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Epigenética
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Fenómeno Epigenético
• Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência do DNA (código genético) e que pode persistir por uma ou mais gerações
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Territórios cromossómicos
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Espaços intercromáticos
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Territórios cromossómicos eEspaços intercromáticos
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O início da epigenética
• 1990’s– Descobertas metilases de DNA em C – Metilação representada na maioria dos animais, vegetais e
fungos
• 1993– Stephen Baylin et al
• Metilação do Gene de Supressão Tumoral p16 numa variedade de tumores humanos
• Tratamento destas células com agentes desmetilantes repõe a actividade do gene
– Extensa metilação em promotores de outros genes de supressão tumoral
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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética
• Metilação do DNA• Modificação das Histonas
– Metilação– Acetilação– Fosforilação
• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)
• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas
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Metilação
• A 5ª base 5-metil citosina
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A metilação inactiva os genes
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Papel da Metilação/desacetilação na repressão do genoma
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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas
– Metilação– Acetilação– Fosforilação
• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)
• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas
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Código das histonas (I)
• 1993 Alan Wolffe– Acetilação das histonas altera o acesso de outras
proteínas ao DNA (abre o cromossoma)• Acetilases/Desacetilases formam complexos com factores de
transcrição que ligam/desligam os genes
• 1998 Adrian Bird et al.– Mostrou que as desacetilases podem funcionar em
conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inactiva os genes
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Código das histonas (II)
• 2000 Thomas Jenuwein– Identificou uma metilase de histonas, mostrando que
actuam sobre o mesmo local das histonas que as acetilases
• 2001 Tony Kouzarias– Metilação de histonas desliga os genes
Metilação da H3
permite a ligação
da HP1, o que
silencia os genes
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Modelos de modificação eu/heterocromática por alteração de histonas
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Formation of heterochromatin silences gene expression at telomeres and other regions
Silent genes in mating-type control in yeast
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Several genes encode proteins that bind specifically to silent loci at yeast telomeres
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Schematic model of silencing at yeast telomeres
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Repressors and activators can direct histone deactylation at specific genes
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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas
– Metilação– Acetilação– Fosforilação
• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)
• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas
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Silenciamento do RNA
-RdDM = RNA directed DNA methylation
-PTGS = Post translational gene silencing
-RNAi = RNA interference
siRNA= small interfering RNA
RISC = RNA induced silencing complex
CMT = chromomethylase
DNMT= DNA methyltransferase
IR = inverted DNA repeats
SC = single copy genes
cRdRP= cellular RNA dependent RNA pol
DICER/CAF = RNAse III type enzimes
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Epigenética
• Metilação do DNA• Modificação das Histonas
– Metilação– Acetilação– Fosforilação
• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)
• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas
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Imprinting (I)
• Marcação permanente dos genes passados por cada um dos progenitores
• Fenómeno conhecido há pelo menos 3,000 anos– Égua+Burro Mula– Cavalo+Burra Machohá efeitos específicos do genero nos cruzamentos
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Imprinting (II)
• 1991– Igf2r– H19– Igf2 (activo só se herdado do pai)
• 2001– Mais de 40 genes com efeito de imprinting
• mecdin• UBE3A• p53 (gene de supressão tumoral envolvido no neuroblastoma)
• peg3• igf2• ... ...
Activos só se herdados da mãe
Prader-willi e Angelman syndromes
Afectam o desenvolvimento embrionário
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Imprinting (III)
• Metilação está habitualmente envolvida quer activando quer
inactivando os genes
• Genes imprinted estão presentes em clusters
– Ex:• H19/Igf2 (11p15.5)
• DKK1/GTL2 (14q32)
• Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de 25% dos
genes imprinted não originam proteínas)
• Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de CTCF,
formando uma fronteira cromossómica
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Imprinting (IV)
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Implicações do imprintig
• Necessidade de:– Remover as marcas de imprinting cedo na
gametogénese– Criar novas marcas de imprinting durante a
gametogénese
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A epigenética em análises clínicas(I)• Bibliografia crescente implicando epigenética em patologias (ex: tumores)
– Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation Eric Lander, Rudolf Jaenisch Nature Genetics, vol 27, January 2001
– Cancer epigenetics comes of age. Jones PA, Laird PW. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7.PMID: 9988266; UI: 99140765
– DNA methylation in health and disease.Robertson KD, Wolffe AP Nature Reviews Genetics. 2000 October, Vol.1:11-19
– DNA methylation. Singal R, Ginder GD. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4059-70. PMID: 10361102; UI: 99290759
– DNA methylation: past, present and future directions. Robertson KD, Jones PA. Carcinogenesis. 2000 Mar;21(3):461-7. PMID: 10688866; UI: 20156136
– Current Topics in Microbiology and Immunology. Vol. 249: DNA Methylation and Cancer edited P. A. Jones, P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) pp. 170.
– Behind the Scenes of Gene Expression Elizabeth Pennisi, Science Aug 10 2001: 1064-1067
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A epigenética em análises clínicas(II)
• Patologias com envolvimento da Epigenética– Sindroma do X frágil– Sindroma de Rett– Sindroma ICF (Imunodeficiencias,Instabilidade centromérica
e Anomalias Faciais) (Mutações na DNA metiltransferase 3B (DNMT3B))
– Genes de supressão tumoral em tumores– Deficiencias de imprinting genético– Envelhecimento– Doenças cardiacas
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Métodos para o Estudo Epigenético
1 -Alteração de Histonas
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Analysis of the acetylation state of histones in chromatin associated with a specific region of the genome
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Métodos para o Estudo Epigenético
2 –Metilação do DNA
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Diagrama geral dos Métodos para estudo de mCpG
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Determinação de conteudo global de mCpG
• Hidrólise– Química
– Enzimática
• Marcação fluorescente c/ cloroacetaldeído
• Metilação in vitro com SssI e Leitura por southern Blot
Leitura por HPLC / HPCE
*=ethenocytosine / ethenoadenine (Fluorescentes)
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In Situ DNA methylation
• Metilação in vitro seguida de imunoprecipitação• Utilização de anticorpos anti-mCpG
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Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos
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Métodos enzimáticos
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Southern Blot and PCR
• Utilizar uma enzima de restrição que distingue a sequencia metilada da não metilada
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Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos
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Tratamento com bissulfito
• C U• mC mC
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Methylation specific PCR
• Tratamento com bissulfito
• Duas reacções de PCR– 1 primer terminando na sequencia complementar de C– 1 primer terminando na sequencia complementar de U
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Sequenciação / Pyrosequenciação
• Tratamento com bissulfito Sequenciação
• Tratamento sem bissulfito Sequenciação
• As diferenças (CT) correspondem a C
• As semelhanças (CC) correspondem a mC
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pirosequenciação
• Razão entre altura dos picos C/T é proporcional á metilação
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Detecção de mudança na Tm
• Tratamento com Bissulfito
• Leitura por:– DGGE– TTGE
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Detecção de Alterações de conformação
• Tratamento com bissulfito
• Desnaturação
• Leitura por:– HA– DGGE– SSCP– DHPLC
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Primer extension (PE)
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Real-Time-PCR followed By Tm analysis
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Methylight
• Tratamento com bissulfito– Ex: CpG genome DNA modification kit (QBiogene)
• Real-Time-PCR
• Uso de sondas FRET ou Taqman:– 1 específica para a sequencia terminada em C
• Se produz sinal há metilação
– 1 específica para a sequência terminada em U• Se produz sinal não há metilação
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PE-DHPLC ou PE-CE (Electroforese Capilar)