleration af

Bioteknologi

Figur 3. Monoglyceriddannelse ud fra to forskellige reaktionsveje: (A) glycerolyse og (B) esterficering

A:

B:

29 dansk kemi, 86, nr. 8, 2005

acylvandring, hvor fedtsyren vandrer fra en position på glyce-rolenheden til en anden (typisk fra sn-2-positionen til sn-1 (3)) [2, 4-7]. Den høje temperatur gør det desuden umuligt at frem-stille varmefølsomme monoglycerider med umættet fedtsyre-struktur, og metoden er samtidig meget energikrævende.

Enzymer bygger på »hvid bioteknologi«. De er aktive ved langt lavere temperatur (under ca. 70-80°C) end de uorganiske katalysatorer og er væsentlig mere specifikke i deres katalytiske aktivitet. Enzymatisk produktion er derfor særdeles fordelagtig til visse nicheproduktioner, hvor der kræves lav temperatur og specifik aktivitet. Det er med andre ord en skånsom procesmeto-de, der åbner mulighed for fremstilling af »fremtidens fedtstof-fer« med bevaret umættet og sn-specifik struktur.

Lipaser Der har været en voldsom udvikling i forbindelse med udvikling og forbedring af kommercielle enzymer gennem de seneste år-tier. En udvikling der har gjort brugen af enzymer mere og mere fordelagtig i industrielt øjemed. I dag findes der kommercielt tilgængelige lipase-enzymer på immobiliseret form, der kan være omkostningseffektive ift. potentielt anvendelige storskala-processer.

Immobiliserede lipase-enzymer produceres typisk ved fer-mentering af mikroorganismer, der bindes til eller indkapsles i et beskyttende materiale såsom en polymer eller lignende. Fordelen ved at bruge immobiliserede enzymer er, at de er fysisk stabile, lette at separere fra produktblandingen og kan genbruges. Udførte forsøg har vist en utrolig høj kapacitet af immobiliserede enzymer på ca. 4-5 kg substrat/g immobiliseret lipase-enzym. Det gør brugen af enzymer som katalysator mere attraktiv, trods en høj kg-pris sammenlignet med traditionelle

uorganiske katalysatorer. Lipaser er hydrolaser og virker ved at klippe esterbindingen

mellem glycerol- og fedtsyreenheden. Mekanismen for den lipa-se-katalyserede glycerolyseproces menes at foregå vha. en bi-bi ping-pong-mekanisme [12,14-15]. Bi-bi ping-pong-mekanismen er vist i figur 4 og illustrerer to (=bi) forskellige substrater (A og B, glycerol og olie) og to (=bi) produkter (P og Q, DAG og MAG), der er involveret i processen. Ping-pong-effekten dæk-ker over, at et produkt frigives (DAG), før det andet substrat (gly) kan bindes til enzymet.

UdfordringerSelv om en række forskningsbaserede undersøgelser i lille skala bekræfter potentialet i den enzymkatalyserede glycerolysepro-ces, er der fortsat et stykke vej til industriel storskala-produk-

Bioteknologi

Figur 4. Illustration af bi-bi ping-pong-mekanisme for enzymkatalyseret reaktion. Bi(=to) substrater (A+ B) og bi(=to) produkter (P+ Q) er involveret i processen. Ping-pong-effekten skyldes, at det ene produkt dannes, før det andet substrat bindes til enzymet.

▲

30dansk kemi, 86, nr. 8, 2005

Bioteknologition.

Enzymkatalyseret glycerolyse er et 3-fasesystem bestå-ende af en hydrofil glycerol-fase, en hydrofob olie-fase og en fast fase med enzym, hvilket giver et heterogent system. Årsagen er, at glycerol typisk lægger sig omkring enzymets hydrofile struktur, hvorved olien kun i meget beskedent omfang har mulighed for kontakt med en-zymet. Forbedring af blandbarheden ved eksempelvis homogenisering, hvor olien findeles i små partikler i glycerolfasen (eller omvendt), er van-

skelig, og den kraftige mekaniske påvirkning kan ødelægge den umættede struktur af oliens fedtsyrer.

Der er rapporteret forsøg, hvor glycerolysesystemet er for-søgt forbedret ved binding af glycerol til en silicagel samt forsøg med optimering af de enkelte reaktionsparametre såsom temperatur, reaktionstid, substratmængde, enzymmængde m.v. [4,5,13,16]. Set med industrielle øjne er effekten af disse forbedringer begrænset, og processen er endnu ikke industrielt favorabel.

Selvom anvendelse af opløsningsmidler ikke er at foretrække i relation til arbejdssikkerhed og produkter med fødevaremæsssig anvendelse, er solventer et yderst effektivt medium at anvende i det enzymatiske reaktionssystem. Som illustreret i tabel 1 har screening af diverse solventer i laboratoriet vist, at tertiære al-koholer som tert-pentanol (2-methyl-2-butanol) og tert-butanol (2-methyl-2-propanol) kan forbedre produktudbyttet af MAG så markant i forhold til et solventfrit system (150 min batchreak-tion ved 50°C), at metoden er yderst industrielt attraktiv.

Omfattende forsøgsarbejde med at optimere diverse solvent-systemer har gjort det muligt at producere monoacylglycero-ler hurtigt (blot 45 min til reaktionen er færdig i kontinuert kolonnereaktor), ved lav temperatur (40°C) og i relative store mængder (ca. 70-80 w/w%) med immobiliseret lipase-enzym som katalysator. Flere videnskabelige artikler er udarbejdet i forbindelse med det aktuelle projekt, og resultater om solvents-creening og optimering og er under publicering eller indsendt til internationale tidskrifter [17-19].

Udfordringerne ligger nu i at fuldende procesvejen til færdigt produkt og optimere processen til industriel anvendelse. Det indebærer bl.a. fjernelse af solvent fra produktet og oprensning af monoglyceridet fra reaktionsblandingen vha. teknologier, der er nænsomme ved de umættede fedtsyrer i produktet. Al-ternative tiltag vil fortsat følges mhp. at gøre processen endnu mere attraktiv, f.eks. i form af en yderligere stigning i udbyttet af reaktionsproduktet og/eller en mere simpel eller miljøvenlig procesmetode. Lykkedes det kommende arbejde med at fuld-ende procesvejen er storskala enzymatisk produktion af partielle acylglyceroler sandsynligvis inden for rækkevidde inden for nærmeste fremtid.

Tabel 1. MAG-indhold efter glycerolyse i forskel-lige solventsystemer.

E-mail adresse Marianne Linde Damstrup: mali@biocentrum.dtu.dk

Referencer:1. Moonen, H., and Bas, H. Mono- and Diglycerides, in Emulsifiers in

Food Technology, edited by. Whitehurst R. J., Blackwell Publishing Ltd, Oxford, 2004, pp. 40-58.

2. Krog, N. Food Emulsifiers, in Lipid Technologies and Applications, edited by Gunstone, F.D., Marcel Dekker, 1997, pp. 521-534.

3. Bellot, J.C., Choisnard, L., Castillo, E., and Marty, A. Combining Sol-vent Engineering and Thermodynamic Modeling to Enhance Selectivi-ty During Monoglyceride Synthesis by Lipase-Catalyzed Esterification, Enzyme Microb. Technol. 28: 362-369 (2001).

4. Elfman-Borjesson, I., and Harrod, M. Synthesis of Monoglycerides by Glycerolysis of Rapeseed Oil Using Immobilized Lipase, J. Am. Oil Chem. Soc. 76: 701-707 (1999).

5. Ferreira-Dias, S., Correia, A. C., Baptista, F. O., and da Fonseca, M. M. R. Contribution of Response Surface Design to the Development of Glycerolysis Systems Catalyzed by Commercial Immobilized Lipases, J. Mol. Catal. B-Enz. 11: 699-711 (2001).

6. Coteron, A., Martinez, M., and Aracil, J. Reactions of Olive Oil and Glycerol over Immobilized Lipases, J. Am. Oil Chem. Soc 75: 657-660 (1998).

7. Kaewthong, W, and H-Kittikun, A. Glycerolysis of Palm Olein by Im-mobilized Lipase PS in Organic Solvents, Enzyme Microb. Technol. 35: 218-222 (2004).

8. http://www.risoe.dk/rispubl/Risnyt/risnyt2004/2_2004/RisNeutroner.htm

9. http://www.sdu.dk/Nat/Chem/educ/COURSES_INFO/Mol_bio_A/membran-forel-lille.pdf

10. Timm-Heinrich, M., Xu, X., Nielsen, N. S. and Jacobsen, C. Oxidative Stability of mayonnaise and milk drink produced with structured lipids based on fish oil and caprylic acid. Eur. Food res. Technol. 219: 32-41 (2004).

11. Becker, C., Lund, P., and Hølmer, G. Effect of randomization of mixtu-res of butter oil and vegetable oil on adsorption and lipid metabolism in rats. Eur. J. Nutri. 40 (1): 1-9 (2001).

12. Xu, X. Modification of Oils and Fats by Lipase-Catalyzed Interesterifi-cation: Aspects of Process Engineering, in Enzymes in Lipid Modifica-tion, edited by Bornscheuer, U.T., Wiley-VCH, 2000, pp. 190-215.

13. Lee, G. - C. Wang. D. - L., Ho,Y.-F., and Shaw, J.-F. Lipase-Catalyzed Alcoholysis of Triglycerides for Short-Chain Monoglyceride Produc-tion, J. Am. Oil Chem. Soc 81: 533-536 (2004).

14. Arcos, J. A; Hill, G. C; and Otero, C. Kinetics of the Lipase-Catalysed Synthesis of Glucose Esters in Acetone. Biotechnology and Bioengine-ering 73 (2), 104-110 (2001).

15. Serralha, F. N., Lopez, J. M. ; Lemos, F.; Prazeres, D M. F. ;Aires-Bar-ros, M. R. ; Cabral, J. M. S.; and Ribeiro, F. R. Kinetics and modelling of an alcoholysis reaction catalyzed by cutinase immobilized on NaY zeolite, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 11: 713-718 (2001).

16. Peng, L; Xu, X.; and Tan, T. Enzymatic Production of high quality monacylglycerols, in Research Advances in Oil Chemistry, edited by R. M. Mohan, GRN, Calcutta, India, 2000, vol. 1, pp 53-78.

17. Tiankui Yang, Morten Rebsdorf, Ulrik Engelrud, and Xuebing Xu, Enzymatic production of monoacylglycerols containing polyunsatu-rated fatty acids through an efficient glycerolysis system, J. Agric. Food Chem. 53, 1475-1481 (2005).

18. Damstrup, M.L., Jensen, T., Sparsø, F.V., Kiil, S. Z., Jensen, A.D., and Xu, X. Solvent Optimization for Efficient Enzymatic Monoacylglyce-rol Production Based on Glycerolysis Reaction. Accepted J. Am. Oil Chem. Soc (2005).

19. Damstrup, M.L., Jensen, T., Sparsø, F.V., Kiil, S. Z., Jensen, A.D., and Xu, X. Production of Heat Sensitive Monoacylglycerols by Enzyma-tic Glycerolysis in Tert-pentanol: Process Optimization by Response Surface Methodology. Submitted J. Am. Oil Chem. Soc (2005).

Angivet son vægtprocent af fedtfasen (MAG+DAG +TAG) ± stdev. Reference: Damstrup et al. (2005). Solvent Opti-mization for Efficient Enzymatic Monoacylglycerol Production Based on Glycerolysis Reaction. Ac-cepted J. Am. Oil Chem. Soc.