escuela acadÉmico profesional de ciencias biolÓgicas
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL
DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Inducción de callos embriogénicos en tallos
de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte
utilizando diferentes concentraciones de 2,4-
Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina.
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO
AUTOR: Br. Karen Jannet Hostia Rodriguez
ASESOR: Dr. Julio Roger Chico Ruiz
Trujillo-Perú
2017
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Dr. Orlando Gonzáles Nieves
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Rubén Vera Véliz
VICERRECTOR ACADÉMICO
Dr. Weider Portocarrero Cárdenas
VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
Dr. Esteban Ilich Zerpa
SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Dr. Freddy Roger Mejía Coico
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. William Elmer Zelada Estraver
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Fredy Peláez Peláez
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Dr. Segundo Eloy López Medina
JEFE DE DEPARTAMENTO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
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PRESENTACIÓN
Señores miembros del jurado dictaminador:
Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el reglamento de grados y títulos
de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me es
honroso presentar y someter a vuestra consideración y elevado criterio, el presente
informe de tesis titulado “Inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea
americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes concentraciones de 2,4-
Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”, con el cual pretendo obtener el título de
Biólogo.
Invocando su comprensión señores miembros del jurado dictaminador, a los errores u
omisiones que involuntariamente haya cometido, espero su veredicto en la calificación
del presente trabajo, esperando ser merecedor de su aprobación.
Trujillo, abril del 2017.
______________________________________
Karen Jannet Hostia Rodriguez
BACHILLER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
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MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR
____________________________________________
Dra. Marlene Rene Rodriguez Espejo
PRESIDENTE
____________________________________________
Dr. Roger Veneros Terrones
SECRETARIO
____________________________________________
Dr. Julio Roger Chico Ruiz
VOCAL
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V°B° DEL ASESOR
El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis “Inducción de callos embriogénicos
en tallos de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes
concentraciones de 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”; para optar el
Título Profesional de Biólogo, certifica que la presente ha sido ejecutada de acuerdo al
reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas estando en conformidad
con su correspondiente proyecto y con las debidas orientaciones brindadas y sugerencias
correspondientes.
_________________________________
Dr. Julio R. Chico Ruiz.
ASESOR
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador, declaran que la
presente tesis titulada “Inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea americana
Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes concentraciones de 2,4-
Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”, ha cumplido con los requisitos formales
y fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.
____________________________________________
Dra. Marlene Rene Rodriguez Espejo
PRESIDENTE
____________________________________________
Dr. Roger Veneros Terrones
SECRETARIO
____________________________________________
Dr. Julio Roger Chico Ruiz
VOCAL
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DEDICATORIA
A mis padres, Rut Rodriguez y Carlos Hostia, quien con su amor, esfuerzo, consejos,
motivación y paciencia, son el motor y fortaleza que impulsa mis logros; a mi hermana
Sor Teresa, quien con sus oraciones y aliento de fe, permitió que no desfallezca en
ninguna circunstancia de la vida.
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AGRADECIMIENTOS
A Dios, por permitirme seguir adelante en toda adversidad, lograr mis objetivos y llegar
a esta meta.
A la Universidad Nacional de Trujillo, en especial a la Facultad de Ciencias Biológicas
por permitirme en estos 5 años ser parte de una generación de triunfadores y gente
productiva para el país.
A mi asesor el Dr. Julio Chico Ruiz, por su apoyo desinteresado en la revisión y
realización de la presente tesis, al Dr. Roger Veneros Terrones y Dra. Marlene Rodriguez
Espejo, por su apoyo desinteresado quienes contribuyeron en ultimar detalles en la
revisión de la presente tesis.
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ÍNDICE
CONTENIDO
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS .............. ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ............. iii
PRESENTACIÓN ..................................................................................................... iv
MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR ................................................... v
V°B° DEL ASESOR .................................................................................................. vi
APROBACIÓN ......................................................................................................... vii
DEDICATORIA ...................................................................................................... viii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ ix
ÍNDICE ........................................................................................................................ x
INDICE DE TABLAS ............................................................................................... xi
INDICE DE ANEXOS ............................................................................................. xii
RESUMEN ..... ……………………………………………………………………….1
ABSTRACT ……………………………………………………………………….....2
I. INTRODUCCION ……………………….………………………………...........…3
II. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………..……………………11
III.RESULTADOS ..................................................................................................... 15
IV.DISCUSIÓN .......................................................................................................... 19
V.CONCLUSIONES .................................................................................................. 23
VI.RECOMENDACIONES ....................................................................................... 24
VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 25
ANEXOS…………………………………………………………………………….32
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INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diferentes factorial de las diferentes concentraciones de 2,4-D y BAP por
tratamientos, a partir de tallo de P. americana “palto” cultivar
fuerte.……………………………………………………………..……......13
Tabla 2. Porcentaje del número de callos por explante viable de tallo de P. americana
“palto” cultivar fuerte evaluados en los diferentes
tratamientos...…………………………………..………………………….….15
Tabla 3. Morfología y peso ganado de los callos in vitro de P. americana Mill. “palto”
cultivar fuerte tratados con 2,4-D y BAP. La evaluación se realizó cada 15
días………………………………………………………………………….…16
Tabla 4. ANAVA factorial 4x2 para la variable número de callos in vitro de P. americana
“palto” cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con
2,4-D y BAP a los 120 días.………………………………………………...….17
Tabla 5. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados
con los reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP…………...………...……….17
Tabla 6. ANAVA factorial 4x2 para la variable ganancia de peso de P. americana “palto”
cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y
BAP a los 120 días…………………………………………………………….18
Tabla 7. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados
con los reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP …………………………….18
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INDICE DE ANEXOS
Fig 1. Callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, formado en
T2…………………………………………………………………………………….…33
Fig 2. Vista frontal del callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, vista al
esteroscopio binocular Olympus………………………………………………………..33
Fig 3. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte, formado
en T2. Callo cóncavo con borde sinuoso, de color verde………………………………..33
Fig 4. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte, formado en T2.
Callo cóncavo con borde sinuoso, a los 120 días.
Fig 5. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, formado
en T7. Callo de forma insignificante, color blanco……………………………….……..34
Fig 6. Meristemoides en el cilindro central del tallo de P. americana Mill. Las células son
más pequeñas y citoplasma denso. Tratamiento 5, a los 30 días de edad. Coloración
hematoxilina eosina, aumento 400x……………………………………………...……..34
Fig 7. Corte transversal de un callo emergiendo desde la corteza y rompiendo la capa
epidérmica. Tratamiento T1 a los 35 dias de edad. Coloración hematoxilina eosina,
aumento 400x……………………………………………………………………..…….35
Fig 8. Epidermis rota por la presión de nuevas células en formación y crecimiento.
Observe que estas células son más pequeñas y de forma cuadrada (flecha celeste) y las
células de la corteza son oblongas y más grandes. Tratamiento T2 a los 25 días de edad,
coloración hematoxilina eosina, aumento 400x…………………………………….…..35
Fig 9. Meristemoides en formación de P. americana Mill. “palto” cultivar fuerte.
Sometido a tratamiento T2, a los 15 días. Coloración hematoxilina eosina,
aumento…………………………………………………………………………...……35
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Tabla 1. Muestra experimental para los diferentes tratamientos empleados con los
fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable número de callos en tallo de Persea
americana Mill. “palto” cultivar fuerte…………………………………………………36
Tabla 2. Muestra experimental para los diferentes tratamientos empleados con los
fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable ganancia de peso (g) de callos en tallo de
Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte………………………………..………..37
Fotografías…………………………………..……………………………………..38-39
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RESUMEN
A partir del 2011 la región La Libertad es la más importante productora de paltas en el
país, lo cual, combinado con una elevada producción y exportación de sus frutos,
convierten a esta especie en un recurso agronómico de alto interés económico para el
desarrollo de la región. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención
y regeneración de plantas genéticamente modificadas, o transgénicas, mediante técnicas
de biotecnología, es así que la propagación clonal por embriogénesis somática se ha
convertido en un método esencial para la mejora de la mayoría de las plantas
económicamente importantes, reduciendo el tiempo requerido para la propagación de
plantas. Por ello, el objetivo del trabajo fue inducir callos embriogénicos en tallos de
Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte, utilizando diferentes concentraciones de
2,4-Diclorofenoxiacético (0 y 0.1mg/L) y 6-Bencil Amino Purina (0, 1, 5 y 10mg/L). Se
utilizaron 10 plantas de 120 días de edad del cultivar fuerte y se emplearon 150 explantes,
las evaluaciones por tratamientos fue cada 15 días. Se concluyó que el mayor porcentaje
de inducción de callos embriogénicos fue del 94% a 0 mg/L de2, 4-Diclorofenoxiacético
y 5 mg/L de 6-Bencil Amino Purina, así mismo los callos obtenidos en este tratamiento
presentaron en su morfología coloración verde con forma cóncava sinuosa y una tasa de
crecimiento de 0.20%.
Palabras claves: callos embriogénicos, Persea americana, 2,4-D, BAP.
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ABSTRACT
Since 2011, region La Libertad is the most important avocado producer of the country,
which, combined with a high production and exports of their fruits, makes this species in
a high interest agro-economic resource for the region development. In vitro culture is a
fundamental step in the production and regeneration of genetically modified plants, or
transgenic, through biotechnology techniques, so that the clonal propagation through
embryogenesis has become an essential method for the improvement of most
economically important plants, reducing the time required for the propagation of plants.
Therefore, the objective of the work was to induce embryogenic callus on steams of
Persea Americana Mill. "palto" fuerte culture, using different concentrations of 2,4-
Dichlorophenoxyacetic (0 and 0.1mg/L) y 6-Benzyl Amino Purine (0, 1, 5 and 10mg/L).
Ten 120-day-old fuerte culture plants and 150 explants were used. The evaluations per
treatment were every 15 days. It was found that the highest percentage of induction of
embryogenic callus was 94% at 0 mg/L of 2,4-Dichlorophenoxyacetic and 5 mg/L of 6-
Benzyl Amino Purine, moreover the callus obtained in this treatment presented in its
morphology green coloration with sinuous concave shape and a growth rate of 0.20 %.
Key words: embryogenic callus, Persea americana, 2,4-D, BAP.
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I. INTRODUCCIÓN
El palto (Persea americana Mill.) es un árbol perteneciente a la familia Lauraceae,
la cual comprende poco más de 50 Géneros entre los que se encuentra Persea (Luz
Sánchez, 1999; Rodríguez, 2003; Perea, et. al, 2010), hoja perenne (Perea y col.,
2010), de 6 a 20m de altura, tronco generalmente retorcido y de ramas bajas, con
corteza áspera y a veces surcado longitudinalmente, la corona es ovoide globosa,
irregular y densamente foliada (Rodríguez, 2003).
Se distribuye principalmente en áreas tropicales y subtropicales, originario de
América Central cuyo cultivo comercial se ha incrementado notablemente en los
últimos años hasta llegar a establecerse en países como Estados Unidos, Brasil,
Sudáfrica, Indonesia, Israel, Chile o España (Ray, 2008).
El fruto es una baya con una sola semilla y su tamaño puede variar entre 50 y 2g,
presenta formas, tamaño y colores variables como redonda, oval y piriforme
(Scora, et. al., 2002) y el color que va desde el verde amarillento hasta el morado
o casi negro y de superficie lisa y brillante hasta corrugada y opacas (Mostacero,
et. al, 2009).
El valor nutritivo de la palta es muy alto por su contenido en ácidos grasos, fibra,
vitamina B6, potasio, calorías, agua (67.9%), así mismo presentes en menor
medida vitamina B, B2, B3, B9, C, E, magnesio, ácidos grasos saturados,
carotenoides, fósforo, hierro, proteínas, calcio, yodo, vitamina A, hidratos de
carbono, selenio y sodio (Knight, 2002; Mostacero, et. al, 2009; MINAGRI,
2015). Elimina ácido úrico, anti anémico, diurético, antiinflamatorio para el
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hígado, cálculos renales, fortalece músculos débiles, contra la disentería y como
moderado afrodisiaco; así también es muy utilizado en la industria cosmética
(Mostacero, et. al, 2009; Sierra Exportadora, s.f.).
El incremento de la producción y exportación del Perú es notable, lo que hace
pensar que el país va por un excelente camino hacia la obtención de mejores
oportunidades de desarrollo. La palta, en especial la variedad Hass, tiene una gran
demanda mundial, tanto por sus propiedades nutritivas como por la preferencia
que tienen los consumidores, siendo Estados Unidos el principal importador desde
hace varios años, con una demanda que va creciendo a pasos agigantados.
En el 2013, el Perú destinó más de un millón de dólares a la promoción del
consumo de palta peruana en los mercados estadounidenses, en el 2013 se
exportaron 110 mil toneladas de paltas Hass, superándose al 2012 con 95 mil
toneladas. Solo entre enero y octubre del 2013, los envíos de paltas crecieron en
volumen un 36%, y en términos de valor un 34% (Berckemeyer, 2014a).
En los últimos 6 años el principal destino de esta fruta ha sido Países
Bajos (Holanda) (Vidal, 2010), que en el primer trimestre concentró el 61% del
total de los envíos. Al 2013 las exportaciones anuales de palta registraron US$
184.3 millones y llegaron a 29 destinos entre los que figuran algunos lejanos como
Hong Kong, Rusia, Marruecos y Bélgica (Berckemeyer, 2014b).
Por otra parte, es de resaltar la evolución de las exportaciones de Perú, que en el
año 2000 se ubicaba en el 13° lugar y en el 2013 ha pasado a ocupar el tercer lugar
después de la Unión Europea, que según refiere MINAGRI (2015) es en realidad
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un re exportador de fruta, de ahí que Perú se constituiría en el segundo exportador
más importante del mundo, con un crecimiento realmente impresionante, en 5
100% entre el año 2000 y el año 2013, dejando atrás a países como Chile,
Sudáfrica, Estados Unidos, República Dominicana y Nueva Zelandia, entre los
más importantes (Berckemeyer, 2015).
Respecto a las áreas cosechadas, el Perú actualmente se ubica en el 6° lugar del
ranking mundial de países con mayores áreas cosechadas de palta (20 mil
hectáreas en el 2012) (MINAGRI, 2015) y de acuerdo con el balance del sector
agroexportador 2013 presentado en el marco del XV Almuerzo Agroexportador
realizado en marzo último (Berckemeyer, 2015).
Los más elevados niveles de producción y exportación de Perú son en abril y
agosto, los cuales salen especialmente de los cultivos desarrollados entre La
Libertad, Lima y recientemente una mayor producción de Ica y algunos valles
interandinos. Sin embargo, el Perú produce palta durante todo el año,
representando una ventaja competitiva frente al resto de productores (MINAGRI,
2015).
Existen más de 20 empresas exportadoras de palta en el Perú, lideradas por
Camposol, Consorcio de Productores de Fruta, Agroindustrias Verde Sol,
Procesadora Larán, Agrícola Copacabana de Chincha (Vidal, 2010). Durante la
temporada 2014, Camposol, se convirtió en la empresa privada con la mayor
exportación de palta Hass a nivel mundial. En total, comercializó 38.000 toneladas
de palta (El Camposolino, 2015).
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La Libertad es la más importante región productora de paltas en el país, a partir
del 2011 se convierte en el primer productor nacional de palta, superando a
Lima, registrando 52,409 mil toneladas de producción y en el 2013 alcanza la cifra
record de 74,7 mil toneladas (26% de participación) (Sierra Exportadora. (s.f.);
MINAGRI, 2015).
La posibilidad de regenerar plantas en virtud de la totipotencia celular a partir de
células de plantas seleccionadas, fue el elemento central de la biotecnología
vegetal. Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos hicieron posible la regeneración
de la mayor parte de las especies vegetales que presentaban interés económico.
Un cultivo in vitro consiste en la proliferación de células a partir de un fragmento
vegetal llamado explante que, colocado en un medio nutritivo adecuado y bajo las
condiciones apropiadas, dará lugar a una masa desorganizada de células
indiferenciadas llamada callo.
Un callo consiste de una masa amorfa surgida de la proliferación de células del
parénquima. Frecuentemente es el resultado de una herida, un callo se forma en el
corte de un tallo o raíz. Los callos no tienen patrones predecibles de organización,
están presentes en centros localizados de actividad meristemática y a menudo
aparecen en regiones cambiales rudimentarios con zonas de diferenciación
vascular. Una de las características importantes de callo, desde un punto de vista
funcional, es su irregular crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces
normales, brotes y embriones que forman plántulas.
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El callo, una vez organizado, puede originar órganos (organogénesis) (Medina et
al., 1998; Prakash et al., 2002; Schween y Schwenkel, 2002; Singh et al., 2003;
Ganesh et al., 2008) o embriones (embriogénesis somática) (Hita et al., 1997;
Gallego et al., 2001; Wang y Balla, 2004; Capelo et al., 2010).
La organogénesis indirecta a menudo induce la variación somaclonal y permite
exponer características diferentes que no están expresadas normalmente en la
naturaleza o bien eliminar alguna indeseable (Sala y Labra 2003).
La característica general del crecimiento de callos, abarca una compleja relación
entre el material usado para iniciar los callos, la composición del medio, y las
condiciones experimentales durante el período de incubación. Algunos desarrollos
de callos son fuertemente lignificados y duros en textura, los que no se pueden
separar fácilmente en pequeños fragmentos. Por el contrario los callos frágiles se
separan fácilmente y se los denomina cultivos friables, frágiles (“frieble
cultures”). Los callos pueden ser amarillentos, blancos, verdes, o coloreados con
antocianinas. La pigmentación será en todo el callo, o en algunas regiones sin
pigmentar. Su anatomía, es de variación considerable a lo largo de la
diferenciación celular.
Después que el callo ha crecido asociado al tejido original por un tiempo, se vuelve
necesario pasarlo a un medio fresco. El crecimiento en un mismo medio por un
período extenso, provocará el agotamiento de nutrientes y una desecación gradual
del agar por la pérdida del agua. Los metabolitos secretados por los callos, se
pueden acumular en niveles tóxicos en el medio. La transferencia del fragmento
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del callo debe ser suficiente para asegurar el nuevo crecimiento en el medio fresco.
Si el inóculo transferido es muy pequeño, va a exhibir una tasa de crecimiento
muy baja, o no va a crecer. Dodd y Lorin (1982) recomiendan que el inóculo debe
tener 5-10 mm de diámetro y pesar 20-100 mg. Los repiques sucesivos se realizan
cada 28 días en tubos de cultivo que tienen 30 cm3 de medio. El tiempo entre
repiques es variable y depende de la tasa de crecimiento del callo.
El cultivo de callos puede ser utilizado para diferentes propósitos, tales como la
micropropagación y el mejoramiento vegetal. La producción de callo requiere de
un explante inicial, el que puede tener una alta diferenciación de sus tejidos, como
un trozo de raíz, tallo u hoja, o bien la utilización de tejidos menos diferenciados
como hipocótilos y cotiledones de plántulas recién germinadas e incluso
embriones cigóticos maduros e inmaduros (Correia y Canhoto 2010). Es así que
la inducción de callo representa un proceso de desdiferenciación y división celular
intensiva, el cual depende principalmente del explante, genotipo, medio de
cultivo, tipo de regulador de crecimiento como también su concentración y
combinación (Larson et al. 2006, Feeney et al. 2007, Rashmi y Trivedi 2014).
El explante es una porción de tejido escindida, u órgano tomado de la planta, para
iniciar un cultivo. Para el establecimiento y desarrollo de cada cultivo se debe
seleccionar el explante adecuado (Pierik, 1976). Generalmente se seleccionan
explantes provenientes de plantas juveniles, ya que en plantas viejas su capacidad
regenerativa suele disminuir, especialmente en árboles y arbustos. Así mismo,
tejidos jóvenes son apropiados para el cultivo debido a su mayor capacidad de
regeneración y número de divisiones celulares (Geier, 1990).
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Las auxinas producen elongación celular y expansión de los tejidos, división
celular (formación de callo); también está relacionado con el proceso de inducción
de raíces adventicias, inhibición en la formación de vástagos axilares y
adventicios, y frecuentemente embriogénesis en los cultivos de suspensión; la
concentración de estás es relativamente amplia sin causar efectos fitotóxicos en el
material tratado. A bajas concentraciones de auxina predomina la formación de
raíces adventicias y a altas concentraciones se da la formación de callo en lugar
de raíces (Pierik, 1990).
Las citocininas son sustancias químicas que se utilizan frecuentemente para
estimular el crecimiento y desarrollo, promoviendo la formación de vástagos
axilares, porque disminuyen la dominancia apical. Retrasan la senescencia,
activan yemas laterales en dormancia, estimulan la división celular sobre todo si
van en compañía de una auxina. Según Kunisaki (1980) la adición de las hormonas
(auxinas y citocininas) es esencial para la inducción y formación de callo, y
crecimiento del cultivo. Entre las más conocidas está la 6-bencilaminopurina
(BAP).
En la actualidad hay escasa información sobre la inducción de callos en palto y
utilizando en conjunto esta auxina y citocinina en el Perú, dicha información se
sustenta en evaluaciones de otros frutales, en Caesalpinia spinosa se obtuvieron
callos a partir de cotiledones, en Uncaria tomentosa “uña de gato” (Sánchez y
Alvarenga, 2014) se obtuvieron callos a partir de segmentos foliares de plantas in
vitro, en Phaseolus vulgaris L. (García et al., 2008) el mayor porcentaje (86%) de
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explantes que formaron callo se observó en los cotiledones, en Borojoa
patinoi“borojó” se obtuvieron callos friables a partir de explantes de hojas jóvenes
generadas in vitro a partir de semilla (Martínez et al., 2007), en Ugni molinae se
obtuvieron callos a partir de explantes de cotiledón, hipocótilo y hoja (Rodríguez
et al., 2014).
Hasta la fecha no existe un protocolo establecido para la obtención de callos
mediante organogénesis indirecta en el cultivo de palto en la región La Libertad,
por lo que infiere un paso significativo en cuanto a la propagación masiva de este
cultivo, tanto por su importancia económica y por su capacidad de generar plantas
libres de enfermedades, con menos tiempo de periodo de cultivo y en condiciones
in vitro. Por ello el objetivo del trabajo es inducir callos embriogénicos a partir de
tallo de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes
concentraciones de 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina. Esta
investigación permite sentar las bases para estudios similares en la obtención de
callos en cultivares de importancia económica, contribuyendo al avance científico
de nuestra región y diferentes zonas del Perú.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1.Material biológico
Se utilizó 10 plantas de 120 días de edad de “palto” del cultivar fuerte. Las
semillas fueron procedentes de un centro de abastos de la ciudad de Trujillo, las
cuales posteriormente se desinfectó por inmersión con alcohol comercial de 70°
por 10 minutos, luego se sembró en macetas con tierra y musgo en la proporción
de 2:1 respectivamente, el riego fue interdiario a condiciones de capacidad de
campo y la temperatura e iluminación en condiciones de laboratorio.
2.2. Preparación y desinfección de los explantes
La desinfección de los explantes se realizó en condiciones asépticas por
inmersión, en alcohol comercial de 70° por 60 segundos seguido por una
inmersión de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% durante 10 minutos.
Finalmente, se realizan 5 enjuagues de 2 min cada uno con agua destilada
esterilizada.
2.3. Medio basal
Se utilizó como medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) para todos los
tratamientos a mitad de su concentración, suplementando con sacarosa (3%), mio-
inositol (0.3%), agar (1%) y reguladores de crecimiento (2,4-D y BAP). Así
mismo para evitar la fenolización u oxidación del material vegetal, se añadió
carbón activado al 0.5% (Montes et al., 2007). El pH del medio se ajustó a 5.6 -
6.5 con NaOH 1N ó HCl 1N. Luego el medio basal se autoclavó durante 30
minutos a 15 libras de presión y 121°C.
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2.4. Inducción de callos
Se emplearon como explantes tallos de 1cm2, a los cuales se les realizó cortes
longitudinales, se desinfectaron previamente con alcohol de 70° por 60 segundos
seguido por una inmersión de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% durante 10
minutos. Para la inducción de callos, se utilizó un medio inductor de callos (MI)
el cual contenía 2,4-D (4,52 uM) como regulador del crecimiento. Los explantes
fueron sembrados en frascos de penicilina (un explante por frasco) conteniendo
como medio inductor a MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementando 2,4-D a 2
ppm y carbón activado 0.5%. Se utilizaron 150 explantes, los cuales se man-
tuvieron en oscuridad continua por 15 días. Al cabo de este tiempo, se evaluó el
número de callos formados por explante, el peso, color y forma de los callos
obtenidos.
2.5. Desarrollo del callo embriogénico
Posterior a la inducción, los callos obtenidos de la primera etapa fueron
transferidos a un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) en la cual se
combinaban diferentes concentraciones de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-
bencilaminopurina (BAP) como regulador de crecimiento (Tabla 1), cada frasco
de penicilina tuvo 1 explante, para cada tratamiento se utilizaron 35 unidades
experimentales con una repetición por tratamiento, los mismos que permanecieron
durante 60 días en cámara de incubación, con un fotoperiodo de 16 h luz. Se
evaluó cada 15 días la sobrevivencia de callos y se clasificaron en blanco, verde,
con morfología insignificante o cóncavo con bordes sinuosos, peso y tasa de
crecimiento.
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Tabla 1. Diseño factorial de las diferentes concentraciones de 2,4-D y BAP por
tratamientos, a partir de tallo de P. americana “palto” cultivar fuerte.
2,4 – D
(ppm)
BAP
(ppm)
0 1 5 10
0 T0 T1 T2 T3
0.1 T4 T5 T6 T7
T0 = testigo
2.5.1. Condiciones de incubación
Los frascos de penicilina se llevaron a incubación en un ambiente
controlado a temperatura entre 25± 2 °, y en oscuridad total por 15 días.
Transcurrido este tiempo, los explantes fueron introducidos a los
diferentes tratamientos establecidos y colocados en fuentes luminosas
(cuatro fluorescentes de luz blanca, 40 watts, cada uno) con fotoperiodo
de 16:8 y a temperatura ambiente ± 21°C.
2.6. Evaluación
La evaluación cualitativa se realizó cada 15 días y la cuantitativa a los 40 días; se
anotó lo siguiente:
A. Callo:
A.1. Peso: Se extrajeron los explantes con una pinza de disección punta fina
de acero inoxidable estéril y se procedió a medir el peso del explante con una
balanza digital de precisión 0.1g de la marca Bsuper Mart® y se anotaron los
datos obtenidos.
A.2. Color: Cada 15 días se evaluó la coloración que tornaban los explantes y
se anotaron los datos obtenidos.
A.3. Forma: Se evaluó el aspecto morfológico de los explantes cada 15 días
y se anotaron los resultados obtenidos según Chico et al. (2005).
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La Tasa de crecimiento (TC) se determinó con la siguiente fórmula:
𝑇𝐶 =𝑊₂ − 𝑊₁
𝑡₂ − 𝑡₁𝑥 100
donde: W2= peso final; W1= peso inicial; t2= tiempo final; t1= tiempo inicial.
2.7. Análisis Estadísticos
Este experimento se estableció bajo un diseño Factorial 4x2 (con el testigo
incluido en dicho factorial). Para observar las diferencias significativas en los
porcentajes de callogénesis en el medio de inducción se utilizó el análisis de
varianza (ANAVA) y la prueba de comparación de medias HSD Tukey (p < 0.05).
Para el procesamiento de los datos se utilizó el software de analítica
predictiva IBM SPSS 22.0.
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III. RESULTADOS
Los explantes que fueron sometidos a los tratamientos que contenían reguladores de
crecimiento 2,4-D y BAP, indujeron callos in vitro en el explante evaluado pero con
diferentes proporciones. Así, los explantes de tallo sembrados en medio sin regulador de
crecimiento (T0) no generaron callos embriogénicos y los T4 y T5 resultaron menos
viables. El mayor número y porcentaje de callos embriogénicos obtenidos, se indujo en
los tratamientos T2 inducido con 2,4-D (0mg/L) y BAP (5mg/L) con 410 callos
representado con un 94%, y el T1 inducido con 2,4-D (0mg/L) y BAP (1mg/L) con 176
callos y un 92% (Tabla 2).
Tabla 2. Porcentaje del número de callos por explante viable de tallo de P. americana “palto”
cultivar fuerte evaluados en los diferentes tratamientos.
Tratamiento N° Explante viable N° Callo % N° Callo/explante
T0 0 0 0 0
T1 23 176 92 5.7
T2 33 410 94 11.7
T3 7 52 64 1.5
T4 1 1 3 1.0
T5 1 8 17 0.4
T6 2 20 22 0.8
T7 3 25 38 0.8
Las hormonas 2,4-D y BAP, indujeron la formación de callos embriogénicos en tallos de
Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte, los cuales presentaron características
peculiares. Los callos obtenidos de T4, T5, T6 y T7 expuestos a luz, no presentaron
diferencia en el color blanco ni en su forma (reducido), a contraposición de los
tratamientos T1, T2, T3 que presentaron callos con coloración verde y forma definida,
así mismo se registró ganancia de peso de 0.2, 0.15, 0.17 respectivamente y obteniéndose
la mayor tasa de crecimiento de 0.20% en T2 (Tabla 3). La evaluación fue cada 15 días.
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Tabla 3. Morfología y peso ganado de los callos in vitro de P. americana Mill. per“palto” cultivar
fuerte tratados con 2,4-D y BAP. La evaluación se realizó cada 15 días.
MI: medio inductor: MS+2,4-D 2ppm
Según los resultados obtenidos en el número de callos in vitro por tratamiento, se encontró
que las hormonas 2,4-D y BAP influyen en la inducción de callos embriogénico
existiendo diferencias significativas en ANAVA (Tabla 4), así mismo se realizó la prueba
Tukey, con significancia de 0.05 evidenciando que existe efecto en la interacción (Tabla
5).
Días
Luz
Tratamientos
Callo
Color Forma Ganancia
de peso (g)
Tasa de
crecimiento
(%)
15 Ausente MI blanco Insignificante 0.01 0.00
30 Presente T1 verde Cóncavo con bordes sinuosos 0.2 0.13
45 Presente T2 verde Cóncavo con bordes sinuosos 0.15 0.20
60 Presente T3 verde Cóncavo con bordes sinuosos 0.17 0.13
75 Presente T4 blanco Insignificante 0.03 0.07
90 Presente T5 blanco Insignificante 0.1 0.13
105 Presente T6 blanco Insignificante 0.06 0.13
120 Presente T7 blanco Insignificante 0.07 0.07
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Tabla 4. ANAVA factorial 4x2 para la variable número de callos in vitro de P. americana “palto”
cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y BAP a los 120
días.
Origen SC GL CM F Sig.
Entre
Tratamientos
990.608 7 141.515 15.671 **0.000
2,4-D 164.654 1 164.654 18.233 **0.000
BAP 231.756 3 77.252 8.555 **0.000
2,4-D * BAP 183.040 3 61.013 6.756 **0.000
Error 1381.653 153 9.030
Total corregido 2372.261 160
p<0.05
Tabla 5. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados con los
reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP.
Tratamientos
N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2 3
T0 35 0.0000
T4 32 0.0625
T5 6 0.1667
T6 9 0.5556
T7 8 0.6250
T3 11 1.1818 1.1818
T1 4.5200 4.5200
T2 5.8286
Sig. 0.974 0.098 0.955
Los resultados obtenidos en ganancia peso (g) en los callos in vitro por tratamiento, se
encontró los fitorreguladores de crecimiento 2, 4-D y BAP influyen en el peso de callos
embriogénicos, existiendo diferencias significativas en ANAVA (Tabla 6), así mismo se
realizó la prueba Tukey, con significancia de 0.05 evidenciando que existe efecto en la
interacción (Tabla 7).
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Tabla 6. ANAVA factorial 4x2 para la variable ganancia de peso de P. americana “palto” cultivar
fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y BAP a los 120 días.
Origen SC GL CM F Sig.
Entre tratamientos 1.055 7 0.151 5.612 **0.000
2,4-D 0.305 1 0.305 11.334 **0.001
BAP 0.114 3 0.038 1.415 0.240
2,4-D * BAP 0.260 3 0.087 3.227 0.024
Error 4.111 153 0.027
Total corregido 5.166 160
p<0.05
Tabla 7. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados con los
reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP.
Tratamientos N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2
T0 35 0.00
T4 32 0.00
T6 9 0.01 0.01
T5 6 0.02 0.02
T7 8 0.04 0.04
T2 35 0.14 0.14
T3 11 0.17 0.17
T1 25 0.20
Sig. 0.158 0.084
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IV. DISCUSIÓN
El explante de tallo en P. americana Mill. “palto” cultivar fuerte, fue capaz de generar
callo embriogénico debido a la influencia de los fitorreguladores 2,4-D y BAP, así mismo
la formación de callo es estimulada por el corte de los tejidos y la concentración exógena
del regulador de crecimiento utilizado. Los callos se generan a partir de la zona de corte
en todos los explantes, los tallos lo hacen en ambos extremos lo que sugiere una
acumulación de auxinas en las zonas de corte y en consecuencia una estimulación de la
mitosis permitiendo la formación de tejido calloso (Smith, 2012).
En el tallo se ve un claro incremento de la callogénesis cuando se aumenta la
concentración de BAP y se suprime la del 2,4-D (Tabla 2). Entre los tratamientos que
utilizaron las auxinas con BAP la mejor combinación es 0 ppm 2,4-D + 5 ppm BAP para
la formación de callos embriogénicos, encontrando 92% de formación de callos. Según
Bhau (1999), Llamoca et al. (1999), Medeiros et al. (2006), Angulo y Paredes (2011) el
Ácido 2,4–diclorofenoxiacético (2,4–D) es un herbicida que actúa como auxina y
favorece la formación de callos en tejidos vegetales; ha sido usado en algunas especies
de cactáceas, con distintas concentraciones o combinado con otros reguladores de
crecimiento, actuando en diferentes explantes o tejidos. Estos autores coinciden con
Zhao et al. (2005) en que la formación de callos se produce cuando la misma
concentración de auxina y citoquinina se añade al medio de cultivo; por tanto, la relación
entre ambos reguladores de crecimiento constituye el factor crítico que desencadena las
reacciones de desarrollo in vitro.
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El Medio Inductor enriquecido con 2,4-D estimuló el crecimiento en regiones polares de
los explantes de P. americana Mill., mientras que al utilizar BAP se observó crecimiento
de callo tanto en regiones polares como en las regiones laterales. En el presente trabajo,
con Persea americana Mill., no se observó una respuesta favorable de diferentes
concentraciones de 2,4–D ó 2,4–D + BAP, ya que no indujeron el desarrollo de callos
embriogénicos en condición de luz. Los callos formados, presentaron características
variables en color y textura.
A diferencia de esto Pinto et al. (2002) lograron incrementar el porcentaje de callos au-
mentando la concentración hormonal de 2,4-D y de BAP en E. globulus. Por otra parte,
Suksa-Ard et al. (1999) consideraron que la formación y las características de los callos
dependen, considerablemente, del órgano usado como explante. Shu et al. (2005)
mostraron los mejores resultados en la obtención de callos embriogénicos, al utilizar
como explante segmentos de tallos de Dioscorea zingiberensis e incluir en el medio de
cultivo 0,5 ppm de BAP y 2,0 ppm de 2,4- D, con lo que lograron una frecuencia de
formación de callos del 87%.
La inducción de la callogénesis se atribuye a los múltiples mecanismos de acción de los
reguladores de crecimiento empleados. Para que las auxinas induzcan el efecto fisiológico
estas deben ser transportadas desde el medio de cultivo hasta las células blanco como
mencionan Taiz y Zieger (1998). Estos investigadores propusieron el modelo
quimiosmótico de transporte polar de las auxinas. En este proceso las bombas de H+
mantienen una gradiente electroquímica entre el citoplasma y la pared celular. Para que
las auxinas induzcan el crecimiento celular estas deben unirse a receptores externos e
internos, los que a la vez inducen la expresión de genes que codifican factores proteicos
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que aumentan la plasticidad y ablandan la pared celular. Esto tiene como efecto la
dilatación de la célula, debido a la presión del agua dentro de su vacuola (presión de
turgencia), de este modo continúa agrandándose hasta que la pared opone resistencia
(Azcón-Bieto y Talón 2008).
Muchos investigadores han relacionado el tipo de callo con la respuesta organogénica y
embriogénica que se pueda presentar, siendo altamente dependiente de la especie. Por lo
tanto, el tipo de callo puede ser un indicador importante de la ruta morfogénica a seguir
(Smith 2012). El cambio de aspecto de los callos conforme se cultivan en el tiempo ha
sido reportado por Larson et al. (2006). La apariencia en su forma cóncava con bordes
sinuosos de Persea americana cultivar fuerte, se relaciona a los explantes de tallo
inducidos con BAP (1, 5 y 10 ppm) y 0 ppm de 2,4-D. Al respecto Shiram et al. (2008)
señalan que altas concentraciones de auxina o citoquininas estimulan la producción de
callo y que su aspecto está relacionado al tipo de hormona utilizada durante su inducción.
No se reportó que exista mayor influencia de inducción de callos in vitro cuando se
aplicaba mayor concentración de la auxina, ni en combinación con las citocininas, sino
que se obtuvieron resultados significantes al incremento del BAP, así también para la tasa
de crecimiento en función al peso de los explantes con callo por tratamiento, siendo el
más óptimo el T2 al encontrarse un 0.20%. No obstante, en otras investigaciones la
inducción de callos con una alta relación auxina/citoquinina o sólo auxinas favorece la
presencia de callos caulogénicos, como lo dejan en evidencia los reportes de Tang y
Newton (2005) en Pinus strobus L. y de Hajari et al. (2006) en híbridos de Eucalyptus
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grandis x Eucalyptus urophylla. En otros casos, como en Eucaliptus nitens, E. globulus
y E. camaldulensis, la inducción basada en auxinas ha promovido callos embriogénicos
(Bandyopadhyay et al. 1999, Prakash et al. 2002). Este estudio, pionero para la especie,
abre expectativas para el uso potencial de callos de P. americana cultivar fuerte en otras
aplicaciones como embriones somáticos.
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V. CONCLUSIONES
- El mayor porcentaje de inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea
americana Mill. “palto” cultivar fuerte, fue del 94% que se obtuvo con 0 mg/L de
ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina (5 mg/L).
- Los callos embriogénicos inducidos del tratamiento de 0 mg/L de ácido 2,4-
Diclorofenoxiacético y 5 mg/L de 6-Bencil Amino Purina (T2), expuestos a luz
presentaron coloración verde, con forma cóncava sinuosa y una tasa de
crecimiento de 0.20%.
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VI. RECOMENDACIONES
- Se recomienda para evaluar la inducción de callos embriogénicos en Persea
americana Mill. “palto” cultivar fuerte, las concentraciones comprendidos entre
0 mg/L de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 1mg/L y 5mg/L de 6-Bencil Amino
Purina y hallar un equilibrio en cuanto a ahorro de materia prima.
- Se recomienda emplear el material biológico a partir de los 3 meses de edad para
evitar fenolización y/o muerte del explante cuando es muy joven.
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ANEXOS
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Fig 1. Callo embriogénico de P. americana
Mill. Cultivar fuerte, formado en T2.
Fig 2. Vista frontal del callo embriogénico de
P. americana Mill. Cultivar fuerte, vista al
esteroscopio binocular Olympus.
Fig 3. Morfología de callo embriogénico de P.
americana Mill. cultivar fuerte, formado en T2.
Callo cóncavo con borde sinuoso, de color verde.
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Fig 5. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte,
formado en T7. Callo de forma insignificante, color blanco.
Fig 4. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte,
formado en T2. Callo cóncavo con borde sinuoso, a los 120 días.
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Fig 6. Meristemoides en el cilindro central del tallo de P.
americana Mill. Las células son más pequeñas y citoplasma
denso. Tratamiento 5, a los 30 días de edad. Coloración
hematoxilina eosina, aumento 400x.
Fig 7. Corte transversal de un callo
emergiendo desde la corteza y rompiendo
la capa epidérmica. Tratamiento T1 a los
35 días de edad. Coloración hematoxilina
eosina, aumento 400x
Fig 8. Epidermis rota por la presión de nuevas
células en formación y crecimiento. Observe que
estas células son más pequeñas y de forma
cuadrada (flecha celeste) y las células de la corteza
son oblongas y más grandes (flecha roja).
Tratamiento T2 a los 25 días de edad, coloración
hematoxilina eosina, aumento 400x.
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Fig 9. Meristemoides en formación de P. americana
Mill. “palto” cultivar fuerte. Sometido a tratamiento
T2, a los 15 días. Coloración hematoxilina eosina,
aumento 400x.
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Tabla 1. Muestra experimental para los diferentes tratamientos empleados con los
fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable número de callos en tallo de Persea americana
Mill. “palto” cultivar fuerte.
N
Tratamientos
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
1 0 0 14 1 0 0 5 0
2 0 0 12 1 0 2 0 0
3 0 0 10 1 0 0 0 2
4 0 0 8 0 0 0 2 0
5 0 4 13 0 0 0 0 3
6 0 0 13 0 0 0 0 0
7 0 1 26 0 0 0 2 0
8 0 0 11 3 0 0 0 2
9 0 0 11 7 0 0 2 0
10 0 9 17 0 0 0 0 0
11 0 3 22 0 0 0 3 0
12 0 0 19 0 1 0 0 3
13 0 0 13 4 0 0 0 0
14 0 0 17 1 0 3 2 0
15 0 8 9 1 0 1 0 0
16 0 17 7 1 0 0 0 2
17 0 0 5 1 0 0 0 0
18 0 19 3 3 0 0 0 0
19 0 9 15 3 0 0 0 0
20 0 2 10 3 0 0 2 0
21 0 13 12 2 0 0 0 0
22 0 13 9 0 0 0 0 2
23 0 10 5 1 0 2 0 0
24 0 0 12 1 0 0 0 0
25 0 34 17 1 0 0 2 0
26 0 10 11 4 0 0 0 0
27 0 0 8 3 0 0 0 3
28 0 11 5 2 0 0 0 0
29 0 5 12 0 0 0 0 0
30 0 0 18 0 0 0 0 0
31 0 0 5 2 0 0 0 0
32 0 3 9 1 0 0 0 0
33 0 2 9 1 0 0 0 2
34 0 0 12 2 0 0 0 3
35 0 3 11 2 0 0 0 3
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38
Tabla 2. Muestra experimental para los diferentes tratamientos empleados con los
fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable ganancia de peso (g) de callos en tallo de Persea
americana Mill. “palto” cultivar fuerte.
N Tratamientos
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
1 0 0.06 0.06 0.12 0 0.1 0.04 0
2 0 0 0.16 1.1 0 0 0.08 0
3 0 0.22 0.13 0.14 0 0 0 0.13
4 0 0.14 0.08 0 0 0 0 0.11
5 0 0.12 0.12 0 0 0 0 0
6 0 0.06 0.2 0 0 0 0 0
7 0 0 0.23 0 0.03 0 0 0.09
8 0 0.09 0.14 0.12 0 0 0 0
9 0 0.14 0.11 0.06 0 0 0 0
10 0 0.18 0.12 0.04 0 0 0 0
11 0 0.25 0.04 0.28 0 0 0 0
12 0 0.16 0.16 0 0 0 0 0
13 0 0.19 0.13 0 0 0 0 0
14 0 0.11 0.12 0 0 0 0 0
15 0 0.04 0.22 0 0 0 0 0
16 0 0.18 0.04 0 0 0 0 0
17 0 0.18 0.03 0 0 0 0 0
18 0 0.22 0.26 0 0 0 0 0
19 0 0.02 0.08 0 0 0 0 0
20 0 0.9 0.04 0 0 0 0 0
21 0 1.2 0.15 0 0 0 0 0
22 0 0.12 0.12 0 0 0 0 0
23 0 0.12 0.08 0 0 0 0 0
24 0 0.17 0.08 0 0 0 0 0
25 0 0.12 0.08 0 0 0 0 0
26 0 0 0.28 0 0 0 0 0
27 0 0 1.19 0 0 0 0 0
28 0 0 0.15 0 0 0 0 0
29 0 0 0.03 0 0 0 0 0
30 0 0 0.06 0 0 0 0 0
31 0 0 0.05 0 0 0 0 0
32 0 0 0.03 0 0 0 0 0
33 0 0 0.02 0 0 0 0 0
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Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
BIBLIO
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FOTOGRAFÍAS
A. Vista de la investigadora realizando la siembra de los explantes de tallo de
Persea americana Mill. “palto” variedad fuerte.
B. Vista de la investigadora luego de realizada la siembra de los explantes de
tallo de Persea americana Mill. “palto” variedad fuerte.
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C. Frascos de penicilina con los explantes sembrados en los diferentes
tratamientos.
D. Cámara de siembra con el material con MS, mecheros y material utilizado en
la siembra de los explantes a investigar.
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