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ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
Isolamento di DNA ed RNA da un tessuto o da cellule eucariotiche o procariotiche
E’ quindi possibile estrarre acidi nucleici da varie fonti
- Procarioti - Eucarioti (tessuti animali, tessuti vegetali) - Virus - Organelli (mitocondri e cloroplasti), - Liquidi biologici
-Organo intero, tessuto, colture cellulari, sangue - foglie, radici, semi
ISOLAMENTO ACIDI NUCLEICI
Tipo di acido nucleico: ssDNA, ds DNA, RNA totale, mRNA rRNA, tRNA
Risultato desiderato: quantità, purezza, tempo richiesto
Applicazione: - Digestione con ER - Clonaggio, - Marcatura - Ibridazione - PCR ecc
METODO DI ESTRAZIONE TRADIZIONALE
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
Inizialmente tutte le particelle dell’omogenato sono distribuite
uniformemente nel tubo da centrifuga
Centrifughe successive, variando i tempi e velocità di centrifugazione si possono
separare particelle che differiscono in dimensione e
densità
separazione sovranatante da pellet
L’estrazione di acidi nucleici dai vari materiali biologici procede in diverse fasi
1- Rottura e lisi cellulare 2- Allontanamento delle membrane 3- Allontanamento lipidi, proteine e carboidrati (Estrazione
fenolica) 4- Estrazione eterea (per allontanare il fenolo) 5- Allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo) 6- Precipitazione alcoolica e purificazione A.N. 7- Dosaggio.
1- ROTTURA DELLE CELLULE
Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter). Vibrazioni ultrasoniche Congelamento/scongelamento Scoppio delle cellule per shock osmotico Agenti litici responsabili della lisi cellulare
Metodi di lisi cellulare
Tecnica Applicazione Metodi non meccanici
Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali
Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri
Enzimi litici Cellule animali e vegetali
Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti
Sfere di vetro Batteri e funghi
Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali
Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati
Ultrasonicazione Microorganismi
La LISI CELLULARE può avvenire in due modalità:
1- Lisi blanda Triton e lisozima ( piccoli pori nella membrana).
Isolamento DNA plasmidiale mentre il DNA cromosomiale rimane attaccato alla membrana interna;
Detergenti anionici quali SDS (membrane Frantumate). Isolamento acidi nucleici totali (DNA
cromosomiale, mRNA, rRNA, tRNA ecc) . 2- Lisi spinta
2. ALLONTANAMENTO DELLE MEMBRANE
centrifugazione che permette la Separazione di due fasi
- una superiore (sopranatante) che contiene gli acidi nucleici in soluzione
- una inferiore (pellet) che comprende membrane e frammenti cellulari.
3. ALLONTANAMENTO PROTEINE
Sodio Dodecil Solfato (SDS).
Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura secondaria e, se costituite da subunità, si dissociano
Enzimi proteolitici: pronasi e proteinasi K. PRONASI: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici, di cui due endopeptidasi (serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi (carbossi e ammino-petidasi). PROTEINASI K: endopeptidasi aspecifica molto attiva.
Cloroformio-alcool isoamilico. Le proteine formeranno un gel all’interfase cloroformio-acqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione
3. ALLONTANAMENTO PROTEINE
FENOLO
IL FENOLO si lega al core delle proteine causando denaturazione
- DNA si usa fenolo a pH basico (che inibisce le DNAsi).
- RNA si utilizza fenolo a pH acido (che inibisce le RNAsi) .
Si aggiunge un egual volume di fenolo al sopranatante che diventa lattescente dopo agitazione. Quindi si centrifuga.
Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:
1) superiore che contiene la soluzione di acidi nucleici;
2) interfase di proteine denaturate; 3) inferiore fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche
di aminoacidi idrofobici
4. ESTRAZIONE ETEREA
Trattamento surnatante con etere per allontanare eventuali residui di fenolo
Dopo centrifugazione l'etere localizzato nella parte superiore del tubo viene allontanato.
La soluzione risultante costituisce la miscela di acidi nucleici.
5. ALLONTANAMENTO DI DNA O RNA
E' possibile a questo punto eliminare uno dei due componenti: RNA previo trattamento con ribonucleasi (RNAsi) DNA con l'uso di desossiribonucleasi (DNAsi)
La RNAsi viene usata per eliminare l’RNA in preparazioni di DNA; la DNAsi viene usata per eliminare il DNA che contamina le preparazioni di RNA
6. PURIFICAZIONE A.N.
La fase finale dell'estrazione è costituita dalla precipitazione alcolica
DNA è miscelato con 2 volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti e viene lasciata precipitare a –80°C.
Tale precipitazione è fortemente dipendente dal raggiungimento di una massa critica. Per soluzioni a concentrazioni <10µg/ml è opportuno
aggiungere un carrier: t-RNA di lievito.
LAVAGGIO DEL PELLET
Dopo centrifugazione, i pellet di DNA vanno lavati in etanolo 70° e ricentrifugati. Tale lavaggio allontana i sali, insolubili in tale solvente, ma non è in grado di allontanare il cloruro di sodio
RISOSPENSIONE DELL’A.N
Il pellet dopo essiccazione, viene risospeso in un tampone a bassa forza ionica, in genere TE (Tris-EDTA) a pH 7.6 - 8.0
L'acido nucleico può quindi essere dosato ed essere utilizzato per ulteriori procedure quali digestione con
endonucleasi di restrizione, marcatura
DOSAGGIO DELL’A.N
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ • Questa tecnica sfrutta un gradiente di densità del mezzo per separare le particelle : • ZONALE (centrifugazione in base alle dimensioni delle particelle es: ribosomi) • ISOPICNICA (centrifugazione in base alla densità delle particelle es:DNA) • Il gradiente di densità del mezzo aumenta dall'alto verso il fondo del tubo. • Substrati maggiormente utilizzati sono il Saccarosio o metalli pesanti (Cloruro di cesio o di litio)
TIPI DI GRADIENTE
• DISCONTINUI la densità del mezzo cresce dall’alto verso il basso in maniera discontinua attraverso una serie di soluzioni di differente densità che vengono stratificate l’una sull’altra.
• CONTINUI quando la densità del mezzo cresce continuamente lungo il tubo da centrifuga
UTILIZZO DEI KIT (in soluzione o su colonna di silice)
Sistemi di Isolamento e separazione degli acidi nucleici disponibili in commercio
• I Kit per l’estrazione degli acidi nucleici hanno il vantaggio di fornire reagenti standardizzati e di qualità garantita dando così un elevato grado di affidabilità
• L’Estrazione automatizzata mediante strumenti consente di estrarre il DNA senza alcun intervento manuale (circa 45’)
KIT DI PURIFICAZIONE
Molti prodotti commerciali garantiscono facilità d’uso riproducibilità ed elevato livello di purificazione. Si basano
essenzialmente sull’utilizzo di
.Kit per estrazione in soluzione •Resine a scambio ionico (scambiatori anionici come la DEAE cellulosa) •Matrici silicee •Gel filtration •Ultrafiltrazione
scambiaredamolecolacontroioneescambiator
OOCR'Cl........NR4 +−+
scambiatoionelegatomolecolareione
−+
+ ClOOCR'....NR 4
Matrici silicee
Legame acidi nucleici e particelle della matrice in presenza di sali caotropici, (tiocianato della guanidina GuSCN) .
NO legame a sostanze contaminanti
ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE
Lavaggi ed eluizione degli acidi nucleici con tamponi a basso contenuto in sali
Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell’estrazione di DNA da cellule o tessuti
DNA Omegenizzazione di cellule/tessuti 4°C
Lisi cellulare:detergenti/lisozima
Agenti chelanti: EDTA/citrato
Agenti proteinasici:proteinasi K
Lisi parete
Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio
Purificazione
Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %
Risospensione del DNA: Tampone TE (Tris -EDTA pH 8)
Conservazione del DNA: 4 / -20 / -80 °C
DNasi (ioni metallici) sono termolabili, facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave RNasi (no cofattori) resistono a trattamenti drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono attive entro un ampio range di pH.
ESTRAZIONE DELL’RNA
Vincere la battaglia con le RNasi
Fonti di RNasi in laboratorio
Tamponi e soluzioni di uso comune
Presenza di batteri o altri microrganismi che rilasciano i loro enzimi; autoclavarli NON inattiva le RNasi, anzi può introdurle nei reagenti.
lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e cellulari
batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie delle soluzioni, portando con sè RNasi
Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensato soluzioni di RNasi
E’ importante quindi
Dividere le soluzioni in piccole aliquote Utilizzare plastica garantita RNasi-free Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C
Indossare sempre guanti e cambiarli spesso
Mantenere un’area di lavoro separata, dedicata all’RNA
Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi
Potenti agenti denaturanti • Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato) • 2-mercaptoetanolo
• Temperatura (Ghiaccio)
Sostanze deproteineizzanti
fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K
RNase inhibitor Proteine che legano covalentemente le RNasi inibendo il 90% dell’attività. Legame reversibile (inibitore mantenuto attivo)
soluzioni contenenti agenti fortemente denaturanti, come SDS o urea, mantenendo un ambiente riducente e la temperatura < 65°C.
EVITARE
Composti contenenti gruppi amminici primari, come il Tris reagiscono con il DEPC; di conseguenza, le soluzioni devono essere preparate sciogliendo il Tris in acqua DEPC già trattata ed autoclavata.
Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi
DEPC (dietilpirocarbonato): agente alchilante che reagisce con le proteine attaccando gli azoti imidazolici dei residui istidinici, con perdita dell’attività enzimatica
Inattivazione RNasi alla conc. dello 0,1% INATTIVAZIONE IN AUTOCLAVE
ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE Metodo del fenolo acido-guanidina tiocianato
Si procede quindi alla precipitazione alcolica in presenza di cloruro
di litio, ammonio acetato o sodio acetato
PRINCIPIO il DNA passa nella fase organica se il fenolo è tamponato con una soluzione a pH acido 5-6, mentre l’RNA rimane
nella fase acquosa
metodo non adatto per gli mRNA batterici
ISOLAMENTO DELL’mRNA
mRNA eucariotici presentano la coda di poliA all’estremità 3’.
Ibridazione con sequenze sintetiche di oligo(dT)
• La preparazione di RNA totale è fatta passare attraverso una colonna costituita da un polimero ricoperto con oligo(dT).
• Solo l’mRNA polidanilato ibriderà con l’oligo(dT), mentre le altre specie verranno eliminate mediante lavaggi con tamponi a bassa concentrazione salina.
• L’eluato finale sarà costituito dalla miscela di tutte le specie di mRNA presenti nella cellula al momento dell’estrazione.
ISOLAMENTO DELL’mRNA
Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell’estrazione di RNA da cellule o tessuti
RNA Trattamento dei reagenti con inibitori delle RNAsi (DEPC DietilPiroCarbonato)
Omegenizzazione di cellule/tessuti 4°C
Lisi cellulare: detergenti/lisozima
Agenti proteinasici:proteinasi K
Lisi parete
Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio Purificazione
Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %
Risospensione e conservazione dell’RNA a -80°C
Solventi per RNA: Guanidina tiocianato
E' possibile dosare gli acidi nucleici con: 1) Metodo Spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto)
2) Metodo Fluorimetrico 3) Metodo Colorimetrico (spettroscopia nel visibile)
Dosaggio degli acidi nucleici
acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo alla lunghezza d'onda di 260 nm.
METODO SPETTROFOTOMETRICO
Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, per cui è caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA.
la frazione della luce incidente che viene assorbita da una soluzione ad una determinata λ è proporzionale a: -concentrazione della specie assorbente -spessore della soluzione (cammino ottico) determinazione assoluta, che si basa sulla relazione esistente tra concentrazione e assorbanza.
Log I0/I = ε c λ
I0 è l’intensità della luce incidente I : intensità della luce trasmessa ε :coefficiente di estinzione molare (l’assorbanza di una soluzione 1M della sostanza in esame quando viene letta in una cuvetta con percorso ottico uguale ad 1 cm, ad una determinata lunghezza d’onda) c : concentrazione della specie assorbente (moli/l) λ : percorso ottico (cm)
LEGGE DI LAMBERT-BEER
L’espressione Log I0/I viene detta assorbanza (A) o densità ottica (OD).
Coefficiente di estinzione specifico K, anziché il coefficiente di estinzione molare
L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce
c = A/ ε λ Se λ = 1 cm c = A /ε
Il coefficiente di estinzione molare ε dipende da:
-la natura chimica del composto -il solvente -la lunghezza d’onda
Il coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1M e a cammino ottico unitario
K esprime l’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1mg/ml alla λ di 260 nm K = 21 per il DNA nativo a doppio filamento K = 23 per il DNA denaturato a singolo filamento K = 25 per l’RNA
Quindi: C (mg/ml) = A / K
Il coefficiente di estinzione molare degli acidi nucleici è la somma dei coefficienti di estinzione molare di ciascun nucleotide. È impossibile calcolare questa somma per tutti i nucleotidi, quindi è usato un coefficiente di estinzione molare medio che è: 50 (µg/ml)-1 cm-1 per il DNA a doppio filamento 40 (µg/ml)-1 cm-1 per l’ RNA Quindi: 1 A260 di DNA a doppio filamento = 50 µg/ml
1 A260 di RNA = 40 µg/ml
oppure
Preparazioni pure di DNA hanno valori di A260/A280 uguali a 1,8
Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali 2
DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA
Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della preparazione degli acidi nucleici
Assorbanza a 230 nm contaminazione del campione dovuta a carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici
Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2
Il dosaggio fluorimetrico è un dosaggio di tipo RELATIVO.
• Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleico vengono caricate su un gel accanto al campione a concentrazione incognita.
• Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione di Etidio Bromuro che si intercala tra le basi d e l l ' a c i d o n u c l e i c o r e n d e n d o l o fluorescente alla luce UV.
la quantità di DNA nella banda del campione è stimata
confrontando la fluorescenza delle bande della serie standard
METODO FLUORIMETRICO
Concentrazione acidi nucleici stimata in base alla fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.
La quantità fluorescenza emessa da ciascuna banda
osservata, è proporzionale alla massa del DNA presente nella
banda stessa,
METODO COLORIMETRICO
Orcinolo per l’RNA
Difenilammina per il DNA
Formazione di complessi colorati di particolari sostanze con il ribosio o con il deossiribosio dello scheletro degli acidi nucleici
Valuta esattamente la quantità di DNA o RNA presenti in soluzione, anche se la soluzione contiene entrambi gli acidi nucleici.
L’intenso colore verde-azzurro, che si produce al termine della reazione, consente il dosaggio colorimetrico dell’RNA a 660 nm. Per il dosaggio, è necessario costruire una retta di taratura con
soluzioni di RNA a concentrazione nota e crescente.
Saggio con l’orcinolo per il dosaggio dell’RNA
Si basa sul dosaggio del ribosio attraverso la liberazione del furfurale che si ottiene per riscaldamento del ribosio in ambiente contenente acido cloridrico concentrato L’RNA in HCl concentrato, subisce dapprima depurinazione e successivamente i ribosi fosfati ottenuti defosforilati e deidratati per produrre furfurale. Quest’ultimo si condensa con l’orcinolo dando origine ad un complesso stabile e colorato.
Saggio con la difenilammina per il dosaggio del DNA
Si basa sul dosaggio del deossiribosio che, resosi libero in ambiente acido, viene convertito in ω−idrossilevulinilaldeide che con la difenilammina dà luogo ad una colorazione blu. Campioni contenenti DNA vengono incubati in acido perclorico. In queste condizioni il DNA è depurinato, viene rilasciato deossiribosio e convertito a ω- idrossilevulinilaldeide. Si legge l’Assorbanza a 750 nm e a 595nm. 595 nm = max assorbanza del complesso 750 nm si leggono le impurezze, per cui tale lettura va sottratta a quella a 595 nm.
Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)
Analisi acidi nucleici
Analisi di acidi nucleici
• Elettroforesi su gel di agarosio
• Elettroforesi su gel di poliacrilammide
• Elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis)
Elettroforesi: separazione di molecole di RNA/DNA in base alla dimensione
Elettroforesi su gel di agarosio
Apparato elettroforetico
Elettroforesi su gel di agarosio
Effetto setaccio del gel di agarosio
L’agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L galattosio.
PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO
Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb
Concentrazione di agarosio
0.8% : 0.5 – 20 kb 2% : 0.1 – 3 kb Risoluzione
Come si prepara un gel d’agarosio
Etidio Bromuro (EtBr):
colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E’ utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l’intensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in
basi)
Fattori che influenzano la migrazione
• Peso molecolare
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA
• Voltaggio applicato
• Intercalanti • Tampone di elettroforesi
Marcatori di peso molecolare
λ HindIII
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI
Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa
elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano
DENATURAZIONE RNA
Agenti denaturanti comunemente usati:
ü calore, ü formaldeide, ü formammide, ü urea
SEPARAZIONE IN GEL D’AGAROSIO DI MOLECOLE DI RNA IN CONDIZIONI DENATURANTI
La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel.
Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide
ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Ø La PAGE in presenza di SDS (buffer) è il metodo di più largo impiego per l’analisi qualitativa di miscele di proteine
Ø Separazione di frammenti minori di 1 kb
Ø Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)
Formazione di un gel di poliacrilammide
ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Spessore del gel 0,4-1,5 mm
Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore
dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante
acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Risoluzione: 20 - 1000 nucleotidi
SDS-PAGE
Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE)
Carica Massa
+3 30kD
-4 42kD
SDS Carica Massa
-300 30kD
-420 42kD
§ Le molecole di SDS si legano alle proteine § Le proteine perdono la loro normale forma § Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa § Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni
SDS-PAGE SDS (Sodio Dodecil Solfato)
• Solubilizza e denatura le proteine
• Aggiunge cariche negative alle proteine
O S O
O
O
-
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
SDS
Proteina Nativa Carica netta: -4
Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)
SDS-PAGE
Colorazione con Blu di Coomassie
acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
+
–
Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8
ü Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica
• Inclusione di un marker di peso molecolare colorato • 10-50ug di estratto proteico totale • 0.1-1ug di proteina purificata
ü Ioni Cloruro (-) / Proteina/Glicina(+)
ü Si muovono verso il gel separatore (“resolving”)
• Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore
Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda)
Coomassie staining Silver staining
VISUALIZZAZIONE DELLE PROTEINE NEL GEL
I due metodi piu’ usati sono:
ENZIMI DI RESTRIZIONE ED ANALISI RFLP
ENZIMI DI RESTRIZIONE enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze:
1. Le esonucleasi (estremità libere)
2. Le endonucleasi (legami interni)
Endonucleasi Esonucleasi
Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali riconosce una sequenza particolare.
ENZIMI DI RESTRIZIONE
• Enzimi batterici capaci di tagliare molecole di DNA in posizioni specifiche
• Fenomeno della restrizione-modificazione controllata dalla cellula ospite
ANNI ’50: preparazione di batteriofagi cresciuta in E.coli non pienamente infettante per E.coli di un altro ceppo ANNI ’65: si scopre che il DNA fagico preparato in E.coli (c) è degradato una volta entrato nel ceppo K che restringe i fagi prodotti in E.coli (c).
10 anni dopo: nel fago resistente alla degradazione presenza di basi metilate
La degradazione del DNA del fago è dovuta all’esistenza di un sistema di restrizione modificazione controllato dalla cellula ospite
per proteggersi dall’introduzione di sequenze di DNA esogeno
SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE
Contengono due componenti:
-ENDONUCLEASI di restrizione: taglia il DNA a livello di una specifica sequenza (no metilazione).
-DNA metilasi: modifica mediante metilazione specifiche basi nella sequenza riconosciuta dall’endonucleasi di restrizione
E. coli degrada DNA esogeno Taglio in siti specifici
SISTEMA MODIFICAZIONE
Metilazione DNA endogeno
NO TAGLIO
ENZIMI DI RESTRIZIONE
1970 Isolamento enzima restrizione dal ceppo Rd del batterio Haemophilus influenziae (HindII)
5’- GT(T/C) (G/A)AC -3’ 3’- CA(A/G) (C/T)TG -5’
L’enzima non era in grado di tagliare il genoma di H. influenziae ma era capace di tagliare in oltre 40 punti il genoma del fago T7.
1972 Isolamento enzima di restrizione EcoRI dal ceppo RY13 di E. coli,
5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’
SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE EcoRI
Sistemi di restrizione-modificazione
enzimi di classe I:
Restrizione e metilazione casuale nella stessa molecola lontano dai siti di riconoscimento
enzimi di classe II:
Restrizione e metilazione su molecole distinte, elevata specificità di taglio a livello o vicino al sito di
riconoscimento
enzimi di classe III
Restrizione e metilazione condividono una subunità comune, tagliano lontano dal sito di riconoscimento
(a 24-26 pb rispetto al sito di riconoscimento)
•Sequenza di taglio se ruotata è simmetrica (palindromo)
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’
•Il sito palindromico puo’ essere continuo o interrotto (es. BstII taglia la sequenza 5’GGNACC 3’).
•Sequenze lunghe 4, 6 o 8 pb •Nomenclatura: genere e specie del batterio dal cui è isolato l’enzima di restrizione:
EcoRI da Escherichia coli, ceppo R
Hind III da Haemophilus influentiae ceppo Rd
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
Gli enzimi di restrizione di tipo II riconoscono sequenze specifiche che tagliano con tre diverse modalità : • Generando estremità piatte (blunt) • Generando estremità sporgenti al 5' (5' protuding) • Generando estremità sporgenti al 3' (3' protuding)
Le estremità sporgenti al 5' e al 3’ sono definite estremità coesive o appiccicose (sticky) perché potranno legarsi con
sequenze di basi complementari (estremità compatibili)
Taglio degli Enzimi di restrizione di tipo II
Estremità appiccicose
ISOSCHIZOMERI
Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza e tagliano allo stesso modo
MboI e Sau3A 5’-GATC-3’
NEOSCHIZOMERI
Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza ma tagliano in modo diverso
XmaI e SmaI 5’-CCCGGG-3’
Enzimi di restrizione compatibili
Enzimi che pur riconoscendo sequenze diverse, producono estremità appiccicose compatibili:
BamHI
5’- GGATCC - 3’ 5’- G - 3’ 5’- GATCC - 3’
3’- CCTAGG - 5’ 3’- CCTAG - 5’ 3’ - G - 5’
BglII
5’- AGATCT - 3’ 5’- A - 3’ 5’- GATCT- 3’
3’- TCTAGA - 5’ 3’- TCTAG - 5’ 3’- A - 5’
Ligazione estremità BamHI+BglII:
5’- GGATCT - 3’ 3’- CCTAGA - 5’
Modificazioni delle estremità coesive
Frequenza di taglio degli enzimi di restrizione
La lunghezza della sequenza di taglio determina la frequenza media di taglio di una molecola di DNA Assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa e che la distribuzione delle 4 basi che compongono il DNA sia casuale
in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 di trovare una delle quattro basi.
La frequenza di taglio è uguale a 1/(4)n (n = al numero di nucleotidi del sito di riconoscimento)
Es. AluI: AGCT frequenza = 1/44 = 1/256 pb EcoRI: GAATTC frequenza = 1/46 = 1/4096 pb
ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
.
CCC/GGG GGG/CCC
GAT/ATC CTA/TAG
SmaI EcoRV
CCC GGG
ATC TAG
la sequenza ibrida che si forma non e’ riconosciuta da nessuno dei due enzimi
Estremità blunt Estremità blunt differenti +
NO complementarietà
Ligasi meno efficiente SVANTAGGIO:
Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici
L’Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
frammenti di DNA di dimensioni diverse
Enzimi di restrizione singoli o in combinazione
mappa dell’acido nucleico