estrutura tridimensional das proteinas (2)
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Estrutura tridimensional das
proteinas
-
Talvez as caractersticas mais notveis (mioglobina) sejam
a sua complexidade e ausncia de simetria, Nature,1958
John Kendrew
-
Kendrew & Perutz
PN 1962 pelos estudos de estruturas de
protenas globulares
-
Protein Data Bank (PDB)
(www.rcsb.org./pdb)
PDB ID coordenadas
+
programas
desenho molecular (p.e. RasMol
e Chime)
Estrutura tridimensional da
protena
-
1920s vrias protenas cristalizadas p.e.
urease (MM 483 000)
hemoglobina (MM 64 500)
-
Estrutura tridimensional determinada pela sequncia de res. de aa?
A estrutura determina a funo ?
Uma protena tem uma ou poucas formas estveis
Importantes p. a estr. trid. so apenas as ligaes
no covalentes
Existem padres estruturais comuns
Conformao: arranjo espacial dos tomos
numa protena (nativa)
-
Flexibilidade estrutural (lig. no covalentes)
Mltiplos estados conformacionais (necessrios p.
funo, ligao)
-
Estabilidade = tendncia para manter conf. nativa
G entre estados fold e unfold (cond. fisiol.) 20-65 kJ/mol i.e.
um polipptido pode terica/assumir um n de conformaes elevada entropia conformacional
elevada entropia conformacional + lig. H com gua unfold mantido
-
Ento porque acontece o fold?
S-S e interaces no cov. entre cadeias (H, inicas
e hidrfobas)
Estabilizao da conform. nativa
-
Pauling PN 1954 (Q)
PN 1962 (Paz)
Stop the war!
Pauling props em 1950 o primeiro modelo
aceitvel para a molcula de protena!
A ligao peptdica (nvel primrio de estrutura)
1930
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Terminal N
Terminal
C
Lig simples-1.47
Lig dupla-1,20
-
Os tomos e os planos definem
o ngulo
-
Os ngulos so 0 para que as lig.
peptdicas no
sejam coplanares
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(graus)
(graus) Grfico de Ramachandran
para L-Ala
-
Nvel secundrio de
estrutura (geometria local)
hlice e conformaes (previstas por Pauling e Corey, 1951)
hlice a mais comum
-
N
C
-
Hlice esquerda
Hlice direita
-
Glu , Ala, Leu, Met H
Ile, Lys, Gln, Trp, Val, Phe h Pro, Gly B
-
N
C
- hlice clssica de Pauling-Corey-
Branson
-
Tipos de constrangimentos que afectam
estabilidade da -hlice:
Repulso (ou atraco)de cargas entre R sucessivos
A dimenso de R adjacentes
Interaces entre R distanciados 3-4 res.
Pro ou Gly
Interaces do res. terminal com o dipolo da hlice
-
Mioglobina
(153res.)
79% - hlice
Insulina
(51res.)
52% - hlice
Citocromo c
(104res.)
39% - hlice
Algumas protenas
globulares
-
Conformao (folhas pregueadas ) tambem previstas por Pauling e Corey;
confirmadas por difraco raios X
Vista lateral
Vista de cima
antiparalela
paralela
-
Tyr, Val, Ileu H
Cys, Met, Phe, Gln, Leu, Thr, Trp h
Pro, Glu, Asp B
-
Dobras ou turns (elementos de ligao)
Tipo I Tipo II
Gly
Prol
Estruturas random ?
-
turns.
Pro
6% cis
-
(graus)
(graus)
Grfico de Ramachandran
folhas
pregueadas antiparalelas
folhas
pregueadas
paralelas
tripla
hlice de
colagneo
-hlice esquerda ??
-hlice direita
folhas pregueadas enroladas direira
-
(graus)
(graus)
Ramachandran para piruvatocinase de msculo coelho
-
Estr.sec.
hl.
%
n
segm
folha
%
folha
n
segm.
dobras
n
anidrase
carbnico
20 7 37 13 4
carboxipeptidase 38 9 17 8 13
cit C 39 5 0 0 6
insulina 52 3 6 1 0
mioglobina 79 8 0 0 6
A ferredoxina Pseudomonas Aeroginosa
no tem nenhuma estrutura sec. caracterizada!
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NVEL SECUNDRIO E PROPRIEDADES DE PROTEINAS FIBROSAS
Estrutura caractersticas exemplo
- hlice dureza e flexibilidade -queratina do cabelo
l.cruz e S-S variavel penas, unhas..
conformaes filamentos flexveis fibrona da seda
tripla hlice rgida e no flexvel colagneo dos tendes
de colagneo e matriz ssea
-
-queratina (cabelo)
-hlice
2 cadeias enroladas
para a
esquerda
protofilamentos
protofibrila
-queratina - estrutura complexa (IF-filamentos intermedirios) e mal estudada!
-
Seco de cabelo
clulas
filamento
intermedirio
protofibrila
protofilamento
2 cadeias
coiled coil
-hlice
Um cabelo um conjunto de
mltiplos filamentos de -queratina
-
Nas regies de proximidade das 2 hlices
Ala, Leu, Ileu, Phe, Met, Val - i. hidrfobas (packing)
superhlice esquerda
Nvel quaternrio da -queratina?
-
red. oxid.
-
Ex2: colagneo PDB ID 1CGD
Hlice esquerda de prolinas(3res/volta)
3
Gly
GlyXPro
GlyX4-Hyp
-
seco da
molcula de
colagneo
cabeas da
molcula de
colagneo
Estrutura das fibrilas
de colagneo
zonas
cruzadas(64nm)
Mr 300 000
3 000 /15
-
seco da
molcula de
colagneo
cabeas da
molcula de
colagneo
Estrutura das fibrilas de
colagneo
Tendo-100% colag.
Cartilagem-colag.
embebido em matriz
poliosdica
Osso-matriz colag.
cimentada por
depsitos de
Ca10(PO4)6(OH)2
zonas
cruzadas(64nm)
-
seco da
molcula de
colagneo
cabeas da
molcula de
colagneo
Estrutura das fibrilas de
colagneo
Tendo-100% colag.
Cartilagem-colag.
embebido em matriz
poliosdica
Osso-matriz colag.
cimentada por
depsitos de
Ca10(PO4)6(OH)2
zonas
cruzadas(64nm)
Nos vertebrados
h muitos tipos
de colagneo
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seco da
molcula de
colagneo
cabeas da
molcula de
colagneo
Estrutura das fibrilas de
colagneo
Tendo-100% colag.
Cartilagem-colag.
embebido em matriz
poliosdica
Osso-matriz colag.
cimentada por
depsitos de
Ca10(PO4)6(OH)2
zonas
cruzadas(64nm)
Colag tpico:
35% Gly
11%Ala
21% Pro(Hyp)
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seco da
molcula de
colagneo
cabeas da
molcula de
colagneo
Estrutura das fibrilas de
colagneo
Tendo-100% colag.
Cartilagem-colag.
embebido em matriz
poliosdica
Osso-matriz colag.
cimentada por
depsitos de
Ca10(PO4)6(OH)2
zonas
cruzadas(64nm)
Cross-links
invulgares entre
Lys, 5-HyL ou
His (X)
-
O tecido conjuntivo envelhecido
(rgido e quebradio) resulta de
desses cross-links nas fibrilas de colagneo.
-
Vitaminas grupo de pequenas molculas nutrientes essenciais para muitos organismos
multicelulares (humanos em particular).
vitamin = vital amine
-
Vitaminas grupo de pequenas molculas nutrientes essenciais para muitos organismos
multicelulares (humanos em particular).
vitamin = vital amine
Walter Norman
Haworth
PN 1937(Q)
Paul Karrer
PN 1937(Q)
for his work in determining
the structure
of ascorbic
acid
for his work on Vitamins
Albert Szent-Gyrgyi
PN 1937(M)
for his studies of the biological functions of L-ascorbic acid
-
desidroascorbato
cido
ascrbico
monodesidroascorbato
Tartarato
+ oxalato
Superxido, H2O2 ,radical
tocoferol Monodesidro
ascorbato
redutase
Desidroascorbato
redutase
Em plantas:
Ascorbato existe no cloroplasto (20-
40%), citosol, vacuolo e em
compartimentos extracelulares.
Vitamina C
Tratado sobre escorbuto
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20% dos mamferos no sintetisam Vit C
A China fornece 80% da Vit C mundial
Dose discutvel:
-
prolil 4-hidroxilase
resduo Pro -oxoglutarato succinato resduo 4-Hyp
-oxoglutarato ascorbato succinato ascorbato oxidado
prolil 4-hidroxilase
-
Importncia do ascorbato:
1. Reaco dependente do ascorbato (formao do colagneo)
-cofactor
2. Antioxidante (ROS)/envelhecimento e cancro
3. Nas plantas substrato do ascorbato peroxidase
-
Outras conformaes ricas em Pro ?
Sequncias de poliprolinas (trans) formam
hlices esquerdas com 3res/volta- docking sites
em locais de reconhecimento
p.e. em vias de transduo de sinal
-
Ex3: Fibrona da seda (artrpodes como alguns insectos e
aranhas)
c. lat. Ala c. lat. Gly
-
Gly
Ala
folhas antiparalelas
No extensvel
Flexvel
-
Protenas globulares-diversidades
estrutural vs diversidade funcional
Conformao
Hlice
Forma globular
nativa
albumina srica humana (MM 64 500) / 585 res./1 cadeia
Compacta e variada
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Nveis de estrutura tercirio e quaternrio
Nvel tercirio: arranjo tridimensional global
Globulares e fibrosas
Vrios segmentos de estr.sec.
um tipo de estr.sec.
protenas fibrosas: relao estrutura-funo -queratina (cabelo, penas, unhas, cornos, l, pele, carapaa tartaruga)- Flexibilidade e rudeza variveis-funo estrutural
-
PDB ID 1MBO
Ex1: mioglobina MM 16 7000
(baleia)
Cadeia nica com 156
resduos + heme
Msculo
Funes:
Transporte e armazenamento de O2 Difuso facilitada de O2 (contraco
muscular)
Nvel tercirio de algumas
protenasglobulares
-
res. hidrfobos Leu, Ile, Val, Phe
A maior parte dos res.
hidrfobos no interior Compacta
Interior hidrfobo
4 H2O no interior
70% hlice
-
Hemoglobina
Mioglobina
Citocromos
Outras protenas hemticas
O grupo heme
-
Outras protenas globulares
(nvel tercirio)
Citocromo c
Heme
ligado covalente/
40% hlice sem folhas
PDB ID 1CCR
Componente da
c.t.e mitocondrial;
MM 12 400
~100res.; 1 cadeia
-
Lisozima PDB ID 3LYM
Cadeias laterais
do c.a.
4 S-S
40% hlice algumas folhas
MM 14 600;129 res.;
clara de ovo;
lgrima humana;
catalisa a hidrlise
de polisidos de
algumas paredes
bacterianas(agente
bactericida)
-
Ribonuclease PDB ID 3RN3
hlice muitas folhas 4 S-S
MM 13 700;
124res.; produzido
no pncreas e
activo no int. delg.
-
Mioglobina + cit c + ribonuclease + lisozima=
pequenas protenas (nvel tercirio)
volume
vol./rea
i.hidrfobas i.inicas
Pequenas protenas necessitam de ligaes
covalentes para estabilizar conformao
-
% aproximada de hlices e estruturas nalgumas protenas globulares de cadeia nica
resduos
hlice conformao Protena (n resduos)
quimotripsina
ribonuclease
carboxipeptidase
citocromo c
lisozima
mioglobina
Comum
i.hidrfobas no interior grupos hidrfilos no exterior muitas lig H algumas i. Inicas
-
Interaco inica
Ligao persulfureto
Ligao de H
Interaces hidrfobas e
de van der Waals
Cadeia
polipeptdica
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Protenas globulares grandes
Estruturas supersecundrias (motivos ou folds ?)-
arranjos estveis de elementos de estruturas sec.
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Motivos com ligaes tpicas (chave grega)
Motivos com ligaes crossover (no observado)
Proteina toxina Antrax
Factores de transcrio (zink finger)
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Domnio-unidade estrutural estvel (~100res.) -estvel mesmo separado do resto da protena
(p.e.clivagem hidroltica)
-
Domnio-unidade estrutural estvel
(25-500 res.)
-estvel mesmo separado do resto da protena
(p.e.clivagem hidroltica)
ou
regio compacta da estrutura
que mtas vezes constituda por
segmento contnuo
da sequncia
Piruvato cinase
Protenas
quimricas
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Troponina C (PDB ID 4TCN)
Alguns domnios so suficiente/ estveis para
existirem autnomos em meio aquoso
(prova-clonagem e expresso do domnio)
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Domnio de hemolisina de Staphilococcus aureus (toxina
que forma poros na membrana
da clula-alvo)
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Rossman fold
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Classificao de protenas com base na estrutura (Structural classification of proteins SCOP -base de dados)
Classes:
s estruturas (ex: citrato sintase)
s estruturas (ex: quimotripsina)
/ (interseptam-se ou ) (ex: cinases e desidrogenases; fosfato de triose isomerase e fosfogliceromutase)
+ (separadas) (ex: termolisina, lisozima, ribonuclease)
(Alguns autores consideram este grupo como subgrupo do ant.)
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Discovery consists of seeing what everybody has seen
and thinking what nobody has thought
Albert Szent-Gyorgi (1893-1986)
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Protenas multidomnio tero evoludo provavel/ a
partir de fuso de genes
O n de domnios no ser ilimitado (alguns milhares)=
domain folds
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A protena seria descrita pelos
domnios que a constituem e pelo
modo como eles se ligam
(interactuam)
Arranjo topogrfico
de elementos de
estruturas sec.que
caracterizam um
domnio
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a protena seria formada de mdulos :
idntica combinao
idntica conformao?
idntica funo?
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Nvel
quaternrio
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Hemoglobina (Mr 64 500; 2 cadeias - 2x141 res.+ 2 cadeias - 2x146 res.) Tetrmero 22 ou dmero ()2
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Perutz e Kendrew-estr.
tridimensional da hemoglobina,
1959
PN 1962-estrutura das
protenas globulares
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Homodmero a2
Heterodmero ab
Heterotetrmero a2b2
Heteropentmero a2bcd
Multmeros(subunidades=
protmeros)
Regulao
Funes mas
relacionadas (catlise e
regulao)
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Homodmero a2
Heterodmero ab
Heterotetrmero a2b2
Heteropentmero a2bcd
Multmeros(subunidades=
protmeros)
Regulao
Funes mas
relacionadas (catlise e
regulao)
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Simetria rotacional ou helicoidal
Simetria icosadrica Poliovirus:dimetro 300
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Simetria helicoidal
Subunidade
proteica
Virus do mosaico do tabaco:
diam. 180 ; comp. 3 000
-
mais fcil fazer muitas cpias de um
pequeno polipptido do que uma cpia
de uma grande estrutura!
H limite dimenso da protena?
Maior dimenso Maior complexidade funcional
2 factores limitantes:
1. Capacidade codificadora do DNA
Ex: capside do vrus,
citoesqueleto, enzimas (Mr 100 000 mltiplas subunidades)
2. Preciso do processo de traduo
Baixa(??) frequncia do erro:
1 /10 000 res.
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DESNATURAO e FOLDING Desnaturao - perda da estrutura tridimensional perda de funo
1-Calor: agente desnaturante comum maior parte
das protenas (quebra das lig. H ??)
%
sinal
Temperatura C
Ribonuclease A
Apomioglobina
(Por fluorescncia)
mantem S-S
(Por dicrosmo
circular) Curvas deste tipo sugerem cooperatividade!
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Protenas de bactrias termfilas no
desnaturam a 100C e so homlogas de
protenas de E.coli. Porqu?
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Os estados de desnaturao com os diferentes agentes no so idnticos!
A desnaturao pode ser reversvel- certas protenas globulares desnaturadas podem
renaturar i.e. ao regressar s condies iniciais, voltam a
ter actividade.
2- pH (extremos)
3- solventes orgnicos (lcool, acetona)
4- solues (ureia, guanidina HCL)
5- detergentes
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Ex: Ribonuclease purificado Estado nativo;
catalticamente activo
adio de ureia e -mercaptoetanol
remoo de ureia e -mercaptoetanol
Estado desnaturado;
inactivo
Quebra das ligaes S-S
Estado nativo;
catalticamente activo
S-S recuperadas
experincia de
Anfinsen (1950s) confirmada com
ribonuclease
sinttico
PN1972
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Mesmo que cada resduo tenha apenas 2 estados - R e - um pptido com 100 resduos teria 2100 ~ 1030 conformaes possveis. Admitindo que a velocidade de
interconverso entre conformaes ~ 10 -13 seg, o
polipptido de 100 resduos levaria 1030 x 10 -13 ~1017
seg ~ 109 anos. As protenas no podem enrolar ao
acaso e s escuras.
A sntese de uma cadeia polipeptdica um
processo rpido Ex: E.coli faz uma cadeia de 100 resduos em 5 segundos
a 37C
O paradoxo de Levinthal (1968):
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BSE (encefalopatia espongiforme de bovino)
Kuru e Creutzfeldt-Jakob em humano
scrapie em ovinos
Ex: encefalopatias espongiformes
Cortex cerebral
de doente com
Creutzfeldt-Jakob
Folding incorrecto=
patologia
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1960 Tikvah Alper - ausncia de material gentico no agente infeccioso!?
1990 Stanley Prusiner PN 1997 Encefalopatias so doenas diferentes Protena o agente infeccioso PrP MM 28 000
Crebro de mamfero; funo?
PrPc conformao normal
PrPSc conformao modificada
PrPSc
PrPc PrPSc
mecanismo???
mutaes???
efeito domin
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Folding facilitado (para muitas protenas)
Chaperes moleculares-protenas que
interactuam com as cadeias polipeptdicas
permitindo (ou corrigindo) o folding
HSP 70 (heat schock MM 70 000) chaperoninas-complexos proteicos
(na E.coli 20% das protenas precisam de
chaperoninas)
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e ainda PDI (protena persulfureto isomerase)
PPI (peptidoprolil cis-trans isomerase)
+enzimas
+ protenas