erstellen von stabilen in vitro zell-expressionssystemen transfektion oder infektion der zielzelle...
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Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen
Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI)
Zielzellen in Kulturschale
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen
GIGI
GI
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein)
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Stabil transfizierte Zellen
in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen
Zugabe von Substrat
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Nicht transfizierte Kontrollzellen
transfizierte Zellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist, Kontrollzellen nicht oder deutlich weniger, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird
Abwaschen des nicht aufgenommenen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.
in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
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Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
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Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Inhibitor zu den den zu untersuchenden Transporter exprimierenden Zellen geben, Kontrollzellen ohne Inhibitor
Kontrollzellen
Inhibitor lagert sich an Transporter an Abwaschen des überschüssigen Inhibitors Zugabe von Substrat Kontrollzellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist. Die inhibierten Zellen nehmen weniger oder kein Substrat auf, da der Transporter blockiert ist
Abwaschen des überschüssigen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen.
in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen
Zellen lysieren
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
ERGIC
GOLGILysosom
Endosom
Zellkern
endoplasmatischesRetikulum
Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen
Membranen isolieren ggfs. apikale und balolaterale Membranen trennen Membranen bilden inside-out-Vesikel, d.h. die inneren Membranbestandteile liegen außen und umgekehrt Zugabe von Substrat Substrat gelangt über Influx-Transporter in das Innere der Vesikel über Membranen der transfizierte Zellen, wenn Substrat transporterspezifisch ist, die Vesikel der Membranen der Kontrollzellen nehmen kein Substrat oder nur wenig auf, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird
Abwaschendes nicht aufgenommenen Substrates Homogenisieren der Vesikel Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.