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上上海海市市临临床床检检验验中中心心Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory

临床基因扩增检验临床基因扩增检验

质量控制质量控制


PCR技术灵敏度高，特异性强，广泛

应用于病原体感染的早期诊断、疗效监

测、肿瘤及遗传性疾病的研究。


由于灵敏度高和影响因素多，很容

易造成假阴性或假阳性的结果，从而限

制PCR技术在临床上的应用。


临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

（医卫发[2002]10号）

临床基因扩增检验实验室工作规范

（卫生部临床检验中心）

上海市临床基因扩增检验实验室工作规范

（上海市卫生局）


实验室的规范设置实验室的规范设置

四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、

产物分析区）必须是互相独立的

各区间不能直通，应有缓冲间

应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调

设备(不能使用中央空调)

生物安全柜、冲眼器

各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯

传递窗


临床基因扩增检验质量控制临床基因扩增检验质量控制

分析前—标本（采集、运送、验收、保存）、仪器、试剂、耗材、人员

分析中—核酸提取、核酸扩增、产物分析、检测的有效性判断。

分析后—报告发出、结果解释


标本标本

标本采集时间对扩增检测结果的影响

标本的类型和采集量

采样质量的评价

采样及运输容器

标本采集中的防污染


标本采集时间标本采集时间

临床“假阳性”问题：TB、CT、NG建议治疗

结束后2周再检测，避免因死基因存在而造成

的假阳性


标本的接收标本的接收

标本接收建议在三个测定区之外

接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从

其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，

因其有较大的发生标本间污染的可能性


标本采集量标本采集量

标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。

一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的

话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增

检测。


标本验收、拒收标本验收、拒收

血液标本：溶血、严重脂血等应拒收

泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。

痰液：镜下观察上皮细胞很少(低于10个鳞状上

皮细胞)，白细胞一般超过25个。


标本采集中的防污染标本采集中的防污染

标本采集最好采用一次性无菌器材，采集中要

特别注意污染，防止混入操作者的头屑，表皮

细胞等。如使用玻璃器皿，必须为密闭的、必

须经高压灭菌，以使可能存在的RNAase永久性

失活。


采样容器采样容器

采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应

对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全

血、骨髓和血浆标本，最好用EDTA抗

凝，不使用肝素，因其是 Taq酶的强抑

制剂，且在核酸提取过程中很难完全去

除。


标本运送标本运送

实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种

临床标本的运送条件（温度、时间）作出

相应规定。

靶核酸为DNA的标本8h，靶核酸为RNA的标

本4h内送至实验室，所有临床标本在采集

后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。


标本保存标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本

的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）

靶核酸为DNA的标本4℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－

20℃下保存

－20℃下保存1-2周

－70℃以下可长期保存

如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10 mmol/L

Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5～8.0)缓冲液中4 ℃下保存。

用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 TE缓冲液中-70℃保存。

痰（液化标本）、棉拭子（离心沉淀物） -70℃以下保存


实验室仪器设备及管理实验室仪器设备及管理

实验室仪器设备应保养良好，实验用品要

达到相应的要求。核酸扩增仪？恒温金属浴？

加样器的校准？


扩增仪扩增仪

结构：温度控制及导热系统、光路系统、

检测系统

校准：1）光路校准（荧光检测波长530nm、

640nm、710nm）

2）温度校准（温度准确度、孔间温度

的均一性、温度升降速率）


恒温金属浴校准恒温金属浴校准

温度准确度

孔间温度的均一性


移液器移液器

外校

自校-参照《定量、可调移液器试行检定规程》(JJG646-90)


理想耗材、试剂理想耗材、试剂

耗材带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检

试剂盒的质检包括外观质检和性能质检

采用血清盘进行质检（选择试剂品牌）

采用弱阳性进行质检（更换试剂批号）


带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检

首先制备一个含1～2%甘油及色素（如甲基橙）

的水溶液，如果吸头的最大体积为100μl，则

将加样器吸取体积调至110～120μl，再套上

吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，

则有色液体不应出现在滤塞之上，否则说明滤

塞不严。


离心管质检离心管质检

爆管试验

1）随机抽取5-10个离心管，装三分之二的蒸馏

水，1，3000 rpm离心10分钟

2）100℃ 10分钟

抑制物质检试验

采用已知浓度阳性样本进行扩增检测，如出现检

测结果与预期结果明显偏低（如1-2个数量级）说明离

心管可能有抑制物的存在。


血清盘进行质检血清盘进行质检

血清盘由20份左右样本组成(一定数量的原血

清阴阳性样本、3～5份系列稀释阳性样本)。

阴、阳性样本比例最好为1：1，阳性样本中

还应包括一定数量的弱阳性标本。原血清样

本可用于判断PCR试剂盒对特定病原体核酸检

出的特异性、灵敏度和符合率，系列稀释阳

性样本用于判断试剂的测定下限。


试剂性能质检试剂性能质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照

试剂不合格

1）空白对照扩增，如扩增曲线CT值大于35，需重复实验确证试剂污染

2）低值阳性对照和阳性标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

低值阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。

空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

低值阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。


试剂性能质检试剂性能质检

试剂合格

空白对照、阴性对照无扩增、低值阳性质控品

检出（靶值±0.5）


人员培训人员培训

临床PCR测定虽然操作简单，但要获得可靠的

测定结果，操作人员需要一定的技术知识和经

验，在实际工作中，不同的操作者所得到的结

果往往变化很大，因此，人员的培训非常重要。


室内质量控制室内质量控制

目的监测和控制实验室常规工作的精密度，

即实验室测定的批内和批间重复性

IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性

和有效性


核酸提取及扩增有效性的质控核酸提取及扩增有效性的质控

定性检测

已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：

至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提

取和扩增检测的有效性的综合反映。

已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：

至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提

取过程中是否发生污染。


核酸提取及扩增有效性的质控核酸提取及扩增有效性的质控

定量检测

已知高、中、低质控品（基质与待测标本相

同）：其最后的检测结果，应是核酸提取和扩

增检测的有效性的综合反映。

已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：

至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提

取过程中是否发生污染。


测定中质控样本的设置、数量测定中质控样本的设置、数量

如果临床基因扩增检验的标本量不是特别大，

定性测定有一份弱阳性和一份阴性质控样本应

可以满足要求。而定量测定则要根据试验的测

定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本

和一份阴性质控样本。


临床基因扩增检验室内质控的独特性临床基因扩增检验室内质控的独特性

即监测污染发生的阴性质控的设置。

应该包括1份阴性原血清样本、1份在标本核酸

提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反应混

合液的管。


阴性原血清质控样本的功能阴性原血清质控样本的功能

监测实验室的以前扩增产物的污染

由实验操作所致的标本间的交叉污染

强阳性标本气溶胶经加样器导致污染

强阳性标本经操作者手导致污染

翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开

扩增反应试剂的污染


在标本核酸提取过程中带入的一在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能个空管的功能

基本功能与阴性原血清质控样本相同，但不同

的是，其基质为水，不含阴性原血清质控样本

中可能有的扩增抑制物，因而对污染的反映更

为灵敏

不能取代原血清质控样本（原血清质控样本中

存在蛋白和脂类等）


仅含扩增反应混合液的管的功能仅含扩增反应混合液的管的功能

监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴

别性。

如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或多个

空管打开静置于标本制备区30～60分钟，然后加

入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，

如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴

性，则说明实验室以前扩增产物的存在。


统计学质控的特点统计学质控的特点

检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差

系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是

由仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而

造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以

控制，是可以排除的。

随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实验

操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完

全避免和控制。


统计质控方法统计质控方法

Levey-Jennings质控图方法

Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控

方法

“即刻法”质控方法


常用质控规则的符号及定义常用质控规则的符号及定义符号定义

12S 一个质控测定值超出±2s控制限。

13S 一个质控测定值超出±3s控制限。

22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。

R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值

超出4s控制限。

31S 三个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。

41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。

7X 七个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。

7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。

8X 八个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。

9X 九个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。

10X 十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。


由由112S 2S ，，113S3S ，，222S2S ，，RR4S4S ，，441S1S ，，10 10 等规等规

则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，

也有对系统误差敏感的。结合在一起，大大也有对系统误差敏感的。结合在一起，大大

提高了失控的检出率。提高了失控的检出率。

x

WestgardWestgard多规则控制方法多规则控制方法


1) 11) 12S2S 为警告规则，不是失控规则。为警告规则，不是失控规则。

若本批检验没有出现控制结果超出控制若本批检验没有出现控制结果超出控制

线，表示本批结果没有问题，在控，可以发出线，表示本批结果没有问题，在控，可以发出

报告。报告。

若本批检验有若本批检验有11个个控制结果超出（不包括正控制结果超出（不包括正

好在限值线上的结果）好在限值线上的结果）2S2S控制控制线，表示本批结线，表示本批结

果可能有问题，符合果可能有问题，符合112S2S规则。是一个警告，但规则。是一个警告，但

不是失控。不是失控。


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S

112S2S

112S2S规则示意图规则示意图


失控的表现如下：失控的表现如下：

22））113S3S 即这个控制值不仅超出即这个控制值不仅超出2S2S控制线（符控制线（符

合合112S2S规则），而且还超出了规则），而且还超出了3S3S限值（符合限值（符合113S3S规则）。这是在检验中很少发生的（概率约规则）。这是在检验中很少发生的（概率约

为为0.3%0.3%），是一个检出随机误差的失控规则。），是一个检出随机误差的失控规则。


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S

113S3S失控规则失控规则

113S3S失控规则示意图失控规则示意图


33）） 222S2S 有两种表现：有两种表现：

同批两个控制品结果同方向超出同批两个控制品结果同方向超出2S2S限值。限值。

或同一控制品连续两批控制结果同方向超出或同一控制品连续两批控制结果同方向超出2S2S

限值。限值。

属系统误差失控。属系统误差失控。


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S





44）） RR4S4S 在同一批中两个控制结果差超出在同一批中两个控制结果差超出4S4S范范

围，其中有一个超出了围，其中有一个超出了+2S+2S限值，另一个超出了限值，另一个超出了

−−2S2S限值。或其中一个超出了＋限值。或其中一个超出了＋1.5S1.5S，，另一个超出另一个超出

了－了－2.5S2.5S限值属随机误差过大，为失控。限值属随机误差过大，为失控。


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S

RR4S4S失控规则失控规则

RR4S4S失控规则示意图失控规则示意图


55）） 441S1S 有两种表现：有两种表现：

包括出现警告在内的这个超出包括出现警告在内的这个超出2S2S的控制结果，的控制结果，

这个控制品前这个控制品前33次结果均和这个控制结果在同次结果均和这个控制结果在同

方向超出方向超出+1S+1S或或 −−1S1S范围。范围。

包括出现警告在内的这个超出包括出现警告在内的这个超出2S2S的控制结果，的控制结果，

这个控制品前这个控制品前11次结果，均同方向超出次结果，均同方向超出+1S+1S或或

−−1S1S范围；另一个控制品的这两次结果也是同范围；另一个控制品的这两次结果也是同

方向超出方向超出+1S+1S或或−−1S1S范围。范围。

属系统误差失控。属系统误差失控。


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S





66）） 10 10 连同出现连同出现112S2S警告的这个结果，警告的这个结果，

另外还有两个控制品的结果，在前几批另外还有两个控制品的结果，在前几批

及本批结果中，有连续及本批结果中，有连续1010次在次在的一的一

侧。侧。

属系统误差失控属系统误差失控。

X

X


11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010

+3S+3S

+2S+2S

+1S+1S

均值均值

--1S1S

--2S2S

--3S3S

X10失控规则失控规则

失控规则示意图失控规则示意图X10


““即刻法即刻法””质控方法质控方法

只要有3个以上的数据即可决定是否有异

常值的存在。


““即刻法即刻法””质控方法具体步骤质控方法具体步骤

将连续的质控测定值按从小到大排列，即x1、x2、

x3、x4、x5、x6、……xn（x1为最小值，xn为最大

值）；

计算均值和标准差(s);

按下述公式计算SI上限和SI下限值；

SI上限=（x最大值－均值）/s

SI下限=（均值－ x最大值）/s

将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。


SISI值表值表

n n2s n3s n n2s n3s

3 1.15 1.15 12 2.55 2.29

4 1.49 1.46 13 2.61 2.3

5 1.75 1.67 14 2.66 2.37

6 1.94 1.82 15 2.71 2.41

7 2.10 1.94 16 2.75 2.4

8 2.22 2.03 17 2.79 2.47

9 2.32 2.11 18 2.82 2.50

10 2.41 2.18 19 2.85 2.53

11 2.48 2.23 20 2.88 2.56


质控结果的判断质控结果的判断

SI上限和SI下限值均<表中n2s对应的值时，说明测定

质控测定值的变化在2s之内，是可以接受的。

如SI上限和SI下限值中之一处于n2s 和n3s对应的值

之间时，说明该质控测定值的变化在2s～3s之

间，处于“告警”状态。

当SI上限和SI下限值之一> n3s对应的值时，说明该

质控测定值的变化已超出3s，属“失控”。


即刻法优缺点即刻法优缺点

优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进

行质控

缺点：繁琐

初始阶段的质控数据，前3个质控值的CV

对随后的结果影响大。


临床基因扩增检验室内质量控制操作临床基因扩增检验室内质量控制操作

前20个数据使用即刻法，可对第3－20个数据

进行质控判断

第21个数据开始使用常规质控方法进行质控判

断


临床基因扩增检验临床基因扩增检验IQCIQC统计计算问题统计计算问题

可使用质控样本扩增后的拷贝数/ml或IU/ml来

进行统计计算，也可用其对数值或Ct值进行。

由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故使

用其对数值或Ct值来进行质控统计分析可能要

更为方便一些。


图形分析图形分析

如果出现113S3S ，，222S2S ，，RR4S4S ，则为失控，应立即

报告有关负责人，迅速查找原因。必要时复测

标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查

找过程及处理结果等记入失控记录表。


通过观察图形的规律性变化进行误差通过观察图形的规律性变化进行误差分析，消除误差来源分析，消除误差来源

曲线漂移：提示有系统误差，准确度发生了一

次性的向上或向下改变。这种变化往往是由于

一个新的情况引起的。如更换不同批号试剂，

启用新批号的质控血清、操作人员的变换等。

在找原因时，应重点注意“漂移”前后发生了那

些变动的因素。


趋势性变化：向下或向上的趋势性变化表明检

测的准确度发生了渐渐地变化。这种变化往往

是由于一个逐渐改变的因素造成的。如质控血

清的降解，试剂效价的降低等。


连续多点分布在靶值一侧：一般认为质控血清的检

测结果连续6天以上出现在靶值同一侧，则应迅速

查找原因，争取尽快使之回复围绕在靶值随机分布

的状态。因为由纯随机误差造成的这种情况的可能

性很小（小于1.5%），因此凡出现连续6天以上出

现在靶值同一侧者均有可能存在非随机误差因素。

如结果与靶值偏离并不太大，不会给临床使用带来

太大影响时，一般检测报告可以发出。


室内质控数据的评价室内质控数据的评价————阳性质控样阳性质控样

本常见的失控原因本常见的失控原因

核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、

有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残

留等。

仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔

内温度与所示温度的不一致性等。

试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探

针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。


室内质控数据的评价室内质控数据的评价——阴性质控阴性质控

样本的失控原因样本的失控原因

扩增产物的“污染”

临床标本的核酸提取过程中发生的标本

间的交叉 “污染”.


避免基因扩增检验假阳性结果的措施避免基因扩增检验假阳性结果的措施

严格的实验室分区

使用带“滤芯”的吸头

设立“阴性”质控（与标本同时处理）

使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂

临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经

药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治

疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。


避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免基因扩增检验假阴性结果的措施

避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激

素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制

作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀

释标本

定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的

一致性进行检查和校准


结果分析结果分析总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。

基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。

曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。

低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵

敏度高。


实验结果有效性判断实验结果有效性判断

判断标准：室内质控结果在控(阴性、阳性质

控);阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率在

3.3-3.5（理想斜率3.32）截距36-44，相关系

数绝对值在0.98以上。


检测结果报告形式检测结果报告形式

高于检测上限（根据临床需要）

低于检测下限，不能直接报“0”，应报“低于检

测下限”


注意事项注意事项在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管底部。

在标本处理时在生物安全柜内进行，以防止对环境的污染。

操作台、移液器、离心机、恒温金属浴、扩增仪等仪器设备应经常用75%乙醇擦拭消毒。每次实验后用 10%次氯酸和 70%乙醇擦拭移液器、操作台。

实验中涉及废弃物应置专门容器中，妥善处理。

配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。


谢谢谢谢

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