epigenetische phänomene mechanismen und funktionen · 7 grundprinzipien des rna silencing (rna...
TRANSCRIPT
1
Vorlesung
Zellbiologie und Physiologie der PflanzenAG Kudla
Oliver Batistič
Heute:
Epigenetische Phänomene & RNA Silencing
Zielstellungen der heutigen Vorlesung :
- Die „RNA - Welt“
- epigenetische Phänomene
- RNA interference (RNAi)
- Grundlegende Mechanismen und Gemeinsamkeiten
- unterschiedliche Resultate
- miRNAs
- siRNAs
- trans-siRNAs
- Vergleich der Prozesse und Enzyme
- Systemische Ausbreitung von RNAi
- Anwendungen von RNAi
Teil 1
Epigenetische Phänomene
Mechanismen und Funktionen
BlütenpigmentBiosynthese in Petunia Key enzyme:
chalcone synthase
Dihydroflavonol 4-reductase
Hypothese:Überexpression von CHS soll Anthocyanbildung verstärken
Sense RNASense construct:
PRO ORF
Endogenous genemRNA
Transgene
PRO ORF
mRNA
Protein translatiert
mRNA
mRNA
Extra protein translated
CHS Überexpression in Petunie
2
Epigenetische Phänomene –Transkriptionelle Gen-Inaktivierung (TGS)
DNA-Methylierung verursachtChromatinkondensierung
Epigenetische Phänomene:
Jede stabile und vererbbare Veränderung der Genexpression (und damit auch eines Phänotypes) die nicht auf einer Änderung der DNA-Sequenz (also nicht auf einer Mutation) beruht! Epigenetische Phänomene sind prinzipiell reversibel.
Epigenetische Phänomäne werden molekularreguliert durch
DNA Methylierung
Histon Modifikationen
RNAi Prozesse (Teil 2)
Epigenetische Regulation in Pflanzen:
Blühinduktion (Entwicklungsprozesse)
Umweltanpassung
Transposon silencing
Paramutationen (Gene silencing in trans)
Kontrolle von “Imprinted Genes”
DNA Methylierung und Histon Modifikationenzusammen beeinflussen Chromatin Struktur
kondensiertes Heterochromatin (Inaktiv)
lockere Euchromatin (Aktiv)
DNA Methylierung von Cytosin durch Methyltransferasen behindert Bindung DNA bindender Proteine
� Inhibition der Transkription
DNA Methylierungen können vererbt werdenund sind reversibel
Methylierungsmuster werden durch ubiquitin likecontaining PHD and ring finger domain (UHRF)Proteine erkannt, rekrutiert DNA-Methyltransferases
3
Histon Modifikationen beeinflussen Chromatinstruktur
N-terminale Schwänze der Histone könnenunterschiedlicheModifikationen aufweisen
Der Histon Code
Histonmodifikation
H4: K8 Acetylierung Aktivierung
H3: K14 Acetylierung Aktivierung
H3: K27 einfache Methylierung Aktivierung
H3: K27 dreifache Methylierung Repression
H2B: Ubiquitinierung Aktivierung
H2B: S14 Phosphorylierung DNA-Reparatur
Modifikationen von Lysin Resten beeinflussen direkt den Grad der Chromatin Kondensation
Methylierte Histone rekrutieren Proteine die weiter die DNA/Chromatin Struktur und Transkription beeinflussen
- Polycombproteine (PC) (inhibieren Transkription) werden durch HistonMethylierungen rekrutiert
+ TATA-Box bindende Proteine(aktivieren Transkription) werden durchHistonacetylierungen rekrutiert
Vererbung von Histonmodifizierungensemikonservativ (Modell 1) vs. Nachbarschaftsmodell (2)
Histonmodifikationen sind reversibel
HAT: Histon Acetyl Transferase
DHAC: HistonDeacetylase
4
Konstitutive Funktion der HeterochromatinbildungFakultative Heterochromatinbildung
beeinflusst Pflanzenentwicklung
Epigenetische Kontrolle der Blühinduktion Mutanten im FLOWERING LOCUS C (FLC) blühen ohne Vernalisation
FLC inhibiert Flowering Locus T -einen Aktivator der Blühinduktion
FT wird in Blättern gebildet, und wandert dann zum meristematischen Gewebe
FT = Florigen
5
FLC wird durch Vernalisierung transkriptionell inaktiviert FLC wird durch Histon Modifikation und Assoziation von Polycombproteine reguliert
Besonderheit: Inaktivierung von FLC ist quantitativ Zusammenfassung Teil 1
Chromosomenstruktur und transkriptionelle Aktivität von Genen kann durch DNA Methylierung und Histon-Modifikationen beeinflusst werden
Methylierungsmuster und Histonmodifikationen können vererbt werden, und sind reversibel
Methylierungsmuster und Histonmodifikationen können z.B. Blühinduktion beeinflussen
Teil 2
RNA silencing und
Epigenetische Phänomene
Mechanismen und Funktionen
RNA silencing
RNA silencing: verschiedene RNA-basierende Prozesse die alle zur Sequenz-spezifischen Inhibierung derGen-Expression führen.(Transkription, mRNA-Stabilität, Translation)
6
Post-transkriptionelle Gen-Inaktivierung (PTGS)
RNA silencing erfolgt mittels kleiner einzelsträngiger RNA Spezies (21-24 nt Länge):je nach Herkunft und Funktion unterscheidet man:
small interfering RNAs (siRNA)micro RNAs (miRNA)
trans-acting siRNA (ta-siRNA) natural-cis siRNA (nat-siRNA)
repeat-associated siRNA/cis-acting siRNA (rasiRNA, casiRNA)
Allen gemeinsam ist eine Funktion beim Gene Silencing!
antisense-DNA
Was sind small interfering RNAs?Gene targeting durch antisense-RNA
LB T- DNA RB
vir-Gene
ori
tra
noc Annealing
?
Transkription
von mRNA
und
anti-sense RNA
in planta
Silencing
5‘3‘
mRNA
anti-sense
5‘
3‘
5‘
3‘
Im Genom der Pflanze
2 Kopien:
Endogenes Gen: sense
Transgen: antisense
Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference)
Dicer
dsRNA
small dsRNA(ca. 21-24 nt mit 2 Nucleotid Überhang)
RNA silencing: Die Rolle von Dicer(bzw. Dicer like [DCL])
Dicer schneidet dsRNA-VorläuferDurch die Endonuklease Aktivität derRNaseIII Domänen.PAZ Domände bindet am Ende der dsRNAAbstand der RNAseIII Domänenbestimmt 20-30 nt Fragmentgröße
Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference)
Dicer
dsRNA
small dsRNA(ca. 21-24 nt mit 2 Nucleotid Überhang)
RISC (RNA Induced Silencing Complex)mit Argonaute Protein
small ssRNA (siRNA) mit RISC
RNA silencing: Die Rolle von Argonaute
Argonaute: silencing effector protein, die gebundene Einzelstang RNA führt den Komplex zum Ziel,Ziel-RNA bindet 5‘ an Mid und 3‘ an PAZ DomäneSchnitt der Target RNA im katalyt. Zentrum der Piwi Domäne
Arabidopsis ago1
octopus Argonauta argo
7
Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference)
Dicer
Targeting
dsRNA
small dsRNA(ca. 21-24 nt mit 2 Nucleotid Überhang)
RISC (RNA Induced Silencing Complex)mit Argonaute Protein
mRNA
small ssRNA (siRNA) mit RISC
Silencingnächste mRNA
Komplexbindung an endogene,komplementäre mRNA� Abbau der mRNA
Weitere Post Transkriptionelle Silencing (PTGS) Effekte
Die Funktion von siRNAs
• Abbau und Silencing unerwünschter Transkripte
• Gene Silencing von Transposons oder repetitiver Elemente
• Epigentik
• Bekämpfung von Virusinfektion
Virus-induziertes gene silencing (VIGS)
siRNA Mutanten besitzen eine verminderte Viren-Resistenz
WT Arabidopsis +TRV
Double mutant dcl2-dcl4
+TRV
Tobacco Rattle Virus (TRV) silencing in wild-type Arabidopsis plants prevents disease symptoms. Mutants deficient in Dicer activity are unable to suppress viral infection.
Systemische Resistenz durch Virus-induziertes gene silencing (VIGS)
8
Wie kann sich siRNA systemisch ausbreiten? Systemische Ausbreitung RNAi vermittelterSignale
Systemische Ausbreitung RNAi vermittelterSignale
- kleine RNAs können symplastisch weitergegeben werden
- oder über Phloem transportiert- die effektive, systemische
Ausbreitung erfordert eine Amplifikation des silencingEffekts mittels RDR
RNA silencing: Verstärkung des silencing Effektsdurch RNA abhängige RNA Polymerasen
− durch Argonaut geschnittene mRNA dient als Matritze für RNA-abhängige RNA Polymerase (RNA-dependent RNA polymerase, RDR) in Komplex mit SGS3 (supressor of gene silencing)
− doppelsträngige RNA wird durch DCL4 prozessiert
Amplifikation ermöglicht systemische Ausbreitung
Virale Proteine können die Funktion von siRNA aufheben
Tabakpflanze mit GUS Gen, mittels RNAigesilenced.
Kein viralerSuppressor:
GUS Gen inaktiv
Mutierter viralerSuppressor:
GUS Geninaktiv
Viral suppressor: GUS gene expressed
Transcription
siRNA siRNA siRNA
Viral suppressor
RNA Silencing wird durch viraleProteine inhibiert.Dabei kann jederSchritt beeinflusstwerden.
Das 19K Protein (P19) – ein viraler Suppressor
z.B. Tomato Bushy Stunt Virus:- Dimer bindet dsRNA (21nt)
kein Einbau in RISC- Transkriptionelle Regulation von AGO1
9
RNA silencing: Vergleich siRNA und micro RNA
miRNA: microRNA- werden von Genen kodiert- Bilden Stamm-Loop-Struktur, keine perfekte Paarung- Vorläufer miRNA wird von DCL1prozessiert (Nucleus), miRNA duplexwird in Cytoplasma transportiert- guide RNA wird in RISC eingebaut- endogene mRNA wird abgebaut (trans)
siRNA: small interfering RNA- wird aus dsRNA gebildet- Strang und Gegenstrang bilden perfekte Paarung- Ursprung-RNA wird abgebaut (cis)
miRNA Reifung in Pflanzen und Tieren
„mirtron“
dsRNA bindet in pre-RISC,- guide Strang: Bindet an Ziel-RNA mit AGO und vermittelt Ziel-RNA Abbau- passenger Strang: wird durch AGO abgebaut- pre-RISC wird zum aktiven RISC
Unterschiede am 5‘ Ende bestimmen guideund passenger:Strang mit weniger stabilen 5‘- Ende verbleibt im RISC (guide), Strang mit stabilem 5‘-Ende (passenger) wird abgebaut
RNA silencing: welcher RNA Strang bleibt übrig? Funktion von miRNAs
Funktion von miRNAs bei der BlattbildungPhabulosa wird durch miR165/6 reguliert
Wildtyp PHB
Transkriptverteilungwird durch miRNA
reguliertadaxial (hoch) –abaxial (niedrig)
PHB mit mutierter miRNA target site
Transkriptverteilungnicht mehr regulierbar
durch miRNAs
lokale PHBExpression
globale PHBExpression
Funktion miR165/6 bei der Wurzelanatomie
miR165/6 PHB
miR165/6 werden in der Endodermis exprimiert und smyplastisch verteilt� Konzentrationsgradient von miRNA begrenzt die Expression von Phabulosa im zentralen Berreich des Zentralzyllinders
10
Funktion von miR399 bei der Phosphataufnahme
Wurzel:hohe Expression von PHO2(vermittelt die Degradation von Proteinen notwendig für Phosphataufnahme)
Phosphat+ -
PHO2
miR399
miR399
miR399
Blätter:niedrige Expression von miR399(kann über Phloem transportiert werden; Target von miR399 ist PHO2 - wird in der Wurzel exprimiert)
� wenige Moleküle erreichen Wurzel, kein Einfluss auf PHO2
Wurzel:niedrige Expression von PHO2(Proteinen notwendig für Phosphataufnahme werden stabilisiert -Phosphataufnahme)
Blätter:hohe Expression von miR399 und erreicht über das Phloem die Wurzel
� negativer Einfluss auf PHO2
Pi
PHO2
miR399
miR399
miR399
Pi
miR399
Funktion von miRNA168 – Feedback-Regulation von AGO1durch virale Suppressoren
AGO1 Transkript wird selbst durch miRNA168 gesteuert
Die Menge an miRNA168 kann durch virale Proteine wie P19 erhöht werden �verstärkte Suppression von AGO1
Bildung von trans-acting-siRNAs erfolgt mit Hilfe von miRNAs
TAS Gen im Genom kodiert:- Transkript des TAS-Gens wird durch miRNA gebunden- TAS-Gen Transkript wird mittels RISC geschnitten- verkürztes Transkript wird durchRNA-abhängige RNA Pol. kopiert- doppelstrang RNA wird durch DCL4mehrfach geschnitten (tasiRNADuplexe)- tasiRNA bindet an Ziel-mRNA,Abbau durch RISC
TAS Gene in Arabidopsis:TAS1/TAS2, Ziel: pentatricopeptide repeatgenes und HTTsTAS3, Ziel: ARF transcription factorTAS4, Ziel: MYB transcription factor
Hitzeschock Toleranz in Arabidopsis wird durch TAS1 reguliert
HEAT-INDUCED TAS1 TARGET
Die Länge der miRNA steuert mRNAAbbau oder RNAKopierung
21nt miRNA: RNA Schnitt mittels AGO � Degradation
22-24nt miRNA: RNA Schnitt mittels AGO � Zweitstrangsynthese mittels RDR
Bildung von Natural antisense-siRNAs (Nat-siRNA)
- sense Gen wird konstitutiv exprimiert- antisense Gen wird stress-induziert exprimiert (z.B. Salzstress)- Transkripte von sense und antisense Gen binden imüberlappenden Bereich- komplementärer Überlapp wird durch DCL2 geschnitten, nat-siRNA Duplexe werden gebildet- nat-siRNA bindet an die ursprüngliche Transkripte- Ursprung-RNA wird durch RISC geschnitten, und durch RDR kopiert, doppelsträngige RNA wird durchDCL1 geschnitten- nat-siRNA bildet mit RISC Komplex, bindet anZiel-mRNA- Ziel-mRNA wird geschnitten
11
repeat-associated siRNA/cis-acting siRNA vermittelt transkriptionelles gene silencing (TGS)
− transkriptionell „inaktiver“ Bereich der DNA wird von RNA-Polyermase IV abgelesen (reich an repetitiven Elementen)
− Transkript dient als Matrize für RDR
− doppelsträngige RNA wird durch DCL3 zu
kurzen RNA-Duplexen prozessiert
− rasi/casiRNA komplexiert mit AGO
− RNA-AGO Komplex interagiert mit RNA-Polymerase V und bindet an komplemtären„DNA“-Strang
− Komplex vermittelt die Bindung von DNA-Methyltransferasen und Histon-modifizierenden Proteinen -Heterochromatinbildung
DNA-abhängige RNA Polymerasen IV und V sindpflanzenspezifisch
Überblick: Unterschiedliche Funktionen verschiedener Argonaute Proteine
Transkriptionelles Silencing von FLC erfolgt vielleicht durch FLC Antisense RNA
RNAi vermittelte Paramutationen am booster1 Lokus in Mais?
+B‘/B‘ B-I/B-I
B‘/B-I
Nach Mendel erfolgt eine Aufspaltung 50%:50%durch das B‘ Allel bilden 100% der Nachkommen weniger Anthocyane
50%
50%
Erwartet:
100%
+
B‘
B-I/B-I
Allel B‘ überträgt Eigenschaften auf B-I (paramutiert) mit Hilfe von RNA-abhängigen RNA Polymerasen
RNAi vermitteltes silencing von Transposons
Transposons = springende Gene(erstmals Beschrieben in Mais von Barbara McClintock, 1948)
75% des Maisgenoms besteht aus Transposon DNA
12
RNAi vermitteltes silencing von Retrotransposons
Genomstabilität wird durch RNAi gewährleistet1. post-transkriptionelles silencing2. transkriptionell inaktiv durch RNAi vermittelte DNA methylierung und Histonmodifizierung
Virus-induziertes transkriptionelles gene silencing
Intron
Biotechnologische Anwendung: Gene silencing mit Hilfeartifizieller miRNA (amiRNA)
LB T- DNA RB
vir-Gene
ori
tra
noc
Annealing
Splicing
Transkription
in planta
Targeting
Online Tools helfen beim Design der artificial miRNA
Gene targeting durch miRNA induced gene silencing (MIGS)
Vorteile:
- kein „Design“ der miRNA
- miRNA-target Sequenz kann leicht
mittels PCR Primer angebracht werden
- PCR Fragment leicht „klonierbar“