estudio de las mutaciones del gen jak2 en pacientes …

ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS

CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL

SEGUIMIENTO

TESIS DOCTORAL

Curso 2009-2010

Autora: Marta Anna Sobas

Directores:

Prof. José Luis Bello López

Prof. Manuel Mateo Pérez-Encinas

FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina

ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS

CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL

SEGUIMIENTO

Marta Anna Sobas

10 de Junio 2010

FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina

D. José Luis Bello López, Profesor Titular de Hematología, Departamento de

Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela,

CERTIFICO

Que la tesis doctoral titulada “ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL

GEN JAK2 EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS

MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y

CLINICA”, presentada por Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi

dirección y considero que reúne las condiciones necesarias para ser defendida

frente al Tribunal correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y

Cirugía.

En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010

Fdo.: Prof. D. José Luis Bello López

D. Manuel Mateo Pérez Encinas, Profesor Asociado de Departamento de

Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela,

CERTIFICO

Que la tesis titulada “ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2

EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS

CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y CLINICA” presentada por

Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi dirección y considero que

reúne las condiciones necesarias para ser defendida frente al Tribunal

correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía.

En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010

Fdo.: Prof. D. Manuel Mateo Pérez Encinas

A mi familia en Polonia y en España

Mojej rodzinie w Polsce i w Hiszpanii

AGRADECIMIENTOS

Al Prof. José Luis Bello López, por haber aceptado la dirección de este proyecto y sobre

todo por su ejemplo personal como Jefe de Servicio de Hematología y Hemoterapia del

Hospital Clínico de Santiago de Compostela, con su dedicación al trabajo ha contribuido a

formarme como hematóloga y como médico.

Al Prof. Manuel M. Pérez-Encinas, por su ayuda en iniciar, proseguir y finalizar este

trabajo. Y sobre todo por su tiempo, paciencia y cariño. Sin su ayuda, la realización de

este trabajo no sería posible.

Al Prof. Radek Skoda (Department of Biomedicine, University Hospital Basel), por

introducirme en el apasionante mundo de anomalías genéticas de las neoplasias

mieloproliferativas, por dejarme participar en alguno de sus proyectos de investigación y

por su amistad.

A Dra. Teresa González López y Dra. Celsa Quinteiro García por sus enseñanzas para no

“perderme” en el mundo de la genética, por su ayuda en el laboratorio de Medicina

Xenómica y sobre todo por su infinita paciencia y apoyo.

Al Dr. Francisco Gude Sampedro, por su paciencia y por su ayuda en esa materia, para mí

tan complicada, que es la estadística.

A todo el personal del Servicio de Hematología y Hemoterapia, médicos, enfermeros,

auxiliares y técnicos de laboratorios, todos en algún momento me han ayudado y animado

a seguir. Pero sobre todo quiero agradecer a los médicos hematólogos y MIR que han

colaborado directamente en el manejo de los pacientes que han sido motivo de análisis, es

decir a Aída Fernández Montero, María Ángeles Bendaña López, María José Rabuñal

Martinez, Natalia Alonso Vence, José Ángel Díaz Arias, María Dolores Vilariño López y

Eugenia Fernández Mellid.

A mis amigos del “Department of Biomedicine” en el Hospital Universitario de Basilea:

Renate Looser, Pontus Lundberg, Franz Schaub, Ralph Tiedt, Hui Hao-Shen, Li Sai por

su desinteresada ayuda en mi aprendizaje de las técnicas del estudio molecular y por su

amistad.

Deseo expresar mi agradecimiento a todos los pacientes diagnosticados de neoplasias

mieloproliferativas crónicas (especialmente a Victoria y a su familia), que han participado

con su consentimiento en este estudio. Sin ellos, nuestro trabajo carecería de sentido.

Por último, mencionar que este trabajo ha sido subvencionado por la beca de la

“Consellería de Sanidade, Xunta de Galicia” (PS08/01), por lo tanto quiero dar las gracias

al tribunal y autoridades administrativas que han confiado en este proyecto.

ÍNDICE

1

ABREVIATURAS 4

I. REVISIÓN DEL TEMA 6

1. Introducción 7

2. Epidemiología y factores pronósticos 8

3. Criterios diagnósticos 10

4. Tratamiento 11

5. Patogénesis 12 5.1. Introducción 12 5.2. Mutación JAK2V617F 13 5.3. Mutaciones del gen MPL 16 5.4. Mutaciones del gen JAK2-exón 12 18 5.5. Relación entre genotipo y fenotipo 19

6. JAK2V617F y clínica 21 6.1. JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 21 6.2. JAK2V617F: la carga alélica 21 6.3. JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica 22 6.4. Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F 23

6.4.1. Secuenciación 24 6.4.2. Pirosecuenciación 24 6.4.3. PCR alelo-específica 25

7. Citogenética convencional 26

8. Alteraciones inmunológicas en /MP 27

II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 28

1. Justificación del trabajo 29

2. Hipótesis de estudio 30

3. Objetivos del estudio 31 3.1. Objetivo general 31 3.2. Objetivos específicos. 31

III. MATERIAL Y MÉTODOS 32

1. Muestra del estudio 33

2. Metodología 34 2.1. Variables del estudio 34

2.1.1. Variables clínicas 34 2.1.2. Variables analíticas 36

2.2 Estudio de las mutaciones 36 2.3 Estudio morfológico de médula ósea 37 2.4 Revisión de los criterios diagnósticos de WHO 38

ÍNDICE

2

3. Procedimientos y técnicas utilizadas 40 3.1. Análisis de la mutación JAK2V617F 40 3.2. Análisis de otras mutaciones en NMP 43

3.2.1. Estudio de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2 43 3.2.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL 43

3.3. Estudio citogenético de la médula ósea 43 3.4. Subpoblaciones linfocitarias 44

4. Análisis estadístico 45

IV. RESULTADOS 46

1. Criterios diagnósticos WHO 49 1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación 49

1.1.1. Grupo con sospecha de PV 49 1.1.2. Grupo con sospecha de TE 50 1.1.3. Grupo con sospecha de MFP 51 1.1.4. Grupo con progresión 51

1.2. Estudio histopatológico de las NMP (WHO 2008) 52

2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en /MP (WHO 2008) 54 2.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 54 2.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg 55 2.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos 56 2.4. Estado JAK2V617F y estudio histopatológico 58

2.4.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 58 2.4.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg 58 2.4.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos 59

3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 60 3.1. Carga alélica JAK2V617F y diagnóstico según WHO 2008 60 3.2. Carga alélica JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre la PV y la TE. Curva ROC. 62 3.3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 64 3.4. Carga alélica JAK2V617F y estudio histopatológico 68

4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica 69 4.1. Seguimiento del grupo JAK2V617F-neg 69 4.2. Seguimiento del grupo JAK2V617F-pos 70

4.2.1. Grupo completo de pacientes. 70 4.2.2. Grupo sin tratamiento citorreductor 72 4.2.3. Grupo con tratamiento citorreductor con HDU 73 4.2.4. Grupo con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos 79 4.2.5. Grupo con progresión de NMP 80

4.2.5.a. Progresión a otra NMP 80 4.2.5.b. Progresión de una NMP a LMA 82

5. /uevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico 83 5.1. Estudio de las mutaciones en el gen JAK2-exón 12 83 5.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL 83

6. Cariotipo y JAK2V617F 85

7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F 87

8. Factores pronósticos y JAK2V617F 89

ÍNDICE

3

8.1. Supervivencia y JAK2V617F 89 8.2. Eventos vasculares y JAK2V617F 90 8.3. Progresión y JAK2V617F 91

V. DISCUSIÓN 92

1. Criterios diagnósticos WHO 93 1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación 93 1.2. Estudio histopatológico de las NMP WHO 2008 94

2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en /MP (WHO 2008) 98

3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 101

4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica 104

5. /uevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico 113

6. Cariotipo y JAK2V617F 116

7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F 117

8. Factores pronósticos y JAK2V617F 119 8.1. Supervivencia 119 8.2. Eventos trombóticos 119 8.3. Progresión a MFsec o LMA 121

VI. CONCLUSIONES 123

VII. BIBLIOGRAFÍA 127

ABREVIATURAS

4

• Alo-TPH: transplante alogénico de progenitores hematopoyéticos

• ANA: anagrelida

• AMO: aspirado de médula ósea

• BMO: biopsia de médula ósea

• ELN: European LeukemiaNet

• EPO: eritropoyetina

• FAL: fosfatasa alcalina leucocitaria

• HDU: hidroxiurea

• INF-α : interferón α

• JAK2V617F-neg: ausencia de la mutación V617F en el gen JAK2

• JAK2V617F-pos: mutación V617F en el gen JAK2

• JAK2-exón 12: mutación en el exón 12 del gen JAK2

• LDH: lactato dehidrogenasa

• Linfocitos NK: linfocitos natural killer

• TNK: linfocitos T con actividad de linfocitos NK

• LMA: leucemia mieloide aguda

• LMC: leucemia mieloide crónica

• MFP: mielofibrosis primaria

• MFsec: mielofibrosis secundaria

• MO: médula ósea

• MPL: gen que codifica el receptor de la trombopoyetina

• NMP: neoplasia mieloproliferativa

• NRh: no respuesta hematológica

• NFg: no respuesta genética (se refiere a la mutación JAK2V617F)

• PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

• Ph-neg: cromosoma Filadelfia negativo

• PV: policitemia vera

ABREVIATURAS

5

• PVSG: Polycythemia Vera Study Group

• RCh: respuesta hematológica completa

• RCg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F)

• RPh: respuesta hematológica parcial

• RPg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F)

• SNP: Single ucleotide Polymorphisms

• SP: sangre periférica

• TE: trombocitemia esencial

• TPO: trombopoyetina

• WHO: World Health Organization

6

I. REVISIÓN DEL TEMA


7

1. Introducción

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) engloban un grupo de entidades hematológicas

que se originan en la expansión clonal de una célula germinal pluripotencial. Comparten

ciertas características clínicas y biológicas como son la presencia de una médula ósea

hipercelular, una incidencia aumentada de complicaciones trombóticas y hemorrágicas y, a

largo plazo, un riesgo aumentado de evolución a leucemia aguda [1]. Se caracterizan por la

proliferación incontrolada en la médula ósea de una o más líneas celulares mieloides con

maduración [2]. Dentro de las NMP diferenciamos: NMP cromosoma Philadelfia positivos

(Ph-pos) y Ph negativos (Ph-neg). Bajo el término de NMP Ph-neg (llamadas a partir de

ahora NMP) se incluyen, entre otras entidades, la policitemia vera (PV), la trombocitemia

esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP).

El descubrimiento en el año 2005 de la mutación V617F del gen JAK2V617F en el 95% de

los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP ha venido a apoyar la

agrupación de estas tres entidades en una posición nosológica común [3-7]. El aumento de la

masa eritrocitaria en la PV, la trombocitosis en la TE y la fibrosis medular en la MFP son las

características fundamentales de cada una de estas tres entidades.


8

2. Epidemiología y factores pronósticos

La incidencia anual de PV y de TE es de 2 a 3 casos por 100,000 habitantes, mientras que la

de MFP es de solo 0,5 casos por 100,000 habitantes año [8-9]. A raíz de la incorporación de

los nuevos criterios diagnósticos WHO 2008 [10], se ha observado un aumento de la

incidencia de TE mientras que la de PV y MFP se mantiene estable [11]. Dicho aumento se

debe al descenso de cifra de plaquetas y a la incorporación de las mutaciones JAK2V617F y

del gen MPL en los criterios diagnósticos.

La edad media de presentación de la PV y de la TE es de unos 60 años y ambas entidades

son poco frecuentes en pacientes jóvenes. Solamente el 5% de los enfermos con PV tienen

menos de 40 años, el 1% menos de 25 años y el 0,1% menos de 20 años. En la TE el 15-

20% de los pacientes tienen menos de 40 años de edad en el momento del diagnóstico. En la

MFP la edad media de presentación de MFP es de unos 65 años [9,12-14].

La supervivencia media de los pacientes diagnosticados de PV o TE es de 15 años, la cual

según algunos estudios es similar a la de la población general [13-16], pero podría estar

acortada según otros estudios [17-18]. La supervivencia de estos pacientes puede verse

acortada sobre todo por el desarrollo de las complicaciones trombóticas y por progresión de

la enfermedad a mielofibrosis secundaria (MFsec) o a leucemia mieloide aguda (LMA). El

riesgo a 10 años de desarrollar mielofibrosis es <5% para la TE y <10% para la PV, y el

riesgo para desarrollar una LMA es de <2% en la TE y <6% en la PV [19-20]. Los pacientes

con MFP tienen una supervivencia media de 4-5,5 años y entre las causas fundamentales de

la muerte se encuentran: progresión a LMA (en 20% de los casos a 10 años de seguimiento),

alteraciones relacionadas con el fallo medular (anemia, sangrado), alteraciones hepáticas y

trombosis [17].


9

La patogénesis de la trombosis en las NMP es multifactorial y en parte se atribuye a la

hiperviscosidad sanguínea y a factores de riesgo cardiovascular como el tabaquismo, la

hipertensión arterial, la hipercolesterolemia, la diabetes o las trombofilias hereditarias.

También se valora la posible influencia de otros factores, entre ellos la cifra de plaquetas y

leucocitos, la interacción entre ambos y finalmente la presencia de la mutación JAK2V617F

[15-16,19,21-35].

Respecto a la progresión a mielofibrosis secundaria (MFsec) o leucemia mieloide aguda

(LMA) se dispone de escasa información. La duración de la enfermedad es el único factor

de riesgo claramente asociado con la progresión a MFsec [35-36]. En cuanto a la progresión

a LMA, la edad superior a 70 años y el empleo de citostáticos diferentes de la hidroxiurea

(HDU) y el interferón α (INF-α) fueron los únicos factores relacionado con el riesgo de

progresión [36]. Recientemente se ha sugerido que la leucocitosis ≥ 15000 x 109/L, podría

ser otro factor de riesgo de progresión a MFsec o a LMA [31,37]. Además en varios

estudios se analizó la relación entre la mutación JAK2V617F y el desarrollo de la

progresión, sin poder sacar conclusiones definitivas [5,17,32,38-46].


10

3. Criterios diagnósticos

El diagnóstico tradicional de las NMP se basaba en un conjunto de datos clínicos, en el

recuento celular en sangre periférica (hematimetría), el estudio morfológico de la médula

ósea y la sangre periférica, y en la exclusión de otros cuadros tumorales o reactivos que

pueden cursar con una expresión hematológica similar. Varios grupos, especialmente el

Polycythemia Vera Study Group (clasificación PVSG) cuya primera clasificación data del

año 1975 [47] y un grupo de expertos de la Organización Mundial de la Salud (clasificación

WHO revisada periódicamente) [48] han elaborado unos criterios diagnósticos, basados

esencialmente en la exclusión. Con el descubrimiento de la mutación V617F en el gen JAK2

en año 2005, se planteó su estudio con finalidad diagnóstica. Además se vio que la TE con

mutación JAK2V617F, presentaba un curso de la enfermedad similar al de la PV por lo que

se sugirió que los pacientes TE JAK2V617F-pos son realmente enfermos con PV inaparente

[43]. En este sentido, se han realizado muchos trabajos de distintos grupos de investigación

tanto básica como clínica [3-7,43-51], que llevaron en el año 2008 a la última actualización

de los criterios diagnósticos WHO [10], incluyendo un cambio de nomenclatura,

actualmente llamadas neoplasias mieloproliferativas (NMP), en los que se incluye el estudio

de la mutación JAK2V617F (véase la Tabla 2, 3 y 4).

La incorporación de los criterios anatomopatológicos dentro de los criterios diagnósticos de

las NMP, ocurrió por la primera vez en la clasificación de la Organización Mundial de la

Salud, WHO 2001 [48]. El papel diagnóstico de la biopsia de médula ósea (BMO) ha sido

ratificado en la nueva clasificación de la WHO 2008 aunque la reproductibilidad de los

criterios histopatológicos, sobre todo de la morfología de la línea celular megacariocítica ha

sido cuestionada en publicaciones recientes [52-53].


11

4. Tratamiento

El tratamiento de las NMP varía según el diagnóstico (PV vs TE vs MFP) y en función de

riesgo trombótico de cada pacientes [33,54-59]. En pacientes jóvenes, sin gran componente

proliferativo ni factores de riesgo trombótico, se recomienda la abstención terapéutica o la

administración de antiagregantes (ácido acetilsalicílico) en dosis bajas [60]. En la PV

también debe realizarse sangrías con el objetivo de mantener el hematocrito (Hematocrito)

<0,45% en hombres y <0,42% en mujeres [55-56]. El tratamiento citorreductor se reserva

cuando han fracasado otras medidas, así como para los pacientes mayores y/o con factores

de riesgo trombótico asociados y/o gran componente proliferativo. Los fármacos

citorreductores más frecuentemente utilizados son: hidroxiurea (HDU), anagrelida (ANA) y

en algunos casos Interferón-α (INF-α) [61]. El tratamiento de los enfermos con MFP es

fundamentalmente paliativo y dirigido a controlar síntomas [62-63]. En los pacientes

jóvenes con el diagnóstico de la MFP o mielofibrosis secundaria (progresión de PV o TE)

puede estar indicada la realización de un trasplante alogénico de progenitores

hematopoyéticos (alo-TPH) [62-66].


12

5. Patogénesis

5.1. Introducción

La policitemia vera, fue mencionada por primera vez en el año 1892 por Vaquez [67] y su

primera descripción fue publicada por Osler en 1903 [68]. En 1951 Dameshek sugirió que

en las NMP había un incremento en la proliferación de células mieloides, debido

probablemente a una alteración desconocida que estimulaba dicha proliferación [1]. Además

este autor estableció la relación entre la PV, la TE y la MFP, englobándolas en el grupo

llamado “enfermedades mieloproliferativas”. En 1974, se describió que los progenitores

eritroides de la médula ósea de los pacientes con PV podían cultivarse in vitro en ausencia

de eritropoyetina [69]. La existencia de un crecimiento autónomo de los progenitores

eritroides sugería un comportamiento neoplásico y, por lo tanto, un origen clonal de la

enfermedad. Dicho origen clonal se demostró estudiando los patrones de inactivación del

cromosoma X en mujeres con PV [2,70].

Sin embargo, los genes implicados en la etiopatogenia de la PV permanecieron ocultos hasta

muy recientemente, cuando Kralovics et al [71] refirieron que el 33% de los pacientes con

PV presentaban una pérdida de la heterocigosidad en el brazo corto del cromosoma 9. Dicho

hallazgo reforzaba el origen clonal de la PV y señalaba al brazo corto del cromosoma 9

como el lugar donde se encontraba el gen causal de la PV. Finalmente, en el año 2005 cinco

grupos independientes demostraron de forma simultánea que la mayoría de pacientes con

PV presentaban una mutación puntual localizada en el gen de la cinasa JAK2, localizado en

el brazo corto del citado cromosoma 9 [3-7].


13

5.2. Mutación JAK2V617F

JAK2 (cr9p24), es un gen que codifica una proteína citoplasmática con actividad

tirosincinasa que interviene en la cascada de transducción de señales intracelulares [72-73],

al activarse los receptores de citocinas tipo I como son los receptores de la eritropoyetina,

del G-CSF, del GM-CSF o de la trombopoyetina (MPL). La mutación V617F afecta a un

aminoácido situado en el dominio JH2 y se produce por un cambio de una guanina en el

alelo salvaje por una tirosina del alelo mutado en el nucleótido 1849 (en el exón 14) que

origina la sustitución de una valina por una fenilalanina en la posición 617 de la proteína

madura (véase Figura 1) [3-7].

El dominio JH2 tiene actividad pseudocinasa y su función consiste en inhibir al dominio

cinasa JH1 interaccionando con el bucle de activación [75]. Como consecuencia de la

mutación V617F no se produce la inhibición del dominio cinasa JH1, lo que resulta en una

activación constitutiva de la proteína JAK2 en ausencia de la unión del ligando al receptor

Figura 1. La mutación JAK2V617F. A: Secuencia de los aminoácido del gen JAK2 mutado (mutación V617F). B: Secuencia de los aminoácidos del gen JAK2 no mutado (74 modificado).


14

hematopoyético. Se trata, por tanto, de una mutación que provoca una ganancia de función

[3-7], es decir, una activación permanente de diferentes vías de transducción de señales

implicadas en la señalización de los receptores de citocinas de tipo I (EPO, G-CSF, c-MPL)

como JAK-STAT, PI3K, AKT, MAPK y ERK (véase Figura 2) [3-7,76-78].

EPO

JH1 JH1

JH2JH2

FERM FERM

JAK2 WT SI/ERITROPOYETI/A

JAK2 WT CO/ERITROPOYETI/A

JAK2 CO/ MUTACIÓ/ V617F

JH1 JH1P P

JH2 JH2

FERM FERM

AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2

ACTIVACIÓ/ VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES

ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES

JH1

JH2

FERM

PJH1

P

JH2

FERM

R-EPO R-EPOR-EPOR-CSFc-MPL

ERITROPOYESIS PANMIELOPOYESIS

CITOPLASMA

ESPACIO EXTRACELULAR

EPO

JH1 JH1

JH2JH2

FERM FERM

JAK2 WT SI/ERITROPOYETI/A

JAK2 WT CO/ERITROPOYETI/A

JAK2 CO/ MUTACIÓ/ V617F

JH1 JH1P P

JH2 JH2

FERM FERM


ACTIVACIÓ/ VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES


JH1

JH2

FERM

PJH1

P

JH2

FERM

JH1

JH2

FERM

PJH1

JH2

FERM

PJH1

P

JH2

FERM

JH1P

JH2

FERM

JH1P

JH2

FERM

R-EPO R-EPOR-EPOR-CSFc-MPL

ERITROPOYESIS PANMIELOPOYESIS

CITOPLASMA


Figura 2. Mecanismo de acción de JAK2. Cuando el receptor de la eritropoyetina (R-EPO) no está unido a su ligando, la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que se transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la eritropoyetina, el R-EPO se activa y se produce la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular, lo que resulta en un estímulo de la eritropoyesis. Cuando la proteína JAK2 alberga la mutación V617F, permanece fosforilada en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales. Como la mutación se produce en un progenitor hematopoyético, da lugar a un estímulo de las tres series, ya que JAK2 está implicada en la transmisión de señales de la EPO, el G-CSF y la TPO [79 modificado].


15

En condiciones normales, al unirse la eritropoyetina al receptor, éste se dimeriza, de forma

que las dos moléculas de JAK2 unidas al dominio yuxtamembrana citoplasmático del

receptor se aproximan y se activan mutuamente por fosforilación [80-83]. Una vez activada

JAK2, recluta a las proteínas STAT, que se fosforilan y dimerizan, entrando en el núcleo,

donde activan la transcripción de genes implicados en la proliferación y la supervivencia

[72-73].

Existen evidencias sólidas que demuestran que la mutación JAK2V617F es un evento

fisiopatogénico importante en el desarrollo de las NMP [3-7,84-86]. Entre ellas el hecho de

que es una mutación somática y adquirida, cuyo origen es un precursor hematopoyético

pluripotencial, ya que células mieloides, eritroides, megacariocitos y linfocitos presentan la

mutación [3,87-88]. Pero sobre todo los estudios funcionales con JAK2V617F en líneas

celulares y en modelos animales transgénicos han demostrado el carácter oncogénico de

dicha mutación y su potencial para causar la enfermedad [4-5,84-86].

La frecuencia de aparición de la mutación JAK2V617F en las tres principales entidades de

NMP es variable, según la técnica de detección usada: 65-97% en pacientes con PV, 23-

57% con TE y 35-95% con MFP [3-6]. Además, dicha mutación puede encontrarse con

frecuencias bajas en leucemia mieloide aguda (5%), síndromes mielodisplásicos (3%),

leucemia mielomonocítica crónica (6%), síndromes mieloproliferativos atípicos (20%),

síndrome hipereosinofílico (1%), mastocitosis sistémica (6%) y aislados casos de leucemia

mieloide aguda (LMA) primaria o leucemia mieloide crónica (LMC) [87-94]. En caso de la

LMC, se detecta la coexistencia del cromosoma Ph y de la mutación JAK2V617F [90-94].

Además, la mutación JAK2V617F, no aparece en enfermos con eritrocitosis o trombocitosis

secundaria [3-6], enfermedades linfoproliferativas [95-96]. En caso de individuos sanos, su

detección es posible en 2% de los casos, solamente utilizando técnicas muy sensibles [97-


16

99]. Por este motivo estudio de la mutación JAK2V617F promete ser de gran ayuda para el

diagnóstico diferencial de estas entidades.

Sin embargo, JAK2V617F no es la única mutación presente en las NMP [100-111]. En 2006

se describieron mutaciones en el gen MPL [102-103] y en 2007 en el exón 12 del gen JAK2

[104]. Recientemente, se han comunicado nuevas mutaciones en las NMP como: TET2

[105-107], CBL [107-108], ASXL1 [109], IDH [110] y IKZF1 [111] de las cuales la más

frecuente es la mutación TET2 que aparece en 16% de PV, 5% de TE y MFP 17%. Hasta la

fecha no se ha demostrado su papel patogénico primario, siendo probablemente eventos

secundarios [109-111]. Además, se esta analizando su probable relación con la progresión a

LMA, ya que casi 20% de los casos de NMP en la fase blástica presentan alguna de estas

mutaciones [101,105-111].

5.3. Mutaciones del gen MPL

La mutación MPL-W515L afecta al aminoácido 515 del gen que codifica el receptor de la

trombopoyetina y provoca la dimerización del receptor en ausencia del ligando y la

activación constitutiva de la vía de transducción de señales dependiente de este receptor

[102-103] (véase Figura 3).


17

Se han descrito otras mutaciones, funcionalmente relevantes, en el gen MPL como: MPL-

W515K, MPL-W515A y MPL-S505N [101,112-113]. Las mutaciones MPL W515K/L/A

están presentes aproximadamente entre 1 y 9% de los pacientes con MFP y TE y la

mutación MPL-S505N está descrita tanto en casos de trombocitosis familiar como en la TE

esporádica. Las mutaciones en el gen MPL no se encuentran en los pacientes con PV, lo que

sugiere que dichas mutaciones favorecerían el desarrollo preferencial de la línea

megacariocítica con respecto a la eritroide. Esta hipótesis ha sido confirmada in vitro

demostrando la mutación en progenitores hemopoyéticos multipotentes con diferenciación

megacariocítica espontánea [114]. El papel etiopatogénico de la mutación W515L de MPL

en la MFP se puso de manifiesto en un modelo murino en el que los ratones trasplantados

CITOPLASMA


W515K, W515L, W515R, W515A

RECEPTOR MPL SI/TROMBOPOYETI/A

RECEPTOR MPL U/IDO A TROMBOPOYETI/A

RECEPTOR MPLMUTADO


ACTIVACIÓ/ VÍATRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES


ESTIMULACIÓ/ MEGACARIOPOYESIS

JAK2 JAK2P

JAK2JAK2

PJAK2

P PJAK2

TPO

CITOPLASMA


W515K, W515L, W515R, W515A



RECEPTOR MPLMUTADO





JAK2 JAK2P

JAK2JAK2

PJAK2

P PJAK2

TPO



RECEPTOR MPLMUTADO








JAK2 JAK2P

JAK2

PJAK2JAK2

PJAK2

PJAK2

P PJAK2

TPO

Figura 3. Mecanismo de acción del receptor de MPL. En condicionales normales cuando el receptor de la trombopoyetina (MPL) no está unido a su ligando la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la TPO, el MPL se dimeriza y activa, produciéndose la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular lo que resulta en un estímulo de la megacariopoyesis. Cuando el receptor MPL alberga la mutación W515K o W515L, se produce la dimerización del receptor en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales [79 modificado, 102-103].


18

con progenitores portadores de dicha mutación desarrollaron un síndrome mieloproliferativo

rápidamente progresivo, caracterizado por leucocitosis, trombocitosis, esplenomegalia y

fibrosis medular, pero no eritrocitosis [102].

5.4. Mutaciones del gen JAK2-exón 12

Las mutaciones en el gen JAK2-exón 12 (véase Figura 4) fueron descritas en

aproximadamente el 3-5% [101,113] de los pacientes con PV JAK2-neg. Hasta la fecha, se

han descrito más de 10 distintas mutaciones del gen JAK2-exón 12 [104,115-122].

Los casos de PV que presentan mutaciones en el exón 12 tienen valores más altos de

hemoglobina en el momento del diagnóstico que los casos de PV JAK2V617F-pos, así

como valores de leucocitos y de plaquetas normales [104,115,117,121].

Se conoce, que tanto las mutaciones MLP como las del exón 12 están implicados en la

fisiopatología de las NMP [102,104,113]. Además, ambas mutaciones han sido incluidas

Mutaciones en el exón 12535 547

SH2 JH2 JH1FERM

V617F

Carboxi-terminal

Amino-terminal




SH2 JH2 JH1FERM

V617F

Carboxi-terminal

Amino-terminal

SH2 JH2 JH1FERM

V617F

Carboxi-terminal

Amino-terminal

Figura 4. Esquema de la proteína JAK2. La proteína JAK2 consta de un dominio FERM de

interacción con el receptor de citoquinas, un dominio SH2 donde se unen proteínas inhibidoras de JAK2, un dominio JH1 con actividad cinasa y un dominio JH2 con actividad pseudocinasa cuya función es inhibir el dominio JH1. Localización de las mutaciones en el exón 12 y de JAK2V617F en la proteína JAK2 [116 modificado].


19

como los marcadores clonales de las NMP JAK2V617F-neg en la nueva revisión de los

criterios diagnósticos WHO 2008 [10].

5.5. Relación entre genotipo y fenotipo

Existen muchos motivos para pensar que exista otra alteración genética, aparte de la

mutación JAK2V617F, que influye en el desarrollo de las NMP, entre ellos el hecho de que

dicha mutación no aparece en todas las NMP y que la mayoría de estos casos son procesos

clonales [123]. Además tampoco está claro como una mutación única JAK2V617F puede

causar tres diferentes fenotipos: PV, TE y MFP y qué proceso regula la aparición de la

eventual progresión. Se ha postulado que las combinaciones de factores como el número de

copias (carga mutacional) de la mutación JAK2V617F, predisposición alélica, factores

dependientes del huésped, y mutaciones adicionales darían lugar al fenotipo tan heterogéneo

de las NMP [84,100,113,124-127].

Por otro lado, aunque la mutación JAK2V617F es un evento fisiopatogénico fundamental en

PV, se postula que no es el evento clonogénico inicial ni en la PV ni en otras NMP (véase

Figura 5) [128].

Homocigoto V617F

Heterocigoto V617F

Mutación desconocida?

Mutación V617F (50%)

Recombinación mitótica 9pLOH (25%)

Figura 5. Modelo de patogénesis de las NMP [100 modificado].


20

Es probable que las mutación JAK2V617F constituyan un evento genético secundario que

acontece sobre una predisposición genética heredada y sobre una probable adquisición

previa de un clon tumoral en la stem cell [100,113,127]. Igualmente, las mutaciones JAK2-

exón 12 y las del gen MPL, a pesar de su implicación fisiopatogénica demostrada en las

NMP, son probablemente eventos secundarios [100,113,116].


21

6. JAK2V617F y clínica

6.1. JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg

En varios estudios se ha observado la asociación entre la mutación JAK2V617F y el

fenotipo tipo PV es decir con cifras altas de hematocrito, de hemoglobina, y de leucocitos y

con cifras bajas de plaquetas y de EPO [4, 43-44]. Sin embargo, los resultados acerca de la

asociación entre la mutación JAK2V617F con eventos clínicos como la progresión o la

trombosis es el tema que aún se está debatiendo [3-5,43-44,49,129].

6.2. JAK2V617F: la carga alélica

De acuerdo con la teoría de un continum entre la PV y la TE JAK2V617F-pos [43], el

desarrollo de la PV podría estar favorecido por adquisición de homocigosidad para

JAK2V617F ya que el estado de homocigosis aparece en el 30% de los casos con PV pero

muy raramente en la TE (véase Tabla 1) [3-6,43,123,130]. El estado de homocigosis aparece

como el efecto de la recombinación mitótica, promovido a su vez por la inestabilidad

genética inducida por la mutación JAK2V617F [131]. De acuerdo con el estudio de Tiedt et

al, los niveles bajos de expresión de JAK2V617F (heterocigosis) dan lugar a desarrollo de la

TE, y niveles más elevados (homocigosis) sucesivamente a MFP y PV [132]. Por lo tanto, es

probable que la cantidad del alelo mutado JAK2V617F afecte al fenotipo de las NMP.

Recientemente, con la utilización de las técnicas de detección cuantitativas, surgió el

término de la carga alélica (la ratio entre el alelo JAK2V617F mutado y no mutado) [87].

Hasta la fecha parece que hay acuerdo entre los autores sobre la relación directa entre la

carga alélica de JAK2V617F y la cifra de hemoglobina, leucocitos, presencia de

esplenomegalia y prurito e indirecta con la cifra de plaquetas. Sigue habiendo controversia


22

acerca de la relación entre la carga alélica JAK2V617F y aparición de eventos trombóticos,

progresión a LMA y a MFsec, supervivencia y necesidad de citorreducción [45-46,124,133-

140].

6.3. JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica

Hasta la fecha, se han publicado muy pocos estudios acerca de los cambios de la carga

alélica durante el seguimiento de los pacientes y su implicación clínica.

En relación a los pacientes JAK2V617F-neg, hay un consenso según el cual dichos

pacientes no adquieren la mutación JAK2V617F a lo largo del seguimiento [43,140-141].

En las NMP JAK2V617F-pos, se sugiere que la carga alélica en la mayoría de los casos se

mantiene estable a lo largo del tiempo [142-143], pero en algunos pacientes, se han visto

variaciones de la carga alélica JAK2V617F durante el seguimiento. Se observó el descenso

o incluso negativización de la carga alélica JAK2V617F en relación con el tratamiento

administrado: hidroxiurea (HDU), INF-α, alo-TPH [142,144-149]. Además recientemente,

se han publicados criterios de respuesta molecular según European LeukemiaNet (ELN) en

estos pacientes [150]. Sin embargo, la implicación clínica de la reducción de la carga alélica

JAK2V617F en estos casos no esta clara [145]. Por otro lado, es probable que la carga

alélica JAK2V617F se modifique en contexto de la larga evolución de la enfermedad y del

desarrollo de la progresión de una NMP a otra o a LMA. Según algunos autores la cantidad

de la mutación JAK2V617F puede aumentar con el tiempo en la PV y la MFP [40,137]. En

caso de TE, no existen datos concluyentes: se encuentran estudios según cuales la carga

alélica se mantiene estable [133] o aumenta [134]. Se sugiere que el aumento de la carga

alélica JAK2V617F, en caso de la PV y MFP, se asocia con el desarrollo de una MFsec


23

post-PV, marcada esplenomegalia y aumento de la necesidad de citorreducción [45-

46,137,140,151]. En este momento no se dispone de estudios prospectivos de seguimiento

de la carga alélica JAK2V617F en este tipo de pacientes.

6.4. Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F

La mutación JAK2V617F puede detectarse en sangre total, granulocitos, plaquetas,

preparaciones de médula ósea e incluso en biopsias de médula ósea (siempre y cuando éstas

no hayan sido procesadas con reactivos que contengan mercurio). Asimismo puede

detectarse en progenitores hemopoyéticos obtenidos de cultivos celulares in vitro. Se pueden

aplicar diferentes técnicas para detectar la presencia de la mutación de JAK2V617F. De

entre las técnicas disponibles, una de las que tiene una mayor sensibilidad es la PCR-

aleloespecífica cuantitativa (véase Tabla 1).

Autor ref.

Método de detección

PV JAK2V617F-pos (homocigotos)

TE: JAK2V617F-pos (homocigotos)

MFP: JAK2V617F-pos (homocitogos)

4 Secuenciación 89 (30) 43 43 6 Secuenciación 74 (25) 32 (3) 35 (9) 5 Secuenciación 65 (27) 23 (3) 57 (22)

3 Secuenciación/PCR

alelo-específica 97 (26) 57 (0) 50 (19)

130 ARMS/piro

secuenciación 81 (33) 41 (7) 43 (29)

123 Taqman alelo-

específica 99 72 39

97 Sondas de hibridación 87 61 50 Tabla 1. Frecuencias y métodos de detección de la mutación JAK2V617F en las NMP clásicas [152 modificado].


24

6.4.1. Secuenciación

En esta técnica, una secuencia amplificada de DNA se procesa a través de un secuenciador

automático, que está basado en el principio de secuenciación de Sanger [153]. Este método

utiliza didesoxinucleótidos (ddNTP), derivados sintéticos de los nucleótidos que, al

incorporarse a la cadena naciente, impiden que continúe la polimerización. Cada uno de los

4 ddNTP empleados tiene un marcador fluorescente distinto. En el proceso se lleva a cabo

una reacción de síntesis de DNA en la que se incluyen los ddNTP, además del DNA que se

desea secuenciar, una polimerasa y nucleótidos (dNTP). El producto de esta síntesis es una

colección de cadenas de DNA de longitudes crecientes en función de dónde se haya

incorporado el ddNTP. La mezcla de cadenas de DNA se separa de una en una mediante

electroforesis. La electroforesis está conectada a un detector de fluorescencia que determina

el ddNTP que lleva cada fragmento, con lo que se obtiene la secuencia de nucleótidos de la

cadena original. El método es semicuantitativo; puede distinguirse entre homocigoto y

heterocigoto en ausencia de poblaciones heterogéneas. La sensibilidad obtenida es de

alrededor del 20% [3-5,87,152].

6.4.2. Pirosecuenciación

Dicha técnica está basada en la detección de la bioluminiscencia de la reacción de la

luciferasa. Se someten a pirosecuenciación los productos de una PCR realizada previamente.

Los pirofosfonatos liberados por la incorporación de nucleótidos llevada a cabo por la

polimerasa durante la síntesis de DNA in vitro son utilizados como fuente de ATP. Los

nucleótidos específicos son adicionados mediante la reacción para determinar la secuencia

de la hebra de DNA de interés. El método es adecuado para la determinación cuantitativa y

puede distinguir entre homocigotos y heterocigotos de la mutación. Se estima que posee una

sensibilidad del 5% [128,130,152].


25

6.4.3. PCR alelo-específica

Los métodos PCR alélo-específica (PCR-AS) son los más adecuados para realizar medidas

cuantitativas en PCR a tiempo real [123]. Es un ensayo muy sensible (0,01-0,1%). Se

emplea un oligonucleótido mutado para la amplificación de la secuencia, que es detectada

posteriormente mediante electroforesis capilar. En otros procedimientos de AS-PCR se

emplean dos parejas de cebadores que amplifican el gen normal y el gen mutado en una sola

reacción. Con este sistema, llamado ARMS (Amplification Refractory Mutation System), se

obtiene una sensibilidad del 1-2% [130,152,154].

En nuestro laboratorio se utiliza la técnica de la PCR a tiempo real alélo-específica por su

alta sensibilidad (2%) y por su capacidad de determinar la carga alélica de células mutadas

ya que, como se comenta posteriormente, puede ser un factor pronóstico, que determine

decisiones terapéuticas y permitiría, además, evaluar la respuesta a un posible tratamiento.

En el año 2009, se publicaron por la primera vez unos criterios de la respuesta molecular

según ELN, valorados por la cuantificación de la carga alélica JAK2V617F [150].


26

7. Citogenética convencional

Las alteraciones citogenéticas en NMP no son frecuentes ni específicas: aparecen

aproximadamente en el 20% en la PV, menos de 5% en la TE y en el 40% de los pacientes

con MFP. Las alteraciones más frecuentes incluyen la: del(20q), del(13q), +8, +9 y las

alteraciones del cromosoma 1. Además, están descritas las alteraciones en los cromosomas 5

y 7 [97,155-164].

En un tercio de los pacientes con PV se observó la disomía uniparenteral del brazo corto del

cromosoma 9 (9pUPD) lo que condujo al descubrimiento de la mutación JAK2 [5]. Según

Campell et al, es posible, que la trisomía del cromosoma 9, +9p y del(20q) estén

relacionadas con la mutación JAK2V617F [38].

No se ha encontrado un significado pronóstico a las alteraciones citogenéticas en la PV y en

la TE [157-158]. En cambio en la MFP el cariotipo anómalo parece asociarse a peor

supervivencia, pero no se conoce la importancia de cada una de las alteraciones

cromosómicas más frecuentes [16,156,162-164].


27

8. Alteraciones inmunológicas en NMP

El reciente descubrimiento de la mutación puntual V617F en el gen JAK2, nos ayudó a

entender la fisiopatogenia de las NMP. El gen JAK2 pertenece a la familia de Janus

quinasas (JAK1, JAK3 y Tyk2) que intervienen en la cascada de transducción de señales

intracelulares entre ellos señales cruciales en el desarrollo, proliferación y diferenciación de

los linfocitos T. Las deficiencias de JAK1 y JAK2 resultan ser letales, la deficiencia de

JAK3 cursa con ausencia de linfocitos T y NK y alteración de la función de linfocitos B; y la

deficiencia de Tyk2 cursa con alteraciones en la respuesta pro-inflamatoria y el aumento en

la respuesta Th2 [165-166]. La mutación en JAK2V617F se ha descrito no solo en la serie

mieloide sino también en subpoblaciones linfocitarias B, T y NK [167-168], por ello parece

razonable esperar que dicha mutación afecta de alguna manera a su número o función. Este

aspecto no ha sido analizado hasta ahora en ninguna publicación.

28

II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS

Y OBJETIVOS

II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS

29

1. Justificación del trabajo

Las NMP constituyen un grupo heterogéneo de patologías mieloproliferativas que cursan

con diferentes presentaciones clínicas y analíticas, diferentes rasgos anatomopatológicos y

precisan de diferentes tratamientos. Bajo el término de NMP se engloban, tanto patologías

de baja agresividad (TE y PV) con supervivencia similar a la de población general como de

mayor agresividad y peor pronóstico (MFP).

Los criterios diagnósticos utilizados tradicionalmente se basaban en muchos criterios de

exclusión y alguno de inclusión. El descubrimiento de las nuevas mutaciones en el gen

JAK2 (V617F y en el exón 12) y en el gen MPL provocó la revisión de los criterios

diagnósticos.

En varios estudios se han observado claras diferencias analíticas y algunas clínicas y

biológicas (citogenéticas) en los pacientes portadores de la mutación respecto a los que no

presentan la mutación. Además se ha visto que en algunos casos la carga alélica varía con el

tiempo y con el tratamiento. Aún no se sabe si gracias a la mutación JAK2V617F se puede

cambiar la clasificación de las NMP o utilizar la mutación JAK2V617F como el factor

pronóstico (seguimiento de la evolución de la enfermedad o de la respuesta al tratamiento).

Actualmente la única indicación claramente establecida para el estudio de las mutaciones

JAK2 (V617F y exón 12) y MPL es establecer un diagnóstico pero con la limitación de no

ser una anomalía completamente específica de las NMP y sobre todo con la limitación de no

estar presente en todos los casos. Tampoco se conoce si la presencia de la mutación

JAK2V617F puede asociarse a alteraciones en la distribución de subpoblaciones

linfocitarias (linfocitos T, B, NK y TNK) en enfermos con NMP.


30

2. Hipótesis de estudio

Tras la descripción de la mutación JAK2V617F en el año 2005, los criterios diagnósticos de

las NMP fueron modificados. De esta forma, se introdujeron cambios en la clasificación

WHO 2008 derivados del estudio de la de la mutación de este gen.

La mutación JAK2V617F aparece de forma prácticamente constante en la PV. Sin embargo,

sólo aparece en aproximadamente la mitad de los casos con TE y MFP. Es posible que las

características clínicas y biológicas de la enfermedad incluyendo anomalías citogenéticas y

subpoblaciones linfocitarias sean diferentes en pacientes portadores o no portadores de la

mutación. Asimismo, la carga alélica de la mutación varía de unos pacientes a otros, siendo

posible que a mayor carga alélica más sintomática sea la enfermedad.

También se han descrito cambios en la carga alélica de JAK2V617F en el seguimiento de

estos pacientes, lo cual sugiere una nueva utilidad del estudio de la mutación con fines de

evaluación de la respuesta a los tratamiento y como marcador evolutivo.

Como se ha mencionado, la mutación del JAK2V617F aparece en la mitad de los pacientes,

habiéndose descrito otras dos mutaciones: JAK2-exon12 y c-MPL que, al igual que la

mutación JAK2V617F, están jugando un papel en la etiopatogenia de las NMP. Se postula

que las características biológicas y clínicas podrían ser diferentes en los portadores de estas

mutaciones.


31

3. Objetivos del estudio

3.1. Objetivo general

Estudio de las características clínico-biológicas de la mutación JAK2V617F en los pacientes

diagnosticados de NMP.

3.2. Objetivos específicos.

Validar y comparar los criterios WHO 2008 en relación a los anteriores de 2001 para

clasificar a los pacientes con NMP.

Determinar si los pacientes con mutación JAK2V617F presentan características clínico-

biológicas diferentes a los que no tienen la mutación.

Determinar si la carga alélica de la mutación JAK2V617F se asocia a un fenotipo

hematológico y clínico y si supone una mayor carga de la enfermedad.

Investigar si el cambio de la carga alélica a lo largo del seguimiento comporta un cambio en

las características clínico-evolutivas/pronósticas de los pacientes.

Estudiar el interés diagnóstico y el significado clínico de nuevas mutaciones tales como

JAK2-exón 12 y MPL en los pacientes diagnosticados de NMP JAK2V617F-neg.

32

III. MATERIAL Y MÉTODOS


33

1. Muestra del estudio

Se realiza el estudio de seguimiento (ambispectivo) de una cohorte de 183 pacientes con el

diagnóstico clínico de NMP: PV (n=45; 24,6%), TE (n=128; 70%) y MFP (n=10; 5%). Los

pacientes fueron atendidos de forma rutinaria en el Servicio de Hematología del Hospital

Universitario de Santiago de Compostela. El diagnóstico de estos pacientes fue realizado en

el período de tiempo comprendido entre el 15 de noviembre de 1975 hasta el día 31 de

diciembre de 2008 y la recolección de los datos se realizó entre el 20 de enero de 2006 y el

31 de diciembre de 2009.

Criterios de inclusión:

• Enfermos con la sospecha o diagnóstico de NMP tipo PV, TE o MPF según

diagnóstico que consta en el informe el clínico,

• Acceso a los datos clínicos y analíticos de los pacientes tanto en el momento del

diagnóstico como a lo largo del seguimiento.

• Determinación de la mutación JAK2V617F.

Se excluyen del estudio a los pacientes con el diagnóstico de otras NMP distintas de las

mencionadas, así como los síndromes mieloproliferativos/mielodisplásicos y con las

sospechas de alteraciones analíticas reactivas.

Este estudio se ajustó a los criterios de Helsinki. Todos los pacientes dieron su

consentimiento informado por escrito para la recogida de datos de su historia clínica como

para la obtención, almacenamiento y estudio de muestras sanguíneas con los fines

específicos de este estudio. Dicho estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación

Clínica de Galicia.


34

2. Metodología

2.1. Variables del estudio

Todas las variables clínicas y analíticas fueron obtenidas de las historias clínicas, e incluye

tanto datos al diagnóstico como evolutivos. Los datos se resumen en la Tabla 6 del apartado

de resultados.

2.1.1. Variables clínicas

• Datos demográficos: edad y sexo

• Factores de riesgo cardio-vascular: tabaquismo, diabetes mellitus, hipertensión

arterial, hiperlipemia, historia previa (máximo dos años antés del diagnóstico de la

NMP) de trombosis

• Esplenomegalia: objetivada en el examen físico ó por pruebas de imagen

• Presencia de prurito

• Eventos vasculares:

o Trombosis mayor (arterial y venosa): infarto cerebral y miocárdico, angina,

trombosis arterial periférica, trombosis venosa profunda incluida la cerebral

y trombosis de la vena esplénica, embolismo pulmonar. Se consideraron

todos los que ocurrieron en los 2 años previos al diagnóstico y los que

ocurrieron posteriormente

o Hemorragia mayor: un descenso de la Hb de >= 2 g/dL, necesidad de

transfusión de hematíes o de la intervención quirúrgica. Se recogieron tanto

los eventos al diagnóstico como durante el seguimiento

• Progresión de la enfermedad: de una NMP a otra NMP o a LMA


35

• Tipo de tratamiento citorreductor

• Respuesta hematológica al tratamiento citorreductor según se ha definido por un

grupo de expertos de ELN [150]:

o En la TE:

� Respuesta hematológica completa (RCh): plaquetas < 400 x 109/L y

no síntomatología relacionada con la enfermedad (eventos

microvasculares, prurito, cefalea) y bazo de tamaño normal (por

pruebas de imagen) y cifra de leucocitos ≤ 10 x 109/L

� Respuesta hematológica parcial (RPh): pacientes que no cumplen

criterios para RC, plaquetas < 600 x 109/L o descenso > 50% desde

los valores iniciales

� Falta de respuesta: cualquier respuesta que no cumple los criterios de

RP

o En la PV:

� RCh: Hematocrito < 45% sin necesidad de flebotomía y plaquetas ≤

400 x 109/L y cifra de leucocitos ≤ 10 x 109/L y bazo de tamaño

normal (por pruebas de imagen) y no síntomatología relacionada con

la enfermedad (eventos microvasculares, prurito, cefalea).

� RPh: no cumple criterios de RC pero Hematocrito < 45% sin

necesidad de flebotomía o cumplimiento de ≥ 3 de otros criterios

� No respuesta (NR): cualquier respuesta que no cumple los criterios

de RP

• Respuesta molecular al tratamiento citorreductor según ELN:


36

o Respuesta genética completa (RCg): disminución de la alteración molecular (la

carga alélica JAK2V617F) hasta su total desaparición

o Respuesta genética parcial (RPg):

� Disminución ≥ 50% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor

basal (si valor basal de JAK2V617F < 50%)

� Disminución ≥ 25% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor

basal (si valor basal de JAK2V617F > 50%)

o No respuesta (NRg): todos los cambios de la carga alélica JAK2V617F que no

cumplan al menos criterios de RP

2.1.2. Variables analíticas

• Hematimetría: valores de hemoglobina, leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos,

plaquetas

• FAL leucocitaria

• Lactato deshidrogenasa sérica (LDH)

• Nivel de eritropoyetina sérica

2.2 Estudio de las mutaciones

A todos los pacientes se les realizó una determinación cuantitativa de la mutación

JAK2V617F. En 124 pacientes se realiza la determinación periódica de dicha mutación y la

frecuencia del estudio depende de la accesibilidad a las muestras según visitas asistenciales

y consentimiento de los pacientes.


37

En algunos pacientes JAK2V617F-neg se realizó una determinación de mutación JAK2-

exon12 (n=2) y c-MPL (n=45) (véase apartado 4 de metodología).

2.3 Estudio morfológico de médula ósea

Se revisaron 146 (85%) cilindros de biopsia de médula ósea (BMO) y 109 (64%) muestras

de aspirados medulares (AMO) de los pacientes incluidos al estudio. El análisis de la BMO

fue realizado, en nuestro centro hospitalario, por un anatomopatólogo y la revisión del AMO

por un hematólogo experto en citología, ambos sin conocimiento previo del diagnóstico ni

de datos analíticos ni del estado mutacional de JAK2V617F. Se analizaron solamente las

muestras extraídas al diagnóstico y previamente al inicio del tratamiento citorreductor. En el

análisis de BMO se valoraron: celularidad total, cantidad de megacariocitos, sincitios y

fibrosis; la serie eritroide y mieloide fueron analizados en AMO. Para la valoración de las

muestras se utiliza una escala semicuantitativa previamente descrita [169-170]: normal: 0,

levemente aumentado 1+, moderamente aumentado 2+ y muy aumentado 3+.

Finalmente, según los datos obtenidos, se emitió un diagnóstico confirmatorio o se excluyó

el diagnóstico de la NMP.


38

2.4 Revisión de los criterios diagnósticos de WHO

Finalmente, se revisó el diagnóstico clínico de los pacientes siguiendo los criterios WHO

2001 y WHO 2008 (véase Tablas 2-4). Se clasificó a los enfermos como PV, TE o MFP

según los datos analíticos y clínicos que presentaba cada enfermo en el momento del

diagnóstico. Los casos que no cumplían criterios diagnósticos de la WHO en el momento

del diagnóstico, se revisaron de nuevo el diagnóstico al finalizar el estudio.

WHO 2001 para PV (criterios A1 y A 2 más: otro A o dos B)

WHO 2008 para PV

(el primero de los mayores y dos menores o los dos mayores y uno menor)

A1. ME >25%, ó Hb > 18,5 g/dl (varón) ó > 16,5 g/dl (mujer), ó Hb >99% de percentil A2. No causa de eritrocitosis secundaria:

• No eritrocitosis familiar • No elevación de EPO por hipoxia • Hb de alta afinidad para el oxígeno • Receptor de eritropoyetina truncado • Inapropiada producción de EPO

(tumor) A3. Esplenomegalia A4. Anomalía clonal (no BCR-ABL) A5. Formación de colonias eritroides endógenas B1. Trombocitosis > 400 x 109L B2. Leucocitosis > 12 x 109L B3. Cambios en BMO tipo PV B4. Bajo nivel de EPO

Criterios mayores 1. Aumento de la ME:

• Hb >18,5 g/dl (varón) o Hb > 16,5 g/dl (mujer)

• Hb>17g/dl (varón) ó > 15g/dl (mujer) si se asocia a aumento de >=2g/dl no atribuído a corrección de déficit de hierro

• Aumento percentil 99 para edad, sexo o altitud

• Aumento de la masa eritrocitaria >25% 2. Mutación JAK2V617F (o JAK2-exón12) Criterios menores 1. Cambios en BMO tipo PV (panmielosis) 2. Bajo nivel de EPO 3.Formación de colonias eritroides endógenas

Tabla 2. Criterios diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008 para PV. Abreviaturas: ME - masa eritrocitaria, Hb - hemoglobina, EPO - eritropoyetina, BMO - biopsia de médula ósea.


39

Tabla 3. Criterios diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008 para TE. *Valoración clínica: excluir neoplasia, inflamación, infección, esplenectomía u otro tipo de cirugía reciente, falta de hierro, otros. Abreviaturas: BMO - biopsia de médula ósea, LMC - leucemia mieloide crónica, SMD – síndrome mielodisplásico.

WHO 2001 para MFP WHO 2008 para MFP (tres mayores y dos menores)

MPF prefibrótica 1. BMO de MFP precoz 2. Leve anemia 3. Leve leucotrombocitosis 4. Esplenomegalia presente u ausente 5. No signos MPF en SP MPF en fase fibrótica 1. BMO de MFP con fibrosis 2. Anemia 3. Leucocitos, plaquetas: normales,

aumentados o descendidos 4. Hepatoesplenomegalia 5. Cambios morfológicos en SP

Criterios mayores 1. BMO compatibles con MFP 2. No criterios WHO para PV, LMC, SMD, otros

NMP 3. Marcador clonal (JAK2V617F o

MPL515W>L/K) 4. En ausencia de marcador clonal: descartar

fibrosis medular por proceso neoplásico (tricoleucemia, linfoma, metástasis) o inflamatorio ó tóxico

Criterios menores 1. Leucoeritroblastosis 2. Elevación de la LDH 3. Anemia 4. Esplenomegalia palpable

Tabla 4. Criterios diagnósticos WHO 2001 y WHO 2008 para MFP. Abreviaturas: BMO - biopsia de médula ósea, LMC - leucemia mieloide crónica, SMD – síndrome mielodisplásico, LDH – lactato dehidrogenasa.

WHO 2001 para TE (todos los criterios)

WHO 2008 para TE (todos los criterios)

Criterios apoyo

Plaquetas >= 600 x 109/L Cambios tipo TE en BMO

Plaquetas >= 450 x 109/L (mantenidas) Cambios tipo TE en BMO

Criterios exclusión

No reunir criterios WHO para PV, MFP, LMC o SMD Excluir trombocitosis reactiva por valoración clínica*

No reunir criterios WHO para PV, MFP, LMC, SMD otras NMP. Excluir trombocitosis reactiva por: JAK2V617F (u otro marcado) positivo ó Valoración clínica*.


40

3. Procedimientos y técnicas utilizadas

3.1. Análisis de la mutación JAK2V617F

Todos los casos disponen de al menos una determinación, en el momento de ser incluidos en

el estudio, lo cual pudo ser al diagnóstico o en un momento posterior. En un subgrupo se

realizó una determinación periódica (aproximadamente cada 3-12 meses) de la carga

mutacional JAK2V617F.

El estudio se realiza a partir de DNA de granulocitos de sangre periférica. La separación de

granulocitos de sangre periférica se realizó utilizando la técnica de Ficoll Paque, en las

primeras 24 post extracción. Se confirmó la pureza de separación de granulocitos (tiene que

ser >=90-95%) preparando las extensiones en portas (tinción May Grünwald-Giemsa). La

extracción de DNA de los granulocitos de SP se realizó utilizando Qiagen Tissue DNA

extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), siguiendo las recomendaciones del

fabricante. Una vez extraído, la concentración y calidad del ADN fue medida utilizando un

espectrofotómetro modelo Nanodrop (NanoDrop® ND-1000 spectrophotometer, USA). La

muestra de DNA se conserva en congelador a –20ºC.

A todos los pacientes incluidos en el estudio se le realizó la determinación cuantitativa

(utilizando la técnica de Real-Time PCR) de la mutación JAK2V617F. Además, en caso de

n=124 pacientes se realizó también la determinación periódica (cada 3-12 meses) de la carga

mutacional JAK2V617F.

Se llevó a cabo un análisis de discriminación alélica (PCR-AS, kit comercial

MutaScreenTMKit, IPSOGEN), que nos permitirían detectar y cuantificar la existencia del


41

alelo mutado y/o no mutado usando sondas fluorescentes específicas (TaqMan) para cada

alelo. Sondas TaqMan alelo específicas (Applied Biosystem):

-gen no mutado: TCT CCA CAG ACA CAT AC; marcados con VIC, HPLC

-gen mutado (V617F): TCC ACA GAA ACA TAC; marcados con 6-FAM, HPLC

La sonda que identifica al alelo mutado está marcada con el fluorocromo FAM y la de alelo

normal con VIC. Durante la PCR, cada sonda se une específicamente con su secuencia

complementaria amplificada mediante el uso de dos cebadores comunes y la AmpliTaq

Gold DNA polimerasa. Esta enzima es capaz de producir la liberación del fluorocromo de la

sonda que hibrida perfectamente con el alelo, el incremento de fluorescencia así generado

indica que el alelo complementario a la sonda está presente en la muestra.

El análisis cuantitativo precisa de una curva de calibración, que se realizó en una mezcla de

diluciones seriadas de ADN extraído de células HEL (homocigotas para la mutación

JAK2V617F) y un ADN control normal. Se realizaron los estudios de validación de la

técnica (precisión, exactitud, linealidad, límite de detección).

La diferencia en la fluorescencia entre ambos alelos nos permitió diferenciar la

amplificación de cada alelo. Se estimó el porcentaje del alelo mutado que existe en la

muestra según la siguiente fórmula:

Valor del alelo mutado (V617F)/ valor del alelo no mutado.

El resultado se presenta de dos maneras:


42

• En rangos (referidos a la curva estándar realizada con las muestras calibradoras): <2%:

negativo, 2-5%, 5-12,5%, 12,5-31%, 31-50%, 50-78% y >78%.

• Como el valor único aproximado; se construye una curva de calibración con los valores

de los mismos estándares usados para la determinación de JAK2V617F por rangos.

Con este abordaje la detección teórica del alelo mutado sería posible si está presente en tan

sólo un 2% de las células (el límite de detección de la técnica es de aproximadamente un

2%).

Para el análisis del seguimiento de la carga alélica JAK2V617F, se hace el cálculo de dos

variables:

• Cambio absoluto:

% JAK2V617F primero - % JAK2V617F último

Para considerar que hay un cambio debe haber un aumento o descenso de al menos un 10%

por lo que si el valor basal es menor del 10% no pueden analizarse los posibles descensos de

la carga alélica.

• Variación ó cambio relativo:

% JAK2V617F primero - % JAK2V617F último

% JAK2V617F último x 100

Los casos que presenten doble cambio en la carga alélica JAK2V617F (inicial subida con

posterior bajada o al revés) se denominan como con el patrón tipo “pico sierra”. En estos

casos se valora solamente el cambio absoluto por lo tanto quedan excluídos del análisis de la

variación de la carga alélica JAK2V617F.


43

3.2. Análisis de otras mutaciones en NMP

En las muestras de los pacientes con diagnóstico de PV que no presentaron la mutación

JAK2V617F se realizó la determinación de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2. En

las muestras de los pacientes con diagnóstico de TE y de MFP que no presentaron la

mutación JAK2V617F se realizó un estudio de las mutaciones en el gen MPL.

3.2.1. Estudio de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2

Dicho estudio fue realizado en el Department of Reseasech, Experimental Hematology,

University of Basel, Basilea, Suiza. En total se estudiaron en pacientes con poliglobulia y

negativos para la mutación JAK2V617F (n=2).

Se utilizaron dos técnicas de estudio: secuenciación y pirosecuenciación que ya fueron

previamente descritas.

3.2.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL

El estudio de las mutaciones del gen MPL se realizó mediante la amplificación por PCR y

posterior secuenciación cíclica del exón 10 del gen del receptor de trombopoyetina MPL.

3.3. Estudio citogenético de la médula ósea

Los estudios citogenéticos se realizaron según práctica asistencial en el Laboratorio de la

Fundación Pública de la Medicina Xenómica. Se ha recogido los datos de estudio

citogenético realizado al diagnóstico y durante del seguimiento.


44

3.4. Subpoblaciones linfocitarias

El estudio de subpoblaciones linfocitarias se realizó mediante citometría de flujo (BD FACS

Calibur), en la unidad de citometría de nuestro servicio, en sangre periférica y utilizando los

siguientes anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson): anti-CD3, CD4, CD8, CD16,

CD56, CD19. Se analizaron las subpoblaciones linfocitarias como corresponde: linfocitos T

(CD3+) con sus subpoblaciones (CD4+/CD8- y CD4-/CD8+), linfocitos TNK

(CD3+/CD56+), linfocitos NK (CD3-/CD56+ y/o CD16+) y linfocitos B (CD19+). Los

valores obtenidos se compararon con los rangos de referencia utilizados habitualmente en

nuestro laboratorio (véase Tabla 5).

Subpoblaciones linfocitarias

Anticuerpos monoclonales

Valor relativo (%) Valor absoluto (cels/uL)

CD3+ 60-80 850-3600

CD4+/CD8- 35-55 500-2500 Linfocitos T

CD4-/CD8+ 15-40 200-1800

Linfocitos TNK CD56+/CD3+ 1-5 14-70

Linfocitos NK CD16+/CD3- y/o

CD56+/CD3- 5-20 70-900

Linfocitos B CD19+ 5-25 70-1135

Tabla 5. Valores normales de subpoblaciones linfocitarias


45

4. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa SPSS 15.0. El valor p<0,05 se

consideró como estadísticamente significativo. Se contó con la colaboración de la Unidad de

Epidemiología Clínica del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela.

Los resultados de las variables cualitativas se expresan en frecuencias absolutas y en

porcentaje, mientras que los resultados de las variables cuantitativas están expresados en

medias ± desviación estándar.

Para la comparación de variables cualitativas se utilizó el test chi-cuadrado. Las variables

cuantitativas se analizaron utilizando los test de t-student o Mann-Whitney, ANOVA o

Kruskal-Wallis y Wicoxon según los datos siguieran o no una distribución normal, y los

datos fuesen o no pareados. Para explorar la presencia de asociación entre variables

continuas, se usó la correlación de Spearman o de Pearson según fuese apropiado.

Se utilizó el índice Kappa para valorar el grado de concordancia entre los criterios

diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008. Los valores Kappa fueron categorizados según

los valores propuestos por Fleiss [171]: >0,75: muy buena concordancia, 0,4-0,75:

concordancia intermedia, y <0,4: mala concordancia.

En el grupo de pacientes JAK2V617F-pos, se analizó el mejor punto de corte para poder

diferenciar la PV de TE utilizando la curva de ROC. La sensibilidad se define como la

proporción de individuos con mutaciones prueba con una probabilidad de detección de

portadora o mayor que un determinado valor (de corte), y la especificidad es la proporción

de los individuos sin mutaciones con una probabilidad de detección inferior a la de corte.

46

IV. RESULTADOS

IV. RESULTADOS

47

Se realizó el estudio en 183 pacientes con el diagnóstico previo de NMP según historial

clínico. Las características principales son las siguientes: la edad media fue de 61 ± 16 años,

con un rango de 16 a 93 años, el 55% fueron mujeres y el 45% hombres. El tiempo medio de

seguimiento fue de 72 meses (rango 0 a 406). La esplenomegalia fue encontrada en 60 casos

(33%), prurito en 29 casos (16%), durante el seguimiento se observó una progresión de una

NMP a otra NMP o a LMA en 23 casos (13%) y eventos vasculares, en su mayoría

trombóticos se encontraron en 36 casos (20%). La mutación JAK2V617F estaba presente en

128 casos (70%) y la MPL en 4 casos (9%) de los 45 estudiados. En la Tabla 6 se presentan

los valores clínicos y analíticos del grupo de estudio; los casos están clasificados según el

diagnóstico inicial con el que estaban catalogados en la historia clínica.

IV. RESULTADOS

48

Características PV TE p** MFP

Nº de pacientes 45 129 - 9

Edad (años) 60 ±82 61±33 0,858 66±16

Mujeres 23 (51%) 75 (58%) 0,259 3 (33%)

Riesgo trombótico:

-Alto

-Intermedio

-Bajo

30 (67%)

9 (20%)

6 (13%)

89 (69%)

20 (15,5%)

20 (15,5%)

0,765

7 (78%)

2 (22%)

0 (0%)

Prurito 19 (42%) 8 (6%) 0,000 2 (22%)

Esplenomegalia 24 (54%)1 30 (23%) 0,000 6 (67%)

Eventos vasculares totales 7 (16%) 24 (19%) 0,090 5 (56%)

Progresión 4 (9%) 18 (14%) 0,275 1 (11%)

Citorreducción 42 (93%) 115 (89%) 0,312 5 (56%)

JAK2V617F:

-Negativo

-2-31%

-31-100%

1 (2%)*

15 (33,5%)

29 (64,5%)

51 (39,5%)

62 (48%)

16 (12,5%)

0,000

3 (33,3%)

3 (33,3%)

3 (33,3%)

Mutación c-MPL - 3 (7%)1 - 1 (22%)2

Hemoglobina (g/dL) 18,8 ± 1,7 13,8 ± 1,7 0,000 11,8 ± 2,5

Leucocitos (x109/L) 12,52 ± 6,23 9,80 ± 2,94 0,001 13,55 ± 10,7

Neutrófilos (x109/L) 9,29±5,053 6,66±2,64 0,000 10,44±10,62

Linfocitos (x109/L) 2,04±1,363 2,07±0,72 0,861 1,83±0,62

Plaquetas (x109/L) 531 ± 240 861 ± 358 0,000 360 ± 244

EPO4 (mU/mL) 3,6±4,5 22,2±32,9 0,000 143,5±132,1

FAL5 * 111±66 70±52 0,000 152±109

LDH6 (UI/L) 389,6±129,6 311,7±128 0,001 801,7±469,8

MO compatible con NMP8 32 (91%)5 93 (93%)6 - 9 (100%)7

Tabla 6. Datos clínico-analíticos de NMP al diagnóstico. 1datos para 41 pacientes, 2 datos para 4 pacientes, 3 datos para 44 pacientes, 4datos para 42 pacientes con PV, 59 con TE y 5 con MFP, 5datos para 38 pacientes con PV, 86 con TE y 5 con MFP, 6datos para 42 pacientes con PV, 125 con TE y 8 con MFP, 7datos para 44 pacientes con PV, 127 con TE y 9 con MFP, 8datos para 35 pacientes con PV, 100 con TE y 9 con MFP. *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias, **el valor p se refiere a la comparación entre el grupo de PV y TE.

IV. RESULTADOS

49

1. Criterios diagnósticos WHO

El diagnóstico según la clasificación WHO 2001 se basaba en criterios de exclusión

seguidas de estudios confirmatorios. La novedad de criterios WHO 2008 es la inclusión de

un marcador genético, es decir de las mutaciones en el gen JAK2 (V617F y JAK2-exón12) y

MPL.

Con el objetivo de valorar la utilidad de los nuevos criterios WHO 2008 en la práctica diaria

se analizó el cumplimiento de dichos criterios en 171 pacientes con el diagnostico de NMP

(44 PV, 118 TE y 9 MFP). Para la revisión de los criterios WHO se utilizan los datos

clínicos y analíticos del diagnóstico. De esta parte del estudio quedan excluidos 12 pacientes

por falta de datos (1 PV, 10 TE y 1 MFP): en todos estos pacientes no se realizó el estudio

de médula ósea y en el caso de PV falta además el valor de la EPO.

1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación

1.1.1. Grupo con sospecha de PV

El diagnóstico de PV fue confirmado, según los criterios WHO 2001 y WHO 2008, en 42

(95%) de 44 pacientes con sospecha de PV (véase Tabla 7) y la concordancia entre ambos

criterios diagnósticos fue muy buena con el índice kappa = 1 (p<0,001).

WHO 2008 PV No cumple

PV 42 0 WHO 2001 No cumple 0 2

Tabla 7. Concordancia de los criterios WHO 2001 y WHO 2008 en pacientes con PV.

Los pacientes, que no cumplieron los criterios WHO 2001 ni 2008, presentaban el estudio

histopatológico de médula ósea insuficiente para el diagnóstico de NMP. Uno de estos

IV. RESULTADOS

50

pacientes fue negativo para ambas mutaciones en el gen JAK2 (V617F y JAK2-exón 12) y

presentaba niveles altos de EPO, por lo que el diagnóstico fue modificado a eritrocitosis

idiopática. El segundo fue diagnosticado de PV si bien en el momento del diagnóstico no

cumplía criterios estrictos WHO pero con el seguimiento sí adquirió los criterios

diagnósticos de PV (aumento de cifra de hemoglobina).

1.1.2. Grupo con sospecha de TE

De los 118 pacientes con el diagnóstico clínico de TE, 96 (81%) cumplían criterios WHO

2001 y 111 (93%) WHO 2008 (véase Tabla 8). El índice kappa de concordancia entre

ambos criterios de la WHO fue igual a 0,43 (p<0,001).

WHO 2008 TE No cumple

TE 96 0 WHO 2001 No cumple 15 7

Tabla 8. Concordancia de los criterios WHO 2001 y WHO 2008 en pacientes con TE.

En 15 de 111 pacientes con el diagnóstico clínico de TE, no se pudo confirmar el

diagnóstico de acuerdo con los criterios WHO 2001, pero sí según los criterios WHO 2008,

en todos los casos debido un recuento de plaquetas menor de 600 x 109/L. De estos

pacientes, 14 (93%) presentaban la mutación JAK2V617F-pos. Dichos pacientes eran más

jóvenes que los que cumplían los criterios WHO 2001 y WHO 2008 y más de la mitad

presentó el riesgo trombótico intermedio o alto (véase Tabla 9). Además, 6 de estos 15

(40%) pacientes presentaron progresión a lo largo de su seguimiento: cuatro progresaron a

una PV y dos a una MFsec (véase Tabla 9 y Tabla 10). En el grupo que cumplía ambos

criterios diagnósticos solo 12 (13%) pacientes presentaron progresión durante el

seguimiento.

IV. RESULTADOS

51

Características WHO 2001 (-) WHO 2008 (+)

WHO 2001 (+) WHO 2008 (+)

p

Número de pacientes 15 96 - Edad (años) 53 ± 17 62 ± 17 0,042 Mujeres 10 (67%) 51 (53%) 0,243 Prurito 2 (13%) 6 (6%) 0,295 Esplenomegalia 3 (20%) 23 (24%) 0,514 Eventos vasculares totales 1 (7%) 22 (23%) 0,132 Progresión 6 (40%) 12 (13%) 0,016 Riesgo trombótico:

-Alto -Intermedio -Bajo

5 (33%) 4 (27%) 6 (40%)

70 (73%)

12 (12,5%) 14 (14,5%)

0,009

Citorreducción total 13 (87%) 91 (95%) 0,240 JAK2V617F: -Negativo -2-31% -31-100%

1 11 3

45 39 12

0,013

Mutación c-MPL 1 negativo1 35 negativos, 2 positivos2

0,947

Hemoglobina (g/dL) 13.7 ± 1.7 13.7 ± 1.7 0,897 Leucocitos (x109/L) 7.85 ± 2.16 10.06 ± 3.10 0,009 Plaquetas (x109/L) 528 ± 51 946 ± 370 0,000 Tabla 9. Datos analíticos y clínicos en pacientes con TE diagnosticados según WHO 2001 y WHO 2008. WHO 2001 (-)/WHO 2008 (+) significa que estos pacientes no cumplen criterios WHO 2001 y si WHO 2008; WHO 2001 (+)/WHO 2008 (+) significa que estos enfermos cumplen ambos criterios. 1determinado en 1 paciente, 2 determinado en 37 pacientes. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.

1.1.3. Grupo con sospecha de MFP

Todos los casos (n=9) con MFP cumplieron criterios WHO 2001 y WHO 2008 (kappa =1,

p<0,00).

1.1.4. Grupo con progresión

De los 171 pacientes, 23 (13%) presentaron progresión de una NMP a otra o a LMA durante

el seguimiento. El estudio de la mutación JAK2V617F fue positivo en 19 y negativo en 4 de

estos pacientes. Subrayar que 6 de los 18 pacientes con TE (33%) al diagnóstico no

IV. RESULTADOS

52

cumplían criterios WHO 2001: cuatro de ellos presentaron progresión a PV y dos a MFsec.

En la Tabla 10 se presenta el resumen de todos los pacientes diagnosticados de NMP según

WHO 2008 que presentaron progresión durante el seguimiento.

Progresión a: Diagnostico inicial (WHO 2008) PV MFsec LMA

PV (n=4) - 3 1

TE (n=18)* 4 12 2

MFP (n=1) - - 1

Tabla 10. Pacientes con NMP (WHO 2008) y progresión durante el seguimiento. * 6 de estos pacientes no cumplían criterios WHO 2001.

1.2. Estudio histopatológico de las NMP (WHO 2008)

Se revisaron 146 muestras de BMO: 37/44 (84%) con sospecha de PV, 100/118 (85%) con

probable TE y 9/9 (100%) con probable MFP. También se revisaron 109 AMO: 30/44

(68%) con sospecha de PV y 79/118 (67%) con sospecha de TE.

Tras revisión de los diagnósticos iniciales (según historia clínica) y aplicando los criterios

WHO 2008, los pacientes se clasificaron como: PV (35 de 37 casos), TE (93 de 100) y MFP

(9 de 9). Además 9 de los pacientes no cumplieron criterios WHO 2008. En la Tabla 11 se

presentan los resultado del análisis de estudio morfológico frente a los diagnósticos

revisados según criterios WHO 2008 (PV, TE, MFP y el grupo que no cumplía criterios

WHO 2008). Los hallazgos morfológicos fueron en general los esperables para cada grupo

diagnóstico. Así la TE se caracterizó por el aumento de los megacariocitos, mientras que la

PV se caracterizó por el aumento de la serie eritroide con diferencias significativas al

comparar el grado y tipo de celularidad.

IV. RESULTADOS

53

Valoración morfológica (grado 2+/3+)

PV (n=35)

TE (n=93)

p* MFP (n=9)

No cumple (n=9)

Celularidad total, n (%) 28 (80%) 34 (36%) 0,000 1 (11%) 0 (0%)

Megacariocitos, n (%) 7 (20%) 73 (78%) 0,000 3 (33%) 0 (0%)

Sincitios, n (%) 12 (34%) 83 (89%) 0,000 3 (33%) 1 (11%)

BM

O (n

=14

6)

Fibrosis, n (%) 0 (0%) 1 (1%) 0,727 7 (78%) 0 (0%)

PV (n=29)

TE (n=73)

p* - No cumple

(n=7)

Serie eritroide, n (%) 17 (59%) 0 (0%) 0,000 - 0 (0%)

AM

O

(n=

109)

Serie mieloide, n (%) 8 (27%) 6 (18%) 0,015 - 0 (0%)

Tabla 11. Estudio morfológico de MO y fenotipo de NMP (WHO 2008). Valoración morfológica (la escala de 0 a 3+): grado 2+ significa moderadamente aumentado y grado 3+ muy aumentado. *valor de la p: comparación PV vs TE. En la MFP no se valoraron los AMO. En el grupo definido como “no cumple” corresponde a hallazgos morfológicos inespecíficos.

En caso de PV, la coincidencia entre el diagnóstico morfológico y el diagnóstico clínico fue

muy buena con discrepancia en solo 2 (5%) casos (véase Tabla 11). Uno de los pacientes fue

JAK2V617F-pos y adquirió los criterios de WHO 2008 para PV durante el seguimiento

(aumento de cifra de hemoglobina). El otro caso (JAK2V617F y JAK2-exón 12 negativa,

niveles altos de EPO) después de la revisión diagnóstica fue reclasificado como eritrocitosis

idiopática.

En la TE, la coincidencia también fue buena, con solo 7 (7%) casos discrepantes por

ausencia de hallazgos morfológicos significativos (véase Tabla 11). De estos pacientes seis

(86%) fueron JAK2V617F-pos y la evolución clínica fue compatible con la sospecha inicial

de TE.

IV. RESULTADOS

54

2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en NMP (WHO 2008)

2.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg

En el grupo de pacientes con NMP diagnosticadas de acuerdo con los nuevos criterios WHO

2008, la mutación JAK2V617F fue detectada en 100% de PV, 58% de TE y 56% de MFP.

Tal como se muestra en la Tabla 12 (datos al diagnóstico): el grupo de pacientes

JAK2V617F-pos comparado con el grupo JAK2V617F-neg mostró valores más altos de la

concentración de hemoglobina, cifra de leucocitos y valor de fosfatasa alcalina leucocitaria

(FAL), mientras que la cifra de plaquetas y el nivel sérico de la EPO fueron

significantemente más bajos. No se detectaron diferencias significativas en los niveles

séricos de LDH, el sexo, edad al diagnóstico, progresión, prurito, eventos vasculares,

esplenomegalia al diagnóstico y necesidad de citorreducción.

IV. RESULTADOS

55

Características NMP, JAK2V617F-pos NMP, JAK2V617F-neg P

Nº pacientes 112 50 -

Edad (años) 61 ± 16 60 ± 17 0,701

Mujeres 61 (54%) 25 (50%) 0,361

Prurito 23 (20%) 5 (10%) 0,075

Esplenomegalia 41 (37%)1 13 (26%) 0,118

Eventos vasculares totales

23 (20%) 12 (24%) 0,381

Eventos trombóticos 21 (19%) 10 (20%) 0,505

Progresión: TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA

19 (17%) 4 11 4

4 (8%) 0 4 0

0,100

Citorreducción total 101 (90%) 46 (92%) 0,482

Hemoglobina (g/dL) 15,8 ± 2,9 12,9 ± 2,1 0,000

Leucocitos (x109/L) 11,42 ± 5,51 9,09 ± 2,9 0,006

Plaquetas (x109/L) 688 ± 3351 934 ± 428 0,000

EPO (mU/mL) 14,2 ± 35,02 44,3 ± 71,43 0,008

FAL * 103 ± 654 66 ± 575 0,004

LDH (UI/L) 348 ± 1456 379 ± 2767 0,364 Tabla 12. Datos analíticos y clínicos en NMP (WHO 2008) según el estado mutacional de JAK2V617F. *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias. 1datos para 111 pacientes. 2datos para 71 pacientes, 3datos para 24 pacientes, 4datos para 75 pacientes, 5datos para 37 pacientes, 6datos para 107 pacientes, 7datos para 49 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.

2.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg

Al comparar las características clínico-analíticas (datos al diagnóstico), el grupo de TE

JAK2V617F-pos comparado con el TE JAK2V617F-neg mostró: concentración de

hemoglobina y FAL fueron más altas y recuento de de plaquetas más bajo. No se

encontraron diferencias significativas en la cifra de leucocitos, niveles séricos de EPO y

LDH, sexo, edad al diagnóstico, en frecuencia de progresión o aparición de eventos

IV. RESULTADOS

56

vasculares al diagnóstico ni durante el seguimiento, prurito, esplenomegalia al diagnóstico o

necesidad de citorreducción (véase Tabla 13).

Características TE, JAK2V617F-pos TE, JAK2V617F-neg p


Edad (años) 61 ± 18 60 ± 17 0,762

Mujeres 37 (57%) 24 (52%) 0,381

Prurito 3 (5%) 5 (11%) 0,188

Esplenomegalia 17 (26%) 9 (19%) 0,283


14 (21%) 9 (19%) 0,497


Progresión TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA

14 (30%) 4 8 2

4 (6%) 0 4 0

0,058


Hemoglobina (g/dL) 14,1 ± 1,5 13,2 ± 1,9 0,004

Leucocitos (x109/L) 10,14 ± 3,2 9,23 ± 2,7 0,124

Plaquetas (x109/L) 816 ± 345 997 ± 390 0,013

EPO (mU/mL) 22 ± 381 29 ± 322 0,475

FAL * 90 ± 573 58 ± 474 0,013

LDH (UI/L) 309 ± 1415 313 ± 1176 0,875 Tabla 13. Datos analítico-clínicos en TE (WHO 2008): JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg. *valores normales de 20 a 100 unidades arbritarias. 1valores para 28 pacientes, 2valores para 22 pacientes, 3valores para 34 pacientes, 4valores para 38 pacientes, 5valores para 63 pacientes, 6valores para 45 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.

2.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos

El grupo con PV (WHO 2008) al compararlo con el grupo TE (WHO 2008) JAK2V617F-

pos presentó (datos al diagnóstico): valores significativamente más altos de concentración de

hemoglobina, cifra de leucocitos y niveles séricos de LDH, frecuencia de prurito y de

esplenomegalia. Por contrario el grupo con TE JAK2V617F-pos presentó un valor de

IV. RESULTADOS

57

plaquetas y niveles de EPO más altos que el grupo con PV. No se encontraron diferencias

estadísticamente significativas en el sexo, edad al diagnostico, en frecuencia de eventos

trombo-hemorrágicos al diagnóstico y durante el seguimiento, necesidad de tratamiento

citorreductor o progresión de la enfermedad durante el seguimiento (véase Tabla 14).

Características PV, JAK2V617F-pos TE, JAK2V617F-pos P


Edad (años) 60 ± 15 61 ± 18 0,845

Mujeres 22 (52%) 37 (57%) 0,396

Prurito 18 (43%) 3 (5%) 0,000

Esplenomegalia 21 (51%)1 17 (26%) 0,008


7 (17%) 14 (21%) 0,360


Progresión TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA

4 (9%) - 3 1

14 (21%) 4 8 2

0,085


Hemoglobina (g/dL) 18,9 ± 1,5 14,1 ± 1,5 0,000

Leucocitos (x109/L) 12,57 ± 6,221 10,14 ± 3,25 0,001

Plaquetas (x109/L) 523 ± 2101 816 ± 345 0,000

EPO (mU/mL) 2,9 ± 42 21,5 ± 383 0,003

FAL * 115 ± 66 90 ± 57 0,080

LDH (UI/L) 397 ± 1302 309 ± 1414 0,002 Tabla 14. Datos clínico-analíticos de pacientes con PV y TE JAK2V617F-pos (WHO 2008). *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias 1datos de 41 pacientes, 2datos para 40 pacientes, 3datos para 28 paciente, 4datos para 63 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.

IV. RESULTADOS

58

2.4. Estado JAK2V617F y estudio histopatológico

2.4.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg

Hemos comparado las características morfológicas (celularidad total, eritroide y mieloide,

megacariocitos, fibrosis colágena y sincitios) frente al estatus JAK2V617F. Los pacientes

con NMP JAK2V617F-pos presentaron el patrón medular más “eritrocítico” y los

JAK2V617F-neg más “trombocitósico” (véase Tabla 15).

JAK2V617F Valoración morfológica

(grado 2+/3+) Negativo (n=46)

Positivo (n=100)

p

Celularidad, n (%) 13 (28%) 50 (50%) 0,011

Megacariocitos, n (%) 35 (76%) 47 (47%) 0,001

Sincitios, n (%) 39 (85%) 60 (60%) 0,002

BM

O (n

=14

6)

Fibrosis, n (%) 3 (6%) 5 (5%) 0,488

Negativo (n=31)

Positivo (n=78)

p

Serie eritroide, n (%) 0 (0%) 17 (22%) 0,002

AM

O

(n=

109)

Serie mieloide, n (%) 3 (10%) 11 (14%) 0,393

Tabla 15. Análisis histopatológico y estatus de JAK2V617F en pacientes con NMP según WHO 2008. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado). En la MFP los AMO no se pudieron valorar.

2.4.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg

Al analizar por separado el grupo de pacientes con TE (n=93), no se observaron diferencias

significativas en las características analizadas (celularidad total, eritroide y mieloide, cifra de

megacariocitos y fibrosis) entre los casos JAK2V617F-pos (n=53) vs JAK2V617F-neg

(n=40).

IV. RESULTADOS

59

El mismo análisis no se pudo realizar en el grupo de PV puesto que el 100% de los pacientes

fueron JAK2V617F-pos.

2.4.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos

Al comparar el grupo PV frente a TE JAK2V617F-pos encontramos que la PV mostraba

más celularidad a expensas de la serie eritroide, mientras que la TE JAK2V617F-pos

mostraba un mayor número de megacariocitos (véase Tabla 16).

NMP JAK2V617F-pos Valoración morfológica

(grado 2+/3+) PV (n=35)

TE (n=53)

P

Celularidad, n (%) 28 (80%) 21 (40%) 0,000

Megacariocitos, n (%) 7 (20%) 39 (74%) 0,000

Sincitios, n (%) 12 (34%) 46 (87%) 0,000

BM

O (n

=88

)

Fibrosis, n (%) 0 (%) 1 (2%) 0,602

PV (n=29)

TE (n=44)

P

Serie eritroide, n (%) 17 (59%) 0 (0%) 0,000

AM

O

(n=

73)

Serie mieloide, n (%) 8 (28%) 3 (7%) 0,016

Tabla 16. Análisis histopatológico en pacientes con PV y TE según WHO 2008 JAK2V617F-pos. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado).

IV. RESULTADOS

60

3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas

3.1. Carga alélica JAK2V617F y diagnóstico según WHO 2008

Primero analizamos la distribución de la carga alélica JAK2V617F en el grupo total (n=119)

de los pacientes JAK2V617F-pos (véase Figura 6). De este análisis se excluyeron 9

pacientes en los que no se pudo establecer el diagnóstico WHO 2008 por falta de datos. Los

valores de la carga alélica JAK2V617F fueron significativamente (p=0,000) más altos en los

casos de PV (mediana de la carga alélica de 37% con el rango de 5 a 100%) que en TE

(mediana de la carga alélica de 23% con el rango de 4 a 71%). La mediana de la carga

alélica JAK2V617F en MFP fue de 37% con el rango de 16 a 57% y en los casos que no

cumplían los criterios WHO 2008, la mediana de la carga alélica JAK2V617F fue de 10%,

con el rango de 7 a 41%.

Dada la posibilidad de influencia del tratamiento citorreductor, tiempo de evolución y/o

presencia de progresión sobre la carga alélica JAK2V617F, dividimos a los pacientes en dos

grupos: grupo 1): casos con la primera determinación de JAK2V617F realizada al

diagnóstico (n=57) y grupo 2): casos con la primera determinación de JAK2V617F realizada

posteriormente, durante el seguimiento (n=62) y analizamos la distribución de la carga

alélica JAK2V617F (véase Figura 6B y 6C). No se objetivo una diferencia estadísticamente

significativa, respecto a la distribución de la carga alélica por diagnósticos entre estos grupos

ni con el grupo total de los pacientes (véase Figura 6A, 6B, 6C y Tabla 17).

IV. RESULTADOS

61

PV TE p* MFP No cumple

Total

(n=119)

n=42 Mediana: 37% Rango: 5-100%


0,000 n=5

Mediana: 37% Rango: 16-57%

n=7 Mediana 10% Rango: 7-41%

Grupo 1

(n=57)

n=16

Mediana: 40,5% Rango: 9-100%

n=33

Mediana: 23% Rango: 4-44%

0,000

n=3**

Sólo 3 valores: 16, 37 y 57%

n=5

Mediana 10% Rango: 7-29%

Grupo 2 (n=62)



0,000

n=2** Solo 2 valores:

27 y 49%

n=2** Solo 2 valores:

10 y 41%

Tabla 17. Distribución de la carga alélica según el fenotipo en el grupo total, en pacientes con la primera determinación de JAK2 al diagnóstico (grupo1) y en pacientes con la primera determinación de JAK2 realizada posteriormente al diagnóstico (grupo 2). *el valor p se refiere a la comparación entre el grupo de PV y TE, **No se presenta valor de la mediana en los grupos con el número de casos < 5.

IV. RESULTADOS

62

No cumple (n=7)

MFP (n=5)

TE(n=65)

PV (n=42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=7)

PMF (n=5)

ET (n=65)

PV(n =42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple (n=7)

MFP (n=5)

TE(n=65)

PV (n=42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple (n=7)

MFP (n=5)

TE(n=65)

PV (n=42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=7)

PMF (n=5)

ET (n=65)

PV(n =42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=7)

PMF (n=5)

ET (n=65)

PV(n =42)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

MFP (n=3)

TE (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

PMF (n=3)

ET (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

MFP (n=3)

TE (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

MFP (n=3)

TE (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

PMF (n=3)

ET (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple(n=5)

PMF (n=3)

ET (n=33)

PV (n=16)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple (n=2)

MFP(n=2)

TE (n=32)

PV (n=26)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

PMF (n=2)

No cumple(n=2)

PV(n=26)

ET(n=32)

No cumple (n=2)

MFP(n=2)

TE (n=32)

PV (n=26)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

No cumple (n=2)

MFP(n=2)

TE (n=32)

PV (n=26)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

PMF (n=2)

No cumple(n=2)

PV(n=26)

ET(n=32)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

PMF (n=2)PMF (n=2)

No cumple(n=2)

No cumple(n=2)

PV(n=26)

PV(n=26)

ET(n=32)

ET(n=32)

A

B

C

Figura 6. La distribución de la carga alélica JAK2V617F según el diagnóstico (WHO 2008) representada por un gráfico de dispersión (a la izquierda) y un diagrama de cajas (a la derecha): A). en el grupo total (n=119), B) en el grupo 1 (n=57) y C) en el grupo 2 (n=62).

IV. RESULTADOS

63

3.2. Carga alélica JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre la PV y la TE. Curva ROC.

Para el siguiente análisis, se seleccionan los casos con sospecha de PV y TE en los que se

determinó la carga alélica JAK2V617F en el momento del diagnóstico, previamente al inicio

del tratamiento citorreductor. Mediante el análisis de la curva ROC, se valora la utilidad de

la carga alélica de JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre una PV y una TE

JAK2V617F-pos. Se establecen los valores de sensibilidad y especificidad para cada punto

de corte (véase Figura 8). Con el valor de la carga alélica igual a 40%, el test presenta una

sensibilidad del 50% y una especificidad del 97% para el diagnóstico de PV mientras que

con el valor de 45%, la sensibilidad es de 44%, con una especificidad del 100%.

Figura 7. Punto de corte de JAK2V617F para diferenciar PV de TE para pacientes con JAK2V617F determinado en el momento del diagnóstico (solo pacientes JAK2V617F-pos; n=49). [Curva ROC: AUC=0,788; EE (AUC)=0,075 ; p=0,001]

1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0

Sen

sibi

lidad

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Curva ROC

1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0

Sen

sibi

lidad

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Curva ROC

JAK2V617F Sensibilidad Especificidad 10% 0,93 0,27 20% 0,81 0,47 30% 0,62 0,80 35% 0,56 0,90 40% 0,50 0,97 45% 0,44 1 54% 0,31 1 65% 0,25 1

IV. RESULTADOS

64

3.3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas

En el siguiente análisis se seleccionaron los pacientes del grupo 1, con la primera

determinación de JAK2V617F al diagnóstico (n=63); se incluyeron tanto casos con el

diagnóstico de NMP confirmado (n=52) como no confirmado, sea por falta de datos (n=6) o

por no cumplimiento de los criterios WHO 2008 (n=5). En la Tabla 18 se muestran las

características al diagnóstico de los pacientes con NMP en función de la carga alélica al

diagnóstico. La carga alélicas JAK2V617F se analizó como variable continua y en rangos:

de 2 a 30%, de 31 a 50% y > de 50%. Los valores altos de la carga alélica de JAK2V617F se

asociaron con la presencia de prurito. La frecuencia de esplenomegalia y de eventos

vasculares presentan tendencia a aumentar con la mayor carga alélica JAK2V617F, sin

alcanzar los valores estadísticamente significativos (p=0,083 y 0,084 respectivamente).

Además, tal y como puede observarse en la Figura 7, se encontró una relación positiva,

estadísticamente significativa, entre la carga alélica JAK2V617F y los valores de

hemoglobina (r = 0,370; p = 0,003) o cifra de leucocitos (r = 0,251; p = 0,047) y la relación

inversa, sin alcanzar valores estadísticamente significativos (r = - 0,176; p = 0,168), con la

cifra de plaquetas.

El mismo análisis se ha realizó en el grupo total de los pacientes (incluyendo los casos con

el diagnóstico no confirmado tanto por falta de datos como por no cumplimiento de los

criterios WHO 2008). La Tabla 19 muestra el análisis de la primera determinación de la

carga alélica (al diagnóstico o posteriormente) con las características de la enfermedad en el

momento del diagnóstico. A pesar de la probable influencia del tratamiento y del tiempo de

evolución puede observarse que las principales asociaciones entre JAK2V617F y las

IV. RESULTADOS

65

características clínico y analíticas están mantenidas. Además encontramos una asociación

entre la mayor carga alélica y presencia de esplenomegalia y elevación de la LDH sérica.

JAK2V617F carga alélica Características

clínico-analíticas Grupo 1 2-30%

Grupo 1 2-30%

Grupo 1 2-30%

P

Nº pacientes 45 12 6 -

Edad, años 65 ± 17 60 ± 19 67 ± 17 0,614

Mujer 25 (56%) 5 (42%) 4 (67%) 0,558

Esplenomegalia 8 (18%) 5 (42%) 3 (50%) 0,083

Prurito 0 (0%) 2 (17%) 2 (33%) 0,002


6 (13%) 2 (17%) 3 (50%) 0,084

Eventos trombóticos 6 (13%) 1 (8%) 3 (50%) 0,051

Progresión 2 (4%) 1 (8%) 0 (0%) 0,723

Hemoglobina (g/dL) 14,7 ± 2,1 16,4 ± 2,7 17,4 ± 3,1 0,008

Leucocitos (x109/L) 9,9 ± 2,7 10,8 ± 4,3 20,1 ± 12,1 0,000

Plaquetas (x109/L) 748 ± 330 592 ± 180 466 ± 245 0,052

EPO (mU/mL)1 24 ± 53 7 ± 8 1 ± 0,8 0,438

FAL2 71 ± 46 106 ± 67 154 ± 82 0,013

LDH (UI/L)3 309 ± 100 283 ± 107 389 ± 127 0,172

Tabla 18. Características clínico-analíticas de las NMP (WHO 2008) según la carga alélica JAK2V617F al diagnóstico. 1datos para 27 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 8 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%; 2FAL: datos para 25 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 8 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%; 3LDH: datos para 43 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 11 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%. * FAL valores normales de 20 a 100 de unidades arbitrarias

IV. RESULTADOS

66

Carga alélica JAK2 (%)

100806040200

Hem

oglo

bina

(g/

dL)

21,00

18,00

15,00

12,00

9,00


100806040200

Hem

oglo

bina

(g/

dL)

21,00

18,00

15,00

12,00

9,00


100806040200

Leuc

ocito

s (x

109 /

L)

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00


100806040200

Leuc

ocito

s (x

109 /

L)

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00


100806040200

Pla

quet

as (

x10

9 /L)

2000

1500

1000

500

0


100806040200

Pla

quet

as (

x10

9 /L)

2000

1500

1000

500

0

Figura 8. Diagrama de puntos que presenta la correlación entre la carga alélica de JAK2V617F y los valores analíticos tales como: cifra de hemoglobina (A), leucocitos (B) y plaquetas (C) en 63 pacientes con determinación de JAK2V617F realizada en el momento del diagnóstico.

C

B

A

IV. RESULTADOS

67

JAK2V617F carga alélica Características

clínico-analíticas Grupo 1 2-30%

Grupo 2 31-50%

Grupo 3 >50%

p global

Nº pacientes 80 29 19 -

Edad, años 62 ± 17 61 ± 16 62 ± 15 0,933

Mujer 46 (57%) 17 (57%) 9 (44%) 0,696

Esplenomegalia 16 (22%)1 14 (46%) 15 (78%) 0,000

Prurito 8 (11%) 8 (28%) 8 (44%) 0,002


11 (15%) 6 (21%)2 7 (37%) 0,065

Eventos trombóticos 11 (14%) 4 (14%)2 7 (37%) 0,051

Progresión 9 (11%) 4 (14%) 6 (28%) 0,080

Citorreducción total 69 (89%) 26 (89%) 18 (94%) 0,793

Hemoglobina (g/dL) 15,1 ± 2,3 15,9 ± 3 17,9 ± 3 0.000

Leucocitos (x109/L) 10,6 ± 4,4 10,3 ± 3,4 16,2 ± 8,2 0.000

Plaquetas (x109/L) 766 ± 335 612 ± 238 494 ± 2603 0.001

EPO (mU/mL)4 20± 42 6 ± 7 2 ± 0,9 0.104

FAL5 91 ± 61 94 ± 67 118 ± 64 0.329

LDH (UI/L)6 317 ± 119 354 ± 133 449 ± 140 0,002

Tabla 19. Características clínico-analíticas de NMP (WHO 2008) según carga alélica JAK2V617F. 1datos para 79 pacientes, 2datos para 28 pacientes, 3datos para 18 pacientes, 4datos para 46 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 20 entre 31-50% y 14 pacientes con >50%, 5datos para 51 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 21 entre 31-50% y 16 pacientes con >50%, 6datos para 78 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 28 entre 31-50% y 17 pacientes con >50%.

IV. RESULTADOS

68

3.4. Carga alélica JAK2V617F y estudio histopatológico

Finalmente, hemos analizado la relación de la carga alélica y el patrón morfológico. Al

analizar por separado a los pacientes con PV o TE, no se encontró ninguna asociación entre

la carga alélica y las variables analizadas (celularidad total, eritroide y mieloide,

megacariocitos y fibrosis). Solamente al analizar el grupo total (PV, TE, MFP y pacientes no

clasificados) observamos una asociación entre la carga alélica con el grado de celularidad

total, eritroide y mieloide y número de megacariocitos (véase Tabla 20).

Carga alélica JAK2V617F Valoración morfológica

(grado 2+/3+) 2-30% (n=63)

31-50% (n=23)

>50% (n=14)

p

Celularidad, n (%) 26 (41%) 13 (56%) 11 (78%) 0,032

Megacariocitos, n (%) 36 (57%) 10 (43%) 1 (7%) 0,003

Sincitios, n (%) 42 (67%) 13 (56%) 5 (36%) 0,094

BM

O (n

=10

0)

Fibrosis, n (%) 1 (2%) 3 (13%) 1 (7%) 0,090

2-30% (n=49)

31-50% (n=18)

>50% (n=11)

p

Serie eritroide, n (%) 6 (12%) 5 (28%) 6 (54%) 0,007

AM

O

(n=

78)

Serie mieloide, n (%) 3 (6%) 2 (11%) 6 (54%) 0,000

Tabla 20. Análisis histopatológico en pacientes con NMP (WHO 2008) según la carga alélica JAK2V617F. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado).

IV. RESULTADOS

69

4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica

La evolución de la carga alélica JAK2V617F fue analizada en 124 de 183 (68,3%) pacientes

incluidos en el estudio. Se realizaron determinaciones seriadas de la mutación JAK2V617F

en el periodo de junio de 2005 a diciembre de 2009. Los pacientes fueron seleccionados si

cumplían los siguientes criterios de inclusión: presencia de al menos dos determinaciones de

JAK2V617F, periodo de seguimiento de al menos 12 meses (salvo un caso de seguimiento

de 5 meses por éxitus relacionado con el transplante) y suficiente documentación clínica. Se

analizaron por separado los pacientes JAK2V617F-neg (n=28) y los JAK2V617F-pos

(n=96). Se valoró el cambio absoluto y el cambio relativo de la carga alélica JAK2V617F

según se describió en el apartado 4.1 de Metodología. Además, en el grupo de pacientes con

el inicio del tratamiento con hidroxiurea (HDU) posterior a la primera determinación de

JAK2V617F, se analizó la respuesta molecular según los criterios de ELN (véase el apartado

4.1. de Metodología).

4.1. Seguimiento del grupo JAK2V617F-neg

Se realizó análisis seriado de mutación JAK2 en 28 pacientes, en 10 desde el diagnóstico, y

en 18 con la primera determinación realizada posterior al diagnóstico.

El seguimiento medio del grupo total (n=28), fue de 25 ± 9 meses (rango de 11 a 47) con

una media de 3 muestras por paciente (rango de 2 - 5 muestras). Todos los pacientes

permanecieron negativos a lo largo de seguimiento.

IV. RESULTADOS

70

4.2. Seguimiento del grupo JAK2V617F-pos

4.2.1. Grupo completo de pacientes.

Se estudió la evolución de la carga alélica en 96 pacientes JAK2V617F-pos, con un

seguimiento medio de la carga alélica JAK2V617F de 31 ± 11 meses (rango de 12 a 52) y

media de 4 muestras por pacientes (rango de 2 a 11).

Al analizar el cambio absoluto de la carga alélica en el grupo total (n=96): en 39 (41%)

pacientes permaneció estable, y 57 (59%) presentaron cambio (≥10% respecto al valor basal

de la carga alélica JAK2V617F): 31 presentaron aumento, 15 disminución y en 11 casos se

observó una evolución de la carga alélicas tipo “pico de sierra” (véase Tabla 21). El patrón

tipo “pico de sierra” incluye tres tipos de pacientes: 5 casos con el reciente inicio del

tratamiento con hidroxiurea, 3 casos de interrupción e reintroducción del tratamiento y 3

casos con el inicial aumento de la carga alélica JAK2 durante la progresión de TE a MFsec y

posterior negativización de la misma una vez realizado el alo-transplante de médula ósea

(n=2) o diagnosticada progresión a LMA (n=1). Estos casos se comentarán con más detalles

en otro apartado de este estudio. En aquellos casos que parten de un nivel bajo de la carga

alélica JAK2V617F, la definición del cambio absoluto (≥10%) puede limitar su análisis. En

16 casos el nivel basal de la carga alélica JAK2V617F era menor de 10% (3 PV y 13 TE), de

los cuales en 3 aumentó el nivel al menos un 10%. En los otros 13 se descarta el aumento de

la carga alélica, pero con los criterios utilizados no podemos diferenciar entre un valor

estable o descenso. El análisis de la evolución de la carga alélica JAK2V617F (cambio

absoluto) según fenotipo mostró una proporción similar de los pacientes con PV y TE que

cambiaron o no su carga alélica (véase Tabla 21).

IV. RESULTADOS

71

CARGA ALELICA JAK2V617F

Aumento Descenso Estable Pico sierra Total (n=96) 31 (32%) 15 (16%) 39 (41%) 11 (11%) PV (n=37) 12 (32%) 8 (22%) 14 (38%) 3 (8%) TE (n=56) 17 (30%) 7 (13%) 25 (45%) 7 (12%) MFP (n=3) 2 (67%) - - 1 (33%)

Tabla 21. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo total (n=96) de pacientes clasificados según diagnóstico. En 13 casos con valores iniciales bajos no podemos diferenciar claramente entre valores estables o descenso o un patrón en pico de sierra

A continuación se realiza el cálculo de la variación de la carga alélica JAK2V617F (es decir

el valor relativo del cambio) del cual se excluyen los casos con el patrón “pico de sierra”

(véase el apartado 4.1. de Metodología). En nuestra serie, la mediana de variación de la

carga alélica JAK2V617F para todos los casos, presentó ligera desviación positiva (+22%)

desde la línea basal (la línea basal significa no cambios en la variación de la carga alélica

JAK2V617F). No se objetivó una diferencia estadísticamente significativa (p=0,644) entre

la mediana de variación de la carga alélica JAK2V617F en caso de PV y TE: +5% y +42%

respectivamente (véase Figura 9).

TE (n=49)PV (n=34)

Cam

bio

rela

tivo

(var

iaci

ón J

AK

2)

300

200

100

0

-100

p=0,644

TE (n=49)PV (n=34)

Cam

bio

rela

tivo

(var

iaci

ón J

AK

2)

300

200

100

0

-100

p=0,644

Figura 9. Diagrama de cajas que representa la variación de la carga alélica JAK2V617F según el fenotipo: PV y TE. La mediana de variación en la PV fue del +5% y en la TE del +42%, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa. En el gráfico faltan 2 valores atípicos (1 de PV y 1 de TE). No se estudia la variación de la carga alélica en el grupo de MFP por escaso número de casos (n=3). Tampoco están incluidos 10 pacientes con el patrón “pico sierra”.

IV. RESULTADOS

72

A continuación, valoramos si los cambios de la carga alélica JAK2V617F puedan tener

relación con el tratamiento recibido o progresión de la enfermedad.

Finalmente, valoramos si los cambios de la carga alélica JAK2V617F podría tener relación

con el tratamiento recibido o con la progresión de la enfermedad.

En nuestra serie, en 45 de los pacientes (47%), la primera determinación JAK2V617F fue

realizada en el momento del diagnóstico. Durante el seguimiento, 10 de estos pacientes

permanecieron sin tratamiento citorreductor, mientras que en los 35 restantes se inició dicho

tratamiento: en 34 pacientes con hidroxiurea (HDU) y 1 con anagrelida (ANA). En los 51

pacientes restantes (53%), la primera determinación de JAK2V617F fue realizada

posteriormente al momento del diagnóstico. Mientras que en 2 de estos pacientes no se

inició el tratamiento citorreductor, en 49 de ellos la citorreducción (39 con HDU y 10 con

otro tipo de citorreducción) fue iniciada de media de 88,7 ± 93 meses (rango de 2 a 369

meses) previo a la primera determinación de JAK2V617F.

De los 96 pacientes, 17 presentaron progresión de una NMP a otra o a LMA: 8 durante el

seguimiento de la carga alélica JAK2V617F y 9 previo al inicio del seguimiento.

4.2.2. Grupo sin tratamiento citorreductor

Se dispone de la evolución de la carga alélica JAK2V617F en 10 pacientes (1 PV, 7 TE, 1

MFP) que durante el estudio permanecieron sin tratamiento citorreductor. La primera

determinación de la carga alélica JAK2 en estos pacientes fue realizada en el momento del

diagnóstico.

El seguimiento medio de estos enfermos fue de 28 ± 10 meses (rango de 12 a 43) y con la

media de 4 muestras (rango de 2 a 7) por paciente. Al analizar el cambio absoluto de la

IV. RESULTADOS

73

carga alélica JAK2V617F, en 7 pacientes (70%) se observó un discreto aumento ( ≥ 10%)

de la carga alélica JAK2V617F, en otros 2 (20%) casos no se observaron cambios y en 1

(10%) descenso (véase Figura 10A). Sin embargo, al comparar la media de la carga alélica

JAK2 basal con la del final del seguimiento (véase Figura 10B), no se observó una

diferencia estadísticamente significativa (p=0,084) entre los valores medios en ambos

grupos (20% frente a 30% respectivamente).

NMP sin citoreducción - JAK2 al diagnóstico

0

20

40

60

80

100

1 12 23 34

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A B

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

JAK2-finalJAK2-basal

60

50

40

30

20

10

0

p=0,084NMP sin citoreducción - JAK2 al diagnóstico

0

20

40

60

80

100

1 12 23 34

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A B

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)


60

50

40

30

20

10

0

p=0,084


60

50

40

30

20

10

0

p=0,084

4.2.3. Grupo con tratamiento citorreductor con HDU

Este grupo de pacientes se dividió en dos subgrupos homogéneos: 34 casos con el primer

estudio de la carga alélica JAK2V617F al diagnóstico (grupo 1) y 39 posterior al inicio del

tratamiento con HDU (grupo 2).

La media del seguimiento entre la primera determinación de JAK2V617F y el inicio de

tratamiento con HDU en el grupo 1 de los pacientes, fue de 5 ± 7 meses (rango de 0 a 23) y

el seguimiento medio de la carga alélica JAK2V617F desde el inicio de HDU fue de 29 ± 12

(rango de 12 a 52) meses con la mediana de 3 ± 1,4 (rango de 2 a 7) muestras por paciente.

Figura 10. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en pacientes sin citorreducción. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde).

IV. RESULTADOS

74

Los resultados del cambio absoluto de la carga alélica JAK2V617F en este grupo de

pacientes, se presenta en la Tabla 22. Un descenso de la carga alélica JAK2V617F, en

valores absolutos (cambio ≥ 10%), se encontró solo en el 29% de los pacientes; 40% en PV

y 26% en TE. En los demás casos, la carga alélica JAK2V617F permaneció estable en el

38% o aumentó en el 18% de los casos. Finalmente, un 15% de los casos (n=5) mostraron

el patrón tipo “pico de sierra” (el aumento durante los primeros meses del tratamiento con

el posterior descenso de la carga alélica JAK2V617F).

CARGA ALELICA JAK2V617F Aumento Descenso Estable Pico sierra

Total (n=34) 6 (18%) 10 (29%) 13 (38%) 5 (15%) PV (n=10) 2 (20%) 4 (40%) 2 (20%) 2 (20%) TE (n=23) 4 (17%) 6 (26%) 11 (48%) 2 (9%) MFP (n=1) - - - 1 (100%)

Tabla 22. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo de pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada al diagnóstico y tratados con HDU (n=34).

Al comparar la media de la carga alélica JAK2V617F basal frente a la del final del

seguimiento no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos

valores ni en PV (46% vs 36%; p=0,400) ni en TE (18% vs 13%; p=0,092) (véase Figura 11

y Figura 12).

Finalmente, se valoró la respuesta molecular, según los criterios de ELN (véase Tabla 23).

En nuestra serie, no se detectó ningún caso de respuesta completa. En cambio la respuesta

parcial fue detectada en 40% (n=4) pacientes con PV y en 22% de TE (n=5). Basándonos en

la recomendación de ELN, no se valoró la respuesta molecular en los casos con la carga

alélica JAK2V617F basal ≤ 10%. Los criterios ELN no se pueden aplicar en pacientes con

evolución de la carga alélica JAK2V617F (%) tipo “pico de sierra” que, en nuestra serie,

representaron un 15% de los casos. Nosotros excluimos estos pacientes del análisis de la

respuesta molecular.

IV. RESULTADOS

75

PV con HDU de reciente inicio

0

20

40

60

80

100

-24 -12 0 12 24 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

JAK2-basal JAK2-final

p=0,400A BPV con HDU de reciente inicio

0

20

40

60

80

100

-24 -12 0 12 24 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0


p=0,400

100

80

60

40

20

0

JAK2-basalJAK2-basal JAK2-finalJAK2-final

p=0,400A B

FFigura 11. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en PV con citorreducción con HDU. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.


40

30

20

10

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

p=0,092BTE con HDU de reciente inicio

0

10

20

30

40

50

60

70

-24 -12 0 12 24 36 48 60

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A


40

30

20

10

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

p=0,092BTE con HDU de reciente inicio

0

10

20

30

40

50

60

70

-24 -12 0 12 24 36 48 60

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A

Figura 12. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en TE con citorreducción con HDU. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento del inicio de HDU.

IV. RESULTADOS

76

Diagnóstico Número JAK2V617F basal (%)

JAK2V617F último (%)

Variación JAK2V617F

1 4 6 +50

2 4 6 +50

3 6 7 +17

4 8 4 -50

5 10 4 -60

6 10 4 -70

7 10 2 -80

8 17 3 -82

9 Pico de sierra

10 Pico de sierra

11 18 33 +83

12 19 39 +105

13 19 14 -26

14 21 23 +9

15 22 19 -14

16 23 10 -56

17 23 13 -43

18 23 15 -35

19 24 29 +21

20 24 36 +12

21 26 2 -92

22 31 11 -64

Pacientes con TE

23 40 2 -92

1 9 25 +16

2 19 12 -36

3 21 10 -52

4 26 41 +58

5 32 17 -70

6 70 49 -30*

7 91 98 +8

8 100 38 -62

9 Pico de sierra

Pacientes con PV

10 Pico de sierra

MFP 1 Pico de sierra

Tabla 23. Cambios individuales de la carga alélica JAK2V617F en pacientes con PV y TE con el inicio de HDU posterior a la primera determinación de JAK2V617F. Pacientes con la carga alélica JAK2V617F basal ≤ 10% (color azul), pacientes con criterios de RC (color rojo). * JAK2V617F basal >50%.

IV. RESULTADOS

77

Para obtener datos a más largo plazo sobre la evolución de la carga alélica JAK2V617F en

pacientes a tratamiento con HDU, también se realizó el seguimiento de la mutación

JAK2V617F en 39 pacientes (24 PV, 13 TE, 2 MFP) con la primera determinación de

JAK2V617F realizada posteriormente al inicio del tratamiento con HDU (grupo 2). La

media del periodo del tiempo entre el inicio de HDU y la primera determinación de

JAK2V617F fue de 74 ± 50 meses (rango de 1 a 230). El seguimiento medio de la carga

alélica JAK2V617F en este grupo fue de de 108 ± 51 meses (rango de 33 a 266) con la

mediana de 4 muestras por pacientes (rango de 2 a 8). Al analizar el cambio absoluto de la

carga alélica JAK2V617F, en la mayoría de los casos se observó estabilidad o discreto

aumento (≥10%) a lo largo del periodo de seguimiento (véase Tabla 24). Solo en 4 casos de

PV se observó el descenso de la carga alélica JAK2V617F y en 1 caso de TE el patrón tipo

“pico de sierra”. Al comparar la media de la carga alélica JAK2V617F basal frente a la del

final del seguimiento, en caso de PV (véase Figura 13) no se detectó diferencia

estadísticamente significativa (p=0,456) entre ambos valores (56% vs 69%; p=0,456),

mientras que en TE (véase Figura 14) se observó el aumento de los valores del 22% al 34%

alcanzando la diferencia estadísticamente significativa (p=0,013).

CARGA ALELICA JAK2V617F Aumento Descenso Estable Pico sierra

Total (n=39) 15 (39%) 4 (10%) 20 (51%) - PV (n=24) 8 (33%) 4 (17%) 12 (50%) - TE (n=14) 6 (43%) - 7 (50%) 1(7%) MFP (n=1) 1 (100%) - -

Tabla 24. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo de pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada posteriormente al tratamientos con HDU (n=39).

IV. RESULTADOS

78

100

80

60

40

20

0


Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

PV con HDU de larga evolución

0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A Bp=0,456

100

80

60

40

20

0


Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0

JAK2-basalJAK2-basal JAK2-finalJAK2-final

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

PV con HDU de larga evolución

0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A Bp=0,456

TE (HDU pre JAK2)

0

20

40

60

80

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a J

AK

2 (%

)

A B


80

60

40

20

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

p=0,013TE (HDU pre JAK2)

0

20

40

60

80

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a J

AK

2 (%

)

A TE (HDU pre JAK2)

0

20

40

60

80

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a J

AK

2 (%

)

A B


80

60

40

20

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)


80

60

40

20

0

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

p=0,013

En 3 de los pacientes (2 con TE y 1 con PV) se dispone de estudio evolutivo durante el

tratamiento citorreductor y después de su suspensión (véase Figura 15) cuando se observó el

incremento de la carga alélica de la mutación JAK2V617F. Además en un paciente

(seguimiento en verde) tras reintroducir el tratamiento con HDU se observó de nuevo el

descenso de la carga alélica de JAK2V617F.

Figura 13. Evolución de la carga alélica en PV con el tratamiento con HDU de larga evolución (la primera determinación de JAK2V617F fue realizada posteriormente al inicio del tratamiento). A). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.

Figura 14. Evolución de la carga alélica en TE con el tratamiento con HDU de larga evolución (la primera determinación de JAK2V617F fue realizada posteriormente al inicio del tratamiento). A). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.

IV. RESULTADOS

79

4.2.4. Grupo con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos

Se dispone de seguimiento da la carga alélica en dos pacientes con MFsec sometidos a

trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH). En ambos pacientes se

observó negativización de la carga alélica de JAK2V617F (véase Figura 16): en el paciente

p237 al día +30 post trasplante y en el paciente p236 al día +141 post trasplante.

PV y retirada del tratamiento con HDU

0

20

40

60

80

100

-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

TE y retirada del tratamiento con HDU

0

10

20

30

40

50

60

70

-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a J

AK

2 (%

)

Reinicio HDU

PV y retirada del tratamiento con HDU

0

20

40

60

80

100

-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

TE y retirada del tratamiento con HDU

0

10

20

30

40

50

60

70

-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a J

AK

2 (%

)

Reinicio HDU

Figura 15. Incremento de la carga alélica al retirar el tratamiento con HDU en pacientes con PV (A) y TE (B). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). Las flechas rojas indican el momento de suspensión del tratamiento con HDU. En un pacientes (marcado en verde) se suspendió dos veces HDU (descenso de la carga alélica JAK2V617F con la reintroducción de HDU).

Alo-TPH

0

20

40

60

80

100

1 6 11 16 21 26 31Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Alo-TPH

0

20

40

60

80

100

1 6 11 16 21 26 31Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Figura 16. Evolución de la carga alélica en 2 pacientes sometidos a un trasplante alógenico de progenitores hematopoyéticos. En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). Las flechas indican el momento de realización de trasplante

IV. RESULTADOS

80

4.2.5. Grupo con progresión de NMP

Hemos definido la progresión como evolución de una NMP a otra NMP o a leucemia

mieloide aguda (LMA). Este hecho se presentó en 20 JAK2V617F-pos y se disponía de

análisis evolutivo de la carga alélica en 17 de estos casos: 14 (82,4%) con la progresión de

una NMP a otra NMP y 3 (17,6%) a LMA. El seguimiento medio de estos enfermos, desde

el diagnóstico hasta la fecha de finalización del estudio, fue de 118 ± 80 meses (rango de 49

a 364) y el tiempo medio desde el diagnóstico de la NMP hasta la progresión fue de 89 ± 58

meses (rango de 24 a 256) meses.

4.2.5.a. Progresión a otra NMP

De los 14 pacientes: 4 presentaron progresión de TE a PV y 10 a MFsec (7 TE y 3 PV). El

seguimiento medio del estudio de la mutación JAK2V617F fue de 26 ± 11 meses (rango de

5 a 45) con la media de 4 muestras por paciente (rango de 2 a 11). Dichos pacientes durante

el seguimiento recibieron diferentes líneas de tratamientos: 2 casos estaban sin

citorreducción, 3 con HDU de reciente inicio, 3 con HDU de inicio antiguo, en 3 casos se

administraron varias líneas de tratamiento y en 3 se retiró el tratamiento citorreductor. En

todos los casos de progresión de una TE a una PV (n=4) se observó el aumento de la carga

alélica JAK2V617F durante el seguimiento, alcanzando la diferencia significativa (p=0,012)

entre el valor basal y el final. La media de la carga alélica JAK2V617F pre-progresión fue

de 25 % ± 2, mientras que post-progresión fue de 40% ± 6 (véase Figura 17).

En el grupo que progresó de una TE o una PV a una MFsec (n=10) solamente en un caso se

disponía de valores pre-progresión (véase Figura 17) con un claro aumento de la carga

alélica a lo largo del seguimiento (de 27% a 69%). Este caso inicialmente fue diagnosticado

de TE, luego de PV y finalmente de MFsec (véase Figura 18A). En los 9 enfermos restantes,

IV. RESULTADOS

81

el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F fue iniciado una vez diagnosticada la

progresión, objetivándose igualmente un discreto (≥10%) aumento o estabilidad de la carga

alélica JAK2V617F (véase Figura 18B). No se alcanzó la diferencia estadísticamente

significativa (p=0,066) entre la carga alélica JAK2V617F basal y la final en este grupo de

pacientes.

Progresión TE-MFsec

0

15

30

45

60

75

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Casos con progresión (excepto a LMA)

0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A B

TE

¿PV?MFsec

Progresión TE-MFsec

0

15

30

45

60

75

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)


0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A BProgresión TE-MFsec

0

15

30

45

60

75

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)


0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

A B

TE

¿PV?MFsec

Figura 19. Evolución de la carga alélica JAK2V617F en casos de progresión a MFsec. A). Progresión durante el seguimiento desde TE a probable PV y finalmente a MFsec. B). Progresión previa al inicio del seguimiento. En la eje X se representan los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F.

100

80

60

40

20

0 JAK2-finalJAK2 basal

Progresión de TE a PV (n=4)

p=0,012

Progresión de TE/PV a MFsec (n=10)

p=0,066

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

100

80

60

40

20

0 JAK2-finalJAK2 basalJAK2-finalJAK2 basal

Progresión de TE a PV (n=4)

p=0,012

Progresión de TE a PV (n=4)Progresión de TE a PV (n=4)

p=0,012


p=0,066


p=0,066

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Figura 18. Evolución de la carga alélica JAK2V617F en pacientes con progresión de una NMP a otra NMP (TE a PV y TE/PV a MFsec).

IV. RESULTADOS

82

4.2.5.b. Progresión de una NMP a LMA

Se dispone de datos evolutivos (pre- y post-progresión) de la carga alélica en 3 casos con

transformación a una LMA: de PV (n=1), de TE (n=1) y de MFP (n=1). Dos casos habían

sido tratados con HDU y el otro con varias líneas de tratamiento. En el caso con PV la carga

JAK2V617F descendió del 100% a 59-66%. Los casos con TE y con MFI mostraron previo

a la progresión aumento de la carga alélica con posterior descenso en la fase de LMA,

incluso hasta objetivarse negativización de la mutación en el paciente con TE (véase Figura

19).

Transformación a LMA

0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49 61

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Transformación a LMA

0

20

40

60

80

100

1 13 25 37 49 61

Seguimiento (meses)

Car

ga a

lélic

a JA

K2

(%)

Figura19. Evolución de la carga alélica de JAK2V617FV617F en los pacientes con la progresión a LMA. Las flechas indican éxitus. En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%).

IV. RESULTADOS

83

5. Nuevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico

Los casos de NMP JAK2V617F-neg se estudiaron para determinar la frecuencia de las

mutaciones en el gen JAK2-exón 12 (en pacientes con sospecha de PV) y MPL (en

pacientes con sospecha de TE y MFP).

5.1. Estudio de las mutaciones en el gen JAK2-exón 12

Se estudiaron dos casos con poliglobulia y el diagnóstico no definido. La mutación JAK2-

exón 12 en ambos pacientes resultado ser negativa. El primer caso, tras revisión de los

criterios diagnósticos, fue reclasificado como eritrocitosis idiopática y el segundo se

clasificó como una TE (con moderada elevación de la hemoglobina).

5.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL

Se ha realizado el estudio de las mutaciones en el gen MPL en 45 de 54 pacientes

JAK2V617F-neg con el diagnóstico clínico de TE (n=41) y MFP (n=4).

La mutación MPL fue detectada en 4 de 45 pacientes (9%): en 2 con diagnóstico de MFP y

en los otros 2 con una TE. Se han detectado dos variantes de la mutación en el gen MPL: la

W515L en tres pacientes y la W515A en un paciente.

Las características clínicas y analíticas de este grupo de pacientes con MPL-pos se muestran

en la Tabla 25.

IV. RESULTADOS

84

DiagnósticoWHO 2008

MPL variante

Cariotipo Leucocitos (x109/L)

Hemoglobina (g/L)

Plaquetas (x109/L)

LDH al dx

Espleno- megalia

Transfor- mación

TE W515L 1996 (al dx): 46,XY.

2000: 46,XY,del(20)(q11) 7,00 14,6 900

379

SI MFsec

MFP

W515L Al dx: 46,XX 5,30 12,3 412 582 SI NO

MFP

W515L 1995 (al dx): 46,XY

2006: del cr 13 11,30 11,3 236

894

SI NO

TE

W515A Al dx: 46,XX 16,06 13,7 1301 329 NO MFsec

Tabla 25. Características clínico-analíticas de pacientes portadores de la mutación MPL. Abreviaturas: al dx significa realizado en el momento del diagnóstico.

IV. RESULTADOS

85

6. Cariotipo y JAK2V617F

Se dispone del estudio citogenético en 121 pacientes: 25 con diagnóstico de PV, 90 con TE

y 6 con MFP. En 119 casos el estudio fue realizado al diagnóstico. Dentro de este grupo,

solo en 7 (5,9%) pacientes se detectaron alteraciones del cariotipo: 1 (4%) con PV, 5 (5,5%)

con TE y 1 (16,7%) con MFP.

En 7 casos se dispone del estudio citogenético en el momento de la sospecha de la

progresión a MFsec o a LMA: todos los pacientes presentaron alteraciones en el cariotipo, la

mayoría con cariotipo complejo. En 6 de estos pacientes se disponía del cariotipo previo: 4

de ellos presentaban inicialmente el cariotipo normal y 2 patológico pero menos complejo

que en el estudio posterior (véase Tabla 26).

Las alteraciones citogenéticas parecen independientes del status de JAK2V617F, aunque el

limitado número de casos impide sacar conclusiones firmes.

IV. RESULTADOS

86

Diagnóstico Citogenética al diagnóstico

Citogenética seguimiento

JAK2V617F (%)

PV 47,XX,+9. N.D. 37 PV-AML 2002: N.D. 2008 (progresión a LMA):

64-69,XY,+der(1p),+del(2p),+3, +3,-4,+6,+6,+8,+8,+10, +11,+12,13,+14,+19,+19,del(20q12)x2,der(22q),+6marc[15]

100

TE 46,XY,del(9)(q22q23)[17] y 46,XX[3] N.D. 0 TE 46,XY,t(6;11),(q21;q23)[20]

SP: no alts. numéricas, ni estructurales N.D.

0

TE 45,X,-Y[20] N.D. 0 TE 46,XX [20]/47,XX,+19[3] N.D. 6 TE-MFsec 1998: 46,XX[28]/45,X[3] 2009 (progresión a MFsec): 46,XX/46,XX,del(1q),+1q,

del(5q),der(12q),-18 [7]; FISH: 5q33 (15%)

28

TE-MFsec 1996: 46,XY

2000: 46,XY,del(20)(q11.2)[4]/46,XY[16] 2004 (progresión a MFsec): 46,XY,del(20)(q11,2)[8]

0

TE-AML 2000: 46,XX 2009 (progresión a LMA): 44,XX, del(5q), +9, add(11p), add(12p),-13,-15,-16,-17,+marc [17]

25

TE-AML 2001: 46,XY 2008 (progresión a LMA): 5,XY,del(5q),del(7q), -8,-8, -11,-16,-17,-17,+5marc [9]

42

MFP

1995: 46,XY 2006: del(13)-30% gen Rb 0

MFP-AML 2002: 47,XY,+9 [14]/46,XY [9]; 2008 (progresión a LMA): 46,XY [11]/47,XY,+8 [9], más roturas cromosómicas [4 de 20]

37

Tabla 26. Pacientes con estudio citogenético anormal al diagnóstico o/y durante el seguimiento.

IV. RESULTADOS

87

7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F

Se analizó la distribución de subpoblaciones linfocitarias (definidas previamente en el

apartado 3.4 de Material y Métodos) en el grupo de 56 pacientes: 11 con PV, 44 con TE y 1

con MFP. La mutación JAK2V617F estaba presente en 39 (70%) de estos pacientes. El

seguimiento medio de los pacientes fue de 77 ± 71 meses (rango de 2 a 364 meses) y 8 de

estos pacientes presentaron datos de progresión: 3 casos de progresión de TE a PV y 5 de

TE o PV a MFsec. La mayoría de los pacientes recibió el tratamiento con HDU (n=39), 4

pacientes no recibieron ningún tratamiento y los demás (n=13) varias líneas del tratamiento.

De acuerdo con nuestros resultados, la única alteración constante (en 55% de los casos), fue

el discreto aumento de los valores de los linfocitos TNK (por encima de los valores de la

normalidad utilizados en nuestro laboratorio), mientras que en otras subpoblaciones

(linfocitos T CD3+, CD4-/CD8+, CD4+/CD8-, linfocitos NK CD3+/CD56+ y/o CD16+ y

linfocitos B CD19+) se detectaron valores normales o en una minoría valores descendidos

(véase Tabla 27).

Subpoblaciones linfocitarias

Anticuerpos monoclonales

Valores disminuidos

Valores aumentados

Valores normales

CD3+ 11 (20%) - 45 (80%) CD4+/CD8- 10 (18%) - 46 (82%) Linfocitos T CD4-/CD8+ 7 (12,5%) - 49 (87,5%)

Linfocitos TNK CD3+/CD56+ - 31 (55%) 25 (45%) CD3-/CD56+ 4 (7%) - 52 (93%)

Linfocitos NK CD3-/CD16+ 7 (12,5%) - 49 (87,5%)

Linfocitos B CD19+ 15 (27%) - 41 (73%) Tabla 27. Valores de subpoblaciones linfocitarias.

IV. RESULTADOS

88

No se encontró ninguna relación entre dichas alteraciones y la mutación JAK2V617F.

Tampoco hubó relación con otros datos clínicos o analíticos (trombosis, prurito,

esplenomegalia, cifra de hemoglobina, leucocitos ni plaquetas, progresión).

IV. RESULTADOS

89

8. Factores pronósticos y JAK2V617F

Los factores que puedan modificar la supervivencia de los pacientes con NMP son en su

mayoría los eventos vasculares y la progresión a MFsec u a LMA. En este apartado se

analiza la relación entre la mutación JAK2V617F y el pronóstico de los pacientes con NMP.

8.1. Supervivencia y JAK2V617F

La supervivencia global acumulada, analizada en la totalidad de NMP (n=175; 8 casos

excluidos), fue de 89% a los 5 años y de 78% a los 10 años. Por grupos la supervivencia a 5

años fue de 96% para la PV, 90% para la TE y 75% en el grupo con MFP. No hubo

diferencia entre la supervivencia en los pacientes con NMP JAK2V617F-pos y

JAK2V617F-neg (véase Figura 20). No se estudió la relación entre supervivencia y la carga

alélica JAK2V617F dado el pequeño número de casos. Durante el seguimiento fallecieron

19 (10%) pacientes y sólo en 5 de ellos la causa estaba relacionada probablemente con la

NMP: hemorragia digestiva aguda (n=1), isquemia intestinal (n=1), progresión a LMA

(n=3). Hubo dos éxitus por complicaciones asociadas al trasplante de precursores

hematopoyéticos. En los 12 casos restantes la muerte fue relacionada con: carcinoma

gástrico (n=1), cirugía de estenosis aórtica severa (n=1), neoplasia de pulmón (n=1) o causas

desconocidas (n=9).

IV. RESULTADOS

90

8.2. Eventos vasculares y JAK2V617F

Durante el seguimiento se produjeron 36 (20%) eventos vasculares graves: 32 trombóticos y

4 hemorrágicos. La distribución de las complicaciones vasculares según diagnóstico y

estatus JAK2V617F se muestra en las Tablas 12, 13 y 14.

No encontramos diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de

complicaciones trombóticas (p=0,521) al comparar los grupos JAK2V617F-pos y

JAK2V617F-neg.

Al analizar exclusivamente al grupo de NMP JAK2V617F-pos, los pacientes con la carga

alélica más alta presentaban tendencia a tener más eventos trombóticos, pero sin alcanzar la

diferencia estadísticamente significativa (véase Tablas 18 y 19). La carga alélica

JAK2V617F fue similar entre los pacientes con y sin eventos trombóticos (33% vs 25%

respectivamente; p=0,256). No hemos analizado por separado los eventos trombóticos

arteriales y venosos debido al bajo número de eventos.

Seguimiento (meses)

Sup

ervi

venc

ia a

cum

ulad

a

5004003002001000

1,00

0,95

0,90

0,85

0,80

0,75

0,70

CURVA KAPLAN MEIER

JAK2-POSJAK2-NEG

p=0,849

Seguimiento (meses)

Sup

ervi

venc

ia a

cum

ulad

a

5004003002001000

1,00

0,95

0,90

0,85

0,80

0,75

0,70

CURVA KAPLAN MEIER

JAK2-POSJAK2-NEGJAK2-POSJAK2-NEG

p=0,849

Figura 20. Comparación de la supervivencia entre los pacientes con NMP JAK2V617F-pos y NMP JAK2V617F-neg.

IV. RESULTADOS

91

8.3. Progresión y JAK2V617F

En nuestra serie, 23 pacientes presentaron progresión a lo largo del seguimiento: 4 casos de

TE a PV, 15 de TE/PV a MFsec y 4 de TE/PV/MFP a LMA. El tiempo medio desde el

diagnóstico de la NMP hasta la aparición de datos de progresión fue de 95,7 ± 54,6 meses

(rango de 24-256). El tiempo medio desde el diagnóstico de TE hasta la progresión a PV fue

de 50,6 ± 32,2 meses (rango de 24 a 100), de TE o PV a MF fue de 115,6 ± 57,8 meses

(rango de 46 a 256) y de TE o PV o MFP a LMA fue de 82,2 ± 22,4 meses (rango de 65-

114).

Como era de esperar todos los casos con transformación de una TE a una PV (n=4) fueron

JAK2V617F-pos. Pero también fueron JAK2V617F-pos todos los casos con transformación

a una LMA (n=4), y la mayoría de los pacientes con progresión a MFsec (11 casos

JAK2V617F-pos y 4 casos JAK2V617F-neg). A pesar de una más alta frecuencia de

progresión en la NMP JAK2V617F-pos frente a las NMP JAK2V617F-neg, la diferencia no

alcanzó significado estadístico (p=0,100).

La evolución de la carga alélica en relación a la progresión ya fue descrita previamente en el

apartado 4.2.5. de los Resultados.

92

V. DISCUSIÓN

V. DISCUSIÓN

93

1. Criterios diagnósticos WHO

1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación

En nuestra experiencia, hay una alta concordancia entre las clasificaciones WHO 2001 y

2008 para los casos con sospecha de PV (factor kappa = 1), observación que compartimos

con Kondo et al. [172]. Además, según Girodon et al, la incidencia de PV fue estable en el

período del tiempo de 1980 a 2007 [11] a pesar de la incorporación del estudio de la

mutación JAK2V617F. Por lo tanto la principal ventaja de la nueva clasificación WHO

2008 en el estudio del paciente con sospecha de PV es su simplicidad lo cual se debe sobre

todo a la incorporación de los nuevos marcadores clonales (JAK2V617F y JAK2V617F-

exón 12) y a la eliminación de los criterios de exclusión [10-11,161,173]. En la mayoría de

nuestros pacientes el diagnóstico se realizó o hubiera podido realizarse sin necesidad de una

biopsia ósea. Nuestros datos están de acuerdo con las recomendaciones de los expertos [10-

11,161,173]: el diagnóstico de PV en la mayoría de los pacientes puede realizarse solamente

al detectar la mutación JAK2V617F y los niveles bajos de la EPO. Esto no significa que el

estudio medular carezca de capacidad diagnóstica – véase el apartado 1.2 de la Discusión -

pero sí que puede ser omitido sin perder seguridad diagnóstica.

En cambio en la TE observamos una discordancia relevante entre los criterios WHO 2001 y

2008 (factor kappa = 0,43). Utilizando los criterios WHO 2008, pudimos confirmar el

diagnóstico en más pacientes con sospecha de TE, sobre todo en los que anteriormente no

fueron diagnosticados al presentar la cifra de plaquetas discretamente elevada. Nuestros

resultados son concordantes con un análisis similar recientemente publicado, en el cual

destaca como principal ventaja de los criterios WHO2008 para la TE JAK2V617F-pos, la

posibilidad de hacer diagnósticos más tempranos [11,174]. Destacamos que el análisis de

V. DISCUSIÓN

94

riesgo trombótico de TE en la que nosotros interpretamos como fase temprana de la

enfermedad (pacientes diagnosticados según criterios WHO 2008 y no según WHO 2001),

reveló que más de la mitad de ellos pertenecían al grupo de riesgo intermedio y alto. Así

que, la nueva clasificación WHO 2008 permite clasificar mejor a un grupo de pacientes con

patología probablemente en la fase más temprana pero no por ello de menos riesgo y que

por lo tanto se pueden beneficiar de un diagnóstico y tratamiento más precoz.

En conclusión la nueva clasificación WHO 2008 supone una clara mejora sobre la

clasificación anterior al simplificar el diagnóstico de las NMP y permitir el diagnóstico en

fases más tempranas de la TE. El diagnóstico en fases más precoces de la TE aumenta el

riesgo de confusión con una PV o una MPF en fases precoces o enmascaradas - véase el

Apartado 1.2 de la Discusión -. El estudio de la mutación de JAK2V617F (y otros

marcadores clonales) debe incorporarse en el estudio de los pacientes con sospecha de una

NMP.

1.2. Estudio histopatológico de las NMP WHO 2008

En los nuevos criterios WHO 2008, se ratifica la importancia del estudio morfológico de la

médula ósea como criterio mayor para el diagnóstico de TE y MFP y como criterio menor

para la PV [10]. La motivación del estudio morfológico medular viene dado en primer lugar

por la necesidad de excluir otros procesos que pueden cursar con trombocitosis, sobre todo

el SMD con trombocitosis [161]. Pero también la WHO le aporta al estudio morfológico de

la MO un valor diagnóstico propio [161]. En este aspecto hemos encontrado limitaciones del

estudio morfológico, a pesar de una revisión exhaustiva de las biopsias y aspirados de

médula ósea.

V. DISCUSIÓN

95

La principal limitación la encontramos en la ausencia de criterios morfológicos en algunos

pacientes con un claro diagnóstico clínico de NMP. Esta limitación afecta en mayor medida

a la TE ya que para su diagnóstico se exige el cumplimiento de todos los criterios, incluido

el estudio morfológico de la MO. En nuestra experiencia, la coincidencia entre el criterio

clínico y morfológico fue bastante buena, pero encontramos 7 casos (7%) de TE,

diagnosticados clínicamente y en 6 también con el apoyo del estudio mutacional de

JAK2V617F, los cuales sin embargo no podrían ser diagnosticados por falta de criterios de

diagnóstico morfológico (véase Tabla 8 y Tabla 11). Es destacable que dichos pacientes al

diagnóstico presentaban un recuento plaquetario menor de 800 x 109/L, por lo que se podría

especular que fueran formas incipientes de TE las cuales todavía no hubieran adquirido un

patrón morfológico característico. La evolución clínica después de varios años de

seguimiento sigue siendo compatible con el diagnóstico de una TE. Por ello el estudio

morfológico aporta información útil tanto para el diagnóstico positivo como para la

exclusión, pero no puede hacerse un diagnóstico firme de exclusión de NMP basado solo en

“ausencia de atipias morfológicas”. Teniendo en cuenta nuestros resultados pensamos que el

criterio morfológico de diagnóstico de la TE debería ser menos estricto al menos en

términos asistenciales [53,161,174].

En nuestra experiencia la coincidencia entre el diagnóstico morfológico y el clínico en la PV

fue muy alta, detectamos solamente discrepancia en dos casos (5%) que no presentaban

hallazgos morfológicos característicos. En la PV el estudio morfológico de la MO no es un

criterio imprescindible para el diagnóstico [10,161], pero dada la alta concordancia

encontrada entre el diagnóstico morfológico y el diagnóstico clínico, pensamos que el

estudio medular puede ser útil para excluir o confirmar los raros casos de PV negativos para

JAK2V617F y JAK2V617F-exón 12. Por lo tanto en la PV nuestra experiencia apoya la

utilidad de los nuevos criterios diagnósticos WHO.

V. DISCUSIÓN

96

La segunda limitación, que creemos que presenta el estudio morfológico, se refiere a la

dificultad para diferenciar entre si las distintas NMP. Según algunos autores [175], el estudio

morfológico de MO es capaz de detectar las formas incipientes de las NMP. Así fue

adoptado por la clasificación WHO 2001, donde las formas incipientes (junto con formas

tardías caracterizadas por marcada mielofibrosis) se catalogaban dentro de la entidad

llamada enfermedades mieloproliferativas crónicas (EMP) no clasificables [48]. En la

clasificación 2008 se reafirma la necesidad y la validez del estudio morfológico para

distinguir la verdadera TE de formas incipientes de PV o MFP (fase prefibrótica de MFP),

aunque dichas formas ya no se engloban dentro de una entidad “no clasificable”. Sin

embargo, otros autores señalan la baja reproducibilidad de la clasificación morfológica [52]

y reconocen que existen limitaciones de la morfología para diferenciar algunas fases de las

NMP [52-53]. Además se sugiere que la PV, la TE y la MFP pueden evolucionar a lo largo

del tiempo y la morfología de la MO es el reflejo actual de cada estadio de la NMP [53]. De

acuerdo con esta teoría, los pacientes se deben diagnosticar según las características del

momento del estudio, asumiendo como normal que una proporción de estos pacientes

evolucionará a otra NMP (cuadros de MFsec post-TE y post-PV) o que algunos no podrán

ser correctamente clasificados. Nuestra experiencia confirma estas observaciones,

especialmente por la limitación de los criterios morfológicos para el diagnostico de las

formas “incipientes” de NMP. En nuestra serie tuvimos 6 casos que al diagnóstico cumplían

criterios (analíticos y morfológicos) de TE según WHO 2008 y con el paso del tiempo

adquirieron rasgos típicos de una PV (n=4) o de una MFsec post-TE (n=2) (véase Tabla 10).

La nueva valoración morfológica, de la MO extraída al diagnóstico, no fue capaz de

diagnosticarlas como formas “incipientes” de PV o MFP, sino que confirmó el diagnóstico

de TE. Además, al realizar el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F en los cuatro

casos con progresión a PV (véase apartado de Resultados) y en un caso de progresión a

V. DISCUSIÓN

97

MFsec, se detectó el progresivo aumento de su valor, correspondiente con su presentación

fenotípica en aquel momento, lo que estaría de acuerdo con la teoría de progresión de la

enfermedad con el tiempo. Curiosamente, estos pacientes en el momento del diagnóstico, no

cumplían los criterios de WHO 2001 para TE ya que sus cifras de plaquetas fueron < 600 x

109/L. Por lo tanto al bajar el nivel de cifra de plaquetas necesario para el diagnóstico de TE,

nos encontramos con más “fallos” diagnósticos al no poder diferenciar una TE de una fase

incipiente de la PV o MFP con trombositosis. Sin embargo, desde el punto de vista clínico

este hecho no supone ningún cambio en la actitud terapéutica respecto a estos pacientes.

Al comparar la morfología medular (BMO y AMO) del grupo de TE JAK2V617F-pos

frente al de grupo de PV encontramos un patrón más mieloproliferativo y “eritrocítico” en la

PV y más trombocitósico en TE (véase Tabla 15). En el estudio de Campbell el at, se

observó que los pacientes con TE JAK2V617F-pos presentaban mayor grado de celularidad

total, a expensas de serie mieloide y eritroide, que los pacientes con TE JAK2 V617F-neg

[43]. En nuestra serie, el estatus de JAK2V617F entre los pacientes con TE, no se asoció

con características morfológicas específicas.

En conclusión nuestro estudio confirma que los nuevos criterios WHO 2008 simplifican el

proceso del diagnóstico de las NMP y en la TE ayudan en el diagnóstico de pacientes con

cifra de plaquetas no muy elevada, que no necesariamente presentan el riesgo trombótico

bajo. Además, sugerimos que la ausencia de hallazgos morfológicos anormales no es

suficiente para excluir el diagnóstico de una TE en presencia de un conjunto de datos

analíticos, clínicos y biológicos específicos. Por lo tanto la clasificación WHO para el

diagnóstico de la TE tiene limitaciones que deben tenerse en cuenta en la práctica clínica.

Sin embargo pensamos que la clasificación debería seguirse de modo estricto en los ensayos

clínicos.

V. DISCUSIÓN

98

2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en NMP (WHO 2008)

Nuestros resultados confirman que la mutación JAK2V617F está presente en la mayoría de

los pacientes con PV y en más de la mitad de los pacientes con TE y MFP [3-6]. Además, al

igual que en los estudios previos observamos (véase Tabla 12) la presencia del fenotipo

“tipo PV” en pacientes con NMP JAK2V617F-pos frente al fenotipo “tipo TE” en los casos

JAK2V617F-neg [4,43-44,46]. In vivo, se ha reproducido el fenotipo policitémico en

modelos murinos al realizar transplante de progenitores hematopoyéticos con células madre

hematopoyéticas transfectadas con la mutación JAK2V617F, caracterizado por eritrocitosis,

neutrofilia y descenso de cifra de plaquetas [84-86]. Algunos animales, después de unos

meses de seguimiento desarrollaban MFsec [4]. En nuestra serie, el fenotipo JAK2V617F-

pos se caracterizó por presentar valores más altos de hemoglobina, de recuentos

leucocitarios y de fosfatasa alcalina leucocitaria (FAL), mientras que la cifra de plaquetas y

el nivel sérico de la EPO están más bajos. Estos resultados son concordantes con estudios

previamente publicados [4,43-44]. Respecto a las características clínicas, la frecuencia de

esplenomegalia y progresión (de una NMP a otra o a LMA) parecen ser más frecuenten en

casos JAK2V617F-pos, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa, mientras

que no detectamos diferencia en la frecuencia de eventos trombóticos ni en la presencia de

prurito entre los pacientes JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg. Los estudios publicados no

son concluyentes acerca de la presencia de la asociación de esplenomegalia, prurito,

complicaciones trombóticas y progresión en NMP JAK2V617F-pos [3-5,43-44,46]. En el

apartado 8 de la Discusión profundizaremos el papel del estado de la mutación JAK2V617F

como factor de riesgo para trombosis.

V. DISCUSIÓN

99

En el análisis por subgrupos, los casos de TE (criterios WHO 2008) JAK2V617F-pos, en

comparación con los JAK2V617F-neg, se asemejan al cuadro de PV, tanto en nuestros

resultados (véase Tabla 13) como en los de otros autores [43]. Nuestros pacientes con TE

JAK2V617F-pos se caracterizaban por presentar los valores más altos de hemoglobina y

FAL así como más bajos los de plaquetas. Según algunos autores se sugería que los

pacientes con TE JAK2V617F-pos son formas “frustradas” de PV que con el paso de tiempo

se transforman en PV [43]. Sin embargo, a pesar de que las progresiones desde TE a PV

ocurren, no son tan frecuentes como se predecía de acuerdo con este modelo [43,176].

Además, los pacientes con TE JAK2V617F-pos presentan características biológicas

diferentes de los pacientes con PV, por ejemplo casi nunca presentan colonias homocigotas,

mientras que casi todos los pacientes con PV lo hacen [3-6,130,176]. Además, de acuerdo

con nuestros resultados, existen diferencias clínicas y analíticas entre los casos de TE

JAK2V617F-pos y la PV. La PV se caracteriza por un fenotipo más eritrocitósico y menos

trombopoyético (mayor frecuencia de esplenomegalia y prurito, cifra más altas de

hemoglobina, leucocitos y niveles séricos de LDH y más bajas de plaquetas en PV) (véase

Tabla 14) que al grupo de TE JAK2V617F-pos. En este momento se valora la posibilidad de

que el fenotipo final de la NMP depende de muchos factores como la carga alélica de

JAK2V617F (véase el apartado 3 de la Discusión), predisposición alélica, factores

dependientes del huésped y mutaciones adicionales [101,124-125,127,176].

A continuación valoramos si el estatus JAK2V617F guardaba alguna relación con la

morfología medular. Al estudiar el grupo total de NMP encontramos que los pacientes

JAK2V617F-pos presentaban el mayor grado de la celularidad total y de la serie eritroide y

los JAK2V617F-neg la mayor cantidad de megacariocitos. Nuestros datos no coinciden con

los publicados por Bousquet et al, según el cual no existía ninguna relación entre la

morfología de la MO y el estatus de JAK2V617F [177] en pacientes con NMP (PV, TE y

V. DISCUSIÓN

100

MFP). Esta diferencia tal vez se deba a la amplia variabilidad conocida entre diferentes

profesionales respecto a la interpretación del estudio morfológico [52]. El siguiente paso fue

analizar la relación entre la morfología de MO y el estatus JAK2V617F exclusivamente en

el grupo de TE. Al igual que en el estudio publicado por Larsen et al [178], no se encontró

relación entre las variables estudiadas (celularidad total, serie eritroide, mieloide y

megacariocitos) y el estatus de JAK2V617F. Sin embargo, otros autores describen mayor

celularidad total en TE JAK2V617F-pos frente a la TE JAK2V617F-neg [43,52] así como

aumento de la serie eritroide y mieloide en TE JAK2V617F-pos [43]. Es posible que la falta

de asociación detectada en nuestro estudio se deba a la pequeña cantidad de casos estudiados

en nuestra serie. Finalmente se analizó la morfología de MO exclusivamente en pacientes

JAK2V617F-pos comparando la distribución de las características morfológicas entre dos

grupos diagnósticos: PV vs TE JAK2V617F-pos (WHO 2008). Observamos, que cada

grupo diagnóstico (PV o TE) conservaba las características morfológicas propias, es decir la

mayor celularidad a expensas de serie eritroide en PV y la mayor cifra de megacariocitos en

TE.

Con el descubrimiento de la mutación en JAK2V617F surgió la propuesta de clasificar a las

NMP según la presencia o no de la mutación en JAK2V617F. El grupo de Cambell et al.

[43] defiende la clasificación de las NMP según su estado mutacional, sin embargo la nueva

clasificación WHO conserva la tradicional separación entre TE y PV en base a parámetros

analíticos y morfológicos sin considerar el estado mutacional en JAK2V617F. En nuestra

opinión, el estatus JAK2V617F-pos frente JAK2V617F-neg no aporta suficiente rasgo

diferencial para definir las NMP como entidades basadas en el estado mutacional Por lo

tanto consideramos adecuado mantener todavía la clasificación tradicional de las NMP en

base a su fenotipo clínico-analítico.

V. DISCUSIÓN

101

3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas

Una hipótesis postula que la TE JAK2V617F-pos y la PV deberían ser vistas como

“continuum biológico” y no como dos entidades distintas [43]. El fenotipo de estas

entidades podría estar influenciado por varios factores fisiológicos y genéticos [42,100,113,

124-125,127,178-179], entre ellos por la cantidad del alelo mutado JAK2V617F. Se ha visto

que los valores de la carga alélica de JAK2V617F se solapan entre diferentes fenotipos de

las NMP [136,140,142,178-179], pero también se ha descrito la asociación de la TE con la

carga alélica JAK2V617F menor de 50% [180], lo cual coincide con nuestros resultados.

Por lo tanto, en el caso de un paciente con sospecha de NMP con trombocitosis y carga

alélica de JAK2V617F >50%, el diagnóstico más probable es de PV o de fase prefibrótica

de MFP, mientras que el diagnóstico de TE es poco probable [180]. Vannucchi et al,

comenta la distribución de la carga alélica JAK2V617F entre las tres entidades (PV, TE y

MFP) en rangos: 1-15%, 26-50%, 51-57% y 76-100%. Según esta distribución, observamos

que más de 90% de pacientes con TE presenta valores bajos (<51%) de la carga

JAK2V617F, mientras que en los pacientes con PV los valores de la carga alélica están

distribuidos entre los cuatro rangos de manera bastante uniforme (1-25%: cerca de 20%; 26-

50% cerca de 35%, 51-75% cerca de 30% y 76-100% cerca de 20%) [136]. Los estudios que

analizan la homocigosidad señalan que cerca de 30% de pacientes con PV y solo una

proporción muy pequeña de pacientes con TE (<10%) presentan la mutación JAK2V617F

en estado de homocigosis, lo cual en términos cuantitativos se asocia con cargas alélicas ≥

de 50% [3-6,130,179]. Por lo tanto, de nuevo parece que los pacientes con TE tienen la

carga alélica menor de 50%. En nuestro estudio, la mediana de la carga alélica, determinada

al diagnóstico, en la PV fue de 40,5% (rango de 9 a 100%), en TE fue de 23% (rango de 4 a

44%) y en MFP de 37% (solo tres valores de 16, 37 y 57%). Hemos podido encontrar un

V. DISCUSIÓN

102

claro punto de corte (curva ROC) que separa la PV de la TE JAKV617F-pos: el valor entre

40 y 45% de la carga alélica de JAK2V617F diferencia con claridad entre estas dos

entidades. Por lo tanto, sugerimos igualmente que en estudios previos [179], que ante una

carga alélica JAK2V617F >50% y un cuadro clínico compatible con NMP no MFP se debe

sospechar PV con independencia del valor de la hemoglobina (PV “enmascarada”).

En el conjunto completo de casos, la carga alélica parece influir en la presentación clínico-

analítica de la enfermedad. En nuestra serie observamos, que existe una relación positiva

entre la carga alélica JAK2V617F y los valores de la hemoglobina, cifra de leucocitos y el

valor de FAL, así como una relación inversa con el recuento de plaqueta, estos resultados

son concordantes con otros estudios [124,133-137,139]. Respecto a la clínica, los pacientes

con la carga alélica JAK2V617F más alta presentaban mayor frecuencia de prurito y de

esplenomegalia, aunque ésta última no alcanzaba los valores significativos, estos datos son

concordantes con estudios previos [124,133,135-139]. Acerca de las complicaciones

trombóticas y progresión la literatura muestra resultados discrepantes [135,137,141]. En

nuestro estudio, los eventos trombóticos parecen ser más frecuentes en pacientes con la

carga alélica más alta, pero sin alcanzar diferencia significativa (p=0,051) (véase el apartado

8 de la Discusión). No encontramos relación entre la carga alélica JAK2V617F y la

aparición de progresión (véase el apartado 8 de la Discusión).

Finalmente, hemos estudiado el significado de la carga alélica JAK2V617F y la morfología

de MO, encontrando una relación positiva con el grado de celularidad total a expensas de

serie eritroide y mieloide. Al contrario, la carga alélica más baja se asoció con el aumento de

megacariocitos. No hemos encontrado ningún estudio que analice las características

morfológicas con la carga alélica JAK2V617F como hemos hecho nosotros.

V. DISCUSIÓN

103

En conclusión, además del estado mutacional, la carga alélica aporta información de utilidad

diagnóstica al asociarse valores muy altos con la PV, en cambio valores bajos no pueden

discriminar una PV de una TE JAK2V617F-pos. Como ya comentamos antes la ausencia de

la mutación en JAK2V617F permite excluir la PV casi en el 100% de los casos. En los

criterios diagnósticos actuales WHO 2008, se incorporó el estatus de la mutación

JAK2V617F como marcador clonal. Nuestro estudio sugiere que la incorporación del

estudio de la mutación JAK2V617F en términos de carga alélica podría añadirse a la

clasificación diagnóstica, mejorando la discriminación entre la TE y la PV.

Además, hemos visto que carga alélica JAK2V617F se asocia con algunos parámetros

clínicos y analíticos - cifras altas de hemoglobina y de leucocitos, mayor frecuencia de

prurito y de esplenomegalia. Sin embargo pensamos que sería necesaria una serie mucho

más grande para conocer el significado de la carga alélica JAK2V617F en términos clínicos

(relación con trombosis y progresión). El estudio evolutivo de la carga alélica JAK2V617F,

que discutimos en el apartado 4 de la Discusión, sugiere necesidad de valorar su utilización

como un marcador de la evolución de las NMP.

V. DISCUSIÓN

104

4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica

En el apartado anterior hemos comentado la relación entre la carga alélica de JAK2V617F

en un momento concreto con las características clínico-analíticas de los pacientes. En este

apartado analizamos los resultados de la evolución de la carga alélica en el tiempo.

Se dispone de escasa información sobre la evolución de la carga alélica de la mutación

JAK2V617F y su implicación clínica en los pacientes con NMP.

En los pacientes JAK2V617F-neg, al igual que en estudios previos, hemos demostrado que

el estatus mutacional se mantiene sin cambio a lo largo del seguimiento [43,140-141]. Por lo

tanto las NMP JAK2V617F-neg son procesos biológicamente diferentes de las NMP

JAK2V617F-pos. Además, con las técnicas de detección altamente sensibles (sensibilidad

de AS-PCR en general es de 0,01-0,1% y en nuestro laboratorio es de 2%), es posible

descartar razonablemente que ni siquiera una minoría de las NMP JAK2V617F-neg pueden

presentar la mutación en niveles por debajo de la sensibilidad de nuestra técnica. En la

práctica clínica diaria, la implicación de este hecho es la no necesidad de repetir el estudio

mutacional en JAK2V617F-neg a lo largo del seguimiento en las NMP JAK2V617F

negativas.

En los pacientes JAK2V617F-pos, todos los estudios realizados hasta la fecha fueron

retrospectivos y los grupos analizados fueron muy heterogéneos tanto respecto a la duración

de la enfermedad y tratamientos recibidos como a las técnicas y el material (DNA de

granulocitos de sangre periférica o de médula ósea) utilizado para la determinación de la

carga alélica JAK2V617F. Tampoco están bien definidos los criterios según los cuales se

valoraba el cambio de la carga alélica JAK2V617F [133,141,143,147,181-182].

V. DISCUSIÓN

105

Nosotros hemos realizado el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F de manera

ambispectiva en el grupo de 96 pacientes con NMP JAK2V617F-pos. Además, a la hora de

realizar comparaciones, hemos dividido a los pacientes en subgrupos bastante homogéneos.

Sin embargo, nuestro estudio en el seguimiento se adaptó a la práctica asistencial lo que

limita la cantidad de información obtenida y su interpretación.

Primero observamos, que la variación de la carga alélica JAK2V617F (valor relativo) en el

conjunto de los casos analizados en nuestra serie fue casi estable, objetivándose sólo una

ligera desviación positiva (+22%) desde la línea basal (que significa no cambio de la carga

alélica JAK2V617F). Hay dos pequeñas series, una en 48 pacientes con PV y TE [143] y

otra en 19 TE [141] que también indican que la carga alélica JAK2V617F se mantiene

estable durante el seguimiento en la mayoría de los pacientes. Pero también encontramos

estudios según cuales la carga alélica JAK2V617F presenta tendencia al aumento a lo largo

del seguimiento como el estudio de Hussein et al, realizado en 145 casos (39 TE, 14 PV y 92

MFP) y determinación de JAK2V617F en muestras de MO [180] o el estudio de Antonioli

et al, realizado en 64 casos (40 PV y 24 TE) con larga evolución de la enfermedad [183]. El

planteamiento de otros estudios ha sido comparar la carga alélica de JAK2V617F en

diferentes grupos de pacientes con distinto seguimiento, pero los resultados tampoco son

concordantes [133,138]. Por un lado, Tefferi et al [138] analizando la carga alélica

JAK2V617F en muestras de MO en 123 pacientes con PV (57 pacientes a 1 año del

diagnóstico, 20 a 5 años y 16 con más de 5 años de seguimiento), encontró que los pacientes

con el seguimiento mayor de 5 años presentan la carga alélica más alta en comparación con

otros grupos. En cambio, Kittur et al, en 96 casos de TE (40 pacientes a 1 año del

diagnóstico, 31 entre 1-5 años y 25 más de 5 años post diagnóstico) no vieron diferencia en

la carga alélica JAK2V617F entre los tres grupos (en SP) [133]. Finalmente Barosi et al, en

un estudio realizado en 64 casos de MFP, con el seguimiento mayor de 8 años, sugiere el

V. DISCUSIÓN

106

aumento de la cantidad de la mutación JAK2V617F con el paso del tiempo al observar

frecuente transformación del estado de heterocigosis a homocigosis en estos pacientes [40].

Con estos datos, en nuestra serie profundizamos en el estudio de la evolución de la carga

alélica JAK2V617F en casos individuales teniendo en cuenta el tiempo de evolución de la

enfermedad, el tratamiento administrado y evolución clínica (progresión) de los pacientes.

El cambio (absoluto) de la carga alélica lo definimos como la diferencia ≥ 10% de la carga

alélica JAK2V617F entre la primera y la última determinación y encontramos que más de la

mitad de los pacientes con NMP presentaron dicho cambio. Los cambios absolutos

ocurrieron tanto en la PV como en la TE, y presentaron bien un patrón en ascenso, o

descenso o en picos de sierra.

Primero analizamos la posible relación entre la evolución de la carga alélica JAK2V617F y

el tratamiento. En nuestra serie, la mayoría de los pacientes (n=73) recibieron HDU y en

casi la mitad (n=34) el tratamiento fue iniciado posteriormente a la primera determinación

de JAK2V617F (inicio reciente). En un tercio de estos pacientes, detectamos el descenso

absoluto (≥ 10%) de la carga alélica JAK2V617F, este fue generalmente discreto o

moderado (entre 10 y 20%), y la comparación de los valores medios basales y finales no fue

estadísticamente significativo (p=0,074). En el estudio realizado por Theocharides et al, en 5

de 6 de los pacientes con el inicio reciente de HDU, se observó el descenso de la carga

alélica JAK2V617F después de 6 meses del seguimiento [143]. Igualmente Girodon et al,

describen el descenso de la carga JAK2V617F en 36 pacientes con PV y TE desde el valor

medio al diagnóstico de 43% a 24% después de 5 meses del tratamiento con HDU [147].

Ricksten et al [184] describen un importante descenso de la carga alélica (sin presentar

valores) de la carga alélica después del seguimiento de 4 meses en 18 pacientes (9 PV de y 9

V. DISCUSIÓN

107

de TE). Finalmente, Antoniolli et al [183], al analizar 44 pacientes con el seguimiento medio

de 29 meses, observa sólo un discreto descenso de la carga alélica JAK2V617F en pacientes

con el inicio reciente de HDU (de 45% a 41% con p=0,7 en PV y de 38% a 35% con

p=0,024 en TE).

No hemos podido en nuestra serie, analizar con detalle la secuencia de la evolución de la

carga alélica JAK2V617F a largo plazo de modo prospectivo, si bien parece que el descenso

ocurre más frecuentemente antes de los primeros 24 meses del tratamiento. Sin embargo, de

acuerdo con nuestros resultados, no es improbable encontrar casos de descenso de la carga

JAK2V617F más tarde de los 24 meses de seguimiento. Estos resultados están en

concordancia con estudios que, al igual que nosotros, han analizado el papel de la HDU en

la carga alélica y apoyan que hay un rápido descenso de la carga alélica en los pacientes con

PV y TE en los que se iniciaba el tratamiento con HDU [143,145,147,183-184].

El papel de la HDU en la carga alélica se refuerza con las observaciones de aumento de la

carga alélica JAK2V617F-pos al suspender el tratamiento con HDU y su posterior descenso

al reiniciarlo. Al igual que nosotros, este hecho también ha sido descrito en otra pequeña

serie [143].

Recientemente, los expertos de European LeukemiaNet (ELN) publicaron la propuesta de

valoración de criterios de respuesta molecular en pacientes con NMP. De acuerdo con estos

criterios, la respuesta molecular completa se define por la negativización de la mutación y la

respuesta parcial se define como disminución ≥ 50% desde la línea basal en pacientes con la

primera determinación de JAK2V617F entre 10 y 50% y ≥ 25% en pacientes con la primera

determinación JAK2V617F > 50% [150]. Además, la respuesta molecular no puede

valorarse con estos criterios en pacientes con un valor basal de JAK2V617F < 10%. Hasta

V. DISCUSIÓN

108

ahora, solo en un estudio se analizó la respuesta molecular en los pacientes tratados con

HDU [183]: no se encontró ningún caso de la respuesta completa y la respuesta parcial fue

vista en un 15% (n=3) de TE y 12% (n=3) de PV. Utilizando los criterios de ELN, en

nuestra serie no se dio ningún caso de la respuesta completa, pero si detectamos varios casos

con respuesta parcial (RP): en PV 40% (n=4) y en TE 35% (n=8). La aplicación de los

criterios de respuesta molecular del ELN tiene dificultades. En nuestra serie no pudimos

aplicarlos en 32% (n=7) casos con TE por partir de valores bajos de TE, y tampoco es

posible interpretar el cambio de la carga alélica en términos de respuesta molecular en

aquellos casos con evolución de la carga alélica en patrón de pico de sierra lo cual ocurrió en

el 15% de nuestros pacientes.

Se ha sugerido [43,145,185] que dicha reducción de la carga alélica JAK2V617F con HDU

durante los primeros meses del tratamiento podría estar en relación con la inicial

hipersensibilidad del clon mutado JAK2V617F-pos a HDU. En nuestra serie no observamos

diferencias en la tasa de respuesta hematológica entre las NMP JAK2V617F-pos y

JAK2V617F-neg, pero no hemos analizado la dosis de HDU. Al menos dos estudios

sugieren que las NMP JAK2V617F-pos [43] o las NMP con alta carga alélica [185] son más

quimiosensibles a la HDU que las JAK2V617F-neg o con baja carga alélica lo cual se

traduce en una menor necesidad de HDU. El descenso de la carga alélica JAK2V617F

también se ha descrito con el IFN, pero parece que el grado o el mecanismo de acción son

diferentes. Con HDU no se ha visto respuesta citogenética ni la reversión a la hematopoyesis

policlonal, lo cual si puede ocurrir con INF [145]. No se conoce si el descenso de la carga

alélica JAK2V617F tiene implicación en la evolución clínica de los enfermos.

Otro grupo que analizamos fueron los pacientes con el tratamiento con HDU de larga

evolución (la primera determinación de JAK2V617F realizada después del inicio del

V. DISCUSIÓN

109

tratamiento con HDU). Al comparar nuestros resultados con las publicaciones previas, no

podemos sacar conclusiones firmes acerca de este tema. Por un lado, de acuerdo con Larsen

et at [179], los valores de la carga JAK2V617F en PV y TE recientemente diagnosticados,

frente a los valores de JAK2V617F en casos ya previamente tratados y con el seguimiento

más largo (media de 64 meses), tienden a ser más altos aunque no se alcanza la diferencia

estadísticamente significativa. Girodon et al, comparan la carga alélica en pacientes al

diagnóstico frente al grupo que ya estaba con HDU (de media de 32 meses) antes del estudio

y observan que en caso de PV la carga JAK2V617F es más baja en el grupo tratado frente al

grupo de diagnóstico (44% vs 54% respectivamente), mientras que en el grupo de TE no se

detectaba la diferencia [147]. Otros autores aportan resultados totalmente opuestos: Tefferi

et al, describe el aumento de la carga alélica JAK2V617F en PV [138] y Antoniolli et al

[183] con TE.

Nosotros también hemos estudiados el seguimiento de la carga alélica en el grupo de

pacientes con la primera determinación pos tratamiento y habitualmente de larga evolución.

Este análisis reveló, que la mayoría de los pacientes presentaba estabilidad (50% con PV y

57% con TE) o aumento (33% con PV y 43% con TE) de la carga alélica JAK2V617F, y

solo en el 17% de pacientes con PV observamos un descenso de la carga alélica

JAK2V617F. Al comparar las medias de las cargas alélicas basales con los valores finales,

observamos un discreto aumento tanto en PV como en TE (56 y 60% vs 22% y 34%

respectivamente), sin embargo la diferencia estadísticamente significativa fue detectada

solamente en casos de TE (p=0,013), pero no en la PV (p=0,456), resultados comparables al

estudio de Antonioli et al [183].

En nuestro estudio analizamos también el seguimiento de la carga alélica en un pequeño

grupo de pacientes (n=10) sin citorreducción con HDU. Encontramos un aumento de la

V. DISCUSIÓN

110

carga alélica durante el seguimiento (desde 20 a 30%) sin alcanzar diferencia significativa.

La mayoría de los estudios publicados hasta la fecha presentan datos compatibles con la

estabilidad de la carga alélica en estos casos [141,143,183] por ejemplo en el estudio

realizado por Antonioli, la carga alélica en PV aumentó de 44% a 49% y en TE de 27% a

31% respectivamente sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa. Solamente, en

el estudio publicado por Carobbio et al, realizado en TE con el seguimiento mayor de 10

años, se comenta el aumento significativo de la carga alélica JAK2V617F [134].

En el caso de alo-TPH, hemos confirmado la negativización de la mutación JAK2V617F,

como se reportaba en estudios previos [143,148-149]. Se sugiere que la determinación

cuantitativa de JAK2V617F podría servir como un marcador de respuesta post transplante

alo-TPH [148-149].

Otra causa de variabilidad de la carga alélica podría ser la progresión de la enfermedad. En

nuestro estudio, todos los enfermos con progresión de TE a PV (n=4) presentaron una

duplicación de la carga alélica en el momento del cambio (de 25,2 % al inicio a 40% post

diagnostico de PV con p significativa). El cambio de la carga alélica asociado a la evolución

de una TE a una PV es esperable, pues pensamos que son casos de PV en fase “incipiente”.

Esta evolución también ha sido descrita en otras pequeñas series [180,186] de pacientes. En

la progresión a MFsec, sugerimos que la carga alélica JAK2V617F podría presentar un

aumento durante y post-progresión. Sin embargo, nuestros resultados no son concluyentes

ya que en nuestra serie no encontramos diferencia estadísticamente significativa entre el

valor medio inicial y final en este grupo (52% vs 69% respectivamente) y solamente en un

caso se disponía de valores previos y posteriores a la progresión a MFsec (27% vs 69%

respectivamente). Algunos autores comentan que la carga alélica JAK2V617F en pacientes

con MFsec es más alta al compararla con la carga alélica de JAK2V617F en casos con otros

V. DISCUSIÓN

111

diagnósticos (PV, TE y MFP) [140]. En otro estudio realizado por Guglielmelli et al, se

observó que la carga alélica JAK2V617F en MFsec post PV es cercana a 100% y en la

MFsec post TE es mayor del 50% [187]. Por ello se ha sugerido que uno de los mecanismos

de evolución hacia la MFsec podría estar relacionado con el “acúmulo” de los alelos

mutados JAK2V617F [187]. Sin embargo, para poder sacar conclusiones firmes acerca de la

evolución temporal de la carga alélica JAK2V617F en estos pacientes habría que realizar el

estudio de seguimiento prospectivo, en un amplio grupo de pacientes.

La carga alélica JAK2V617F también cambia cuando se produce una progresión de una

NMP a una LMA, esto ocurrió en tres de nuestros pacientes: dos casos con descenso de la

carga alélica JAK2V617F y un caso con negativización de la mutación JAK2V617F. De

acuerdo con los trabajos publicados hasta la fecha, la progresión a LMA aparece tanto en

pacientes JAK2V617F-pos como JAK2V617F-neg [43-44,142,188-189]. Además, en

pacientes JAK2V617F-pos, en alrededor de 50% de los casos, en el momento del

diagnóstico de LMA se objetiva negativización de la mutación JAK2V617F [38,143,188].

En el momento actual, coexisten dos teorías para la explicación de este fenómeno. Para

ambas existen estudios que le apoyan [39,106,116,143,189-190]. La primera es que la LMA

y NMP se desarrollan en dos diferentes clonas JAK2V617F-neg y JAK2V617F-pos

respectivamente. La otra propone que tanto la LMA como NMP son subclonas que

provienen de una clona común JAK2V617F-neg y en la patogénesis de la NMP aparece otro

evento adicional que es responsable de la adquisición de la mutación JAK2V617F [38-

39,190-191].

Resumiendo nuestros resultados y el análisis de la literatura, la carga alélica JAK2V617F en

el grupo total de los pacientes se mantiene bastante estable. Sin embargo, puede cambiar a lo

lardo de seguimiento en algunos de los pacientes. De acuerdo con los estudios mencionados

V. DISCUSIÓN

112

previamente y nuestros resultados, el tratamiento citorreductor con HDU se puede asociar a

descenso inicial de la carga alélica, pero sólo en algunos de los pacientes. La nueva

propuesta de respuesta molecular necesita ser validada para poder sacar conclusiones sobre

su utilidad en el control de la respuesta al tratamiento con HDU. Otro factor que pueda

tener influencia en la carga alélica de JAK2V617F es el tiempo de evolución de la

enfermedad y aparición de progresión de una TE o PV a MFsec. Estas variables son la causa

de aparentes discrepancias en los distintos estudios publicados acerca de la evolución de la

carga alélica JAK2V617F. Para un conocimiento más profundo de la evolución de la carga

alélica y su relación con la clínica en NMP se precisa de otro diseño de estudio (prospectivo)

en grupos muy homogéneos de pacientes y probablemente utilizando otro tipo de análisis

estadístico (medidas repetidas). Sin embargo el interés de este tipo de estudios estaría

asociado a nuevos tratamientos con mayor capacidad de modificar la carga alélica, como se

sugiere con los inhibidores del JAK2 [192-193].

V. DISCUSIÓN

113

5. Nuevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico

La mutación JAK2V617F no está presente en todas las NMP, aparece en más de 95% de

pacientes con PV y pero solo en el 50% de la TE y MFP [3-6,161]. Además, aunque se ha

visto que dicha mutación tiene un papel importante en la patogénesis de las NMP [4-5, 84-

86], se postula que no es el evento clónico inicial para el desarrollo de NMP [100,105-

109,127-128]. Por lo tanto, se están buscando otras mutaciones para las NMP JAK2V617F-

neg, e incluso en las NMP JAK2V617F-pos podría haber otros eventos genéticos que

precedan a la adquisición de la mutación JAK2V617F.

Las nuevas mutaciones descritas hasta la fecha fueron la mutación JAK2V617F-exón 12,

MPL y más recientemente las mutaciones TET, CBL, ASXL1, IHD, IKZF1 [100-116].

Actualmente, ya se conoce la implicación de la mutación JAK2V617F-exón 12 y MPL en la

patogénesis de las NMP y el hecho de que, al igual que la mutación JAK2V617F, son los

eventos secundarios a otro evento genético inicial [103,105-114,117,128]. Además, ambas

mutaciones JAK2-exón 12 y MPL han sido incorporadas en los nuevos criterios

diagnósticos de NMP WHO 2008, especialmente para facilitar el diagnóstico en casos de

pacientes JAK2V617F-neg [10].

En nuestra serie, estudiamos solo dos pacientes para la mutación JAK2V617F-exón 12,

ambos resultaron negativos. La mutación en el gen JAK2V617F-exón 12, a pesar de su baja

frecuencia en pacientes con PV (3-5%) es el marcador típico de la PV JAK2V617F-neg

[161]. Dicha mutación está además asociada invariablemente con los niveles bajos de EPO y

con la presencia de formación de colonias eritroides, por lo tanto los pacientes portadores de

dicha mutación ya cumplen los criterios de WHO 2008 para la PV [161]. En caso de uno de

V. DISCUSIÓN

114

los pacientes estudiados por nosotros para la mutación JAK2V617F-exón 12, su negatividad

junto con niveles altos de EPO nos ayudó a descartar el diagnóstico de NMP.

La mutación MPL aparece en pacientes con TE (4%) y MFP (11%), sobre todo en casos

JAK2V617F-neg [103-104,113-115], sin embargo hay casos descritos de coexistencia de las

dos mutaciones [113-115,194-195]. En nuestro trabajo, la mutación MPL fue estudiada en

los pacientes JAK2V617F-neg y la encontramos solo en 2/41 (5%) de pacientes con TE

JAK2V617F-neg, frecuencia que es similar a la publicada [103-104]. En cambio en la MFP

encontramos la mutación MPL en 2 de 4 (50%) MFP JAK2V617F-neg, es decir con la

frecuencia más alta de la esperada. Sin embargo, teniendo en cuenta el número limitado de

casos, no se puede sacar conclusiones firmes acerca de estos resultados. Hasta la fecha se

han descrito diferentes variantes de la mutación MPL, de las cuales funcionalmente

relevantes, son la mutación MPL-W515K, MPL-W515L, MPL-W515A y MPL-S505N

[112-114]. En nuestro estudio detectamos dos de estas variantes: W515L (n=3) y W515A

(n=1). La variante W515L es la que aparece con mayor frecuencia y la W515A en casos

aislados [112,195]. Finalmente, dada el pequeño número de casos portadores de la mutación

MPL en nuestra serie, no podemos sacar conclusiones firmes acerca de la presentación

clínico-analítica de estos pacientes. Cabe subrayar, que los dos pacientes inicialmente

diagnosticados como TE MPL-pos presentaron progresión a MFsec. En la literatura hay

varias publicaciones que analizan la implicación clínico-analítica de la mutación MPL en la

presentación clínica de las NMP. Según el modelo realizado en ratones, la mutación en el

gen MPL induce mieloproliferación caracterizada por esplenomegalia, leucocitosis, marcada

trombocitosis, hematopoyesis extramedular y mielofibrosis [103]. La mutación

MPLW515L/K en MFP, según el estudio retrospectivo realizado en 217 pacientes, se asocia

con mayor severidad de anemia y por lo tanto mayor requerimiento transfusional, sexo

femenino y edad avanzada [196]. En caso de TE, la mutación MPLW515L/K se relaciona

V. DISCUSIÓN

115

con mayor edad, anemia y mayor cifra de plaquetas, sintomatología microvascular y mayor

riesgo de trombosis arterial posterior al diagnóstico [197-198].

Finalmente, en nuestro estudio no pudimos valorar la utilidad de la detección de MPL a la

hora de diagnosticar a los pacientes con NMP JAK2V617F-neg dado el pequeño número de

casos. Es posible que al estudiar la mutación MPL con la técnica de secuenciación, no

fuimos capaces detectar todos los casos en nuestra serie. Sin embargo, en general el valor de

la mutación MPL como marcador clonal es limitado dada su baja frecuencia en NMP

JAK2V617F-neg [161].

En conclusión la mutación en exón 12 de JAK2V617F ofrece una importante ayuda

diagnóstica para los pocos casos de PV JAK2V617F-neg, la ausencia de ambas mutaciones

en nuestra experiencia descarta una PV de modo absoluto. En cambio el estudio de la

mutación MPL tiene menos utilidad diagnóstica pues sólo está presente en una minoría de

TE JAK2V617F-neg, pero su presencia tiene un alto valor confirmatorio de NMP tipo TE o

MFP.

V. DISCUSIÓN

116

6. Cariotipo y JAK2V617F

En nuestra serie las frecuencia de anomalías citogenéticas fue solo del 5,9% (n=7) y

comparable a la informada en otros estudios [155-158,162-164]. La mayor frecuencia de

alteraciones citogenéticas se presentan en la MFP (cerca de 40%), seguidos de PV (35%) y

TE (3%). En nuestro análisis, la frecuencia por subgrupos fue algo diferente: 4% en PV

(n=1), 5,5% en TE (n=5) y 16,7% en MFP (n=1), sin embargo, dado limitado número de

casos, no se puede sacar conclusiones firmes acerca de estos resultados.

En nuestra serie, no hemos encontrado asociación entre la presencia o ausencia de la

mutación JAK2V617F y anomalías citogenéticas. En la literatura hay informes discrepantes

acerca de este tema. Por un lado Campbell et al, al analizar un amplio grupo de pacientes

(n=767), opina que existe asociación de la mutación JAK2V617F con dos anomalías

citogenéticas, la del20q y la trisomía 9, y la ausencia de la mutación JAK2V617F con la del

13q y la pérdida del cromosoma 7 [38] Otras series más pequeñas no han corroborado estos

datos [3,43,157-158].

De acuerdo con la literatura, no se han encontrado claras asociaciones entre alteraciones

citogenéticas y el pronóstico en la PV y la TE [157-158,162], mientras que en MFP se está

valorando la incorporación del estudio citogenético dentro de los criterios pronósticos

[66,155-156,163-164]. Nosotros basándonos en nuestra casuística no podemos aportar

información relevante en este aspecto.

En conclusión la citogenética en las NMP puede ser de utilidad diagnóstica como marcador

de clonalidad aunque su frecuencia es baja. Probablemente la nuevos métodos de estudio

citogenético puedan ampliar el conocimiento. Como continuación de este proyecto tenemos

ya iniciada una línea de investigación con SNP array [199].

V. DISCUSIÓN

117

7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F

El sistema inmunológico puede participar en la patogenia de las enfermedades tumorales a

través del inadecuado desarrollo de la respuesta defensiva e incluso puede llegar a facilitar la

supervivencia de las células neoplásicas. Apenas se han estudiado las alteraciones

inmunológicas en los pacientes con NMP. En una serie de 8 casos con PV se encontró una

pobre respuesta linfocitaria T in vitro a mitógenos [200]. En nuestro grupo a estudio, en un

porcentaje pequeño de los pacientes, observamos un discreto descenso de los linfocitos T

CD3+ (tanto CD4+ como CD8+), las células NK (CD56+/CD3-) y linfocitos B (CD19+).

En cambio los linfocitos TNK (CD3+/CD56+) estaban aumentados en más de la mitad de

los pacientes.

No podemos comparar nuestros resultados con otros estudios, ya que hasta ahora no se

realizó un estudio similar. En la LMC se ha sugerido una asociación entre el descenso de la

subpoblación de linfocitos NK y la evolución a progresión [201-203]. Nosotros no hemos

hallado una relación entre las alteraciones descritas previamente con presencia de progresión

ni con otros datos clínicos ni analíticos. Nuestro estudio fue realizado en distintos momentos

evolutivos, lo que puede dificultar la explicación para estas alteraciones inmunológícas.

En los modelos animales, la deficiencia del gen JAK2 resulta ser letal [165-166], por lo

tanto no se dispone de estudios acerca de su papel en el sistema inmunológico. En este

momento se están ensayando varios inhibidores del gen JAK2V617F en pacientes con

NMP. De estos ensayos aprendremos si es seguro inhibir o no el gen JAK2V617F. En

nuestro estudio no encontramos relación entre las alteraciones cuantitativas en las

subpoblaciones linfocitarias y el estatus de la mutación JAK2V617F.

V. DISCUSIÓN

118

En conclusión los pacientes con NMP presentan alteraciones cuantitativas en

subpoblaciones linfocitarias T y NK de SP. Son necesarios más estudios para conocer su

significado. Solamente podemos afirmar que estas alteraciones no guardan relación con el

estado mutacional en JAK2V617F

V. DISCUSIÓN

119

8. Factores pronósticos y JAK2V617F

8.1. Supervivencia

La supervivencia de los pacientes con NMP está principalmente afectada por aparición de

eventos trombóticos y en segundo lugar por progresión a una MFsec o una LMA.

En nuestra serie no observamos diferencia entre la supervivencia en NMP JAK2V617F-pos

frente a JAK2V617F-neg, pero sería necesaria una casuísticas más grande para sacar

conclusiones firmes. Tampoco encontramos resultados definitivos acerca de este tema en la

literatura [17,49,139].

8.2. Eventos trombóticos

La patogénesis de las complicaciones trombóticos en las NMP no está de todo conocida y

parece tener un origen multifactorial. Entre los factores tradicionalmente involucrados en

este proceso se encuentra la hiperviscosidad relacionada con el hematocrito alto, la

trombocitosis [15,21-22], así como los factores de riesgo cardiovascular como diabetes,

hipertensión, etc. [23]. En los estudios recientes se ha encontrado un importante papel de la

activación de las plaquetas y de los leucocitos [24,28,34] y de la cifra de los leucocitos [29-

31]. En varios estudios retrospectivos, se ha sugerido que la mutación JAK2V617F podría

estar asociada con el riesgo de trombosis. El grupo de Campbell et al, encontró una mayor

frecuencia de complicaciones trombóticos venosas en la TE JAK2V617F-pos frente a la

JAK2V617F-neg [43]. También se ha descrito un mayor riesgo trombótico en la TE con la

mutación JAK2V617F en estado de homocigosis, frente a los casos heterocigotas o los

carentes de la mutación [45-46]. No obstante, publicaciones posteriores presentan resultados

V. DISCUSIÓN

120

discordantes [44,140]. En nuestra serie, no detectamos diferencia en la frecuencia de eventos

trombóticos entre las NMP JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg. Tampoco observamos

diferencia entre los pacientes TE JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg ni entre los casos de

TE JAK2V617F-pos y PV. Estudios recientemente publicados establecen la comparación en

función de la carga alélica de JAK2V617F. En nuestra serie, analizamos la relación entre la

carga alélica JAK2V617F y la frecuencia de eventos trombóticos en dos grupos de

pacientes: 1) pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada al

diagnóstico y 2) pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada tanto al

diagnóstico como durante el seguimiento. En ambos grupos observamos tendencia de

presentar mayor frecuencia de eventos trombóticos con mayor carga mutacional

JAK2V617F, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa (p=0,051). El diseño

de nuestro estudio no permite sacar conclusiones firmes acerca de relación entre trombosis y

la mutación JAK2V617F. Sin embargo, tampoco se puede descartar posibilidad de

asociación entre la carga alélica JAK2V617F y eventos trombóticos. En la literatura

publicada hasta la fecha, dos series de pacientes con TE, muestran que tanto la presencia de

la mutación JAK2V617F como su carga alélica se asocian con mayor riesgo trombóticos

[133,137,140]. En cuanto a la PV, aunque no existe evidencia de diferencia entre pacientes

homocigotos y heterocigotos, el riesgo trombótico aumenta significativamente cuando se

analiza respecto a la carga alélica: mayor cuando ésta es superior al 75-80% al diagnóstico

[137], aunque el grupo de Tefferi no corrobora estos resultados [138].

Resumiendo, de acuerdo con nuestros resultados y con los estudios previos, podemos

sugerir la posibilidad de que la carga alélica JAK2V617F tenga algún papel en el desarrollo

de los eventos trombóticos. Sin embargo, para confirmar estos resultados se precisa de

nuevos estudios prospectivos en un amplio grupo de pacientes.

V. DISCUSIÓN

121

8.3. Progresión a MFsec o LMA

Nuestro grupo a estudio (PV y TE) experimentó progresión a MFsec en el 8% de los casos

(7% en PV y 11% en TE) con una media de tiempo de evolución de la enfermedad de 9

años. Nuestros resultados son concordantes con estudios previos [18-19,35,139].

Acerca de la relación entre la mutación JAK2 y el riesgo de progresión a MFsec no hay

resultados concluyentes. En nuestra serie, la mayoría de las MFsec (73%) fueron precedidos

de una NMP (TE o PV) JAK2V617F-pos, pero no hemos alcanzado una diferencia

estadísticamente significativa en el riesgo de transformación en función del estatus de

JAK2V617F. Algunas publicaciones no encuentran relación entre el estatus de JAK2V617F

y la progresión a MFsec [32,43-44]. Sin embargo, otros estudios sugieren la existencia de

esta relación, sobre todo en pacientes con la mutación JAK2V617F en estado de

homocigosis [5,45-46] y en la PV la asociación se ha descrito con la carga alélica más alta

[204]. Un modelo animal, apoya el papel de la mutación JAK2V617F como un factor de

riesgo de desarrollo de MFsec en la PV [84-86]. La evolución de la carga alélica

JAK2V617F en este grupo de pacientes ya se ha comentado previamente en el apartado 4 de

la Discusión.

Respecto a la progresión a LMA, en nuestro grupo ocurrió en el 2% de casos (n=4) con la

media de tiempo desde el diagnóstico de 7 años, resultados que coinciden con los datos

previamente publicados [18-19,35-36,139]. Curiosamente, todos los pacientes fueron JAK2-

pos (2TE, 1 PV y 1 MFP), aunque dado el bajo número de casos analizados y diseño

retrospectivo de nuestro estudio no pudimos analizar ese aspecto. En la literatura los

resultados acerca de progresión a LMA son escasos y no concluyentes [5,43-44,143,188].

Gangat et al, en un estudio retrospectivos realizado en 605 TE, observó que la progresión a

LMA aparece tanto en casos JAK2-pos como JAK2-neg, sin poder encontrar diferencias

V. DISCUSIÓN

122

entre ambos grupos [189]. En un estudio realizado en 174 MFP observaron que la presencia

de mutación JAK2 predice un curso más agresivo con esplenomegalia gigante, necesidad de

esplenectomía y progresión a LMA [40]. En cambio Tefferi et al, no encontraron un valor

predictivo del estado JAK2 para progresión a LMA, pero entre los JAK2-pos la evolución a

LMA fue más frecuente en el grupo con baja carga alélica [41]. En conclusión parece que el

aumento de la carga alélica en la NMP JAK2-pos puede asociarse a evolución a MFsec,

pero el estatus JAK2 no es el predictor de la evolución. El significado clínico del estatus

JAK2 en la evolución a LMA precisa de más estudios, dada la rareza de esta evolución sólo

analizando grandes registros podría sacarse conclusiones válidas.

123

VI. CONCLUSIONES

VI. CONCLUSIONES

124

1. Hay muy buena concordancia entre los criterios WHO 2001 y WHO 2008 para la PV y

solamente intermedia para la TE. Los criterios WHO 2008 diagnostican más casos de

TE en fase temprana, gracias al estudio mutacional y al bajar la cifra de plaquetas.

2. La incorporación del estudio mutacional, sobre todo de la mutación JAK2V617F, en

los criterios WHO 2008 ha simplificado el diagnóstico de la PV y la TE.

3. Es posible realizar el diagnóstico de una TE en ausencia de la mutación JAK2V617F,

mientras que en nuestra serie no se detectó ningún caso de PV JAK2V617F-neg.

4. El estudio medular aporta información diagnóstica en la PV. Sin embargo, su

realización se considera necesaria solamente en caso de poliglobulia (en ausencia de

causas secundarias) y ausencia de la mutación JAK2V617F y JAK2-exón 12. Ante

sospecha de PV y presencia de la mutación JAK2V617F, dicho estudio no es

imprescindible.

5. La mutación JAK2V617F no es específica de ninguna NMP y su presencia o ausencia

debe ser interpretada junto a la clínica, hematimetría y hallazgos morfológicos de la

MO y la SP.

6. La ausencia de criterios diagnósticos morfológicos no debería excluir el diagnóstico de

TE en las trombocitosis JAK2V617F-pos.

7. La presencia de la mutación JAK2V617F se asocia con determinadas características

hematológicas y clínicas. En la TE le confiere un fenotipo “eritrocitósico” con aspectos

comunes con la PV. Sin embargo el estatus de la mutación JAK2V617F en las NMP no

permite por sí solo definir una entidad clínico-biológica o morfológica.

VI. CONCLUSIONES

125

8. Cambios en la distribución de las subpoblaciones linfocitarias, observadas en nuestra

serie, son independientes del estatus JAK2V617F y en este momento se desconoce su

significado.

9. La carga alélica JAK2 es muy variable en función del fenotipo hematológico y clínico,

pero también dentro de un mismo diagnóstico hay una gran variación interindividual.

En nuestra experiencia ante una aparente TE con la carga alélica JAK2V617F mayor de

45-50%, deberíamos sospechar una PV enmascarada.

10. Las cargas alélicas altas se asocian a valores más altos de hemoglobina y menores de

plaquetas. La carga alélica alta también se asocia a leucocitosis, esplenomegalia, prurito

y posiblemente a trombosis.

11. En nuestra experiencia, el aumento de la carga alélica con el tiempo de la evolución

puede asociarse a la progresión de la NMP. Creemos que el seguimiento de la carga

alélica JAK2V617F estaría justificado en estos casos para valorar mejor la aparición de

cambios hematimétricos o de necesidades terapéuticas.

12. La carga alélica JAK2V617F puede descender asociada al tratamiento con HDU, sobre

todo en fases iniciales del tratamiento. El descenso es discreto y probablemente sin

significado clínico. En este momento no creemos necesario la realización de

determinaciones seriadas de la carga alélica JAK2V617F en los pacientes tratados con

HDU fuera de ensayos clínicos, salvo en las circunstancias descritas en el párrafo

anterior.

13. En el estudio de la poliglobulia JAK2V617F-neg, la ausencia de la mutación en el gen

JAK2-exón 12 ayuda para descartar el diagnóstico de PV.

VI. CONCLUSIONES

126

14. En el estudio de una trombocitosis JAK2V617F-neg, la mutación MPL a pesar de su

baja frecuencia, fue útil en establecer el diagnóstico de TE o MFP.

127

VII. BIBLIOGRAFÍA

128

1. Demeshek W. Some speculations on the myeloproliferative syndromes. Blood

1951;6:372-375.

2. Adamson JW, Fialkow PJ, Murphy S, et al. Polycythemia vera: stem cell and probable

clonal origin of the disease. N Engl J Med 1976;295:913-916.

3. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase

JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005;365:1054-1061.

4. James C, Ugo V, Le Couedic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to

constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature 2005;434:1144-1148.

5. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in

myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005;352:1779-1790.

6. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase

JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with

myelofibrosis. Cancer Cell 2005;7:387-397.

7. Zhao R, Xing S, Li Z, et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in

polycythemia vera. J Biol Chem 2005;280: 22788-22792.

8. Kutti J, Ridell B. Epidemiology of the myeloproliferative disorders: Essential

thrombocythemia, polycythemia vera and idiopathic mielofibrosis. Pathol Biol

49:164,2001.

9. Besses C, Sans Sabrafén J. Síndromes mieloproliferativos crónicos. Policitemia vera y

trombocitemia esencial. En: Sans-Sabrafén J, Besses C, Vives Corrons JL.

Hematología clínica, 5ª ed. Madrid: Elsevier; 2006.p.365.

VII. BIBLIOGRAFÍA

129

10. Tefferi A, Vardiman JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms:

the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms.

Leukemia 2008;22:14-22.

11. Girodon F, Bonicelli G, Schaeffer C, et al. Significant increase in the apparent

incidence of essential thrombocythemia related to new WHO diagnostic criteria: a

population-based study. Haematologica 2009;94:865-869.

12. Hoffman R, Baker KR, Prchal JT. The polycythemias. En: Hoffman R, Benz Jr EJ,

Shattil SJ, et al. Hematology. Basic, principles and practice, 4ª ed. Philadelphia,

Pennsylvania 19106: Elsevier; 2005. p. 1209.

13. Hoffman R, Ravandi-Kashani F. Idiopathic mielofibrosis. En: Hoffman R, Benz Jr EJ,


Pennsylvania 19106: Elsevier; 2005. p. 1255.

14. Fruchtman SM, Hoffman R. Essential thrombocythemia. En: Hoffman R, Benz Jr EJ,


Pennsylvania 19106: Elsevier; 2005. p.1277.

15. Rozman C, Giralt M, Feliu E, et al. Life expectancy of patients with chronic

nonleukemic myeloproliferative disorders. Cancer 1991;67:2658-2663.

16. Passamonti F, Rumi E, Pungolino E, et al. Life expectancy and prognostic factors for

survival in patients with polycythemia vera and essential thrombocythmia. Am J Med

2004;117:755-761.

17. Cervantes F, Passamonti F, Barrosi G. Life expectancy and prognostic factors in the

classic BCL/ABL-negative myeloproliferative disorders. Leukemia 2008;22:905-914.

VII. BIBLIOGRAFÍA

130

18. Gruppo Italiano Studio Policitemia Polycythemia vera: the natural history of 1213

patients followed for 20 years. Ann Intern Med 1995;123:656-664.

19. Wolanskyj AP, Schwager SM, McClure Rf, et al. Essential thrombocythemia beyond

the fist decade life expectancy, long-term complication rates and prognostic factors.

Mayo Clin Proc 2006;81:159-166.

20. Tefferi A, Solberg LA, Silvertein MN. A clinical update in polycythemia vera and

essential thrombocythemia. Am J Med. 2000;109:141-149.

21. Pearson TC, Wltherley-Mein G. Vascular occlusive episodes and venous haematocrit in

primary proliferative polycythaemia. Lancet 1978;2:1219-1222.

22. Di Nisio M, Barbui T, Di Gennaro L, et al. The haematocrit and platelet target in

polycythemia vera. Br J Haematol 2007;136:249-259.

23. Barbui T, Barosi G, Grossi A, et al. Practice guidelines for the therapy of essential

thrombocythemia. A statement from the Italian Society of Hematologym the Italian

Society of Experimental Hematology and Italian Group for Bone marrow

Transplantation. Haematologica 2004;89:215-232.

24. Raszeja-Specht A, Skibowska A, Bieniaszewska M, et al. Relationship between

thrombohemorrhagic complicacions and platelet function in patients with essential

thrombocythaemia. Am J Hematol 2001;68:32-36.

25. Michiels JJ, Berneman Z, Van Bockstaele D, et al. Clinical and laboratory features,

pathobiology of platelet-mediated thrombosis and bleeding complications, and the

molecular etiology of essential thrombocythemia and polycythemia vera: therapeutic

implications. Semin Thromb Hemost 2006;32:174-207.

VII. BIBLIOGRAFÍA

131

26. Falanga A, Marchetti M, Barbui T, et al. Pathogenesis of thrombosis in essential

thrombocythemia and polycythemia vera. The role of neutrophils. Seminars Hematol

2005;42:239-247.

27. Burgaleta C, González N, Cesar J. Increased CD11/CD18 expression and altered

metabolic activity on polymorphonuclear leukocytes from patients with polycythemia

vera and Essentials thrombocythemia. Acta Haematologica 2002;108:23-28.

28. Arellano-Rodrigo E, Álvarez-Larrán A, Reverter JC, et al. Increased platelet and

leukocyte activation as contributing mechanisms for thrombosis in essential

thrombocythemia and correlation with the JAK2 mutation status. Haematologica

2006;91:169-175.

29. Carobbio A, Finazzi G, Guerini V, et al. Leukocytosis in a risk factor for

thrombocytosis in essential thrombocythemia: interaction with treatment, standard risk

factors, and JAK2 mutation status. Blood 2007;109:2310-2313.

30. Tefferi A. Leukocytosis as a risk factor for thrombosis in myeloproliferative

neoplasms-biologically plausible but clinically uncertain. Am J Hematol 2010;85:93-

94. Review.

31. Gangat N, Strand J, Li CY, et al. Leucocytosis in polycythaemia vera predicts both

inferior survival and leukaemic transformation. Br J Haematol 2007;138:354-358.

32. Finazzi G, Rambaldi A, Guerini V, et al. Risk of thrombosis in patients with essential

thrombocythemia and polycythemia vera according to JAK2V617F mutation status.

Haematologica 2007;92:135-136.

VII. BIBLIOGRAFÍA

132

33. Harrison CN, Campbell PJ, Buck G, et al. Hydroxyurea compared with anagrelide in

high-risk essential thrombocythemia. N Engl J Med 2005.7;353:33-45.

34. Bellucci S, Michiels JJ. The role of JAK2V617F mutation, spontaneous erythropoiesis

and megakaryocytopoiesis, hypersensitive platelets, activates leukocytes, and

endothelial cells in the etiology of thrombotic manifestations in polycythemia vera and

essential thrombocythemia. Semin Thromb Hemost 2006;32:381-398.

35. Marchiolli R, Finazzi G, Landolfi R, et al. Vascular and neoplastic risk in a large

cohort of patients with polycythemia vera. J Clin Oncol 2005;23:2224-2232.

36. Finazzi G, Caruso V, Marchioi R, et al. Acute leukemia in polycythemia vera: an

analysis of 1638 patients enrolled in a prospective observational study. Blood

2005;105:2664-2670.

37. Passamonti F, Cervantes F, Vannucchi AM, et al. A dynamic prognostic model to

predict survival in primary myelofibrosis: a study by the IWG-MRT (International

Working Group for Myeloproliferative Neoplasms Research and Treatment). Blood

2010;115:1703-1708.

38. Campbell PJ, Baxter EJ, Beer PA, et al. Mutation of JAK2 in the myeloproliferative

disorders: timing, clonality studies, cytogenetic associations and role in leukemic

transformation. Blood 2006;108: 3548-3555.

39. Beer PA, Green AR. Pathogenesis and management of essential thrombocythemia.

Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2009:621-628.

VII. BIBLIOGRAFÍA

133

40. Barosi G, Bergamaschi G, Marchetti M, et al. JAK2V617F mutational status predicts

progression to large splenomegaly and leukemic transformation in primary

myeloibrosis. Blood 2007;110:4030-4036.

41. Tefferi A, Lasho TL, Huang J, et al. Low JAK2V617F allele burden in primary

myelofibrosis, compered to either a higher allele burden or unmutated status, predicts

inferior overall and leukemia-free survival. Leukemia 2008;22:756-761.

42. Guglielmelli P, Barosi G, Specchia G,et al. Identification of patients with poorer

survival in primary myelofibrosis based on the burden of JAK2V617F mutated allele.

Blood. 2009;114:1477-1483.

43. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential

thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation

status: a prospective study. Lancet. 2005;366:1945-1953.

44. Wolanskyj AP, Lasho TL, Schwager SM, et al. JAK2 mutation in essential

thrombocythaemia: clinical associations and long-term prognostic relevance. Br J

Haematol 2005;131:208-213.

45. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, et al. Clinical profile of homozygous

JAK2 617V>F mutation in patients with polycythemia vera or essential

thrombocythemia. Blood 2007;110: 840-846.

46. Tefferi A, Lasho TL, Schwager SM, et al. The clinical phenotype of wild-type,

heterozygous, and homozygous JAK2V617F in polycythemia vera. Cancer

2006;106:631-635.

VII. BIBLIOGRAFÍA

134

47. Berlin NI. Diagnosis and classification of the polycythemias. Semin Hematol

1997;:339-351.

48. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, et al. World Heath Organization classification of tumours.

Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon,

France:IARC;2001.

49. Tefferi A, Lasho TL, Schwager SM, et al. The JAK2(V617F) tyrosine kinase mutation

in myelofibrosis with myeloid metaplasia: lineage specificity and clinical correlates. Br

J Haematol. 2005;131:320-328.

50. Kralovics R, Teo SS, Li S, et al. Acquisition of the V617F mutation of JAK2 is a late

genetic event in a subset of patients with myeloproliferative disorders. Blood

2006;108:1377-1380.

51. Kralovics R, Teo SS, Buser AS, et al. Altered gene expression in myeloproliferative

disorders correlates with activation of signaling by the V617F mutation of Jak2. Blood

2005;106: 3374-3376.

52. Wilkins BS, Erber WN, Bareford D, et al. Bone marrow pathology in essential

thrombocythemia: inter-observer reliability and utility for identifying disease subtypes.

Blood 2008;111:60-70.

53. Spivak JL, Silver R. The revised World Healts Organization diagnostic criteria for

polycythemia vera, essential thrombocythemia, and primary mielofibrosis: an alternal

proposal. Blood 2008;112:231-239.

54. Tefferi A. Risk-based Management in Essentials thrombocythemia. The American

Society of Hematology Education Program Book. 1999, pp 172-177.

VII. BIBLIOGRAFÍA

135

55. Tefferi A. Current management of polycythemia vera. Leuk Lymphoma 2002; 43:1-7.

56. Spivak JL. The optimal Management of polycythemia vera. Br J Haematol

202;116:243-254.

57. Van Genderen PJJ, Silverstein MN. A clinical update in polycythemia vera and

Essentials thrombocythemia. Am J Med 2000;109:141-149.

58. Barbui T, Finazzi G. When and how to treat essential thrombocythemia. N Engl J Med

2005; 353:85-86.

59. Campbell PJ, Green AR. Management of polycythemia vera and essential

thrombocytemia. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 2005;201-208.

60. Finazzi G. A prospective analysis of thrombotic events in the European collaboration

study on low-dose aspirin in polycythemia (ECLAP). Pathol Biol 2004;52:285-288.

61. Bjerrum OW. Polycythaemia vera and essential thrombocythaemia: current treatment

strategies. Drugs 2006;66:2173-2187.

62. Cervantes F. Tratamiento convencional y nuevos fármacos en la mielofibrosis. En:

Besses C, Hernández L, Vicente V. Enfermedades mieloproliferativas crónicas. Acción

Médica 2008, p. 121-129.

63. Mesa RA. Myelofibrosis with myeloid metaplasia: therapeutic options in 2003. Curr

Hematol Rep 2003;264-270.

64. Deeg HJ, Gooley TA, Flowers ME, et al. Allogeneic hematopoietic stem cell

transplantation for mielofibrosis. Blood 2003;102:3912-3918.

VII. BIBLIOGRAFÍA

136

65. Kröger N, Mesa RA. Choosing between stem cell therapy and drugs in myelofibrosis.

Leukemia 2008;22:474-86

66. Cervantes F, Dupriez B, Pereira A. New prognostic scoring system for primary

myelofibrosis based on a study of the International Working Group for Myelofibrosis

Research and Treatment. Blood 2009;113:2895-2901.

67. Vaquez H. Sur une forme speciale de cyanose s’accompagnant d’hiperglobulie

excesive et persistante. C R Soc Biol Paris 1892;44:384-388.

68. Osler W. Chronic cyanosis, with polycythemia and enlarged spleen: a new clinical

entity. Am J Med Sci 1903;126:176-201.

69. Prchal JF, Axelrad AA. Letter: Bone-marrow responses in polycythemia vera. N Engl J

Med 1974;290:1382.

70. Fialkow PJ, Faguet GB, Jacobson RJ, Vaidya K, Murphy S. Evidence that essential

thrombocythemia is a clonal disorder with origin in a multipotent stem cell. Blood

1981;58: 916-919.

71. Kralovics R, Guan Y, Prchal JT. Acquired uniparental disomy of chromosome 9p is a

frequent stem cell defect in polycythemia vera. Exp Hematol 2002;30:229-236.

72. Sandberg EM, Wallace TA, Godeny MD, Vonderlinden D, Sayeski PP. Jak2 tyrosine

kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys 2004;41:207-232.

73. Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, Schindler CW. Signaling through the

JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 2002;285:1-24.

VII. BIBLIOGRAFÍA

137

74. Mori N, Yoshinaga K, Tada M, et al. Infrequent V617F mutation of the JAK2 gene in

myeloid leukemia and its absence in lymphoid malignancies in Japan Genet Mol Biol

2008;31:427-430 (publicación online). Disponible en:

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1415-

47572008000300006&lng=en. doi: 10.1590/S1415-47572008000300006

75. Saharinen P, Takaluoma K, Silvennoinen O. Regulation of the Jak2 tyrosine kinase by

its pseudokinase domain. Mol Cell Biol 2000;20:3387-3395.

76. Socolovsky M, Fallon AE, Wang S, Brugnara C, Lodish HF. Fetal anemia and

apoptosis of red cell progenitors in Stat5a-/-5b-/- mice: a direct role for Stat5 in Bcl-

X(L) induction. Cell 1999;98:181-191.

77. Myklebust JH, Blomhoff HK, Rusten LS, Stokke T, Smeland EB. Activation of

phosphatidylinositol 3-kinase is important for erythropoietin-induced erythropoiesis

from CD34 (+) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 2002;30:990-1000.

78. Ugo V, Marzac C, Teyssandier I, et al. Multiple signaling pathways are involved in

erythropoietin-independent differentiation of erythroid progenitors in polycythemia

vera. Exp Hematol 2004;32:179-187.

79. Bennett M, Stroncek DF. Recent advances in the bcr-abl negative chronic

myeloproliferative diseases. J Transl Med 2006;4:41.

80. Remy I, Wilson IA, Michnick SW. Erythropoietin receptor activation by a ligand-

induced conformation change. Science 1999;283:990-993.

VII. BIBLIOGRAFÍA

138

81. Lu X, Gross AW, Lodish HF. Active conformation of the erythropoietin receptor:

random and cysteine-scanning mutagenesis of the extracellular juxtamembrane and

transmembrane domains. J Biol Chem 2006;281: 7002-7011.

82. Seubert N, Royer Y, Staerk J, et al. Active and inactive orientations of the

transmembrane and cytosolic domains of the erythropoietin receptor dimer. Mol Cell

2003;12: 1239-1250.

83. Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O, et al. JAK2 associates with the

erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following

stimulation with erythropoietin. Cell 1993;74: 227-236.

84. Wernig G, Mercher T, Okabe R, Levine RL, Lee BH, Gilliland DG. Expression of

Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a

murine bone marrow transplant model. Blood 2006;107:4274-4281.

85. Lacout C, Pisani DF, Tulliez M, Moreau GF, Vainchenker W, Villeval JL. JAK2V617F

expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with

secondary myelofibrosis. Blood 2006;108:1652-1660.

86. Bumm TG, Elsea C, Corbin AS et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive

myeloproliferative disease. Cancer Res 2006;66:11156-11165.

87. Scott LM, Scott MA, Campbell PJ, Green AR. Progenitors homozygous for the V617F

JAK2 mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential

thrombocythemia. Blood 2006;108: 2435-2437.

VII. BIBLIOGRAFÍA

139

88. Jamieson CH, Gotlib J, Durocher JA, et al. The JAK2 V617F mutation occurs in

hematopoietic stem cells in polycythemia vera and predisposes toward erythroid

differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103: 6224-6229.

89. Steensma DP, McClure RF, Karp JE, et al. JAK2 V617F is a rare finding in de novo

acute myeloide leukemia, but STAT3 activation is common and remains unexplained.

Leukemia 2006;20:971-978.

90. Jelinek J, Oki Y, Gharibyan V, et al. JAK2 mutation 1849G>T is rare in acute

leukemias but can be found in CMML, Philadelphia-chromosome negative CML and

megakaryocytic leukemia. Blood 2005;106:3370-3373.

91. Cambier N, Renneville A, Cazaentre T, et al. JAK2V617F-positive polycythemia vera

and Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia: one patient with two

distinct myeloproliferative disorders. Leukemia. 2008;22:1454-1455.

92. Hussein K, Bock O, Seegers A, et al. Myelofibrosis evolving during imatinib treatment

of a chronic myeloproliferative disease with coexisting BCR-ABL translocation and

JAK2V617F mutation. Blood. 2007;109:4106-4107.

93. Bornhäuser M, Mohr B, Oelschlaegel U, et al. Concurrent JAK2(V617F) mutation and

BCR-ABL translocation within committed myeloid progenitors in myelofibrosis.

Leukemia 2007;21:1824-1826.

94. Pingali SR, Mathiason MA, Lovrich SD, et al. Emergence of chronic myelogenous

leukemia from a background of myeloproliferative disorder: JAK2V617F as a potential

risk factor for BCR-ABL translocation. Clin Lymphoma Myeloma 2009;9:E25-9.

VII. BIBLIOGRAFÍA

140

95. Melzner I, Weniger MA, Menz CK, et al. Absence of the JAK2V617F activating

mutation in classical Hodgkin lymphoma and primary mediastinal B-cell lymphoma.

Leukemia 2006;20:157-158.

96. Levine RL, Loriaux M, Huntly BJ, et al. The JAK2V617F activating mutation occurs in

chronic myelomonocytic leukemia and acute myeloid leukemia, but not in acute

lymphoblastic leukemia or chronic lymphocytic leukemia. Blood 2005;106:3377-3379.

97. Rapado I, Albizua E, Ayala R, et al. Validity test study of JAK2 V617F and allele

burden quantification in the diagnosis of myeloproliferative diseases. Ann Hematol

2008;741-749.

98. Xu X, Zhang Q, Luo J, et al. Prevalence in a large Chinese hospital population. Blood

2007:339-342.

99. Sidon P, El Housni H, Dessars B, et al. The JAK2V617F mutation is detectable at very

low level in peripheral blood of healthy donors. Leukemia 2006;20:1622.

100. Kralovics R. Genetic complexity of myeloproliferative myeloplasms. Leukemia

2008;22:1841-1848.

101. Tefferi A. Novel mutations and their functional and clinical relevance in

myeloproliferative neoplasms: JAK2, MPL, TET2, ASXL1, CBL, IDH and IKZF1.

Leukemia 2010 [Epub ahead of print].

102. Pikman Y, Lee BH, Mercher T, et al. MPLW515L is a novel somatic activating

mutation in mielofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Medicine 2006;3:e270.

103. Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, et al. MPL515 mutations in myeloproliferative and

other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood 2006;108:3472-3476.

VII. BIBLIOGRAFÍA

141

104. Scott LM, Tong W, Levine RL, et al. JAK2 Exon 12 mutations in polycythemia vera

and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007;356:459-468.

105. Tefferi A, Pardanani A, Lim KH, et al. TET2 mutations and their clinical correlates in

polycythemia vera, essential thrombocythemia and myelofibrosis. Leukemia

2009;23:905-911.

106. Schaub FX, Looser R, Li S, et al. Clonal analysis of TET2 and JAK2 mutations

suggests that TET2 can be a late event in the progression of myeloproliferative

neoplasms. Blood. 2010;115:2003-2007.

107. Bacher U, Haferlach C, Schnittger S, et al. Mutations of the TET2 and CBL genes:

novel molecular markers in myeloid malignancies. Ann Hematol 2010 [Epub ahead of

print].

108. Grand FH, Hidalgo-Curtis CE, Ernst , et al. Frequent CBL mutations associated wit 11q

acquired uniparenteral disomy in myeloproliferative neoplasms. Blood 2009;113:6182-

6192.

109. Carbuccia N, Murati A, Trouplin V, et al. Mutations of ASXL1 gene in

myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2009;23:2183-2186.

110. Green A, Beer P. Somatic mutations of IDH1 and IDH2 in the leukemic transformation

of myeloprolifetaive neoplasms. N Engl J Med 2010;362:369-370.

111. Jager R, Gisslinger H, Berg T, et al. Deletions of the Transcription Factor Ikaros in

Myelopreoliferative Neoplasms at Transformation to Acute myeloid Leukemia, ASH

Annual Meeting Abstract 2009;114:435.

VII. BIBLIOGRAFÍA

142

112. Skoda RC. Thrombocytosis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2009:159-

167.

113. Kralovics R. The role of somatic and hereditary genetic factors in the pathogenesis of

myeloproliferative neoplsms. Hematology Education: the education program for the

annual congress of the European Hematology Association 2009;3:188-191.

114. Chaligné R, James C, Tonetti C, et al. Evidence for MPL W515L/K mutations in

hematopoietic stem cells in primitive mielofibrosis. Blood 2007;110:3735-3743.

115. Williams DM, Kim AH, Rogers O, et al. Phenotypic variations and new mutations in

JAK2 V617F-negative polycythemia vera, erythrocytosis, and idiopathic myelofibrosis.

Exp Hematol 2007;35:1641-1646.

116. Li S, Kralovics R, De Libero G, et al. Clonal heterogeneity in polycythemia vera

patients with JAK2 exon12 and JAK2-V617F mutations. Blood 2008;111:3863-3866.

117. Pietra D, Li S, Brisci A, et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with

JAK2(v617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood 2008;111:1686-1689.

118. Burjanivova T, Marcinek J, Lasabova Z, et al. A novel JAK2 exon 12 mutation

identified in the retrospective analysis of paraffin-embedded tissues of polycythemia

vera patients. Diagn Mol Pathol 2009;18:108-111.

119. Schnittger S, Bacher U, Haferlach C, et al. Detection of JAK2 exon 12 mutations in 15

patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. Haematologica 2009;94:414-

418.

VII. BIBLIOGRAFÍA

143

120. Bernardi M, Ruggeri M, Albiero E, et al. Isolated erythrocytosis in V617F negative

patients with JAK2 exon 12 mutations: report of a new mutation. Am J Hematol

2009;84:258-260.

121. Pardani A, Lasho TL, Finke C, et al. Prevalence and clinicopathologic correlates of

JAK2 exon 12 mutations in JAK2V617F-negative polycythemia vera. Leukemia

2007:21:1960-1963.

122. Butcher CM, Hahn U, To LB, et al. Two novel JAK2 exon 12 mutations in

JAK2V617F-negative polycythemia vera patents. Leukemia 2009;23:1008-1009.

123. Levine RL, Belisle C, Wadleigh M, et al. X-inactivation-based clonality analysis and

quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and

JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a subset of JAK2V617F-negative

ET and MMM patients with clonal hematopoiesis. Blood 2006;107:4139-4141.

124. Passamonti F, Rumi E. Clinical relevance of JAK2 (V617F) mutant allele burden.


125. Pardanani A, Fridley BL, Lasho TL, et al. Host genetic variation contributes to

phenotypic diversity in myeloproliferative disorders. Blood 2008;111:2785-2789.

126. Rumi E, Passamonti F, Pietra D, et al. JAK(V617F) as an acquired somatic mutation

and secondary genetic event associated with disease progression in familial

myeloproliferative disorders. Cancer 2006;107:2206-2211.

127. Levine RL, Gilliland DG. Myeloproliferative disorders. Blood 2008;112:2190-2198.

128. Nussenzveig RH, Swierczek SI, Jelinek J, et al. Polycythemia vera is not initiated by

JAK2V617F mutation. Exp Hematol 2007;35:32-38.

VII. BIBLIOGRAFÍA

144

129. Palandri F, Ottaviani E, Salmi F, et al. JAK2 V617F mutation in essential

thrombocythemia: correlation with clinical characteristics, response to therapy and

long-term outcome in cohort of 275 patients. Leuk Lymphoma 2009;50:247-253.

130. Jones AV, Kreil S, Zoi K, et al. Widespread occurrence of the JAK2V617F mutation in

chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005;106:2162-2168.

131. Plo I, Nakatake M, Malivert L, et al. JAK2 stimulates homologous recombination and

genetic instability: potential implication in the heterogeneity of myeloproliferative

disorders. Blood 2008;112:1402-1412.

132. Tiedt R, Hao-Shen H, Sobas MA, et al. Ratio of mutant JAK2-V617F to wild-type Jak2

determines the MPD phenotypes in transgenic mice. Blood 2008;111:3931-3940.

133. Kittur J, Knudson RA, Lasho TL, et al. Clinical correlates of JAK2V617F allele burden

in essential thrombocythemia. Cancer 2007;109:2279–2284.

134. Carobbio A, Finazzi G, Antonioli E, et al. JAK2V617F allele burden and thrombosis: a

direct comparison in essential thrombocythemia and polycythemia vera. Exp Hematol

2009;37:1016-1021.

135. Dupont S, Masse A, James C, et al. The JAK2 617V>F mutation triggers erythropoietin

hypersensitivity and terminal erythroid amplification in primary cells from patients

with polycythemia vera. Blood 2007;110:1013–1021.

136. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, et al. Clinical correlates of JAK2V617F

presence or allele burden in myeloproliferative neoplasms: a critical reappraisal.

Leukemia 2008;22:1299-1307.

VII. BIBLIOGRAFÍA

145

137. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, et al. Prospective identification of high-

risk polycythemia vera patients based on JAK2(V617F) allele burden. Leukemia

2007;21:1952–1959.

138. Tefferi A, Strand JJ, Lasho TL, et al. Bone marrow JAK2V617F allele burden and

clinical correlates in polycythemia vera. Leukemia 2007;21:2074–2075.

139. Campbell PJ, Griesshammer M, Dohner K, et al. V617F mutation in JAK2 is

associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis. Blood 2006;107:2098–

2100.

140. Antonioli E, Guglielmelli P, Poli G, et al. Influence of JAK2V617F allele burden on

phenotype in essential thrombocythemia. Haematologica 2008;93:41-48.

141. Gale RE, Allen AJ, Nash MJ, et al. Long-term serial analysis of X-chromosome

inactivation patterns and JAK2 V617F mutant levels in patients with essential

thrombocythemia show that minor mutant-positive clones can remain stable for many

years. Blood 2007;109:1241-1243.

142. Mesa RA, Powell H, Lasho T, et al. A longitudinal study of the JAK2(V617F) mutation

in myelofibrosis with myeloid metaplasia: analysis at two time points. Haematologica

2006;91:415-416.

143. Theocharides A, Passweg JR, Medinger M, et al. The allele burden of JAK2 mutations

remains stable over several years in patients with myeloproliferative disorders.


VII. BIBLIOGRAFÍA

146

144. Kiladjian JJ, Cassinat B, Chevret S, et al. Pegylated interferon-alfa-2a induces complete

hematologic and molecular responses with low toxicity in polycythemia vera. Blood

2008;112:3065-3072.

145. Kiladjian JJ, Chomienne C, Fenaux P. Interferon-alpha therapy in bcr-abl-negative

myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2008;22:1990-1998.

146. Larsen TS, Pallisgaard N, de Stricker K, et al. Limited efficacy of hydroxyurea in

lowering of the JAK2 V617F allele burden. Hematology 2009;14:11-15.

147. Girodon F, Schaeffer C, Cleyrat C, et al. Frequent reduction or absence of detection of

the JAK2-mutated clone in JAK2V617F-positive patients within the first years of

hydroxyurea therapy. Haematologica 2008;93:1723-1727.

148. Kröger N, Badbaran A, Holler E, et al. Monitoring of the JAK2-V617F mutation by

highly sensitive quantitative real-time PCR after allogeneic stem cell transplantation in

patients with myelofibrosis. Blood 2007;109:1316-1321.

149. Steckel NK, Koldehoff M, Ditschkowski M, et al. Use of the activating gene mutation

of the tyrosine kinase (VAL617Phe) JAK2 as a minimal residual disease marker in

patients with myelofibrosis and myeloid metaplasia after allogeneic stem cell

transplantation. Transplantation 2007;83:1518-1520.

150. Barosi G, Birgegard G, Finazzi G, et al. Response criteria for essential

thrombocythemia and polycythemia vera: result of a European LeukemiaNet consensus

conference. Blood 2009;113:4829-4833.

VII. BIBLIOGRAFÍA

147

151. Passamonti F, Rumi E, Pietra D, et al. Relationship between granulocyte JAK2

(V617F) mutant allele burden and risk of progression to myelofibrosis in polycythemia

vera: a prospective study of 338 patients. ASH annual meeting Abstract 209;114:751.

152. Martínes-López J, Albizua Huarte E, Rapado Martínez I. En: Besses Raebel C,

Hernández Nieto L, Vicente García V. Enfermedades mieloproliferativas crónicas. p.4-

6.

153. Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed

synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 1975;94:441-448.

154. Vannucchi AM, Pancrazzi A, Bogani C, et al.A quantitative assay for JAK2(V617F)

mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis.

Leukemia 2006;20:1055-1060.

155. Hussein K, Van Dyke DL, Tefferi A. Conventional cytogenetics in myelofibrosis:

literature review and discussion. Eur J Haematol 2009;82:329-338.

156. Hussein K, Huang J, Lasho T, et al. Karyotype complements the International

Prognostic Scoring System for primary myelofibrosis. Eur J Haematol 2009;82:255-

259.

157. Gangat N, Strand J, Lasho TL, et al. Cytogenetic studies at diagnosis in polycythemia

vera: clinical and JAK2V617F allele burden correlates. Eur J Haematol 2008;80:197-

200.

158. Gangat N, Tefferi A, Thanarajasingam G, et al. Cytogenetic abnormalities in essential

thrombocythemia: prevalence and prognostic significance. Eur J Haematol 2009;83:17-

21.

VII. BIBLIOGRAFÍA

148

159. Bacher U, Schnittger S, Kern W, et al. Distribution of cytogenetic abnormalities in

myelodysplastic syndromes, Philadelphia negative myeloproliferative neoplasms, and

the overlap MDS/MPN category. Ann Hematol 2009;88:1207-1213.

160. Bench AJ, Nacheva EP, Champion KM, Green AR. Molecular genetics and

cytogenetics of myeloproliferative disorders. Baillieres Clin Haematol 1998;11: 819-

848.

161. Tefferi A, Skoda R, Vardiman JW. Myeloproliferative neoplasms: contemporary

diagnosis using histology and genetics. Nat Rev Clin Oncol. 2009;6:627-637.

162. Reilly JT. Pathogenetic insight and prognostic information from standard and

molecular cytogenetic studies in the BCR-ABL-negative myeloproliferative neoplasms

(MPNs). Leukemia 2008;22:1818-1827.

163. Tam CS, Abruzzo LV, Lin KI, et al. The role of cytogenetic abnormalities as a

prognostic marker in primary myelofibrosis: applicability at the time of diagnosis and

later during disease course. Blood 2009;113:4171-4178.

164. Hussein K, Pardanani AD, Van Dyke DL, et al. International Prognostic Scoring

System-independent cytogenetic risk categorization in primary myelofibrosis. Blood

2010;115:496-499.

165. Ghoreschi K, Laurence A, O'Shea JJ. Selectivity and therapeutic inhibition of kinases:

to be or not to be? Nat Immunol 2009;10:356-360.

166. Ghoreschi K, Laurence A, O'Shea JJ. Janus kinases in immune cell signaling. Immunol

Rev 2009;228:273-287.

VII. BIBLIOGRAFÍA

149

167. Ishii T, Bruno E, Hoffman R, et al. Involvement of various hematopoietic-cell lineages

by the JAK2V617F mutation in polycythemia vera. Blood. 2006 Nov 1;108:3128-3134.

168. Bogani C, Guglielmelli P, Antonioli E, et al. B-, T-, and NK-cell lineage involvement

in JAK2V617F-positive patients with idiopathic myelofibrosis.Haematologica. 2007

Feb;92:258-259.

169. Stauffer Larsen T, Hasselbalch HC, Pallisgaard N, et al. Bone marrow histomorphology

and JAK2 mutation status in essential thrombocythemia. APMIS 2007;115:1267-1273.

170. Gianelli U, Iurlo A, Vener C, et al. The significance of bone marrow biopsy and

JAK2V617F mutation in the differential diagnosis between the "early"

prepolycythemic phase of polycythemia vera and essential thrombocythemia. Am J

Clin Pathol 2008;130:336-342.

171. Fleiss JL. Statistical methods for rates and proportions.1981. 2nd ed. (New York:John

Wiley) pp.38-46.

172. Kondo T, Okuno N, Naruse H, et al. Validation of the revised 2008 WHO diagnostic

criteria in 75 suspected cases of myeloproliferative neoplasm. Leuk Lymphoma

2008;49:1784-1791.

173. Girodon F, Lippert E, Mossuz P, et al. JAK2V617F detection and dosage of serum

erythropoietin: first steps of the diagnostic work-up for patients consulting for elevated

hematocrit. Haematologica 2007;92:431-432.

174. Kwon M, Osorio S, Muñoz C, et al. Essential thrombocythemia in patients with platelet

counts below 600x10(9)/L: applicability of the 2008 World Health Organization

diagnostic criteria revision proposal. Am J Hematol 2009;84:452-454.

VII. BIBLIOGRAFÍA

150

175. Kvasnicka HM, Thiele J. Prodromal myeloproliferative neoplasms: the 2008 WHO

classification. Am J Hematol 2010;85:62-69.

176. Skoda R. The genetic basis of myeloproliferative disorders. Hematology Am Soc

Hematol Educ Program. 2007:1-10.

177. Bousquet M, Le Guellec S, Quelen C, Frequent detection of the JAK2 V617F mutation

in bone marrow core biopsy specimens from chronic myeloproliferative disorders using

the TaqMan polymerase chain reaction single nucleotide polymorphism genotyping

assay: a retrospective study with pathologic correlations. Hum Pathol 2006;37:1458-

1464.

178. Larsen ST, Hasselbalch HC, Pallisgaard N, et al. Bone marrow histomorphology and

JAK2 mutation status in essential thrombocythemia. APMIS 2007;115:1267-1273.

179. Larsen TS, Pallisgaard N, Møller MB, et al. The JAK2 V617F allele burden in essential

thrombocythemia, polycythemia vera and primary myelofibrosis--impact on disease

phenotype. Eur J Haematol 2007;79:508-515.

180. Hussein K, Bock O, Theophile K, et al. JAK2(V617F) allele burden discriminates

essential thrombocythemia from a subset of prefibrotic-stage primary myelofibrosis.

Exp Hematol 2009;37:1186-1193.e7.

181. Moliterno AR, Williams DM, Rogers O, et al. Molecular mimicry in the chronic

myeloproliferative disorders: reciprocity between quantitative JAK2 V617F and Mpl

expression. Blood 2006;108:3913-3915.

182. Jones AV, Silver RT, Waghorn K, et al. Minimal molecular response in polycythemia

vera patients treated with imatinib or interferon alpha. Blood 2006;107:3339-3341.

VII. BIBLIOGRAFÍA

151

183. Antonioli E, Carobbio A, Pieri L, et al. Hydroxyurea does not appreciably reduce JAK2

V617F allele burden in patients with polycythemia vera or essential thrombocythemia.

Haematologica 2010 [Epub ahead of print].

184. Ricksten A, Palmqvist L, Johansson P, et al. Rapid decline of JAK2V617F levels

during hydroxyurea treatment in patients with polycythemia vera and essential

thrombocythemia. Haematologica 2008;93:1260-1261.

185. Sirhan S, Lasho TL, Hanson CA, et al. The presence of JAK2V617F in primary

myelofibrosis or its allele burden in polycythemia vera predicts chemosensitivity to

hydroxyurea. Am J Hematol 2008;83:363-365.

186. Alvarez-Larrán A, Cervantes F, Bellosillo B, et al. Essential thrombocythemia in young

individuals: frequency and risk factors for vascular events and evolution to

myelofibrosis in 126 patients. Leukemia 2007;21:1218-1223.

187. Guglielmelli P, Barosi G, Pieri L, et al. JAK2V617F mutational status and allele burden

have little influence on clinical phenotype and prognosis in patients with post-

polycythemia vera and post-essential thrombocythemia myelofibrosis. Haematologica

2009;94:144-146.

188. Theocharides A, Boissinot M, Girodon F, et al. Leukemic blasts in transformed JAK2-

V617F-positive myeloproliferative disorders are frequently negative for the JAK2-

V617F mutation. Blood 2007;110:375-379.

189. Gangat N, Wolanskyj AP, McClure RF, et al. Risk stratification for survival and

leukemic transformation in essential thrombocythemia: a single institutional study of

605 patients. Leukemia 2007;21:270-276.

VII. BIBLIOGRAFÍA

152

190. Beer PA, Delhommeau F, LeCouédic JP, et al. Two routes to leukemic transformation

after a JAK2 mutation-positive myeloproliferative neoplasm. Blood 2010;115:2891-

900.

191. Schaub FX, Jäger R, Looser R, et al. Clonal analysis of deletions on chromosome 20q

and JAK2-V617F in MPD suggests that del20q acts independently and is not one of the

predisposing mutations for JAK2-V617F. Blood 2009;113:2022-2027.

192. Tyner JW, Bumm TG, Deininger J, et al. CYT387, a novel JAK2 inhibitor, induces

hematologic responses and normalizas inflammatory cytokines in murine

myeloproliferative neoplasms. Blood 2010 [Epub ahead of print].

193. Verstovsek S. Therapeutic potential of JAK2 inhibitors. Hematology Am Soc Hematol

Educ Program 2009:636-642.

194. Lasho TL, Pardanani A, McClure RF, et al. Concurrent MPL515 and JAK2V617F

mutations in myelofibrosis: chronology of clonal emergence and changes in mutant

allele burden over time. Br J Haematol 2006;135:683-7.

195. Boyd EM, Bench AJ, Goday-Fernández A, et al. Clinical utility of routine MPL exon

10 analysis in the diagnosis of essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.

Br J Haematol 2010;149:250-257.

196. Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bergamaschi G, et al. Anaemia characterises patients with

myelofibrosis harbouring Mpl mutation. Br J Haematol 2007;137:244-7.

197. Beer PA, Campbell PJ, Scott LM, et al. MPL mutations in myeloproliferative disorders:

analysis of the PT-1 cohort. Blood 2008;112:141.149.

VII. BIBLIOGRAFÍA

153

198. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, et al. Characteristics and clinical

correlates of MPL 515W>L/K mutation in essential thrombocythemia. Blood

2008;112:844-847.

199. Sobas MA, González T, Pérez-Encinas M, et al. High-Resolution SNP 6.0 Array

Profiling Discloses Novel Genomic Aberrations in Polycythemia Vera and Essential

Thrombocythemia. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: Abstract

1898.

200. Paul CC, Bauman MA. Impaired interleukin-2 production by T-lymphocythes in

polycythemia vera. Journal of Clinical Laboratory Analysis 1989;3:84-87.

201. Pierson BA, Miller JS. CD56+bright and CD56+dim natural killer cells in patients with

chronic myelogenous leukemia progressively decrease in number, respond less to

stimuli that recruit clonogenic natural killer cells, and exhibit decreased proliferation on

a per cell basis. Blood 1996;88:2279-2287.

202. Nakajima H, Zhao R, Lund TC, et al. The BCR/ABL transgene causes abnormal NK

cell differentiation and can be found in circulating NK cells of advanced phase chronic

myelogenous leukemia patients. J Immunol 2002;168:643-650.

203. Verfaillie C, Kay N, Miller W, et al. Diminished A-LAK cytotoxicity and proliferation

accompany disease progression in chronic myelogenous leukemia. Blood 1990;76:401-

408.

204. Vannucchi AM, Guglielmelli P, Tefferi A. Advances in understanding and

management of myeloproliferative neoplasms. CA Cancer J Clin 2009;59:171-191.

estudio de las mutaciones del gen jak2 en pacientes …

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