esercizio. l’assorbanza per una soluzione contenente una … · 2020. 4. 3. · esercizio....
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ESERCIZIO.L’assorbanza per una soluzione contenente una miscela di NAD+ e NADH è stata misurata a 340 nm e a 260 nmA340= 0.207 e A260= 0.9Conoscendo i coefficienti di estinzione:
mM340 NADH= 6.2 mM-1 cm-1
mM260 NADH= 18 mM-1 cm-1
mM260 NAD+ = 18 mM-1 cm-1
Calcolare le concentrazioni millimolari della forma ossidata e ridotta
A340 0.207
[NADH] = ----------= --------------------------- = 0.0333mM340· l 6.2mM-1cm-1 x 1cm
A260 0.9 [NAD+] +[NADH]= -------- = ------------------------ = 0.05mM
260 x l 18mM-1·cm-1 x 1cm
[NAD+] = 0.05 mM – 0.0333 mM = 0.0167 mM
PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE TECNICHE CROMATOGRAFICHE
Le tecniche cromatografiche, utilizzate nella purificazione delle proteine, sono basate sulla distribuzione differenziale delle varie proteine presenti in una miscela fra DUE FASI IMMISCIBILI FRA LORO:
• fase stazionaria (matrice)
• fase mobile (eluente, solvente che fluisce in continuo attraverso la fase stazionaria)
➢In base alla forma del letto cromatografico
Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)
Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
➢In base allo stato fisico della fase mobile
Cromatografia Liquida (LC)Gascromatografia (GC)Cromatografia fluida supercritica
(SFC)
➢ In base al meccanismo di separazioneAdsorbimentoRipartizioneScambio ionicoEsclusione
Affinità
Le tecniche cromatografiche si distinguono:
CAMPIONE: MISCELA DI PROTEINE ottenuto da frazionamento di unestratto proteico (da tessuto, cellule o fluido biologico)
Le diverse proteine in miscela hanno capacità di distribuirsidiversamente fra FASE MOBLILE e FASE STAZIONARIA, perché hannodiversa sequenza amminoacidica, diversa struttura e quindi diverseproprietà chimico-fisiche.
Le proteine che interagiscono di più con la fase stazionaria, sarannotrattenute più a lungo.
Le proteine che interagiscono di più con la fase mobile transiterannopiù velocemente.
Ogni diversa proteina ha una sua caratteristicadistribuzione fra le due fasi che è espressa come COEFFICIENTE DIRIPARTIZIONE (Kd)
• Coefficiente di ripartizione: definisce come un composto si distribuisce tra due fasi non miscibili
concentrazione proteina nella fase mobile
Kd= ---------------------------------------------------------------
concentrazione proteina nella fase stazionaria
Kd > 1 indica che l’analita interagisce preferenzialmente con la fase mobile → si muove velocemente attraverso la colonna
Kd < 1 indica che l’analita interagisce preferenzialmente con la fase stazionaria
→si muove lentamente lungo la colonna
Kd = 1 indica che l’analita interagisce equamente con entrambe le fasi, il tipo di cromatografia scelto non è efficiente
CROMATOGRAFICA LIQUIDA SU COLONNA
SerbatoioCon fase mobile
Fase mobile
Fase stazion.
Setto poroso
Eluato
rubinetto
rubinetto
Miscela di proteine
Proteineseparate
I componenti della MISCELA cheinteragiscono più fortemente con
la FASE STAZIONARIA sarannorallentati rispetto ad altri
componenti della miscela cheinteragiscono preferenzialmente
con la FASE MOBILE. Questi si muovono più
velocemente lungo la colonna, trascinati dal flusso di fase mobile
FASI OPERATIVE di una SEPARAZIONE PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA:
•IMPACCAMENTO della COLONNA
•CARICAMENTO del CAMPIONE
•ELUIZIONE
•RIVELAZIONE degli analiti
•RACCOLTA delle FRAZIONI
•CONTROLLO della PURIFICAZIONE
APPARECCHIATURE:
• Colonna di vetro
Eventualmente:
• Pompa collegata da un lato al Serbatoio con fase mobile e dall’altro alla colonna
• Collettore di frazioni
• Sistema di rivelazione (spettrofotometro)
IMPACCAMENTO DELLA COLONNA
• La fase stazionaria È una polvere che deve essere sospesa eidratata nella fase mobile
• La sospensione con la fase stazionaria va versata ESTRATIFICATA nella colonna in maniera continua,delicatamente senza intrappolare bolle d’aria
COLONNE PREIMPACCATE CON SPECIFICHE FASI STAZIONARIECOLONNE DA IMPACCARE
Rubinetto chiuso
Fase
st
azio
nar
ia
Fase mobile
• Aggiunta di fase mobile x equilibrare la fase stazionaria, nondeve mai andare a secco!
RESERVOIR
https://www.youtube.com/watch?v=UmWMlKJAdSk
CARICAMENTO DEL CAMPIONE
• Aspirare la fase mobile sulla colonna
• Stratificare delicatamente il campionesulla fase stazionaria (rubinetto chiuso)
• Aprire il rubinetto e far adsorbire ilcampione nella fase stazionaria
• Aggiungere la fase mobile prima che illetto della colonna vada a secco
• Collegare al reservoir con la fase mobile
• Eluire le proteine: i componenti dellamiscela si muovono lungo la colonna infunzione della loro interazione con la F.S.e con la F.M.
Fase
sta
zio
nar
ia
Fase mobile
ELUIZIONE COLONNA
• A flusso naturale o impostato con una POMPA PERISTALTICA
• La quantità di liquido che esce dalla colonna non deve superare quella cheentra: FLUSSO COSTANTE DURANTE TUTTA LA SEPARAZIONE
• Eluizione isocratica: utilizzo un singolo solvente
• Eluizione non isocratica: la composizione della fase mobile cambia neltempo, durante l’eluizione (varia il pH, forza ionica, polarità)
ELUIZIONE A STEPvariazioni discontinue impartitemanualmente dall'operatore
ELUIZIONE in GRADIENTEvariazioni continue mediante formatoredi gradiente o miscelatore
Soluzione più concentrata
Soluzione meno concentrata
RACCOLTA DELLE FRAZIONI
• L’eluato in uscita dalla colonna viene raccolto In tempi diversi inprovette poste all’uscita della colonna (raccolta manuale) o permezzo di un collettore di frazioni automatico.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ASS
OR
BA
NZA
(λ)
RIVELAZIONE: Visualizzazione della separazione
L’eluato deve essere analizzato daun RIVELATORE (per es.SPETTROFOTOMETRO) che misurila presenza dell’analita eluito dallacolonna. Riportando il segnale infunzione del tempo si ottiene ilcromatogramma o profilocromatografico o grafico dieluizione
La posizione dei picchicromatografici sull’asse dei tempi =tempo di ritenzione, serve peridentificare i componenti delcampione
L’area sottesa dai picchi èproporzionale alla quantità di ognisingolo componente e può essereutilizzata a scopo quantitativo
TEMPO DI RITENZIONE O DI ELUIZIONE (Tr o Te)
Tr: Tempo impiegato da ciascun composto per attraversare l’intera colonna eeluire dalla colonna, ed essere rivelato dal detector come un picco.Se la separazione della miscela è efficiente e le proteine da separare hanno undiverso Kd, il Tr è differente per ciascuna proteina
Tempo morto
Tempo ritenzione
Tm
Tr
Cromatogramma per una miscela a due componenti:
• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcunainterazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempomorto, Tm
• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazionecon la fase stazionaria ed esce al tempo Tr > Tm
Volume di ritenzione o di eluizione (Vr o Ve)
Ve: Volume di fase mobile necessario per eluire un analita che abbia uno specifico Tr
Ve = Tr x Fc
(Fc : velocità di flusso della Fase mobile)
Il Volume di ritenzione dipende da:
• Dimensioni della colonna (diametro e lunghezza)
• Dimensioni, forma e porosità delle particelle della fase stazionaria
• Viscosità della fase mobile
SISTEMA CROMATOGRAFICO a bassa pressione
RACCOGLITORE DI FRAZIONI
Posso collegare direttamente la colonna
al raccoglitore di frazioni, e poi leggere l’assorbanza di ogni
frazione allo spettrofotometro
CROMATOGRAMMA(GRAFICO DI ELUIZIONE)
COLONNA
POMPAPERISTALTICA
UV/VISCella a flusso
Misura continua dell’assorbimento
dell’eluato
AλGRAFICO DI ELUIZIONE(CROMATOGRAMMA)
Tempo ritenzione o Volume di eluizione o Numero provetta
ASS
OR
BA
NZA
MIS
UR
ATA
A 2
80
nm
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
280 nm
Matrici: supporto alla fase stazionaria
• MATRICI più utilizzate in CROMATOGRAFIA su colonna:
INORGANICHE:
- SILICE
POLISACCARIDICHE:
• AGAROSIO
• CELLULOSA
• DESTRANO
POLIMERI ORGANICI SINTETICI:
• POLIACRILAMIDE
• POLISTIRENE
Scelta della fase stazionaria è strettamente correlata al tipo di cromatografia
La MATRICE: deve possedere :
- Elevata Stabilità Meccanica (deve permettereflussi di fase mobile elevati)- Stabilità Chimica: inerte e insolubile nella F.
Mobile e nel Campione- Possibilità di essere modificata con l’introduzione di Gruppi funzionali- Elevata densità di gruppi funzionali = ElevataCapacità
• L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimericache è fatta di microsfere con porosità controllata.
• Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengonotrattenute in base alla loro dimensione.
• Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matriceesce con un volume di eluente pari al Void Volume (volumevuoto, V0).
Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare
CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE(o esclusione molecolare)
Livello minimo di sicurezza dell’eluente
Sistema cromatografico semplice dotato di una colonna impaccata con una fase stazionaria per gel-cromatografia
V0
VR
Vtotale
Proteine ad alto
peso
molecolare
Proteine a peso
molecolare intermedio
Proteine a
basso peso
molecolare
Kd + elevatoKd + piccolo
https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ
https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8
FASI STAZIONARIE: sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, sidifferenziano per il LIMITE DI ESCLUSIONE e l’INTERVALLO o CAMPO DIFRAZIONAMENTO
Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (Da)
Sephadex G-10 Destrano 50 - 700
Sephadex G-25 Destrano 1000 - 5000
Sephadex G-50 Destrano 1500 - 30000
Sephadex G-100 Destrano 4000 - 150000
Sephadex G-200 Destrano 5000 - 600000
Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 100 - 1800
Bio-Gel P-6 Poliacrilammide 1000 - 6000
Bio-Gel P-10 Poliacrilammide 1500 - 20000
Bio-Gel P-30 Poliacrilammide 2500 - 40000
Bio-Gel P-100 Poliacrilammide 5000 - 100000
Bio-Gel P-300 Poliacrilammide 60000 - 400000
Sepharose 6B Agarosio 10000 - 4000000
Sepharose 4B Agarosio 60000 - 20000000
Sepharose 2B Agarosio 70000 - 40000000
Sephadex G-200; range di frazionamento 5000-600000 Da
Miscela di analiti caricata in colonna:
Fase mobile: fosfato di sodio 0.05 M + NaCl 0.15 M, pH 7.0
Vit. B12
MbOvalbumin
Transferrin
IgG
Ferritina
Tiroglobulin