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ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de
etidio
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina
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OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Medio LB + KANAMICINA
Escherichia coli
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Se “introducirá el vector pET-TEM
Sitio múltiple de restricción
Origen de replicación
Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina
fosfotransferasa
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PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
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Plásmidos
La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite
desarrrollar estrategias de purificación
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
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Purificación de plásmidos
1. LisisQuímica Mecánica Cambios en la Tempratura
2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas)
3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas
4. Purificación alta resoluciónMétodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad
Disolver Liofilizar Formular
5. Conservar
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ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE
PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA
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Aislamiento de plásmidos por el método de lisis
alcalina
Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
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Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9
La glucosa no tiene carga pero es un osmolito
El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la
membrana.
También el Mg2+ es cofactor de Dnasas
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Componentes de la solución GTE
Tris-HCl
Glucosa
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Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%
Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas
celulares.
SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS
Solución de lisis
El NaOH desnaturaliza el
DNA plasmídico y cromosomal
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Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos.
El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos.
Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN
EL SOBRENADANTE
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El isopropanol precipita los ácidos nucleícos
Incubar por 20 min a -20°C
Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
evapora más rápido
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Purificación de plásmidos
Por ejemplo unión al pétido 16mer
NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-
Gln-COOH
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¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa
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Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos
DNA cromosomal
Plásmido abierto
Plásmido superenrrollado
1 Precipitación con isopropanol
2 Cromatografía intercambío aniónico
3 Filtración con membrana de nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en la membrana de
nitrocelulosa
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Microscopia de polímero de agarosa
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Uso de “colorantes”
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Tinción con Syber Safe
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