“estudio de modelos animales de artrosis para evaluar la
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“Estudio de modelos animales de artrosis
para evaluar la progresión de la enfermedad
y nuevas posibles estrategias terapéuticas”
Tesis presentada por:
Aitana Braza Boïls
Valencia, Enero de 2010.
Índice
I
1. INTRODUCCIÓN
1.1 ARTROSIS
1.1.1 Patología humana 1
1.1.2 Anatomía de la articulación 5
1.1.2.1 Articulación sana 6
1.1.2.2 Articulación artrósica 11
1.1.3 El cartílago articular 15
1.1.3.1 Propiedades biomecánicas de la articulación 21
1.1.3.2 Biomarcadores 22
1.1.3.3 Inflamación en la artrosis 26
1.1.4 Tratamientos actuales de la artrosis 28
1.2 MODELOS ANIMALES 32
1.2.1 Modelos animales de artrosis 35
1.2.2 Modelos estudiados 37
1.2.2.1 Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón
Balb/c 37
1.2.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón
STR/ort 39
1.2.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento
cruzado anterior en rata Wistar 42
1.3 FÁRMACOS ENSAYADOS 43
1.3.1 Estaño protoporfirina IX (SnPP) 43
1.3.2 BIS069 44
2. OBJETIVOS 47
3. MATERIAL Y MÉTODOS 49 3.1. MATERIALES Y REACTIVOS 49
3.1.1 Material y productos para microcirugía 49
3.1.2 Productos para histología e inmunohistoquímica 49
Índice
II
3.1.3 Productos para Western blot 49
3.1.4 Productos para radioinmunoensayo (RIA) 50
3.1.5 ELISA empleados 50
3.1.6 Anticuerpos 50
3.1.7 Tampones empleados 51
3.2 MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS EMPLEADOS 52
3.2.1 Modelo de artrosis inducida por la inyección intraarticular de 52
colagenasa en ratón balb/c
3.2.1.1 Diseño experimental 53
3.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort 53
3.2.2.1 Diseño experimental 53
3.2.2.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 en el modelo de artrosis espontánea en ratón STR/ort 55
3.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado
anterior en rata Wistar 58
3.2.3.1 Diseño experimental 60
3.2.3.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 en el modelo de artrosis provocada por la transección
del ligamento cruzado anterior en rata Wistar 62
3.3 PROCESADO DE MUESTRAS 63
3.3.1 Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón Balb/c.
Estudio de la progresión de la artrosis. 63
3.3.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort. 64
3.3.2.1 Estudio de la evolución de la artrosis 64
3.3.2.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 65
3.3.3 Modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en
rata Wistar 65
3.3.3.1 Estudio de la evolución de la artrosis 65
3.3.3.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 66
Índice
III
3.4 TÉCNICAS EMPLEADAS 67
3.4.1 Estudio radiológico 67
3.4.2 Estudio histológico 68
3.4.2.1 Inclusión de las articulaciones en parafina 71
3.4.2.2 Tinciones químicas 72
3.4.2.2.1 Eosina/hematoxilina 72
3.4.2.2.2 O-safranina 73
3.4.2.3 Inmunohistoquímica 73
3.4.3 Estudio de mediadores 74
3.4.3.1 Homogenización de rodillas de animales de experimentación 75
3.4.3.1.1 Rodillas de ratones STR/ort y ratones balb/c 75
3.4.3.1.2 Rodillas de rata Wistar 77
3.4.3.2 Obtención de suero 78
3.4.4 Técnicas bioquímicas 78
3.4.4.1 Radioinmunoensayo (RIA) 78
3.4.4.2 Inmunodetección por Western blot 80
3.4.4.3 Enzyme Immuno Sorbent Assay (ELISA) 81
3.4.4.4 Inmunoensayo de biomarcadores por la técnica de Multiplex
de Luminex 82
3.4.4.4.1 Fundamento de la técnica 82
3.4.4.4.2 Protocolo 82
4. RESULTADOS 85
4.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR COLAGENASA INTRAARTICULAR 86
4.1.1 Degradación articular 86
4.1.1.1 Estudio histológico 86
4.1.1.2 Estudio de biomarcadores 90
Índice
IV
4.2 MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort 92
4.2.1 Degradación articular 92
4.2.1.1 Estudio histológico 93
4.2.1.1.1 Articulaciones interfalángicas 93
4.2.1.1.2 Articulación del tobillo 96
4.2.1.1.3 Articulación de la rodilla 98
4.2.1.2 Estudio radiológico 105
4.2.2 Estudio de biomarcadores 107
4.2.3 Inflamación 113
4.2.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 128
4.2.4.1 Evolución del peso de los animales 128
4.2.4.2 Estudio radiológico 129
4.2.4.3 Estudio histológico 131
4.2.4.4 Estudio de biomarcadores 133
4.2.4.5 Inflamación 138
4.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL
LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR (ACLT) 145
4.3.1 Degradación articular 145
4.3.1.1 Estudio radiológico 148
4.3.1.2 Estudio histológico 149
4.3.2 Estudio de biomarcadores 155
4.3.3 Inflamación 158
4.3.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 171
4.3.4.1 Evolución del peso de los animales 171
4.3.4.2 Estudio radiológico 171
4.3.4.3 Estudio histológico 173
4.3.4.4 Estudio de biomarcadores 175
4.3.4.5 Inflamación 179
5. DISCUSIÓN 191
Índice
V
6. CONCLUSIONES 203
7. BIBLIOGRAFÍA 205
Índice
VI
Índice de figuras
VII
INTRODUCCIÓN
1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis 2
2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana 7
3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana 8
4: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de la membrana sinovial de
una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad 8
5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis 13
6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana 15
7: Agrecano de cartílago bovino fetal 20
8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que
componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II 24
9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis 29
10: Opciones terapéuticas no farmacológicas 29
11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación 38
12: Ratones STR/ort 39
13: Estaño-protoporfirina IX (SnPP) 43
MATERIALES Y MÉTODOS
14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión
de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intra-articular 53
15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la
progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 54
16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis
en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 54
17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos
de los fármacos estaño prototoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis
en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 55
18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de
los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la
Índice de figuras
VIII
artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 57
19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE)
de la Universitat de València, utilizado para realizar la cirugía 58
20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la transección del ligamento cruzado
anterior (ACLT) 58
21: Fotografías, tomadas a través de la lupa binocular, que muestran los procedimientos
quirúrgicos de la ACLT 59
22: Fotografía de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT 60
23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión
de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por ACLT 61
24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a ACLT para el
estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis
en este modelo 62
25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort
tras su sacrificio 64
26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas
a ACLT 67
27: Grados del sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico
de la OARSI 69
28: Esquema de los grados de degradación del cartílago según el sistema de
evaluación histopatológica del cartílago artrósico descrito por la OARSI. 70
29: Descripción de los estadios del sistema de evaluación de la histopatología
del cartílago artrósico de la OARSI 71
30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort
y Balb/c 76
RESULTADOS
Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
31: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina, de rodillas
de ratones Balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa 87
Índice de figuras
IX
32: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina, de rodillas
de ratones Balb/c 8 días y 36 días tras la inyección de colagenasa 88
33: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de
ratones Balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa 89
Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort 92
35: Patas traseras de ratones STR/ort de 11 semanas de edad 94
36: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y con O-safranina,
de falanges de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 95
37: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y con O-safranina,
de tobillos de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 97
38: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y con O-safranina,
de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 98
39: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de ratones
CBA de 11 semanas de edad 100
40: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de ratones
STR/ort de 7 semanas de edad 101
41: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de ratones
STR/ort de 9 semanas de edad 101
42: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina y eosina/hematoxilina,
de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad 102
43: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de ratones
STR/ort de 15 semanas de edad 103
44: Puntuación, según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI, del cartílago
de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis 104
45: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort y CBA 106
46: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de
ratones STR/ort y ratones CBA 108
47: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratones STR/ort y ratones
CBA de 11 semanas de edad 109
Índice de figuras
X
48: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort
y ratones CBA 110
49: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 111
50: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 112
51: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort de
diferentes edades 114
52: Niveles de interleucina-1β (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 114
53: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort de
diferentes edades 115
54: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort y CBA 116
55: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα) en el suero de ratones STR/ort de
diferentes edades 117
56: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα) en el suero de ratones CBA
y STR/ort de 11 semanas de edad. 118
57: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort de
diferentes edades 119
58: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort y CBA a las
11 semanas de edad 120
59: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de
homogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades 122
60: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2)
en cortes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort 123
61: Western blot para hemo oxigenasa 1 (HO-1) en fracción microsomal de
homogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades 125
61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemo oxigenasa 1 (HO-1)
en cortes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort 126
62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente a hemo oxigenasa 1 (HO-1) de rodilla
de ratón STR/ort de 11 semanas de edad 127
63: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones STR/ort tras cuatro semanas de
tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 129
64: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad tratados
Índice de figuras
XI
durante cuatro semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 130
65: Estudio histopatológico del cartílago de ratones STR/ort de 11 semanas de edad
tras 4 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 132
66: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en suero
de ratones STR/ort tratados y sin tratar con las moléculas en estudio 133
67: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort tratados
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 135
68: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño
protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 136
69: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño
protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 137
70: Niveles de interleucina 1ß (IL 1ß) en el suero de ratones STR/ort tratados con
estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 138
71: Niveles de interleucina 17 (IL 17) en el suero de ratones STR/ort tratados con
estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 140
72: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα ) en el suero de ratones STR/ort tratados
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 141
73: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort tratados con
estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 142
74: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de
homogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad tratados
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 143
75: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en
cortes histológicos de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas tratados con estaño
protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 144
76: Fotografías de rodillas sanas de rata Wistar realizadas a través de la lupa binocular 146
77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado
anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta, realizadas a través de la lupa binocular,
transcurridas 10 semanas desde la cirugía 147
78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento
cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia 148
Índice de figuras
XII
79: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y O-safranina,
de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior
(ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 150
80: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y O-safranina,
de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior
(ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 150
81: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y O-safranina,
de los cóndilos femorales de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección
del ligamento cruzado anterior (ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 151
82: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y O-safranina,
de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior
(ACLT) y sacrificadas 10 semanas tras la cirugía 152
83: Fotografía de corte parafinado, teñido con eosina/hematoxilina, de la membrana
sinovial de una rodilla de rata Wistar sometida a la transección del ligamento
cruzado anterior (ACLT) transcurridas 10 semanas desde la cirugía 153
84: Puntuación del estudio histopatológico según los criterios de la OARSI de las
articulaciones de las ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado
anterior (ACLT) 154
85: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II (CTX-II) en el suero de ratas
Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 156
86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas
Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 157
87: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 158
88: Niveles de interleucina 1β (IL-1ß) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 160
89: Niveles de factor de necrosis tumoral (TNFα) en suero de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 161
90: Niveles de factor de necrosis tumoral (TNFα) en homogeneizado de patas
de ratas Wistar transcurridas 10 semanas desde la transección del ligamento
cruzado anterior (ACLT) 162
Índice de figuras
XIII
91: Niveles de interleucina 17(IL 17) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 163
92: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en suero de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 164
93: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 165
94: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 166
95: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en los homogeneizados de rodillas de ratas
Wistar, transcurridas 10 semanas de la transección del ligamento
cruzado anterior (ACLT) 167
96: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de
homogeneizado de pata de ratas Wistar, transcurridas 10 semanas desde el
inicio del estudio 169
97: Micrografías de inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en cortes
histológicos de rodillas de ratas Wistar, transcurridas 10 semanas
desde el inicio del estudio 170
98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistar sometidas a la transección del
ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP)
y BIS069 durante 10 semanas 172
99: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento
cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069
durante 10 semanas 173
100: Evaluación histopatológica del cartílago articular, según los criterios de la OARSI,
de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT)
y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 174
101: Niveles de C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II) en el suero de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño
protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 176
102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero
de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT)
Índice de figuras
XIV
y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 177 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tratadas con estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 178
104: Niveles de interleucina-1β (IL-1β) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 180
105: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNF α) en el suero de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 181
106: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNF α) en homogeneizado de patas de
ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y
tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 182
107: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas
con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas 183
108: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en sueros de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 184
109: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en homogeneizado de patas de ratas Wistar
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas
con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 185
110: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 186
111: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el homogeneizado de rodillas de ratas
Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con
estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 187
112: Western blot para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en homogeneizado de pata de
ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y
tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 188
Índice de figuras
XV
113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2)
en cortes histológicos de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del
ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX
(SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 189
Índice de figuras
XVI
XVII
ABREVIATURAS
ACL: ligamento cruzado anterior
ACLT: transección del ligamento cruzado anterior
AINE: antiinflamatorio no esteroide
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
BSA: albúmina de suero bovino
C.A.M. concentración alveolar mínima
COMP: proteína oligomérica de la matriz del cartílago
COX-2: ciclooxigenasa-2
COXIB: inhibidor selectivo de la COX-2
CTX-II: C-telopéptido terminal del colágeno II
D.O.I.: densidad óptica integrada
DMSO: dimetil sulfóxido
DTT: DL-Ditiotreitol
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EGTA: ácido etilenglicol tetraacético
ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay
FACIT: fibril associated collagens with interrupted triple helices
GAG: glicosaminoglicanos
HA: ácido hialurónico
HELIX-II: colágeno tipo II helicoidal
HEPES: ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil]- etanosulfónico
HO-1: hemo oxigenasa-1
IMC: índice de masa corporal
IGF-1: factor de crecimiento insulínico tipo 1
IL-1β: interleucina 1β
IL-17: interleucina 17
IL-18: interleucina 18
IL-6: interleucina 6
iNOS: óxido nítrico sintasa inducible
KS: keratán sulfato
XVIII
ME: matriz extracelular
MMP: metaloproteinasas de matriz
mPGES: PGE sintasa microsomal
MS: membrana sinovial
NO: óxido nítrico
NOS: óxido nítrico sintasa
NF-κB: factor de transcripción nuclear κB
O: osteofito
OARSI Osteoarthritis Research Society International
OC: osteocalcina
OPG: osteoprotegerina
PBS: tampón fosfato salino
PGE2 : prostaglandina E2
PIICP: propéptido C-terminal del colágeno tipo II
PIINP: propéptido N-terminal del colágeno tipo II
PLA2 : fosfolipasa A2
PMSF: fluoruro de fenil metil sulfonilo
PVDF: difluoruro de polivinilideno
RANK: receptor activador del factor de transcripción nuclear κB
RANKL: ligando del receptor activador del factor de transcripción nuclear κB
RIA: radioinmunoensayo
SDS: dodecilsulfato sódico
SnPP: estaño protoporfirina IX
SYSADOA: fármaco de acción sintomática lenta para el tratamiento de la artrosis
TEMED: N,N,N’,N’-tetrametileno-diamina
TGFβ: factor de crecimiento transformante β
TNFα: factor de necrosis tumoral α
1. INTRODUCCIÓN
Introducción. Artrosis
1
1.1 ARTROSIS
1.1.1 Patología humana
El término artrosis (osteoartritis, en terminología anglosajona) engloba las
artropatías no inflamatorias. La artrosis es tan antigua como la existencia del ser
humano, ya que en el hombre de Neanderthal se han encontrado signos de artrosis
en rodillas y columna vertebral.
La patología que nos ocupa es una de las afecciones de mayor prevalencia
entre la población adulta. A partir de los 60 años, el 80% de la población
occidental presenta signos radiológicos de artrosis en alguna articulación aunque
sólo manifieste la sintomatología dolorosa un 25% de los afectados.
La artrosis se define como una enfermedad lentamente progresiva,
habitualmente monoarticular, que afecta principalmente a pequeñas articulaciones
de las manos y los pies y a las grandes articulaciones de carga como son la cadera
(coxartrosis) o la rodilla (gonartrosis). Se caracteriza clínicamente, como se verá
más adelante, por el dolor, la deformidad de las articulaciones y la consecuente
limitación de la movilidad (Poole et al., 2007; Sharma y Kapoor, 2007).
Los diferentes factores de riesgo a destacar en el desarrollo de la artrosis
se muestran en la figura 1 aunque es la edad el factor de riesgo de mayor
importancia. Aún no están claramente dilucidados los mecanismos por los que el
proceso de envejecimiento es responsable de la aparición de la artrosis (van der
Kraan y van den Berg, 2008). Otro factor de riesgo destacable es la obesidad, ya
que el deterioro de las articulaciones por la acumulación de lesiones mecánicas se
ve agravado al aumentar significativamente las fuerzas de carga sobre el cartílago
articular (Pottie et al., 2006).
Introducción. Artrosis
2
El envejecimiento articular sano conlleva la fibrilación del cartílago
articular de los cóndilos femorales y la aparición de osteofitos en las regiones
marginales de la articulación. Todos estos procesos de envejecimiento sano se
observan también en la artrosis, pero lo que realmente diferencia un
envejecimiento articular sano de un proceso artrósico es el contenido y
distribución de agua y proteoglicanos en el cartílago.
En la artrosis, los procesos catabólicos y anabólicos se incrementan de
forma importante aunque la calidad de los compuestos sintetizados y la capacidad
de ensamblaje de los componentes de la matriz difieren de la de un cartílago sano
como veremos más adelante (Munuera, 1997; Poole et al., 2007).
En las articulaciones sinoviales la relación entre los factores biológicos y
biomecánicos coexisten estrechamente y, por tanto, la alteración de uno de ellos
induce la alteración del otro provocando, en último término, la artrosis (Sánchez y
Martin, 1987). La biomecánica de la articulación se basa en mecanismos activos y
pasivos que colaboran entre sí con el fin de atenuar las fuerzas de compresión que
se dan sobre la articulación de la rodilla de forma natural. El mecanismo pasivo
que soporta la compresión es, principalmente, el hueso subcondral y los
Figura 1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis.IMC: índice de masa corporal.
· Genética· Sexo· Raza· Edad
· Obesidad (IMC>30)· Traumatismos· Hábitos tóxicos· Aumento de la densidad mineral ósea· Comorbilidad (infecciones, endocrinopatías, metabolopatías)
Factores no modificables Factores modificables
Figura 1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis.IMC: índice de masa corporal.
· Genética· Sexo· Raza· Edad
· Obesidad (IMC>30)· Traumatismos· Hábitos tóxicos· Aumento de la densidad mineral ósea· Comorbilidad (infecciones, endocrinopatías, metabolopatías)
Factores no modificables Factores modificables
· Genética· Sexo· Raza· Edad
· Obesidad (IMC>30)· Traumatismos· Hábitos tóxicos· Aumento de la densidad mineral ósea· Comorbilidad (infecciones, endocrinopatías, metabolopatías)
Factores no modificables Factores modificables
Introducción. Artrosis
3
mecanismos activos serían, por un lado, los músculos que absorben la energía del
movimiento y, por otro, el movimiento articular que distribuye las fuerzas de
compresión (Sánchez y Martin, 1987).
En la génesis de la artrosis encontramos una degeneración producto de la
fatiga articular. La fractura es la estrategia de los componentes de la articulación
sinovial para absorber las fuerzas de compresión en una rodilla envejecida o
sometida a un esfuerzo extremo. Las microfracturas ocurren a lo largo de la vida
del individuo de forma subclínica en el hueso trabecular de los cóndilos
femorales. La acumulación de estas microfracturas en el hueso trabecular provoca
una esclerosis o endurecimiento del hueso subcondral, haciendo que éste pierda su
flexibilidad, dejando así de ser el mayor amortiguador pasivo de las cargas sobre
la articulación. La insuficiente amortiguación provoca un incremento de la presión
sobre el cartílago por parte del hueso subcondral forzando a las moléculas de agua
a salir del cartílago hacia el líquido sinovial. La progresiva deshidratación de la
matriz provoca que el cartílago articular pierda las propiedades biomecánicas que
le confería el agua. Junto con las moléculas de agua, la matriz del cartílago
comienza a perder, por el exceso de compresión, los glicosaminoglicanos de las
capas más superficiales. De forma secundaria a la pérdida de agua y componentes
de la matriz extracelular se produce la muerte de los condrocitos superficiales,
iniciándose así toda una cascada de degradación enzimática de la matriz
extracelular del cartílago articular provocada por la dispersión de los componentes
lisosómicos de los condrocitos. Una vez la superficie del cartílago ha quedado
dañada, aumentan rápidamente las fuerzas de fricción entre el cartílago articular
de la tibia y el fémur acelerando la destrucción del cartílago (Kapandj, 2001;
Munuera, 1997; Owen et al., 1984).
Introducción. Artrosis
4
La liberación al líquido sinovial de los glicopolisacáridos resultantes de la
degradación del cartílago provoca consecuentemente la sinovitis o reacción
inflamatoria del sinovio. La respuesta reparatoria de la articulación es la
formación de acúmulos de matriz extracelular y condrocitos en la periferia de la
articulación, con la finalidad de estabilizar el movimiento de la articulación y
evitar un mayor desgaste por fricción de las superficies de cartílago femoral y
tibial. Estas formaciones son los denominados osteofitos (Menkes y Lane, 2004;
van der Kraan y van den Berg, 2007).
Etiología
Según su etiología se diferencian dos tipos de patología: la artrosis
primaria en la cual no se conoce ninguna alteración articular preexistente que
pueda condicionar la aparición de la enfermedad; y la artrosis secundaria que
aparece como consecuencia de un claro antecedente traumático, como una fractura
o luxación. Aunque la etiología de la artrosis es multifactorial, se apunta al factor
mecánico como causa principal de la artrosis (Hunter y Felson, 2006).
Implicaciones clínicas
La característica principal y más recurrente del cuadro clínico de la artrosis
es el dolor. En la génesis del dolor están implicados por igual la inflamación
sinovial y de las partes blandas de la articulación, los componentes de la cápsula
articular, la afectación de las superficies del cartílago articular que se encuentran
en fricción continua durante el movimiento, y la contractura muscular que suele
acompañar a la degeneración de la articulación sinovial.
Introducción. Artrosis
5
El dolor artrósico se define por ser más intenso al comenzar la marcha,
disminuye en intensidad con el movimiento y se agrava sustancialmente al
finalizar el movimiento.
Otra característica clínica de la artrosis es la limitación del movimiento que se
debe tanto a las fibrosis y adherencias sinoviales a la cápsula articular, como a los
rozamientos óseos entre los osteofitos marginales. La destrucción ósea, la
aparición de osteofitos y las fibrosis que aparecen en la membrana sinovial y
cápsula articular, originan las características deformidades de las articulaciones
afectadas de artrosis, que, en el caso de las articulaciones interfalángicas se
denominan nódulos de Heberden y de Bouchard (Munuera, 1997).
1.1.2 Anatomía de la articulación
La articulación (del latín articulatio, unión) se define como la estructura
que une dos o más huesos en el sitio en el que coinciden.
Existen diferentes tipos de articulación, las articulaciones inmóviles o
ligeramente móviles se denominan sinartrosis, dentro de esta categoría
encontramos las sincondrosis (donde los huesos están unidos por cartílago hialino
como en el caso de las vértebras), las sindesmosis (los huesos están unidos por
tejido conjuntivo denso, un ejemplo son las suturas craneales) y las sinostosis (los
huesos están en contacto directo permitiendo su crecimiento pero no el
movimiento como la fusión de los huesos mandibulares). Y, por último, las
articulaciones móviles se denominan diartrosis o articulaciones sinoviales (gr.
Syn, juntas, lat. Ovum, huevo) que serán objeto de estudio en la presente tesis.
Introducción. Artrosis
6
1.1.2.1 Articulación sana
Como ya se ha mencionado, la articulación sinovial es la única que
permite un libre movimiento entre dos huesos, donde los extremos o epífisis de
los huesos implicados están recubiertos de cartílago hialino y lubricados por el
líquido sinovial. Pertenecen a este grupo de articulaciones las interfalángicas, la
de la cadera y la rodilla, entre otras. Este tipo de articulación es la que aparece
más frecuentemente afectada por la artrosis. Como ya se ha mencionado, esta
enfermedad afecta a gran variedad de articulaciones aunque las más afectadas
suelen ser la articulación de la cadera y la de la rodilla. Dado que en los modelos
animales que se han estudiado en la presente tesis se ha evaluado la progresión de
la enfermedad en la articulación de la rodilla, procederemos a describir más
detalladamente la articulación de rodilla sana.
En la figura 2 observamos las estructuras que componen la articulación de
la rodilla en diferentes orientaciones para poder identificar las estructuras
anatómicas de las que hablaremos más adelante. Al cartílago hialino que recubre
las epífisis de los huesos largos implicados en la articulación y está implicado en
el desplazamiento de los huesos en la articulación se le denomina cartílago
articular, que será descrito detalladamente en posteriores apartados. La
articulación sinovial está protegida por la cápsula articular que se fusiona con él
periostio de los huesos que componen la unión a suficiente distancia de ésta para
no limitar el movimiento. La cápsula se compone externamente por una capa
fibrosa de tejido conectivo continuación de los periostios y su interior está
recubierto de forma intermitente por la membrana sinovial. En la figura 3
podemos apreciar la disposición de la membrana sinovial en una rodilla sana que
recubre completamente las superficies de cartílago en contacto, protegiéndolas y
Introducción. Artrosis
7
lubricándolas para amortiguar las fuerzas de fricción que afectan a la articulación
(Kapandj, 2001).
La membrana sinovial
La membrana sinovial mide unos 35 µm de grosor y forma pliegues que se
proyectan hacia el interior de la articulación, también llamados vellosidades
sinoviales (fig 4). Estas vellosidades aumentan en número y tamaño con la edad
llegando a presentar zonas cartilaginosas en su interior durante el envejecimiento
(Kapandj, 2001).
En la figura 4 podemos observar la membrana sinovial de la rodilla de un
ratón CBA de 11 semanas de edad, que no padece artrosis, donde se pueden
distinguir algunas vellosidades sinoviales, así como los diferentes tipos celulares
Fémur Fémur
Tibia Tibia
TibiaPeroné
Peroné
Cartílagoarticular
Cartílagoarticular
RótulaCóndilos femorales
ANATOMÍA DE LA RODILLA
Fémur
Figura 2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana.En el gráfico se distinguen las principales estructuras anatómicas que componen la articulación sinovial en diferentes orientaciones. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
Fémur Fémur
Tibia Tibia
TibiaPeroné
Peroné
Cartílagoarticular
Cartílagoarticular
RótulaCóndilos femorales
ANATOMÍA DE LA RODILLA
FémurFémurFémur FémurFémur
TibiaTibia TibiaTibia
TibiaTibiaPeronéPeroné
PeronéPeroné
CartílagoarticularCartílagoarticular
CartílagoarticularCartílagoarticular
RótulaRótulaCóndilos femoralesCóndilos femorales
ANATOMÍA DE LA RODILLAANATOMÍA DE LA RODILLA
FémurFémur
Figura 2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana.En el gráfico se distinguen las principales estructuras anatómicas que componen la articulación sinovial en diferentes orientaciones. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
Introducción. Artrosis
8
que confieren a la membrana sinovial sus principales características. Las células
que componen la membrana sinovial son células de tipo fibroblástico, que se
encuentran en la superficie, llamadas sinoviocitos y poseen un abundante retículo
endoplásmico como corresponde a su función primordial, la síntesis y secreción
del colágeno, proteoglicanos y del resto de componentes del líquido sinovial.
Membrana sinovial
Figura 3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana. En el gráfico podemos observar la disposición de la membrana sinovial que recubre y lubrifica la articulación sinovial de la rodilla humana.(imagen modificada de www.eorthopod.com)
Membrana sinovialMembrana sinovialMembrana sinovial
Figura 3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana. En el gráfico podemos observar la disposición de la membrana sinovial que recubre y lubrifica la articulación sinovial de la rodilla humana.(imagen modificada de www.eorthopod.com)
Figura 4: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (20X) de la membrana sinovial de una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías se observan las microvellosidades sinoviales (*) así como las diferentes disposiciones celulares que conforman la membrana sinovial sana.
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*
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* Figura 4: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (20X) de la membrana sinovial de una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías se observan las microvellosidades sinoviales (*) así como las diferentes disposiciones celulares que conforman la membrana sinovial sana.
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Introducción. Artrosis
9
También se encuentran formando parte de la membrana macrófagos, que
presentan un voluminoso aparato de Golgi y son responsables de la eliminación de
los restos del desgaste en el interior de la articulación. Todos estos tipos celulares
son nutridos por una vasta red de capilares (Gerwin et al., 2006).
El líquido sinovial
La función primordial de la membrana sinovial es la síntesis y reabsorción
del líquido sinovial. Este fluido viscoso aporta lubricación a las superficies
articulares, previene el contacto entre las superficies, aporta nutrientes a las
células del cartílago articular y elimina productos de desecho. La membrana
sinovial, como ya se ha mencionado, posee una rica vascularización y,
aproximadamente, la mitad de los capilares presentan aberturas hacia el interior de
la cavidad articular. El líquido sinovial es un ultrafiltrado de plasma a través de la
matriz molecular de ácido hialurónico. El exudado lubricante que baña las
superficies articulares está compuesto por agua, solutos de la sangre, ácido
hialurónico y lubricina que le proporcionan las propiedades lubricantes, y las
glicoproteínas que se encuentran normalmente en el cartílago. En el fluido
sinovial sano también se pueden observar eventualmente pequeñas cantidades de
linfocitos y monocitos (Altman, 2007). Los desechos del metabolismo articular se
eliminan por los capilares linfáticos una vez el transudado de los capilares
sanguíneos se ha vertido hacia la cavidad articular y ha cumplido su función. Esta
circulación ocurre gracias a los cambios de presión provocados por la flexión de la
articulación (Owen et al., 1984; Gerwin et al., 2006; Sandell et al., 2007).
Introducción. Artrosis
10
El cartílago
Como ya se ha mencionado anteriormente, las epífisis de los huesos
implicados en la articulación se encuentran recubiertas de cartílago de tipo hialino
llamado cartílago articular.
El cartílago es una forma especializada de tejido conjuntivo compuesto por
los condrocitos distribuidos de forma dispersa y la matriz extracelular que los
contiene. Este tejido no posee vascularización ni inervación nerviosa y sus
células, los condrocitos, se sitúan en cavidades o lagunas y se nutren por difusión
a través de la matriz extracelular.
Tipos de cartílago
Se distinguen tres tipos de cartílago según la proporción de fibras de
colágeno y elastina que poseen en su matriz extracelular: elástico, fibrocartílago
e hialino.
El cartílago elástico es el tipo menos común y se encuentra únicamente
en el oído externo, las paredes del conducto auditivo externo y la trompa de
Eustaquio, la epiglotis y en pequeños fragmentos del cartílago de la laringe. Los
condrocitos están alojados en lagunas agrupados por grupos isogénicos de dos a
cuatro células y la matriz extracelular se compone de fibras de elastina muy
ramificadas que le confieren gran flexibilidad.
El fibrocartílago es una forma transicional entre el hueso y el tejido
conectivo fibroso denso de los tendones y ligamentos. Los condrocitos se
encuentran rodeados de poca matriz extracelular y se encuentran dispuestos en
filas entre fibras de colágeno I. La matriz extracelular es rica en
glicosaminoglicanos como el condroitín sulfato y el dermatán sulfato.
Introducción. Artrosis
11
El cartílago hialino es la variedad principal y está presente en los anillos
traqueales, la nariz, la laringe, en la unión de las costillas al esternón y constituye
la matriz extracelular del cartílago articular. Es un tejido de apariencia blanca
azulosa traslúcida. El colágeno secretado por los condrocitos constituye el 40%
del peso seco de la matriz cartilaginosa. El colágeno tipo II es el predominante y
se organiza como una red laxa por toda la matriz del cartílago hialino. Los
condrocitos se encuentran en lagunas recubiertas por la cápsula pericelular de un
grosor de 1 a 3 µm y formadas por una malla de fibras similar a la lámina basal.
En esta capa pericelular están localizados los colágenos minoritarios y se
cree que posee una función protectora en los cartílagos sometidos a compresión o
tensión mecánica. Una especialización del cartílago hialino es el cartílago
articular, que será descrito detalladamente en otro apartado dado que es el tejido
más gravemente afectado en el proceso artrósico (Kapandj, 2001).
1.1.2.2. Articulación artrósica
Como ya se ha descrito anteriormente, el principal factor implicado en el
proceso artrósico es la sobrecarga mecánica durante largos periodos de tiempo. La
artrosis de rodilla, gonartrosis, tiene un peor pronóstico que la artrosis de cadera,
coxartrosis, por la presión a la que está sometida de forma continua. La
biomecánica de la rodilla demuestra que la mayor parte de las presiones se
transmiten en la articulación a través del cóndilo femoral al platillo tibial medial,
de forma que el compartimiento que más desgaste presenta es la parte medial del
platillo tibial de la articulación. Por tanto, el desgaste del cóndilo medial junto con
el platillo medial tibial provoca una alteración del eje biomecánico del miembro,
desplazándose las presiones medialmente y agravando la destrucción ósea. Así se
cierra el círculo presión-erosión-presión (Munuera, 1997; Kapandj, 2001).
Introducción. Artrosis
12
En la figura 5 se muestra un esquema de la progresión que sigue el
cartílago articular en el desarrollo de la artrosis, siendo el desencadenante, como
veremos más adelante, una acumulación de lesiones mecánicas del cartílago
articular que conllevan un debilitamiento del cartílago, patente en la pérdida de
proteoglicanos y condrocitos de la matriz que acaban por deteriorar la superficie
articular, pudiendo llegar a aparecer regiones donde el cartílago ha desaparecido
por completo y queda al descubierto el hueso subcondral. La erosión entre las
superficies en contacto entra entonces en una dinámica destructiva y dolorosa.
La anatomía patológica de la rodilla artrósica indica que, a escala
macroscópica, el cartílago articular se presenta amarillento, opaco, rugoso y
menos elástico que el cartílago sano. Aparecen frecuentemente fisuras en la
superficie, provocando en los casos más avanzados de la enfermedad el
desprendimiento y la pérdida de fragmentos completos de cartílago, dejando como
cicatriz ulceraciones que pueden llegar al hueso subcondral en estadios más
avanzados de la enfermedad (Stevens y Lowe, 2001; Owen et al., 1984).
A nivel microscópico, se aprecia la erosión de la matriz extracelular en la
superficie del cartílago y la pérdida de condrocitos, observándose al microscopio
lagunas condrocitarias vacías en la capa más superficial. En las capas más
profundas se observan, por contra, lagunas de mayor tamaño que pueden contener
diez o más condrocitos, lo que demuestra la división de los condrocitos con una
finalidad reparadora (Stevens y Lowe, 2001).
Por lo que respecta a las lesiones óseas, se observan osteofitos en
posiciones marginales de la articulación con la posible función de estabilizar la
Introducción. Artrosis
13
Lesión mecánica del cartílago del cóndilo femoral
Erosión de la superficiedel cartílago articular con pérdida de proteoglucanosy condrocitos
Pérdida de fragmentosde cartílago
Desaparición del cartílago
A B
C D
El hueso subcondral queda al descubiertoE
Figura 5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis. (A) Una acumulación de lesiones mecánicas sobre el cartílago articular de los cóndilos femorales provoca (B) una erosión progresiva del cartílago que conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular y de condrocitos superficiales. (C) El debilitamiento de la matriz del cartílago provoca una ruptura de la superficie del cartílago articular que puede llegar en estadios más avanzados de la enfermedad (D) a la desaparición de regiones del cartílago dejando el hueso subcondral al descubierto (E). (F) Rodilla artrósica. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
F
Lesión mecánica del cartílago del cóndilo femoral
Erosión de la superficiedel cartílago articular con pérdida de proteoglucanosy condrocitos
Pérdida de fragmentosde cartílago
Desaparición del cartílago
A B
C D
El hueso subcondral queda al descubiertoE
Figura 5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis. (A) Una acumulación de lesiones mecánicas sobre el cartílago articular de los cóndilos femorales provoca (B) una erosión progresiva del cartílago que conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular y de condrocitos superficiales. (C) El debilitamiento de la matriz del cartílago provoca una ruptura de la superficie del cartílago articular que puede llegar en estadios más avanzados de la enfermedad (D) a la desaparición de regiones del cartílago dejando el hueso subcondral al descubierto (E). (F) Rodilla artrósica. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
F
Introducción. Artrosis
14
articulación dañada y retrasar así la degradación del cartílago (van der Kraan y
van den Berg, 2007; Menkes y Lane, 2004). La esclerosis subcondral es visible al
microscopio, donde se observan laminillas de tejido óseo superpuestas bajo la
placa ósea subcondral.
El estudio anatomopatológico del sinovio revela una fibrosis en estadios
avanzados de la artrosis que, junto con la fibrosis de la cápsula articular, limitan
los movimientos articulares minimizando los daños por fricción. La sinovitis es
común en fases muy avanzadas de la patología donde existe afectación de la zona
subcondral y se basa en una inflamación del sinovio con infiltrados de células
mononucleares (Kapandj, 2001; Stevens y Lowe, 2001). La sinovitis en la artrosis
es una inflamación crónica producida por la concentración excesiva en el líquido
sinovial de restos de polisacáridos productos de la degradación del cartílago
articular en la progresión de la artrosis (Sánchez y Martin, 1987).
Además, se ha observado que los sinoviocitos presentan alteraciones
ultraestructurales, como un retículo endoplásmico rugoso aumentado con un
aparato de Golgi disminuido, así como un aumento en el número de lisosomas
como adaptación al aumento de actividad secretora de dichas células (Lorenz y
Richter, 2006). El líquido sinovial cambia de color pasando de transparente a
amarillento y la densidad de células asciende de 20-200 a valores de 200-2000
células/mm3 apareciendo células inflamatorias (Sánchez y Martin, 1987). Los
niveles de colesterol y fosfolípidos en el líquido sinovial sano son similares a los
encontrados en el suero, mientras que en articulaciones afectadas de artrosis
aparecen elevados los niveles de colesterol, fosfolípidos y triglicéridos (Lorenz y
Richter, 2006; Gerwin et al., 2006)
Introducción. Artrosis
15
1.1.3 El cartílago articular
El cartílago articular (fig. 6)
se encuentra recubriendo todas las
superficies de los huesos que
componen la articulación donde
pueda existir algún tipo de contacto
durante el movimiento completo de
ésta y, por tanto, debe generar el
mínimo rozamiento y ser muy
resistente a la carga, ya que debe
soportar fuerzas de compresión,
tensión y cizalla. Más del 70% del
cartílago articular es agua que se encuentra unida reversiblemente a los elementos
de la matriz extracelular del cartílago. Gracias a esta característica, el cartílago
articular actúa como una esponja dejando escapar el agua cuando se le comprime
y la reabsorbe cuando cesa la presión, lo que le confiere un papel amortiguador y
protector de los componentes de la articulación (Munuera, 1997; Sánchez y
Martin, 1987). Se trata de un tejido hipocelular, ya que los condrocitos
representan únicamente el 1-2% del volumen total. El 50% del peso en seco
corresponde al colágeno tipo II, el 40% a un proteoglicano llamado agrecano y el
10% restante del peso del cartílago en seco corresponde a pequeños
proteoglicanos de gran importancia implicados también en la estructura de la
matriz y otros colágenos minoritarios tipo VI, IX, X y XI (Sandell et al., 2007;
Ham y Cormack, 1984).
Cartílago articular
Figura 6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana.El gráfico muestra todas las superficies de la articulación que se encuentran recubiertas por cartílago articular. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
Cartílago articularCartílago articularCartílago articular
Figura 6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana.El gráfico muestra todas las superficies de la articulación que se encuentran recubiertas por cartílago articular. (imagen modificada de www.eorthopod.com)
Introducción. Artrosis
16
Estructura del cartílago articular
Pese al escaso grosor del cartílago articular (unos 7 mm en articulaciones
humanas) y a su aparente homogeneidad, se pueden diferenciar cuatro regiones
según la composición celular y la disposición de las fibras de colágeno.
En la capa superficial los condrocitos están aplanados y dispuestos de
forma paralela a la superficie del cartílago junto con las fibrillas de colágeno. En
esta capa existe una elevada concentración de decorina, un proteoglicano de bajo
peso molecular, pero en cambio la concentración de agrecano es muy baja.
La capa media posee los condrocitos en su forma redondeada envueltos
en haces radiales de gruesas fibrillas de colágeno. La cantidad de condrocitos
disminuye con la profundidad en el cartílago articular. Disminuye la
concentración de colágeno tipo II respecto de la capa superficial.
En la capa profunda, la densidad de células disminuye aún más y se
encuentran agrupadas en columnas o racimos y presentan una morfología
hipertrófica llegando a doblar el volumen celular de los condrocitos de la capa
superficial. La concentración de agrecano es máxima, mientras que la cantidad de
colágeno disminuye. Los haces de colágeno II aumentan de grosor y están
dispuestos de forma radial.
La zona más profunda está ocupada por la capa calcificada donde se
encuentra principalmente colágeno tipo X y los condrocitos se muestran
hipertróficos. La zona calcificada actúa como amortiguador mecánico entre el
cartílago articular no calcificado y el hueso subcondral. Esta capa persiste
mientras existe el fenómeno de osificación endocondral a medida que se reabsorbe
la placa de crecimiento.
Introducción. Artrosis
17
De forma paralela a como ocurre con la densidad celular, la concentración
de agua disminuye con la profundidad representando en la capa superficial un 70-
80% del peso total y únicamente un 65-70% en la zona profunda.
Las propiedades biomecánicas características del cartílago articular se las
confiere la red de colágeno fibrilar que proporciona la fuerza tensil. Los
proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados a grandes cantidades de agua le
confieren gran resistencia a la deformación por compresión, cualidades todas
importantes para el funcionamiento normal de la articulación sinovial (Kapandj,
2001; Owen et al., 1984; Windle, 1997).
Composición del cartílago articular
Colágeno
Representa el 25% del total de las proteínas del organismo. Existen 18
tipos diferentes de moléculas de colágeno y todos se caracterizan por poseer una
estructura de triple hélice y formar parte integral de la matriz extracelular.
Los tipos I, II y III constituyen el 80-89% del colágeno total del animal. Se
sintetizan como un procolágeno de triple hélice continua. Extracelularmente, las
peptidasas del procolágeno convierten éste en monómeros de colágeno de triple
hélice flanqueadas por dos regiones cortas no helicoidales. Los monómeros se
ensamblan de forma espontánea en fibrillas tras haber sido eliminados los
propéptidos. Otros colágenos conocidos como FACIT (Fibril Associated
Collagens with Interrupted Triple helices) como los tipos IX, XII y XIV se
asocian a las fibrillas modificando sus posibilidades de interacción con la matriz
(Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).
Introducción. Artrosis
18
Glicosaminoglicanos (GAG)
Los GAG están formados por largas cadenas no ramificadas de
polisacáridos, compuestas a su vez por unidades repetidas de disacáridos. Estas
cadenas son altamente hidrofílicas y pueden, por tanto, unir gran cantidad de
moléculas de agua y adoptar conformaciones muy extendidas, ocupando un
enorme volumen con relación a su masa. En el cartílago articular, los GAG no
representan más del 10% del peso total pero, debido a su capacidad de retener
moléculas de agua, ocupan prácticamente la totalidad de la matriz extracelular.
Las características que confieren los GAG a la matriz del cartílago
articular permiten, no sólo la difusión de moléculas solubles importantes para la
nutrición de los condrocitos sino que constituyen un soporte mecánico esencial
para el desarrollo de las funciones de la articulación.
Los glicosaminoglicanos se distinguen por el tipo de azúcares que poseen,
el tipo de unión entre estos restos y la presencia de los grupos sulfato. El tipo de
GAG de mayor importancia estructural en el cartílago articular es el ácido
hialurónico y se trata de un disacárido de glucuronato y N-acetilglucosamina sin
sulfatar. El condroitín sulfato es un disacárido de glucuronato de N-
acetilgalactosamina. Por epimerización del glucuronato del condroitín sulfato en
iduronato se obtiene el dermatán sulfato. Y, por último, el keratán sulfato se
caracteriza por ser un disacárido de galactosa y N-acetilglucosamina, mientras que
el heparán sulfato contiene iduronato y N-acetilglucosamina.
Aunque todos los tipos de GAG están presentes en la matriz del cartílago
articular, el glicosaminoglicano más abundante es el ácido hialurónico. Se trata
del GAG de estructura más sencilla aunque difiere en algunas características
importantes con la mayoría de los GAG como, por ejemplo, en el hecho que el
ácido hialurónico es el único que no forma proteoglicanos y es el único que no
Introducción. Artrosis
19
está sulfatado. Mientras el resto de glicosaminoglicanos son sintetizados
intracelularmente y liberados por exocitosis, el ácido hialurónico es sintetizado
por un complejo enzimático integrado en la membrana celular del condrocito
(Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).
Proteoglicanos
Están constituidos por un GAG que representa un 95% de la molécula,
unido covalentemente a una proteína central (5%). Los proteoglicanos y los
glicosaminoglicanos también se asocian a proteínas fibrosas como el colágeno
formando redes proteicas extremadamente complejas características del cartílago
articular. El principal proteoglicano del cartílago es el agrecano, que se une al
ácido hialurónico en la matriz extracelular para formar grandes complejos visibles
al microscopio electrónico (fig 7). El agrecano es una molécula de 225-250 kDa y
está compuesto por una proteína central con más de 100 cadenas de GAG unidas.
La mayoría de GAG unidos al agrecano son condroitín sulfato y, en menor
proporción, el keratán sulfato. El agrecano se encuentra normalmente en la matriz
del cartílago articular como un gran agregado de más de 200 moléculas unidas a
una molécula simple de ácido hialurónico mediante una pequeña glicoproteína
visible al microscopio electrónico (Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).
El conocimiento exhaustivo de la composición de la matriz del cartílago ha
permitido la identificación de marcadores moleculares en suero que pueden
utilizarse para diagnosticar alteraciones en el metabolismo del cartílago y
procesos degenerativos como la artrosis, enfermedad objeto del presente estudio.
Introducción. Artrosis
20
Figura 7: Agrecano de cartílago bovino fetal. A: micrografía electrónica del complejo del agrecano. B: esquema del complejo del agrecano. Imagen modificada de Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 2002.
Figura 7: Agrecano de cartílago bovino fetal. A: micrografía electrónica del complejo del agrecano. B: esquema del complejo del agrecano. Imagen modificada de Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 2002.
Condrocitos
Los condrocitos provienen de la familia de células del tejido conjuntivo,
junto con los fibroblastos y los osteocitos. Todas estas formas celulares son
interconvertibles entre sí con un medio extracelular adecuado. La formación y
proliferación del cartílago articular se produce gracias a la acción de los
condrocitos, que regulan el crecimiento y remodelación de la matriz extracelular
que los contiene. Se trata de células especializadas en la síntesis y excreción de
colágeno tipo II principalmente. Se encuentran ocupando al completo lagunas del
cartílago. Su núcleo es irregular, con la cromatina condensada y en el citoplasma
se observa un gran retículo endoplásmico característico de células secretoras. El
número de mitocondrias en el citoplasma es relativamente bajo, lo que demuestra
Introducción. Artrosis
21
que el condrocito obtiene la energía principalmente de la glucólisis de las
partículas de glucógeno que se observan también en el citoplasma (Sandell et al.,
2007; Windle, 1997).
Por tanto, la matriz extracelular se construye de la siguiente forma, los
proteoglicanos son secretados por los condrocitos en su forma monomérica, se
unen al ácido hialurónico en el medio extracelular formando agregados, que a su
vez forman enlaces con fibras de colágeno, formando así una gran red
tridimensional de características inigualables por otros tejidos del organismo.
Además de estos componentes, los condrocitos sintetizan e incorporan a
su superficie celular condronectina, que se une específicamente al colágeno tipo II
y a los glicosaminoglicanos y cuya función parece ser la de facilitar la unión del
resto de componentes a la membrana de la célula (Sandell et al., 2007).
1.1.3.1 Propiedades biomecánicas de la articulación
Las dos funciones principales del cartílago articular son: transmitir y
amortiguar las cargas ejercidas sobre la articulación, donde se encuentran
implicados también el hueso subcondral y el trabecular subyacente, y minimizar el
rozamiento en el contacto entre superficies articulares opuestas.
El mecanismo pasivo que atenúa las fuerzas de compresión es
principalmente el hueso subcondral y los mecanismos activos serían, por un lado
los músculos que absorben la energía del movimiento y por otro el movimiento
articular que distribuye las fuerzas de compresión (Sánchez y Martin, 1987; Owen
et al., 1984).
El cartílago articular posee propiedades viscoelásticas, lo que le permite,
en presencia de una carga constante, sufrir una deformación en dos fases, una
rápida inicial y otra lenta y progresiva hasta alcanzar un equilibrio. Este
Introducción. Artrosis
22
mecanismo de viscoelasticidad está basado fundamentalmente en el flujo de
líquido intersticial de la matriz del cartílago y en el movimiento de las
macromoléculas que conforman la matriz del cartílago articular.
Las fuerzas ejercidas durante el reposo, la marcha o el salto oscilan entre
cero y n veces el peso del cuerpo. Al aumentar la fuerza, aumenta el área de
contacto entre las superficies cartilaginosas hasta que se llega a deformar e incluso
fracturar el hueso subcondral. Los tejidos que componen la articulación son más
resistentes cuanto más alejados se encuentran de la superficie articular; así, desde
la zona superficial va aumentando en la capa subcondral y alcanzando su máxima
resistencia en el hueso compacto. Esta graduación de resistencias asegura una
amortiguación eficaz del impacto.
1.1.3.2 Biomarcadores
Dado que el cartílago es capaz, en las primeras fases de la enfermedad, de
repararse aportando nuevas células y nuevos componentes a la matriz extracelular
se debería desarrollar una metodología de diagnóstico precoz que se sirva de la
capacidad reparadora del cartílago articular para enlentecer o atenuar los estragos
de la degradación de la articulación. Por ello, actualmente, gran parte de los
esfuerzos en la investigación para el tratamiento de la artrosis se centra en la
caracterización de biomarcadores que sirvan de pronóstico del desarrollo de la
patología.
Un biomarcador se define como una molécula, cuyas concentraciones en
los fluidos del organismo (líquido sinovial, sangre u orina) permita prever el
estado metabólico de la articulación (Kong et al., 2006). Los biomarcadores que
se encuentran actualmente en estudio se pueden clasificar como los implicados en
el anabolismo y los resultantes del catabolismo articular. Algunos de los
Introducción. Artrosis
23
marcadores del anabolismo son la fosfatasa alcalina ósea producida por los
osteoblastos y requerida para la mineralización del cartílago articular, la
osteocalcina (OC), o aquellos biomarcadores derivados de la síntesis del colágeno
tipo II, como los propéptidos N- y C- terminales (PIICP, PIIANP y PIIBNP)
(Charni-Ben Tabassi et al., 2008; Bay-Jensen et al., 2008), productos liberados
tras la acción de las peptidasas sobre el procolágeno. El equilibrio entre los
biomarcadores del anabolismo óseo y los resultantes del catabolismo articular
permite conocer el ritmo de degradación-reparación de nueva matriz extracelular
(Goldring y Goldring, 2007). Los marcadores relacionados con el catabolismo
articular los podemos dividir entre aquellos relacionados con la afectación de los
glicosaminoglicanos que conforman el cartílago articular y aquellos derivados de
la degradación del colágeno tipo II. Entre los componentes de la matriz
extracelular del cartílago que se han estudiado figuran el ácido hialurónico (HA)
(Elliott et al., 2005; Criscione et al., 2005), la proteína oligomérica de la matriz
del cartílago (COMP) (Dickinson et al., 2003; Hedbom et al., 1992), el keratán
sulfato (KS), el neoepítopo del agrecano CS846 y la osteocalcina (OC). De todos
estos biomarcadores se ha observado no sólo que presentan variabilidad
circadiana en sus niveles y su excreción es dependiente del ejercicio físico (Kong,
et al., 2006), sino que muchos de ellos aparecen elevados en personas con
evidencias radiológicas de una próxima artrosis como son COMP, KS, HA y OC
(Glasson et al., 2007; Wakitani et al., 2007; DeLaurier et al., 2002).
Por último, aquellos biomarcadores basados en la destrucción del colágeno
tipo II (fig. 8) serían los neoepítopos del segmento helicoidal del colágeno tipo II
(Helix-II) (Charni et al., 2005), el C-telopéptido terminal del colágeno II (CTX-II)
(Charni et al., 2005; Meulenbelt et al., 2006) y el extremo C-terminal del
Introducción. Artrosis
24
propéptido resultante de la digestión del colágeno tipo II por colagenasas (C1,C2)
(Garnero, 2007).
Todos ellos se encontrarían elevados en procesos artrósicos avanzados
como respuesta a la destrucción del colágeno tipo II del cartílago articular
(DeLaurier et al., 2002; Bay-Jensen et al., 2008; Kong et al., 2006; Meulenbelt et
al., 2006; Fernandes et al., 2007). La desventaja que presentan los biomarcadores
séricos relacionados con el colágeno es que muestran el estado de todo el
N-propéptido N-telopéptido Triple hélice C-telopéptido C-propéptido
PIINP PIICP
Sitio de unión de la colagenasa
fragmento 3/4 fragmento 1/4
Figura 8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II. La colagenasa genera dos fragmentos que son ¾ y ¼ de la molécula de procolágeno. El neoepítopo del fragmento ¾ es reconocido por el anticuerpo C1,C2 y C2C y el correspondiente al fragmento ¼ es detectado por la secuencia del telopéptido C-terminal del colágeno tipo II (CTX-II). El epítopo HELIX-II (colágeno tipo II helicoidal) reconoce el colágeno tipo II fibrilar. Los propéptidos resultantes de la acción de las proteasas sobre el procolágeno descubren los neoepítopos PIINP (propéptido N-terminal del colágeno tipo II) y PIICP (propéptido C-terminal del colágeno tipo II).(imagen modificada de Rousseau et al., 2007)
N-propéptido N-telopéptido Triple hélice C-telopéptido C-propéptido
PIINP PIICP
Sitio de unión de la colagenasa
fragmento 3/4 fragmento 1/4
N-propéptido N-telopéptido Triple hélice C-telopéptido C-propéptido
PIINP PIICP
Sitio de unión de la colagenasa
fragmento 3/4 fragmento 1/4
Figura 8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II. La colagenasa genera dos fragmentos que son ¾ y ¼ de la molécula de procolágeno. El neoepítopo del fragmento ¾ es reconocido por el anticuerpo C1,C2 y C2C y el correspondiente al fragmento ¼ es detectado por la secuencia del telopéptido C-terminal del colágeno tipo II (CTX-II). El epítopo HELIX-II (colágeno tipo II helicoidal) reconoce el colágeno tipo II fibrilar. Los propéptidos resultantes de la acción de las proteasas sobre el procolágeno descubren los neoepítopos PIINP (propéptido N-terminal del colágeno tipo II) y PIICP (propéptido C-terminal del colágeno tipo II).(imagen modificada de Rousseau et al., 2007)
Introducción. Artrosis
25
colágeno tipo II del organismo y por tanto puede ser difícil adjudicar una
alteración de los valores a un proceso artrósico (Williams y Spector, 2008).
Estos biomarcadores representan en los fluidos biológicos, en mayor o
menor medida, el estado de las articulaciones. En el individuo sano presentan
niveles basales en suero, líquido sinovial y orina que se ven alterados en respuesta
a una disfunción del metabolismo óseo, pero todos ellos deben ser perfectamente
caracterizados para dotarles de valor diagnóstico (Kong et al., 2006).
Actualmente, uno de los biomarcadores mejor descrito es el COMP, una
proteína pentamérica de 524 kDa de la familia de las tromboespondinas, que es
sintetizada por los condrocitos y está presente en cartílago, sinovio y tendones
(Svensson et al., 2002; Sharif et al., 2006; Williams et al., 2006).
Esta proteína posee dominios de unión al colágeno I, II y IX y, por tanto,
está implicada en el mantenimiento de la integridad de la red que conforma el
colágeno en el cartílago articular. Se ha descrito que sus niveles séricos pueden
aumentar hasta seis veces los niveles basales (Williams y Spector, 2008), aunque
cuando el biomarcador aumenta en esta proporción, el cartílago articular ya se
encuentra gravemente dañado.
Otro de los biomarcadores más estudiado es el CTX-II, que da información
sobre la afectación del colágeno tipo II. A pesar de los inconvenientes del estudio
de marcadores de degradación del colágeno, éste ha demostrado ser un indicador
válido del estadio de la enfermedad. De hecho, se ha demostrado que pacientes
que presentan niveles de COMP elevados en etapas iniciales de la enfermedad,
progresan en la patología elevando sustancialmente los niveles de CTX-II
(Williams y Spector, 2008; Posey y Hecht, 2008; Andersson et al., 2006).
Todo ello sería coherente con la progresión de la enfermedad, ya que la
artrosis se inicia por una pérdida de proteoglicanos y componentes de la matriz
Introducción. Artrosis
26
extracelular y es posteriormente cuando se produce la colagenolisis (Wakitani, et
al., 2007).
1.1.3.3 Inflamación en la artrosis
La artrosis ha sido considerada tradicionalmente como un tipo de
artropatía no inflamatoria debido a la ausencia de neutrófilos en el líquido sinovial
artrósico y a la falta de manifestaciones sistémicas de inflamación. Sin embargo,
se ha asociado a signos y síntomas característicos de un proceso inflamatorio
como es el dolor articular o la rigidez muscular (Felson, 2006; Hunter y Felson,
2006).
Recientemente, se ha descrito que los condrocitos pueden responder
directamente a las perturbaciones biomecánicas como las que ocurren en la
artrosis, incrementando la síntesis de citocinas inflamatorias, aunque éstas
también pueden ser sintetizadas por estructuras anexas como la membrana
sinovial. También es conocido que, como respuesta a un traumatismo, se activa la
expresión génica global, dando como resultado un incremento en la expresión de
mediadores inflamatorios, proteinasas implicadas en la degradación del cartílago y
factores de respuesta al estrés (Goldring y Goldring, 2007).
Se ha estudiado la sinovitis asociada a la artrosis, como respuesta a la
liberación al espacio sinovial de gran cantidad de restos de la degradación del
cartílago articular. Dado que actualmente está demostrada la presencia en el
infiltrado sinovial de linfocitos B y T acompañados de una sobreexpresión de
mediadores inflamatorios (Goldring y Goldring, 2007; Hunter y Felson, 2006), se
ha postulado que el papel de la inflamación sinovial podría ser favorecer el
reequilibrio entre actividades anabólicas y catabólicas del condrocito en el
Introducción. Artrosis
27
remodelado de la matriz extracelular del cartílago (Goldring y Goldring, 2007;
Loeser, 2006).
La población de sinoviocitos, durante el proceso de degradación del
cartílago en la artrosis, produce prostaglandina E2 (PGE2), y las citocinas
proinflamatorias interleucina 1β (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral α
(TNFα), que estimulan una cascada de activación de diversos mediadores
inflamatorios (Hikiji et al., 2008; Samuels et al., 2008; Felson et al., 2000b;
Felson et al., 2000a; Hardy et al., 2002).
La IL-1β es sintetizada por los condrocitos a concentraciones capaces de
inducir la expresión de colagenasas, prostaglandinas, metaloproteinasas de matriz
(MMPs), agrecanasas y otros genes implicados en el catabolismo (Goldring, 2000;
Goldring y Goldring, 2007). Algunos estudios indican que IL-1β y TNFα
incrementan la síntesis de PGE2 por acción de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), PGE
sintasa microsomal (mPGES) y la fosfolipasa A2 (PLA2) y aumentan la
producción de óxido nítrico (NO) vía la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)
(Hardy et al., 2002). Estudios in vitro realizados en cultivos primarios de
condrocitos han demostrado que IL-1β puede aumentar tanto PGE2 como sus
receptores según el estado metabólico de la célula. En cambio, se ha postulado
que TNFα no posee la capacidad de incrementar ni la expresión de PGE2 ni de sus
receptores (Alvarez-Soria et al., 2007). IL-1β induce también la diferenciación de
los osteoblastos en osteoclastos por medio de la PGE2 (Hikiji et al., 2008). Los
osteoblastos artrósicos producen niveles de PGE2 superiores a los encontrados en
rodillas sanas (Goldring y Goldring, 2007; Hikiji et al., 2008). En el cartílago,
PGE2 puede desempeñar un doble papel, por un lado incrementar el catabolismo
óseo aumentando la producción de metaloproteinasas y de IL-1β; y, por otro lado,
Introducción. Artrosis
28
ejercer efectos protectores sobre el metabolismo del cartílago (Alvarez-Soria, et
al., 2007). La IL-1β también induce otras citocinas proinflamatorias como la IL-6,
la IL-17 y IL-18 (Fernandes et al., 2002).
La citocina proinflamatoria IL-17, a su vez, también estimula la
producción de otras citocinas proinflamatorias con efectos sobre los condrocitos
similares a la IL-1β (Lubberts et al., 2005; Vernal et al., 2008; Goldring y
Goldring, 2007). Trabajos recientes indican que la IL-17 está presente en el
líquido sinovial en la artritis reumatoide (AR) y es responsable del daño óseo, ya
que induce la expresión de RANK (Bezerra et al., 2005), responsable de la
diferenciación de osteoclastos, y por tanto, del catabolismo óseo (Vernal et al.,
2008; Lubberts et al., 2005; Koenders et al., 2006). Diversos estudios clínicos han
demostrado que la IL-17 induce la secreción de IL-6 en sinoviocitos de rodillas
con artritis reumatoide, provocando un círculo de inflamación sinovial,
degradación del cartílago e inhibición de la proliferación de condrocitos (Gaffen,
2004). Aunque existen pocos estudios sobre el posible papel de la IL-17 en la
artrosis, sí podemos encontrar algún estudio en artrosis mandibular y se le ha
relacionado, como ya se había descrito para AR, con la inducción de la
osteoclastogénesis, de citocinas proinflamatorias, metaloproteinasas y, por tanto,
con la destrucción del cartílago y el hueso articular (Vernal et al., 2008; Koenders
et al., 2005; Gaffen, 2004).
1.1.4. Tratamientos actuales de la artrosis
La artrosis es una de las enfermedades que más consultas de atención
primaria ocasiona y uno de los problemas de salud pública más importantes en la
actualidad. El tratamiento del paciente se aborda combinando medidas
Introducción. Artrosis
29
farmacológicas (Zhang et al., 2008) (fig. 9) y no farmacológicas (Zhang et al.,
2007) (fig. 10).
En el tratamiento de la artrosis existen unos objetivos directos (aliviar el
dolor y evitar la progresión de la enfermedad) y otros indirectos como la
regeneración del cartílago, prevención del remodelado del hueso subcondral y de
la sinovitis secundaria (Samuels et al., 2008).
El uso del paracetamol fue recomendado para el tratamiento de la
sintomatología de la artrosis, ya que se demostró que 1g/día tenía los mismos
efectos que 1,2- 2,4 g/día de
ibuprofeno en el tratamiento
de pacientes con artrosis de
rodilla o cadera. Otro
beneficio es que el
paracetamol es mejor tolerado
que el ibuprofeno. Por ello, el
paracetamol es el fármaco de
Figura 10: Opciones terapéuticas no farmacológicas
OPCIONES TERAPÉUTICAS NO FARMACOLÓGICAS
· Educación· Apoyo emocional· Actuación sobre factores de riesgo· Higiene postural y ahorro articular· Termo e hidroterapia· Programa de ejercicios· Tai Chi· Medidas de órtesis
Figura 10: Opciones terapéuticas no farmacológicas
OPCIONES TERAPÉUTICAS NO FARMACOLÓGICAS
· Educación· Apoyo emocional· Actuación sobre factores de riesgo· Higiene postural y ahorro articular· Termo e hidroterapia· Programa de ejercicios· Tai Chi· Medidas de órtesis
Figura 9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis
OPCIONES FARMACOLÓGICAS
AnalgésicosParacetamol
Agentes tópicosCapsaicina
Antiinflamatorios no esteroides Inhibidores selectivos de la COX-2Inhibidores no selectivos de la
COX-2Inyecciones intraarticulares
GlucocorticoidesÁcido hialurónico
Analgésicos opioidesTramadol
Fármacos de acción sintomática lenta Condroitín sulfatoSulfato de glucosaminaDiacereínaÁcido hialurónico
Terapias experimentalesInhibidores de metaloproteinasas
Figura 9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis
OPCIONES FARMACOLÓGICAS
AnalgésicosParacetamol
Agentes tópicosCapsaicina
Antiinflamatorios no esteroides Inhibidores selectivos de la COX-2Inhibidores no selectivos de la
COX-2Inyecciones intraarticulares
GlucocorticoidesÁcido hialurónico
Analgésicos opioidesTramadol
Fármacos de acción sintomática lenta Condroitín sulfatoSulfato de glucosaminaDiacereínaÁcido hialurónico
Terapias experimentalesInhibidores de metaloproteinasas
Introducción. Artrosis
30
primera elección para el tratamiento del dolor moderado en pacientes de artrosis
(Zhang et al., 2008).
Por otro lado, la acción tópica de sustancias como la capsaicina ha
demostrado proporcionar alivio del dolor articular en el proceso artrósico (Zhang,
et al., 2008; Sarzi-Puttini et al., 2005).
Sin embargo, son los antiinflamatorios no esteroides (AINE) los que
presentan mejores resultados en el tratamiento del dolor artrósico. Se ha descrito
que la administración de Artrotec® (una combinación de diclofenaco y
misoprostol), a dosis de 75 mg dos veces al día daba mejores resultados que 4000
mg/día de paracetamol (Simon y Strand, 2007). Es sabido que los AINE reducen
el dolor y la inflamación y poseen efectos antipiréticos, pero no han demostrado
inhibir la destrucción del cartílago articular, ni la formación de osteofitos, ni
protegen el cartílago de lesiones mecánicas o inflamatorias durante la progresión
de la enfermedad. Sin embargo, el tratamiento profiláctico con AINE ha
demostrado reducir la formación ósea heterotópica tras la cirugía de reemplazo
articular (Zhang et al., 2008).
Los AINE más usados en el tratamiento de la artrosis son los inhibidores
selectivos de la COX-2 (COXIB), ya que tienen una eficacia similar a los
inhibidores no selectivos de la COX-2 pero provocan menos alteraciones
gastrointestinales. De entre ellos cabe destacar celecoxib, ya que provoca un alivio
sintomático de la artrosis, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante sin
aumentar el riesgo cardiovascular asociado a los inhibidores no selectivos de la
COX-2 (Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2007).
La terapia intraarticular es una técnica sencilla que permite la
administración de sustancias como el ácido hialurónico o los glucocortocoides. Se
ha demostrado que el ácido hialurónico intraarticular reduce los niveles de IL-6 en
Introducción. Artrosis
31
el líquido sinovial, aunque no parece afectar a la IL-8 o TNF-α (Goldberg y
Buckwalter, 2005; Zhang et al., 2007). También se ha observado que suprime la
expresión de la MMP-3 en la membrana sinovial, aunque no altera sus niveles en
el cartílago. Otra de las opciones para el tratamiento de pacientes con una
importante inflamación articular es la administración intraarticular de
glucocorticoides, ya que inhiben la síntesis de prostaglandinas y reducen la
actividad de enzimas como la colagenasa (Gerwin et al., 2006). Normalmente se
usan en su forma cristalina para prolongar su permanencia en la articulación
(Neustadt y Altman, 2007).
Si el paciente artrósico persiste en sus dolores tras el tratamiento con
paracetamol, AINE y COXIB a dosis máximas, se debe considerar el uso de
analgésicos opioides como tramadol. El tramadol se une a los receptores opioides
µ y es un inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina, lo que
proporciona un importante alivio sintomático del dolor (Zhang et al., 2007; Simon
y Strand, 2007).
Los fármacos de acción sintomática lenta para el tratamiento de la artrosis
(SYSADOA), son compuestos que se prescriben como medicamentos, aunque en
otros países se consideren nutracéuticos. Estos compuestos, en su mayoría
presentes de forma constitutiva en nuestro organismo, no tienen un efecto
inmediato como es el caso de los AINE, y su eficacia clínica sobre los síntomas se
observa a partir de las dos semanas de administración continuada. No obstante,
tras la supresión del tratamiento con SYSADOA, se observa un efecto remanente
de varios meses de duración. Estos compuestos se utilizan como terapia de base
para la artrosis. De entre ellos es de destacar el condroitín sulfato, polisacárido
presente en el cartílago articular que actúa como antiinflamatorio, estimulando la
Introducción. Modelos animales
32
síntesis de proteoglicanos y ácido hialurónico endógenos, y disminuyendo la
actividad catabólica de los condrocitos (Isasi et al., 2004; Zhang et al., 2007).
1.2 MODELOS ANIMALES
En palabras de P H Pritzker “un modelo animal para una enfermedad
humana puede ser definido como un grupo de animales que poseen de forma
heredada, naturalmente adquirida o experimentalmente inducida, características
útiles para la experimentación científica que se parecen a uno o más aspectos de
la patología humana” (Pritzker, 1994).
Por tanto, la utilización de modelos animales tiene la finalidad de
desarrollar un sistema que nos permita comprender el mecanismo básico de la
patología, de forma que, empleando el modelo experimental de forma sistemática,
se pueda llegar a un mejor conocimiento de las bases biológicas y patofisiológicas
de la enfermedad (Zúñiga et al., 2008). En general, el modelo será más útil cuánto
mayor sea su semejanza con la patología humana, aunque lo más común es
encontrar modelos que representen una o varias características de la patología. Por
tanto, para una visión global de la enfermedad, debería emplearse más de un
modelo experimental para obtener resultados más concluyentes (van der Kraan y
van den Berg, 2008).
Aunque existen grandes detractores de la experimentación animal y, en la
actualidad, se han desarrollado gran variedad de métodos alternativos a la
utilización de animales de laboratorio, no existen métodos in vitro que puedan
sustituir los resultados obtenidos in vivo, ya que los modelos animales permiten
obtener resultados globales que muestran la respuesta de todo un organismo
(Zúñiga et al., 2008). Además, en el caso de la artrosis, se hace realmente
complicado poder experimentar con muestras humanas, ya que no es posible
Introducción. Modelos animales
33
obtener muestras hasta que el tejido se encuentra gravemente dañado. Por tanto, se
pierde la oportunidad de estudiar los procesos previos de desgaste y degeneración
que conlleva la enfermedad.
Deben tenerse en cuenta los inconvenientes que presenta la
experimentación animal, como son las dificultades metodológicas, económicas y
éticas. Por tanto, siempre debe realizarse el diseño experimental con suma cautela
y responsabilidad, siguiendo el postulado de las 3Rs de Russell y Burch basado en
la Reducción, Refinamiento y Reemplazo, siempre que sea posible.
Los modelos animales pueden clasificarse como inducidos, generados por
modificación genética, espontáneos, negativos y huérfanos. Los modelos
inducidos son aquellos en los que, a un animal sano se le induce
experimentalmente una enfermedad, como podría ser el caso de la artrosis
inducida por colagenasa intraarticular o la artrosis provocada por la transección
del ligamento cruzado anterior que se estudian en esta Tesis. Los generados por
modificación genética son aquellos en los que la ingeniería genética ha
manipulado los animales para obtener una cualidad digna de estudio, como ocurre
en los animales transgénicos o knock-out. Los modelos espontáneos se han
obtenido a partir de la selección de individuos de una cepa que presentan la
característica de la patología a estudiar y al realizar los posteriores cruzamientos
entre estos individuos, se obtiene una cepa consanguínea que presenta en mayor o
menor proporción el rasgo a estudiar. En la presente Tesis se ha estudiado el
modelo de artrosis espontánea desarrollada por la cepa de ratones STR/ort. Los
modelos negativos son aquellos que permiten estudiar cepas de animales que no
son capaces de desarrollar una cierta enfermedad. Y, por último, los modelos
animales huérfanos presentan enfermedades que ocurren de forma natural en
Introducción. Modelos animales
34
distintas especies animales pero que no se conoce aún la patología humana
equivalente.
Por todas las variables mencionadas y por muchas otras que se irán
enunciando a lo largo de este apartado, escoger el modelo experimental adecuado
supone un dilema importante y, en el caso de los modelos experimentales de
artrosis aún se agrava más, ya que la artrosis es una enfermedad con una
patogénesis poco descrita. Problemas prácticos como la disponibilidad de los
animales, el tiempo que tardan los individuos en desarrollar la patología o la
proporción con que ocurre en la cepa, el cómodo manejo del animal o el
mantenimiento de éstos pueden resultar factores limitantes para el estudio de un
modelo animal en concreto (van der Kraan y van den Berg, 2008; Pritzker, 1994).
Además, en el momento de escoger el modelo experimental debe tenerse
en cuenta la finalidad para la que va a ser destinado. Si el objetivo primordial es el
estudio de la patogénesis o de la progresión de la enfermedad, debe emplearse un
modelo que represente la mayor parte de los items que caracterizan la patología.
Si por el contrario, se pretende estudiar los efectos de un determinado
fármaco sobre un aspecto concreto de la enfermedad, se debe optar por aquel
modelo que esté mejor caracterizado y posea un alto grado de reproducibilidad en
la vía implicada. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que dicho modelo puede no
estar representando todos los aspectos de la enfermedad (Pritzker, 1994). Un
ejemplo de modelo validado para el estudio farmacológico de sustancias
implicadas en el dolor artrósico, es el modelo inducido por iodoacetato
intraarticular, aunque este modelo no sería válido para el estudio de la patogénesis
de la enfermedad (Ameye y Young, 2006).
Introducción. Modelos animales
35
1.2.1 Modelos animales de artrosis
La artrosis aparece en todo tipo de animales. Además de la especie
humana la padecen elefantes, perros, caballos, ratones, ballenas, tortugas y aves
entre otros. Pero, aunque todas estas especies puedan desarrollar la artrosis de
forma espontánea durante su proceso de envejecimiento, no se pueden considerar
modelos animales aptos para estudio.
Tal y como describe Pritzker (1994), existen distintos estadios en el
desarrollo de un modelo para el estudio de la artrosis. En primer lugar, la
patología debe identificarse o inducirse en un grupo de animales; en segundo
lugar, debe comprobarse la disponibilidad de ejemplares que desarrollan la
patología. Una vez asegurada la disponibilidad de animales con la enfermedad
claramente diagnosticable, se debe realizar una caracterización funcional y
estructural para determinar las similitudes y diferencias con la artrosis humana. Es
en este momento cuando el modelo queda disponible para realizar estudios de
patogénesis o terapéuticos.
Los modelos animales de artrosis pueden dividirse en dos grandes grupos,
los inducidos experimentalmente y los de animales que desarrollan
espontáneamente la enfermedad. En la figura 11 se muestran algunos ejemplos de
modelos animales de artrosis estudiados actualmente. Los modelos inducidos
experimentalmente se podrían dividir según la patogénesis de la enfermedad, en
los manipulados genéticamente (como podrían ser los ratones IL-6(-/-) o la gran
batería de ratones knock out para componentes de la matriz extracelular,
metaloproteinasas o citocinas (Singer et al., 1995); los manipulados a nivel
mecánico, donde se altera la estabilidad de la articulación, (como el modelo
inducido por la transección del ligamento cruzado anterior); y los intervenidos
estructuralmente por enzimas o sustancias bioquímicas, (como el modelo inducido
Introducción. Modelos animales
36
por inyección intra-articular de colagenasa o papaína (Pritzker, 1994; Piscaer et
al., 2008)). En los modelos inducidos biomecánica o estructuralmente, cabe la
posibilidad de provocar una artrosis monoarticular o poliarticular. La ventaja de
los modelos inducidos monoarticulares es que están perfectamente definidas las
lesiones, la severidad de éstas y la progresión de la enfermedad, quedando como
control la articulación contralateral. El inconveniente es que se trata de una
agresión realizada a una articulación sana, por tanto el desarrollo de la artrosis que
se observará será la de una artrosis secundaria monoarticular similar a las artrosis
secundarias a un traumatismo en humanos (Pritzker, 1994).
Además, los modelos inducidos experimentalmente permiten aislar el
factor edad que tanto afecta en la enfermedad de artrosis (Setton et al., 1999).
El caso de los modelos espontáneos de artrosis es completamente
diferente, ya que, el hecho de que la artrosis se produzca por una serie de
alteraciones que causan una degeneración articular progresiva, hace realmente
difícil distinguir aquellas características asociadas al envejecimiento de aquellas
asociadas a la artrosis (Lorenz y Richter, 2006). En la presente Tesis se ha
realizado el estudio de la cepa de ratones STR/ort que, como se describe en el
próximo apartado, desarrollan de forma espontánea la patología. La ventaja del
estudio de este tipo de modelos radica en el hecho de que no sólo muestran una
lesión localizada, sino que el desarrollo de la artrosis poliarticular va asociado a
una serie de factores sistémicos y a la afectación de las estructuras anexas a la
articulación, como respuesta compensatoria a la degradación articular.
Introducción. Modelos animales
37
1.2.2 Modelos estudiados
En la presente Tesis se han estudiado tres modelos animales de artrosis.
Uno espontáneo y dos inducidos: un modelo por inducción bioquímica y otro por
inducción quirúrgica.
Como modelo de desarrollo espontáneo escogimos la cepa de ratones
STR/ort. De entre los modelos inducidos existentes en la bibliografía escogimos el
modelo de artrosis por inyección intraarticular de colagenasa en ratones Balb/c y
la artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) en
rata Wistar.
1.2.2.1 Modelo de artrosis inducida por inyección intraarticular de
colagenasa en ratones Balb/c
Este modelo de artrosis inducida utiliza colagenasa bacteriana inyectada en
el espacio sinovial de la rodilla del animal. Este enzima afecta a las estructuras
articulares que contienen colágeno tipo I, como los tendones, ligamentos y
menisco, causando una distensión de las estructuras anexas a la articulación que le
confieren estabilidad. Esta prolongada inestabilidad es la que provoca en último
término una degeneración del cartílago homóloga a la que ocurre en el cartílago
artrósico (Rudolphi et al., 2003). El enzima se ha demostrado que posee efectos
mínimos sobre el cartílago articular, rico en colágeno tipo II resistente a la
digestión de este enzima (Botter et al., 2008; Pritzker, 1994). Existen autores que
defienden que la colagenasa empleada en este tipo de experimentos sí que puede
degradar in vitro el cartílago articular (Kikuchi et al., 1998), aunque mucho más
rápidamente de lo que ocurriría in vivo, ya que el organismo posee maquinaria que
le protege de la actividad de la colagenasa (van der Kraan et al., 1989).
Introducción. Modelos animales
38
Mod
elos
esp
ontá
neos
Mod
elos
tran
sgén
icos
Mod
elos
indu
cido
s
Ratón DBA/1 Desarrollo de la enfermedad a Holmdahl, R., et al.,partir de los 4 meses de edad. 1992Sólo la desarrollan los machos.
Ratón STR/ort Desarrollan la enfermedad el 85% Mason, R.M., et al., de los machos. 2001
Macaco Rhesus Desarrollo de la enfermedad a Pritzker, K.P., et al.,partir de los 5 años de edad. 1989
Gen Col2a1 Deleción espontánea. Pace, J.M., et al.,Defectos en el C-propéptido 1997
ADAM-15 Knockout. Majumdar, M.K., Pérdida de proteoglicanos et al.,2007
MMP-14 Knockout. Holmbeck, K., et al.,Desarrollo óseo anormal, 1999Hiperplasia sinovial
Inyección intraarticular Inhibición de la glicolisis Gustafson, S.B., et al.,de iodoacetato sódico en condrocitos 1992
Pérdida de proteoglicanos
Inyección intraarticular Inestabilidad articular provocada van der Kraan, P.M., de colagenasa por la degradación del colágeno I et al., 1990
Formación de osteofitos
ACLT Inestabilidad articular Brandt, K.D., et al., Aplicable a muchas especies 1991 Desarrollo de la enfermedad apartir de las 2 semanas
Mod
elos
indu
cido
squ
ímic
a o
mec
ánic
amen
te
Figura 11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación.
Mod
elos
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Mod
elos
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icos
Mod
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cido
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Ratón DBA/1 Desarrollo de la enfermedad a Holmdahl, R., et al.,partir de los 4 meses de edad. 1992Sólo la desarrollan los machos.
Ratón STR/ort Desarrollan la enfermedad el 85% Mason, R.M., et al., de los machos. 2001
Macaco Rhesus Desarrollo de la enfermedad a Pritzker, K.P., et al.,partir de los 5 años de edad. 1989
Gen Col2a1 Deleción espontánea. Pace, J.M., et al.,Defectos en el C-propéptido 1997
ADAM-15 Knockout. Majumdar, M.K., Pérdida de proteoglicanos et al.,2007
MMP-14 Knockout. Holmbeck, K., et al.,Desarrollo óseo anormal, 1999Hiperplasia sinovial
Inyección intraarticular Inhibición de la glicolisis Gustafson, S.B., et al.,de iodoacetato sódico en condrocitos 1992
Pérdida de proteoglicanos
Inyección intraarticular Inestabilidad articular provocada van der Kraan, P.M., de colagenasa por la degradación del colágeno I et al., 1990
Formación de osteofitos
ACLT Inestabilidad articular Brandt, K.D., et al., Aplicable a muchas especies 1991 Desarrollo de la enfermedad apartir de las 2 semanas
Mod
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ánic
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Figura 11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación.
Introducción. Modelos animales
39
Figura 12: Ratones STR/ort.(Imagen obtenida de www.harlan.com)Figura 12: Ratones STR/ort.(Imagen obtenida de www.harlan.com)
Este modelo de inducción por colagenasa intraarticular ha sido utilizado en
gran variedad de animales como conejos (Kikuchi et al., 1998), en combinación
con modelos espontáneos, como es el caso de los ratones C57Bl6, que poseen un
cartílago articular de grosor reducido, en ratones deficientes en IL-6 (de Hooge et
al., 2005) o en ratones sin ninguna alteración genética como son los Balb/c
(Rudolphi et al., 2003).
La afectación en este modelo se centra primordialmente en la articulación
femorotibial, siendo de destacar la formación de osteofitos como mecanismo
compensatorio a la desestabilización de la articulación (van der Kraan et
al.,1989).
1.2.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort
La cepa de ratones STR/ort (fig12) fue
aislada por el Dr. George E. Jay en 1951 como
un mutante de pelaje moteado (blanco y rojizo)
en la generación F29 procedente de unos
progenitores STR/1N (Jaeger et al., 2008).
Los ratones STR/ort se caracterizan por su
tendencia a sufrir una obesidad independiente
de la dieta y de factores hormonales, siendo su tamaño corporal mayor al resto de
cepas de ratones utilizados habitualmente para experimentación.
No se ha demostrado una correlación entre la obesidad y el desarrollo de la
enfermedad en los ratones STR/ort (Walton, 1979). Además, esta cepa tiene una
elevada susceptibilidad de padecer patologías periodontales, una elevada
prevalencia de hepatomas, niveles bajos de hemoglobina y desarrollan de forma
Introducción. Modelos animales
40
espontánea una degeneración articular similar a la encontrada en pacientes
humanos artrósicos (Jaeger et al., 2008). Las lesiones anatomopatológicas de la
articulación de la rodilla de los ratones STR/ort incluyen la pérdida de cartílago
hialino, la formación de osteofitos y la calcificación y osificación del ligamento
cruzado anterior. Estas características son similares a las encontradas en las
gonartrosis de pacientes humanos. A partir de las 20 semanas de edad, el 85% de
los ratones STR/ort desarrollan la enfermedad y lo hacen en mayor proporción e
intensidad los machos que las hembras. Las hembras y los machos STR/ort no
sólo difieren en la severidad de la enfermedad sino que presentan una expresión
articular de citocinas diferente (Mahr et al., 2003; Mason et al., 2001).
Estudios en los que se analizaba la expresión de los genes para la IL-1α y
β, IL-6, factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) y factor de crecimiento
transformante beta (TGFβ), demostraron que todos los genes estudiados estaban
presentes en los condrocitos de rodillas de ratones STR/ort. Sin embargo, estos
genes no aparecían expresados en ratones CBA de la misma edad (Jaeger et al.,
2008).
El estudio de la matriz extracelular del cartílago tibial medial de ratones
STR/ort demostró una progresiva desorganización de la red de proteoglicanos y la
pérdida de función de la matriz de colágeno, contribuyendo a la aparición de un
cartílago típicamente artrósico donde se encuentran alteradas las propiedades
bioquímicas y biofísicas de la matriz extracelular del cartílago articular (Mason et
al., 2001).
La degradación del cartílago de rodillas de ratones STR/ort aparece en
primer lugar en el menisco tibial medial y, según progresa la enfermedad se
incrementa la pérdida de cartílago, dando como resultado una pronunciada
inestabilidad de la articulación de la rodilla y una deformación progresiva. Este
Introducción. Modelos animales
41
proceso conlleva una subluxación medial de la rótula. Los autores han concluido
que la degeneración del cartílago en la región medial del cóndilo tibial de los
ratones STR/ort se desarrolla espontáneamente por una patogénesis desconocida y
esta degradación es la responsable de la subluxación secundaria de la rótula y los
consecuentes cambios patológicos del cartílago articular característicos de la
artrosis.
Los cambios en la expresión de citocinas y factores de crecimiento han
sido determinados en las fases tempranas de la enfermedad en el modelo en ratón
STR/ort. Estudios previos han identificado un incremento en la cantidad de
proteoglicanos en el cartílago tibial en ratones STR/ort de 16-19 semanas de edad
y un incremento paralelo en la expresión de ARNm de agrecanos, comparados
con los niveles encontrados en ratones CBA de la misma edad que no desarrollan
artrosis (Chambers et al., 2002). Este aumento va seguido de un incremento en la
expresión de MMPs, enzimas responsables de la degradación del cartílago, lo que
conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago.
Se han encontrado tres MMPs con actividad colagenasa en el cartílago
artrósico de ratones STR/ort: la colagenasa 1 (MMP-1), la colagenasa 2 o
colagenasa neutrofílica (MMP-8) y la colagenasa 3 (MMP-13). La MMP-13 tiene
una mayor especificidad frente al colágeno II que la MMP-1. En roedores aparece
predominantemente la MMP-13, aunque se ha propuesto que la MMP-1 podría ser
mayoritaria durante la embriogénesis (Flannelly et al., 2002).
Introducción. Modelos animales
42
1.2.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento
cruzado anterior en rata Wistar
Es conocido que la ruptura del ligamento cruzado anterior provoca una
artrosis prematura en humanos. La lesión del ligamento cruzado anterior
incrementa la movilidad anteroposterior de la articulación, provocando constantes
subluxaciones entre el fémur y la tibia e incrementa la rotación interna entre estas
estructuras. Por tanto, la ausencia del eje que representa el ligamento cruzado
anterior aumenta la fricción entre las superficies articulares y constituye un riesgo
importante de padecer artrosis
Basándose en uno de los factores de riesgo de padecer una artrosis
secundaria en la patología humana, se ha desarrollado el modelo animal basado en
la transección experimental del ligamento cruzado anterior. También se desarrolla
actualmente este modelo en combinación con una meniscectomía parcial que
agrava la inestabilidad articular (Hill et al., 2005; Appleton et al., 2007b)..
Este modelo experimental se ha desarrollado tradicionalmente en perros y
cabras (Setton et al., 1999; Matsuhashi et al., 2008), que permiten obtener gran
cantidad de cartílago para analizar y proporcionan un modelo altamente
representativo de la artrosis humana. Pero, debido a la dificultad para
experimentar con estas especies animales, se ha desarrollado esta cirugía para
conejos (Matsuhashi et al., 2008; Calvo et al., 2007; Calvo et al., 2004) y ratas
(Appleton et al., 2007a; Appleton et al., 2007b), lo que permite estudiar mayor
cantidad de animales y el desarrollo de la patología es más rápido debido a su
menor esperanza de vida (Pritzker, 1994).
Este modelo representa de forma fiable tanto los cambios histológicos y
morfológicos, incluyendo la fibrilación de la superficie articular, como la pérdida
de proteoglicanos. Permite observar también el incremento de proliferación
Introducción. Modelos animales
43
Figura 13: Estaño protoporfirina IX (SnPP)Figura 13: Estaño protoporfirina IX (SnPP)
celular del cartílago y la formación de osteofitos (Setton et al., 1999; Hayami et
al., 2006; Lorenz y Richter, 2006).
De hecho, este modelo ha sido empleado recientemente (Appleton et al.,
2007b) para realizar un estudio sobre la expresión diferencial de genes en el
cartílago artrósico, con la finalidad de poder establecer unos criterios génicos en la
patogénesis de la artrosis humana.
1.3 FÁRMACOS ENSAYADOS
Los modelos de artrosis escogidos para realizar la presente Tesis fueron,
en primer lugar, puestos a punto en nuestro laboratorio, y en segundo lugar, se
analizó la expresión de las diferentes variables implicadas en el desarrollo de la
enfermedad.
Los modelos con los que se consiguieron resultados más fácilmente
cuantificables fueron utilizados para ensayar dos fármacos y poder evaluar sus
efectos sobre el desarrollo de la artrosis.
1.3.1 Estaño-protoporfirina IX (SnPP)
La enzima hemo oxigenasa es la
principal enzima implicada en el catabolismo
del grupo hemo. Degrada el grupo hemo
dando como resultado biliverdina, hierro y
monóxido de carbono (CO). Existe una
isoforma inducible (HO-1) en respuesta a
estrés oxidativo, hipoxia, metales pesados o
Introducción. Modelos animales
44
citocinas; y una isoforma constitutiva (HO-2) (Alcaraz et al., 2003; Soares y
Bach, 2009).
SnPP (fig 13) es un potente inhibidor de la actividad de la hemo oxigenasa.
Debido a su acción inhibitoria sobre el metabolismo del grupo hemo, se ha
demostrado su utilidad en el tratamiento de las ictericias neonatales,
principalmente, en el caso de la ictericia isoinmune por incompatibilidad feto-
materna y la hiperbilirrubinemia no conjugada de Crigler-Najjar. Las
metaloporfirinas, en concreto SnPP, constituyen una alternativa terapéutica
prometedora frente a las ictericias (Drummond y Kappas, 1981).
Se ha observado que diversas metaloporfirinas, entre ellas SnPP, inhiben
las tres isoformas de la oxido nítrico sintasa (NOS) (Wolff y Lubeskie, 1996).
Estudios realizados con modelos animales de artritis reumatoide han
demostrado que la utilización de SnPP previene la aparición de la sintomatología
de la enfermedad y que posee una acción terapéutica antiinflamatoria, reduciendo
los niveles de citocinas proinflamatorias como TNF-α y IL-1β y disminuyendo la
expresión de COX-2 (Devesa et al., 2005b; Devesa et al., 2005a).
Estudios anteriores indican que SnPP puede tener propiedades
antiinflamatorias (Jozkowicz y Dulak, 2003) y destacan el interés que posee la
evaluación de los efectos de este fármaco sobre el proceso inflamatorio asociado a
la artrosis y la degradación articular.
1.3.2 BIS069
BIS069 es un polisacárido semisintético procedente de extractos vegetales
cedido para su estudio por la empresa farmacéutica Bioibérica. En estudios sobre
cultivos primarios de condrocitos humanos, BIS069 ha demostrado poseer
capacidad condroprotectora. Resultados in vitro preliminares han sugerido que
Introducción. Modelos animales
45
BIS069 ayuda a equilibrar el metabolismo del cartílago artrósico activando el
reemplazo de componentes de la matriz extracelular de la matriz del cartílago
(comunicación personal del laboratorio). Se ha sugerido que el polisacárido que se
ha testado en esta Tesis también posee efectos antiinflamatorios sobre algunos de
los mediadores implicados en el proceso artrósico.
Introducción. Modelos animales
46
2. OBJETIVOS
Objetivos
47
2. OBJETIVOS
Tradicionalmente se han empleado los modelos animales para estudiar los
efectos de fármacos susceptibles de ser empleados en el tratamiento de las
enfermedades humanas. La artrosis es una de las enfermedades de mayor
prevalencia entre la población anciana y se caracteriza por una degradación
articular progresiva acompañada de sinovitis que afecta de forma importante la
calidad de vida del paciente. Cada modelo animal representa una o varias
características de la enfermedad, por tanto para realizar un estudio completo de los
efectos de fármacos deben emplearse diferentes modelos experimentales.
SnPP es un potente inhibidor competitivo de la hemo oxigenasa-1 y ha
sido usado para el tratamiento de la hiperbilirrubinemia neonatal. En modelos
animales de artritis reumatoide ha demostrado poseer un importante efecto
antiinflamatorio y condroprotector de la articulación.
BIS069 es un fármaco cedido por la empresa Bioibérica para ser evaluado
en modelos animales de artrosis basándose en resultados previos obtenidos en
estudios in vitro.
Por todo ello, los objetivos planteados en esta Tesis son:
1.- Poner a punto tres modelos animales de artrosis: artrosis inducida por
inyección intraarticular de colagenasa en ratones Balb/c, artrosis espontánea en
ratones STR/ort y artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado
anterior en rata Wistar.
2.- Caracterizar la evolución de la enfermedad, la expresión de diversos
biomarcadores de la degradación articular y la producción de los mediadores
Objetivos
48
inflamatorios que pueden participar en la artrosis, así como realizar un
seguimiento de la degradación del cartílago articular mediante estudio histológico.
3.- Estudiar los efectos de SnPP y BIS069 en aquellos modelos experimentales
que hayan demostrado ser adecuados para realizar la evaluación farmacológica de
dichos fármacos sobre los parámetros estudiados anteriormente.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
49
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES Y REACTIVOS
3.1.1 MATERIAL Y PRODUCTOS PARA MICROCIRUGÍA
Bisturí microcirugía estéril (04-1015, Lawton); sutura de ácido poliglicólico 4/0,
19 mm; tijeras microcirugía (05-0030, Lawton); porta-agujas vascular (25-0216,
Lawton); costótomo (38-0100, Lawton); retractores del iris (60-1215, Graefe);
pinza vascular (09-0351, Graefe). Isoflurano; butorfanol; Lupa binocular (Leica);
colagenasa tipo VII, Clostridium histolyticum (C2399, Sigma); jeringa Hamilton
(701LT, Hamilton).
3.1.2 PRODUCTOS PARA HISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA
Parafina PF 56-58ºC (253211.1211, Panreac); Osteosoft (1.01728.1000, Merck);
hematoxilina Gill nº 2 (GHS216, Sigma); xileno (141769.2711, Panreac); etanol
absoluto (121086.1212, Panreac); tolueno (131745.0314, Panreac); medio de
montaje no acuoso DPX (25525.1608, Panreac); paraformaldehido (P6148,
Sigma). Agente bloqueante de la peroxidasa (S2001, Dako); medio de montaje
acuoso (Dako); cromógeno líquido diaminobenzidina + sustrato (K3467, Dako);
avidina/peroxidasa (P0364, Dako); inmunoglobulina policlonal anti-conejo
producida en cerdo (E0353, Dako); suero de cabra (G9023, Sigma).
3.1.3 PRODUCTOS PARA WESTERN BLOT
Tween20 (P9416, Sigma); reactivos de detección para western blotting por
quimioluminiscencia (RPN2106, GE Healthcare); tinción Ponceau (81462,
Fluka); fluoruro sódico (S7920, Sigma); ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
Material y métodos
50
(E5134, Sigma); ortovanadato sódico (S6508, Sigma); DL-ditiotreitol (D9779,
Sigma); ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) (E3889, Sigma); molibdato sódico
(S6646, Sigma); N,N,N’,N’-tetrametileno-diamina (TEMED) (T9281, Sigma);
acrilamida/bisacrilamida 30% (A3574, Sigma)
3.1.4 PRODUCTOS PARA RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Líquido de centelleo Optiphase Hisafe 2 (Wallac), líquido de centelleo Optiphase
Supermix (Wallac); [5,6,8,11,12,14,15(n)-3H] Prostaglandina E2 (TRK43,
Amersham); anticuerpo anti-prostaglandina E2 producido en ratón (P5164,
Sigma).
3.1.5 ELISA EMPLEADOS
MMP3 (total) (10-0,156 ng/mL)(MMP300, Quantikine, R&D Systems) ; IL-6
(8000-62 pg/mL)(88-7064-22, eBiosciences) ; IL-17 (350-10,9 pg/mL)(M1700,
Quantikine, R&D Systems) ; proteína oligomérica de la matriz del cartílago
(COMP) (0,9-0,055 U/L)(A-COMP.96, MDbiosciences) ; ácido hialurónico
(1600-50 ng/mL)(H-1200, Echelon) ; telopéptido C-terminal del colágeno tipo II
(CTX-II)(247,6-6,3 pg/mL)(serum pre-clinical Cartilaps, 3CAL4000, Nordic
biosciences); TNFα (2700-33,3 pg/mL)(DuoSet, R&D Systems); IL1β (2000-24,7
pg/mL)(DuoSet, R&D Systems). Mouse Bone Panel 2B (40000-9,8 pg/mL;
)(MBN2B-41K, Lincoplex KIT, Linco)
3.1.6 ANTICUERPOS
Anticuerpo policlonal anti-hemo oxigenasa-1 de humano producido en conejo
(SPA-896, Stressgen); anticuerpo policlonal anti-COX-2 de ratón producido en
Material y métodos
51
conejo (160116, Cayman); IgG de cabra anti-IgG de conejo marcada con
peroxidasa (P0448, Dako)
3.1.7 TAMPONES EMPLEADOS
WESTERN BLOT
Tampón electroforesis: glicina (14,4 g/l); trizma base (3 g/l); dodecilsulfato
sódico (SDS) 20% (5 ml/l); H2O (1000 ml)
Tampón transferencia: glicina (2,88 g/l g/l); trizma base (0,6 g/l); SDS 20% (0,5
ml/l); H2O (1000 ml)
Tampón fosfato salino (PBS) 0,02M (pH 7,4): fosfato mono-potásico (KH2PO4)
(1,09 g/l); fosfato sódico hidratado (Na2HPO4 x 12H2O) (21,9 g); cloruro sódico
(NaCl) (9 g); H2O (1000 ml)
RIA
Tampón A1 (pH 7,4): NaH2PO4 x 2H2O (1,19 g/l); Na2HPO4 (4,6 g/l); albúmina
de suero bovino (BSA) (5,1 g/l); azida sódica (0,1%)
Tampón B1 (pH 7,4): tampón A1 + NaCl (9 g/l)
Carbón activo-Dextrano: dextrano (0,5 g); carbón activo (1 g); tampón A1 (100
ml).
HOMOGENIZACIÓN DE TEJIDOS
Tampón de inhibidores pH 8,0: ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil]-
etanosulfónico (HEPES) (10mM); EDTA (1mM); EGTA (1mM); cloruro potásico
(KCl) (10 mM); ditiotreitol (DTT) (1 mM); fluoruro sódico (NaF) (5 mM);
ortovanadato sódico (Na3VO4) (1 mM); molibdato sódico (Na2MoO4) (10 mM);
Material y métodos
52
leupeptina (1 µg/ml), aprotinina (0,1 µg/ml); fluoruro de fenil metil sulfonilo
(PMSF) (0,5 mM).
3.2 MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS EMPLEADOS
Como ya hemos enunciado en la Introducción de la presente Tesis, se han
estudiado 3 modelos animales que representan diferentes aspectos de la
enfermedad de artrosis que padece la especie humana. A continuación se explicará
cada uno de los modelos empleados así como el diseño experimental que se ha
seguido para su estudio.
3.2.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR LA INYECCIÓN
INTRAARTICULAR DE COLAGENASA EN RATÓN BALB/C
El primer modelo animal de artrosis estudiado fue el de artrosis inducida
por inyección intraarticular de colagenasa, para el cual empleamos ratones Balb/c
(Harlan, Europa).
Se emplearon un total de 21 ratones balb/c hembras de 10 semanas de
edad, a los cuales se les realizaron 2 inyecciones intraarticulares en los días –1 y
–3 en la rodilla izquierda únicamente, dejando la rodilla derecha libre del enzima
para control del estado de la rodilla no artrósica de la misma edad.
Se inyectaron las rodillas izquierdas con 1,25U de colagenasa tipo VII
procedente de Clostridium histolyticum en 10 µl de suero fisiológico estéril, en
cada una de las dosis. Anestesiado el ratón con isoflurano inhalatorio, y una vez
rasurada la rodilla, se procede a la inyección intraarticular para la cual se empleó
una jeringa Hamilton de 10 µl (701LT) tipo “luer tip” usando una aguja biselada
de 26G. La inyección intraarticular se realiza atravesando el ligamento principal
con la aguja manteniendo la rodilla del ratón flexionada unos 15º y realizando una
Material y métodos
53
palpación continua de las estructuras de la articulación para evitar dañar el
cartílago articular con la aguja.
3.2.1.1 Diseño experimental
Para realizar un seguimiento de la progresión de la artrosis en este modelo
experimental, los ratones se sacrificaron a diferentes tiempos, como muestra la
figura 14, y se les realizó extracción de sangre a tiempo final para realizar el
control de biomarcadores de degradación de cartílago. Las rodillas (inyectadas y
no inyectadas) se seccionaron con un costótomo y se prepararon para el posterior
estudio histológico.
En este caso compararemos la progresión de la artrosis que se desarrolla en
la rodilla inyectada con colagenasa, a los tres tiempos estudiados, con las rodillas
sin inyectar, que no deben desarrollar la patología.
3.2.2 MODELO DE DESARROLLO ESPONTÁNEO DE LA ARTROSIS
EN RATÓN STR/ort.
3.2.2.1 Diseño experimental
7
7
7
Balb/c1 día
21 días
36 días
Figura 14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular.
7
7
7
Balb/c1 día
21 días
36 días
7
7
7
Balb/c1 día
21 días
36 días
Figura 14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular.
Material y métodos
54
Para el estudio del proceso artrósico en el modelo de desarrollo espontáneo
de la enfermedad se utilizaron 40 ratones macho STR/ort de 7 semanas de edad
que fueron repartidos en 4 grupos de 10 animales, que se sacrificaron a diferentes
tiempos (7, 9, 11 y 15 semanas de edad) según recoge la figura 15, con la
finalidad de estudiar los posibles cambios bioquímicos y anatomopatológicos que
ocurren durante la progresión de la artrosis. Como animales control de la misma
edad y sexo pero sin la capacidad de desarrollar la artrosis, se utilizaron 20 ratones
macho CBA de 7 semanas de edad.
A todos los animales se les realizó una extracción de sangre cada 15 días
por punción en el plexo submandibular con la finalidad de estudiar en suero
posibles biomarcadores de la enfermedad y mediadores inflamatorios
5 10
5 10
5 10
5 10
CBA STR/ort7 semanas
9 semanas
11 semanas
15 semanas
Figura 15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
5 10
5 10
5 10
5 10
CBA STR/ort7 semanas
9 semanas
11 semanas
15 semanas
5 10
5 10
5 10
5 10
CBA STR/ort7 semanas
9 semanas
11 semanas
15 semanas
Figura 15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
edad(semanas)
7 9 11 13 15
PesarExtracción sangreSacrificio (7 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (11 semanas)
PesarPesarExtracción sangreSacrificio (15 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (9 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangre
Figura 16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
edad(semanas)
7 9 11 13 15
PesarExtracción sangreSacrificio (7 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (11 semanas)
PesarPesarExtracción sangreSacrificio (15 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (9 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangre
edad(semanas)
7 9 11 13 15
PesarExtracción sangreSacrificio (7 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (11 semanas)
PesarPesarExtracción sangreSacrificio (15 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangreSacrificio (9 semanas)
Pesar
PesarExtracción sangre
Figura 16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
Material y métodos
55
característicos de la patología degenerativa. Todos los animales fueron pesados
semanalmente. El esquema del plan de trabajo seguido se resume en la figura 16.
3.2.2.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP)
y BIS069 en el modelo de artrosis espontánea en ratón STR/ort
Para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre el
desarrollo de la artrosis en el modelo animal de desarrollo espontáneo de la
enfermedad se utilizaron 74 ratones macho STR/ort (Harlan, Europa) de 7
semanas de edad. Los animales se distribuyeron según indica la figura 17. El
primer grupo de 10 ratones STR/ort se sacrificó a tiempo 0 (7 semanas de edad)
para obtener los datos de los animales antes de comenzar el experimento. A los
grupos de ratones STR/ort, de 17 ratones cada uno, que recibieron los tratamientos
se les administró diariamente durante 4 semanas los fármacos en estudio.
Figura 17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 administrados durante 4 semanas sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
10
17
17
10
10
10
Sacrificados a tiempo 0
Administración intraperitoneal SnPP(12 mg/Kg/día)
Administración oral BIS069 ( 80 mg/Kg/día)
Administración intraperitoneal 1%DMSO+suero fisiológico
Administración oralagua
Animales sin tratar
Nº animales
Figura 17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 administrados durante 4 semanas sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
10
17
17
10
10
10
Sacrificados a tiempo 0
Administración intraperitoneal SnPP(12 mg/Kg/día)
Administración oral BIS069 ( 80 mg/Kg/día)
Administración intraperitoneal 1%DMSO+suero fisiológico
Administración oralagua
Animales sin tratar
Nº animales
10
17
17
10
10
10
Sacrificados a tiempo 0
Administración intraperitoneal SnPP(12 mg/Kg/día)
Administración oral BIS069 ( 80 mg/Kg/día)
Administración intraperitoneal 1%DMSO+suero fisiológico
Administración oralagua
Animales sin tratar
Nº animales
Material y métodos
56
La administración de SnPP se realizó por vía intraperitoneal a la dosis de
12 mg/Kg/día, inyectando 0,2 ml por administración diaria. La protoporfirina se
preparó diariamente en 1% de dimetil sulfóxido (DMSO) en suero fisiológico
estéril. Para conseguir una suspensión fina y homogénea es necesario sonicar el
preparado durante una hora.
El fármaco BIS069 se administró por vía oral a la dosis de 80 mg/Kg/día
en un volumen de 0,2 ml de agua corriente en cada administración. La dosis se
preparó diariamente en la misma agua con la que se les mantiene estabulados.
Los grupos “vehículo”, de 10 ratones STR/ort cada uno, recibieron durante
4 semanas los vehículos en los que se encontraban disueltos los fármacos. En un
caso se administró intraperitonealmente 1% de DMSO en suero fisiológico estéril
y en el otro 0,2 ml por vía oral de agua corriente, para someterlos a la misma
manipulación y estrés que a los animales del grupo tratado.
Por último, existe otro grupo de 10 animales, los ratones “control” a los
cuales no se les administra ninguna sustancia y se utilizarán como control del
desarrollo espontáneo de la enfermedad.
Los animales fueron pesados semanalmente como control del estado de
bienestar y se les realizó extracción de sangre por punción en el plexo
submandibular cada 15 días siguiendo el plan de trabajo descrito en la figura 18.
Material y métodos
57
BIS069 (80 mg/Kg/día) oral
edad(semanas)
7 8 9 10 11
PesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangreSacrificio
Figura 18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
SnPP (12 mg/Kg/día) i.p.
BIS069 (80 mg/Kg/día) oral
edad(semanas)
7 8 9 10 11
PesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangreSacrificio
edad(semanas)
7 8 9 10 11
PesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangre
PesarPesarExtracción sangreSacrificio
Figura 18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.
SnPP (12 mg/Kg/día) i.p.
Material y métodos
58
3.2.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN
DEL LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR EN RATA WISTAR
Para la preparación de la cirugía, los
animales fueron anestesiados en un ambiente estéril
con isoflurano inhalatorio a la dosis de 1,5 C.A.M.
(Concentración Alveolar Mínima) y el grado de
anestesia se evaluó controlando la respuesta refleja
(fig 19). Se les administró Butorfanol subcutáneo a
la dosis de 2 mg/Kg como analgésico, antes de
comenzar la cirugía. Una vez anestesiadas las ratas
se les rasuró la rodilla a operar y con povidona
yodada se desinfectó el campo quirúrgico. Para
facilitar la cirugía se utilizó una lupa binocular
previamente limpiada con etanol.
La incisión de
la piel, de unos 10mm,
se realiza con bisturí
por la cara interna de la
articulación y en
paralelo al ligamento
principal (fig 20A). A
continuación, se realiza
una disección roma de
la piel y se accede a la
Figura 19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE) de la Universitat de València utilizado para realizar la cirugía.
Figura 19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE) de la Universitat de València utilizado para realizar la cirugía.
A
B
Figura 20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: se realiza una incisión en la piel; B: a la cápsula articular se accede por una incisión de unos 3 mm lateral al ligamento principal.
A
B
AA
BB
Figura 20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: se realiza una incisión en la piel; B: a la cápsula articular se accede por una incisión de unos 3 mm lateral al ligamento principal.
Material y métodos
59
cápsula articular por una incisión de 4 mm junto al ligamento principal sin dañar
ninguna de sus fibras (fig 20B). El tejido sinovial se pinza junto con la rótula con
el fin de dejar al descubierto la cavidad articular (fig 21A).
A B
C
Figura 21: Fotografías tomadas a través de la lupa binocular que muestran losprocedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: con ayuda de los separadores se abre lacápsula articular; B: con un separador de microcirugía se aísla el ligamento cruzadoanterior para seccionarse con una aguja hipodérmica; C: se comprueba que el ligamentocruzado anterior ha quedado seccionado.
Material y métodos
60
Con un separador de microcirugía
se procede a aislar el ligamento cruzado
anterior para ser seccionado completamente
con el bisel de una aguja hipodérmica de
25G 5/8’ (fig 21B)’. Tras comprobar que la
transección del ligamento ha sido completa
(fig 21C), se procede a suturar la cápsula
articular con 3 puntos de cirujano con
suturas de ácido poliglicólico de 4/0 y,
posteriormente, se sutura la piel con suturas
de 3/0 (fig 22). La cicatriz se limpia con
povidona yodada y se retira la anestesia
inhalatoria. A las ratas se les mantiene
sobre una manta calefactora hasta que
recobran completamente la movilidad. Se limpiaron las heridas con povidona
yodada durante los tres días posteriores a la operación.
3.2.3.1 Diseño experimental
Para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo que nos ocupa
en este apartado, se utilizaron 25 ratas Wistar macho (Harlan, Europa) de 150 g
que fueron repartidas en 3 grupos antes de ser operadas (fig 23).
La transección del ligamento cruzado anterior se realizó únicamente de la
rodilla derecha de los animales. A 4 animales de cada grupo de estudio se les
realizaron en las rodillas izquierdas operaciones simuladas donde se anestesiaba a
los animales, se les administraba la analgesia, se realizaba la incisión de la piel, la
de la cápsula articular y una vez se dejaba al descubierto el ligamento cruzado
Figura 22: Fotografía de losprocedimientos quirúrgicos de laACLT. Se sutura por capas con suturasde ácido poliglicólico.
Material y métodos
61
anterior para ser seccionado, se suturaba por capas y se mantenía al animal sobre
la manta calefactora hasta que estuviera completamente despierto.
Las ratas se estabularon de dos en dos para asegurar la libre movilidad de
los animales, con comida y bebida ad libitum hasta el momento de su sacrificio.
Para el estudio de la progresión de la enfermedad, un grupo de 5 animales
fue sacrificado a las 24 horas tras la cirugía, considerándolo como tiempo 0. Otro
grupo de 10 animales fue sacrificado a las 6 semanas de la operación y al resto de
ratas se les mantuvo estabuladas hasta la décima semana postcirugía.
Antes de ser sacrificadas, las ratas se anestesiaron con isoflurano, y se les
realizó una extracción de sangre por punción cardiaca. Posteriormente, aún
anestesiadas con isoflurano se sacrificaron por dislocación cervical. Todos los
animales fueron pesados semanalmente.
5
10
10
Ratas operadas ACLT. t 0 (24h)
Ratas operadas ACLT. t 6 semanas
Ratas operadas ACLT. t 10 semanas
Nº animales
Figura 23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT).
5
10
10
Ratas operadas ACLT. t 0 (24h)
Ratas operadas ACLT. t 6 semanas
Ratas operadas ACLT. t 10 semanas
Nº animales
5
10
10
Ratas operadas ACLT. t 0 (24h)
Ratas operadas ACLT. t 6 semanas
Ratas operadas ACLT. t 10 semanas
Nº animales
Figura 23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT).
Material y métodos
62
3.2.3.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP)
y BIS069 en el modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento
cruzado anterior en rata Wistar
A 30 ratas Wistar se les realizó la cirugía de la transección del ligamento
cruzado anterior con el fin de provocar el desarrollo de la artrosis en la rodilla
operada. Tras una semana de recuperación postcirugía, en la cual se les realizaron
las curas necesarias para una correcta cicatrización, comenzó el tratamiento.
Como describe la figura 24, un grupo de 10 ratas operadas recibió SnPP,
otro grupo de 10 ratas recibió el tratamiento con BIS069 y 10 ratas Wistar
operadas se reservaron como grupo control.
Todos los animales se estabularon de dos en dos para facilitar su libre
movilidad durante las 10 semanas que duró el experimento, con comida y bebida
ad libitum.
La administración diaria de la protoporfirina se realizó durante 10 semanas
a la dosis de 12 mg/Kg/día intraperitonealmente. SnPP se preparó diariamente
siguiendo el mismo protocolo que se siguió en el experimento de los ratones
10
10
10
Ratas control (ACLT)
Ratas ACLT. Administración intraperitoneal SnPP (12 mg/Kg/día) durante 10 semanas
Ratas ACLT. Administración oral BIS069 (90 mg/Kg/día) durante 10 semanas
Nº animales
Figura 24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de ACLTen rata Wistar.
10
10
10
Ratas control (ACLT)
Ratas ACLT. Administración intraperitoneal SnPP (12 mg/Kg/día) durante 10 semanas
Ratas ACLT. Administración oral BIS069 (90 mg/Kg/día) durante 10 semanas
Nº animales
Figura 24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de ACLTen rata Wistar.
Material y métodos
63
STR/ort.
Al otro grupo de tratamiento de 10 ratas Wistar operadas se les administró
BIS069 diariamente vía oral a la dosis de 90 mg/Kg/día. La solución se preparó
diariamente siguiendo el mismo protocolo que en el experimento con los ratones
STR/ort.
Los animales fueron pesados semanalmente.
Al finalizar el experimento, tras ser anestesiadas con isoflurano inhalatorio
se les realizó una extracción de sangre por punción intracardiaca. A continuación,
fueron sacrificadas por dislocación cervical. A todos los animales se les
amputaron las rodillas (tanto operadas como no operadas), que se destinaron al
estudio histológico y al estudio de biomarcadores de degradación de cartílago y
mediadores inflamatorios.
3.3 PROCESADO DE MUESTRAS
3.3.1. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón
Balb/c. Estudio de la evolución de la artrosis
En el estudio de la progresión de la artrosis por inyección intraarticular en
ratones balb/c, los animales se desangran por punción cardiaca bajo anestesia
inhalatoria con isoflurano, justo antes de ser sacrificados por dislocación cervical.
A todos los animales del estudio se les seccionan las rodillas con un costótomo,
tanto las inyectadas como las no inyectadas, y se fijan inmediatamente en
paraformaldehido al 4% en PBS. Posteriormente, se inicia el proceso de inclusión
de las muestras en parafina para realizar el estudio histológico.
Material y métodos
64
3.3.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort
3.3.2.1 Estudio de la evolución de la artrosis
En el momento del sacrificio los ratones se desangran por punción
cardiaca y posteriormente se les somete a una dislocación cervical. Las patas se
diseccionan inmediatamente con un costótomo, se limpian en suero fisiológico a
4ºC, y, tras ser radiografiadas, las patas derechas se congelan a –80ºC para
posteriormente homogeneizarlas y medir mediante western blot, ELISA y
radioinmunoensayo diferentes marcadores de la enfermedad; las patas izquierdas
se fijan en paraformaldehido al 4% en PBS para su posterior estudio histológico e
inmunohistoquímico. En la figura 25 se esquematiza el proceso que siguen las
muestras obtenidas a partir de los ratones STR/ort.
- Patas Radiografías
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo
-Pata izquierda
-Pata derecha
Histología
Homogenado
InmunohistoquímicaTinciones químicas
ELISARadioinmunoensayoWestern blot
Figura 25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.
- Patas Radiografías
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo
-Pata izquierda
-Pata derecha
Histología
Homogenado
InmunohistoquímicaTinciones químicas
ELISARadioinmunoensayoWestern blot
- Patas Radiografías- Patas Radiografías
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
RadioinmunoensayoELISARadioinmunoensayo
-Pata izquierda
-Pata derecha
-Pata izquierda
-Pata derecha
Histología
Homogenado
Histología
Homogenado
Histología
Homogenado
InmunohistoquímicaTinciones químicasInmunohistoquímicaTinciones químicas
ELISARadioinmunoensayoWestern blot
ELISARadioinmunoensayoWestern blot
Figura 25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.
Material y métodos
65
3.3.2.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069
Los ratones STR/ort, tras 4 semanas de tratamiento con SnPP (12
mg/Kg/día) y con BIS069 (80 mg/Kg/día), se sacrifican por dislocación cervical
tras una extracción de sangre por punción cardiaca. La distribución de las
muestras para su posterior estudio es el que indica la figura 25 también. Las
rodillas de los ratones se diseccionan inmediatamente con un costótomo. Se
elimina la piel y se limpian las muestras en suero fisiológico a 4ºC.
Las rodillas derechas se van a homogeneizar y, por tanto, se congelan a –
80ºC para su posterior procesamiento y, las rodillas izquierdas se introducen en
paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC, comenzando así el proceso de inclusión en
parafina para el estudio histológico.
Las rodillas izquierdas, una vez fijadas se radiografían para obtener un
control del progreso de la enfermedad.
3.3.3 Modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en
rata Wistar
3.3.3.1 Estudio de la evolución de la artrosis
A las ratas anestesiadas con isoflurano se les realizó una extracción de
sangre por punción intracardiaca y, posteriormente, se les sacrificó por
dislocación cervical. Inmediatamente tras su sacrificio, se diseccionaron las patas
con un costótomo para su posterior procesado. Las patas de la mitad de los
animales de cada grupo (operadas y no operadas) se destinan a estudio histológico
e inmunohistoquímico, por tanto se fijan directamente en paraformaldehido al 4%
en PBS para su posterior inclusión en parafina. Las patas de la otra mitad de los
animales de cada grupo se destinan a la determinación de mediadores en el
Material y métodos
66
homogenado, por tanto, se congelan inmediatamente a –80ºC. Los 4 animales a
los cuales se les realizó la operación simulada en la rodilla izquierda fueron
distribuidos al azar entre el grupo de animales destinados a histología y los
destinados a estudios de expresión proteica y determinación de mediadores, según
indica el esquema de la figura 26.
3.3.3.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069
Para realizar el estudio de los posibles efectos de las moléculas a estudio
sobre el modelo de artrosis por ACLT en rata Wistar, las muestras obtenidas de
dichos animales se distribuyen como indica la figura 26 .
Inmediatamente tras su sacrificio, se diseccionan las patas (operadas y no
operadas) con un costótomo para su posterior procesado. Las patas de la mitad de
los animales de cada grupo (operadas y no operadas) se destinan a estudio
histológico e inmunohistoquímico, por tanto se fijan directamente en
paraformaldehido al 4% en PBS para su posterior inclusión en parafina. Las patas
de la otra mitad de los animales de cada grupo se van a homogeneizar, por tanto,
se congelan inmediatamente a –80ºC.
Material y métodos
67
3.4 TÉCNICAS EMPLEADAS
3.4.1 Estudio radiológico
Las rodillas de todos los ratones, una vez eliminada la piel se fijan en
paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC, como ya se ha mencionado. Las rodillas de
todos los animales se radiografían en posición lateral sobre una placa radiológica
a una distancia de 90 cm de la fuente de rayos X. El análisis radiográfico de las
patas artrósicas se realizó con un aparato de rayos X (Univet LX160, Multimage,
Italy) con KW de exposición durante 0,01s.
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo
- Patas
- Pata izquierda
-Pata derecha OPERADA
SIN OPERAR
OPERACIÓN SIMULADA
Histología
Homogenado
Figura 26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas a ACLT tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo
- Patas
- Pata izquierda
-Pata derecha OPERADA
SIN OPERAR
OPERACIÓN SIMULADA
Histología
Homogenado
-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
Radioinmunoensayo-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA
RadioinmunoensayoELISARadioinmunoensayo
- Patas
- Pata izquierda
-Pata derecha OPERADA
SIN OPERAR
OPERACIÓN SIMULADA
- Patas
- Pata izquierda
-Pata derecha OPERADAOPERADA
SIN OPERAR
OPERACIÓN SIMULADA
SIN OPERAR
OPERACIÓN SIMULADA
Histología
Homogenado
Histología
HomogenadoHomogenado
Figura 26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas a ACLT tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.
Material y métodos
68
3.4.2 Estudio histológico
El estudio histológico de la progresión de la enfermedad en cada uno de
los modelos animales se llevó a cabo siguiendo el sistema de evaluación de la
histopatología del cartílago artrósico descrita por la OARSI (Osteoarthritis
Research Society International) (Pritzker et al., 2006). Este sistema de evaluación
histopatológica de la artrosis se ha basado en el sistema de puntuación histológica
desarrollado por Mankin en 1971 (Mankin et al., 1971). El Sistema Mankin ha
sido revisado y modificado por muchos autores, ya que se ha cuestionado la
reproducibilidad y validez de este método (Ostergaard et al., 1997; Ostergaard et
al., 1999). Por ello, en el año 1998 un grupo de expertos de la OARSI estableció
un nuevo sistema de evaluación histopatológica basándose en los conocimientos
sobre la enfermedad que existían hasta el momento. Por razones prácticas, se
decidió concentrar el sistema de puntuación en un único tejido diana, el cartílago
articular.
En el sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico de
la OARSI se evalúan 3 parámetros (Pritzker et al., 2006):
El grado se define como la progresión de la enfermedad en la profundidad
del cartílago. Es un índice de la severidad de la progresión del proceso artrósico.
Este parámetro asume que la afectación de las capas más profundas del cartílago
implica un estadio más avanzado de la enfermedad y es un buen indicador del
desarrollo de la artrosis. Los grados se clasifican del 0-6 donde 0 indica un
cartílago ausente de características artrósicas. Los grados 1-4 implican una
afectación únicamente del cartílago articular, mientras que los grados 5 y 6 poseen
el hueso subcondral también afectado. Los grados se pueden subdividir en
subgrados según las características y los gráficos que se muestran en las figuras
27 y 28.
Material y métodos
69
Figura 27: Grados del sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico de la OARSI.
El estadio representa la proporción de la superficie articular afectada por
la artrosis comparada con la superficie total del cartílago articular. La progresión
de la artrosis se inicia por una lesión focal provocada en la zona de la superficie
del cartílago articular que sufre la mayor parte de las fuerzas mecánicas. Pero con
el avance de la enfermedad, las lesiones artrósicas van ocupando toda la superficie
articular hasta que todo el cartílago articular se ve afectado. Los estadios se
clasifican del 0-4, donde el estadio 0 representa un cartílago sin ninguna zona
dañada y el 4 supone más de un 50% de la superficie articular dañada (fig. 29).
DeformaciónRemodelación ósea
6.0 Osteofitos marginales6.5 Osteofitos marginales y centrales
GRADO 6
UlceraciónAparición de cartílago calcificado
5.0 Superficie ósea intacta5.5 Presencia de tejido reparador
GRADO 5
Pérdida de matriz del cartílagoPérdida de porciones de ME profunda
4.0 Exfoliación superficial4.5 Excavación de las capas medias
GRADO 4
Fisuras verticalesNuevas formaciones de colágeno
3.0 Fisuras simples3.5 Fisuras ramificadas
GRADO 3
Superficie discontinua Desorientación de las columnas de las lagunas condrocitarias
2.0 Fibrilación superficial2.5 Abrasión superficial con pérdida de matriz
extracelular
GRADO 2
Superficie intactaProliferación celular (clusters)
1.0 Células intactas1.5 Muerte celular
GRADO 1
Superficie intactaCartílago intacto
No hay subgradosGRADO 0
CRITERIOSUBGRADO
DeformaciónRemodelación ósea
6.0 Osteofitos marginales6.5 Osteofitos marginales y centrales
GRADO 6
UlceraciónAparición de cartílago calcificado
5.0 Superficie ósea intacta5.5 Presencia de tejido reparador
GRADO 5
Pérdida de matriz del cartílagoPérdida de porciones de ME profunda
4.0 Exfoliación superficial4.5 Excavación de las capas medias
GRADO 4
Fisuras verticalesNuevas formaciones de colágeno
3.0 Fisuras simples3.5 Fisuras ramificadas
GRADO 3
Superficie discontinua Desorientación de las columnas de las lagunas condrocitarias
2.0 Fibrilación superficial2.5 Abrasión superficial con pérdida de matriz
extracelular
GRADO 2
Superficie intactaProliferación celular (clusters)
1.0 Células intactas1.5 Muerte celular
GRADO 1
Superficie intactaCartílago intacto
No hay subgradosGRADO 0
CRITERIOSUBGRADO
Material y métodos
70
Grado 1.0 Grado 1.5 Grado 2.0 Grado 2.5
Grado 3.5Grado 3.0 Grado 4.0 Grado 4.5
Grado 5.5Grado 5.0 Grado 6.0 Grado 6.5
Grado 0
Figura 28: Esquema de los grados de degradación del cartílago según el sistema de evaluación histopatológica del cartílago artrósico descrito por la OARSI. Esquema modificado de Pritzker et al., 2006.
Material y métodos
71
Figura 29: Descripción de los estadios del sistema de
evaluación de la histopatología del cartílago
artrósico de la OARSI.
La puntuación del estado de la
articulación tras este estudio de la
histología de articulación se obtiene de la
fórmula: puntuación = grado x estadio.
Este sistema de puntuación establece un
rango de afectación entre 0-24, donde 0 corresponde a una articulación libre de
características de artrosis y 24 el estado más avanzado de la enfermedad (más del
50% de la superficie articular se encuentra afectada en un grado 6).
Por tanto, todos los estudios histológicos llevados a cabo en la presente
Tesis se calificarán como GnEn (grado n, estadio n) y Pn (puntuación n) siguiendo
los criterios establecidos por la OARSI y mencionados anteriormente.
3.4.2.1 Inclusión de las articulaciones en parafina
Las patas de los animales se diseccionan, como ya se ha comentado
anteriormente, con un costótomo y las articulaciones de los animales se aíslan en
primer lugar eliminando la piel y cortando la tibia y el fémur a unos 5mm de la
articulación. En el caso de la articulación de rata se disecan los restos de tejido
muscular de forma que el hueso quede lo más aislado posible. Se fija la
articulación en paraformaldehido al 4% en PBS a 4ºC durante una semana. La
descalcificación del hueso se realiza con una incubación en Osteosoft en agitación
a temperatura ambiente durante 8 días en el caso de los ratones y de 12 días en el
caso de las ratas. Los restos del descalcificante se eliminan con una serie de
lavados con PBS en agitación a temperatura ambiente. El tejido se deshidrata con
> 50 %ESTADIO 4
25 – 50 %ESTADIO 3
10 – 25 %ESTADIO 2
< 10 %ESTADIO 1
No se observa actividad artrósica
ESTADIO 0
% DE AFECTACIÓN
> 50 %ESTADIO 4
25 – 50 %ESTADIO 3
10 – 25 %ESTADIO 2
< 10 %ESTADIO 1
No se observa actividad artrósica
ESTADIO 0
% DE AFECTACIÓN
Material y métodos
72
alcoholes de concentración creciente (30%, 50%, 70%, 95%, 100%) en agitación
y en hielo para evitar el endurecimiento de la muestra. Una vez deshidratada
completamente la muestra, se procede a los baños de tolueno en agitación a
temperatura ambiente. Se realizan cambios de tolueno hasta que el tejido queda
completamente transparente y en ese momento se transfiere la articulación a un
primer baño de parafina durante una noche para que se evaporen los restos de
tolueno que puedan quedar en la muestra y entonces, se cambia la muestra a un
segundo baño de parafina nueva, libre de tolueno. En esta parafina se pueden
almacenar en forma sólida las muestras hasta su fundición y encastrado en
bloques para ser cortados en el microtomo. El estudio histológico se realizó
utilizando el microscopio Nikon Eclipse E600FN (Nikon Instruments).
3.4.2.2 Tinciones químicas
Las tinciones químicas de los cortes parafinados de rodillas permiten
observar la estructura microscópica de las mismas, así como evaluar el grado de
afectación de la superficie articular a lo largo de la progresión de la enfermedad.
3.4.2.2.1 Eosina/hematoxilina
Los cortes de 5 µm se desparafinan con xileno y posteriormente las
muestras se rehidratan con una batería de etanoles decreciente (100%, 95%, 70%,
50%, 30%, agua destilada). El tejido articular se tiñe con hematoxilina durante 1
minuto y tras lavar abundantemente los restos de hematoxilina con agua corriente
se tiñen los citoplasmas con eosina al 1% durante 10 segundos. Los cortes se
lavan cuidadosamente hasta eliminar todos los restos de tinción y se deshidratan
de nuevo con diferentes baños en etanol de graduación creciente. Tras el baño con
Material y métodos
73
etanol absoluto, los cortes se lavan con xileno y se montan con el medio de
montaje no acuoso DPX.
3.4.2.2.2 O-safranina
Los cortes se desparafinan y rehidratan con xileno y posteriormente las
muestras se rehidratan con una batería de etanoles decreciente (100%, 95%, 70%,
50%, 30%, agua destilada). Las muestras se tiñen con O-safranina al 0,1% durante
10 min. Posteriormente, los cortes se lavan con abundante agua ultrapura hasta
eliminar completamente los restos de tinción y seguidamente se procede a
deshidratar los cortes para poder realizar el montaje de las preparaciones con el
medio de montaje no acuoso DPX.
La O-safranina permite observar la concentración de proteoglicanos de la
matriz del cartílago siendo la intensidad de coloración proporcional a la cantidad
de proteoglicanos presentes en el cartílago articular.
3.4.2.3 Inmunohistoquímica
Los cortes, en primer lugar, se desparafinan con 2 baños de xileno de 5
minutos. Una vez desparafinados, se procede a la rehidratación del tejido con una
batería de baños de etanol de concentración decreciente de 5 minutos cada uno,
desde el alcohol absoluto al agua destilada. Posteriormente, los cortes se lavan tres
veces con PBS (5 minutos cada vez). Se procede a inactivar la peroxidasa
endógena con una incubación de 10 minutos con 1 gota del agente comercial para
bloquear la peroxidasa. Se lavan los restos de agua oxigenada con 3 lavados de 5
minutos con PBS para posteriormente bloquear el tejido con suero de cabra
diluido 1:10 en PBS durante 15 min. El bloqueo se elimina con PBS-Tween 20.
Material y métodos
74
Los anticuerpos primarios utilizados se diluyen en PBS-Tween 20 a la
dilución recomendada por el fabricante y se incuban durante 2 horas a temperatura
ambiente. Tras la incubación con el anticuerpo primario los cortes se lavan con
PBS-Tween20 abundantemente. Los anticuerpos secundarios utilizados están
biotinilados y son específicos en cada caso para los anticuerpos primarios. Se
utilizan diluidos a 1:250 en PBS-Tween 20, y tras una incubación de 30 min a
temperatura ambiente, se lavan de nuevo los cortes con PBS-Tween 20. Con la
finalidad de potenciar la señal se incuban los cortes con avidina/peroxidasa
diluida 1:1000 en PBS-Tween 20 durante 30 min. Nuevamente se lavan los restos
de avidina y se incuban las preparaciones con el sustrato DAB en oscuridad
durante 10-20 minutos. Una vez los cortes han desarrollado color se lavan con
agua destilada abundantemente hasta eliminar completamente el sustrato y se
contrastan los núcleos con hematoxilina diluida 1:10 en agua destilada durante
10s. Se lavan finalmente los cortes con agua corriente y se montan las
preparaciones con un medio de montaje acuoso.
3.4.3 Estudio de mediadores
Para realizar el estudio de mediadores, tanto inflamatorios como de
degradación articular, cada tipo de muestra biológica debe ser procesada de forma
que se obtengan los concentrados de proteínas y componentes celulares donde
posteriormente se podrán realizar mediciones de diferentes marcadores de la
progresión de la artrosis.
Material y métodos
75
3.4.3.1 Homogeneización de rodillas de animales de experimentación
3.4.3.1.1 Rodillas de ratones STR/ort y ratones balb/c
El protocolo de homogeneización de patas de ratón se resume en la figura
30. Tras el sacrificio del animal, las patas son congeladas a –80ºC hasta su
utilización. Una vez descongeladas, se trabaja sobre hielo para evitar la
degradación de los tejidos. A las patas se les elimina cuidadosamente la piel y las
uñas antes de ser cortadas con tijeras en fragmentos de menor tamaño y
transferidas a tubos cónicos de vidrio pyrex. A los fragmentos obtenidos se les
añade 1 ml de tampón de inhibidores a 4ºC para bloquear la actividad de las
proteasas presentes en el tejido y se homogeniza con un polytron en 3 ciclos de 10
segundos a 4ºC. El homogenado se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos a
4ºC. El sobrenadante resultante se alícuota en tubos Eppendorf que serán
congelados a –80ºC.
Material y métodos
76
Tejidodisgregado
1 ml Tampón deinhibidores Homogeneizar
3 x 10 seg.Centrifugar 2500 rpm 10 min
PROTEINA TOTAL
Sonicar 3 x 10 segCentrifugar 9000g 15 min
FRACCIÓN S9
Utracentrifugar100000 g90 min
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
* Todo el proceso se realiza a 4ºC
Figura 30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort y Balb/c. En el gráfico se describen los procedimientos seguidos para conseguir las diferentes fracciones proteicas a partir del tejido de animales para realizar posteriormente el estudio de biomarcadores de degradación del cartílago y de los mediadores inflamatorios implicados en el proceso artrósico.
Tejidodisgregado
1 ml Tampón deinhibidores
Tejidodisgregado
1 ml Tampón deinhibidores Homogeneizar
3 x 10 seg.Centrifugar 2500 rpm 10 min
PROTEINA TOTAL
Sonicar 3 x 10 segCentrifugar 9000g 15 min
FRACCIÓN S9
Utracentrifugar100000 g90 min
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
Homogeneizar3 x 10 seg.Homogeneizar3 x 10 seg.
Centrifugar 2500 rpm 10 min
PROTEINA TOTAL
Sonicar 3 x 10 segCentrifugar 9000g 15 min
Sonicar 3 x 10 segCentrifugar 9000g 15 min
FRACCIÓN S9
Utracentrifugar100000 g90 min
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
FRACCIÓN S9
Utracentrifugar100000 g90 min
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
FRACCIÓN S9
FRACCIÓN S9
Utracentrifugar100000 g90 min
Utracentrifugar100000 g90 min
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNCITOSÓLICA
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
FRACCIÓNMICROSOMAL
Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores
* Todo el proceso se realiza a 4ºC
Figura 30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort y Balb/c. En el gráfico se describen los procedimientos seguidos para conseguir las diferentes fracciones proteicas a partir del tejido de animales para realizar posteriormente el estudio de biomarcadores de degradación del cartílago y de los mediadores inflamatorios implicados en el proceso artrósico.
Material y métodos
77
La fracción S9 de la proteína total del tejido se obtiene de sonicar las
alícuotas de sobrenadante durante 3 ciclos de 10 segundos en hielo, y
posteriormente se centrifuga a 9000 g durante 15 min a 4ºC.
3.4.3.1.2 Rodillas de rata Wistar
En el caso de las ratas Wistar sometidas a la cirugía de transección del
ligamento cruzado anterior no se podía utilizar el procedimiento seguido en el
caso de las rodillas de ratones para homogeneizar la articulación, debido a la gran
cantidad de tejido óseo del que se partía.
De igual forma que se realizó en el caso de los ratones, tras el sacrificio de
las ratas, las articulaciones se obtuvieron cortando el fémur y la tibia a unos 5 mm
de la articulación y, como se ha mencionado anteriormente, se diseccionaron los
músculos circundantes a la articulación. Las muestras de tejido se congelaron a
–80ºC inmediatamente.
Para la homogeneización de las articulaciones se utilizó un aparato de
pulverización a temperaturas criogénicas (Freezer/Mill G750). Las muestras se
disponen dentro de unos cilindros de plástico transparente equipados con unos
émbolos de acero inoxidable que golpearán contra los extremos del cilindro
también de acero inoxidable. Estos tubos con las muestras se introducen en el
aparato, quedando inmersas en nitrógeno líquido donde serán pulverizadas por
efecto del martilleo del émbolo.
El polvo resultante se extrae cuidadosamente de los cilindros y se
transfiere a un tubo cónico pyrex, donde se le añade 2 ml de tampón de
inhibidores y se agita vigorosamente en un vórtex para asegurar una mezcla
completa del tejido y el tampón. El homogenado obtenido se sonica a 4ºC en 3
ciclos de 10 seg. Nuevamente, se agita en un vórtex y se incuba 10 min a 4ºC. Los
Material y métodos
78
tubos se centrifugan a 2500 rpm durante 10 min a 4ºC y se recoge el
sobrenadante.
Como en el caso de las articulaciones de ratón, de la proteína total
obtenida de la homogeneización se extrae la fracción S9 por sonicación y
centrifugación a 9000g y de ésta las fracciones citosólica y microsomal por
ultracentrifugación. La proteína obtenida en cada fracción se cuantifica
igualmente siguiendo el método de Bradford.
3.4.3.2 Obtención de suero
La sangre de los animales se incuba en un baño a 37ºC en agitación
durante 30 min y posteriormente se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 15
min a 4ºC. El suero resultante se distribuye en alícuotas y se congela a –80ºC
para su posterior utilización.
3.4.4 Técnicas bioquímicas
3.4.4.1 Radioinmunoensayo (RIA)
La técnica de radioinmunoensayo está basada en la formación específica
de los complejos antígeno-anticuerpo. Combina la especificidad de las reacciones
inmunes con la sensibilidad de los métodos radioisotópicos y se puede usar para
cualquier sustancia que se comporte como antígeno, es decir, que sea capaz de
producir anticuerpos. Debido a la elevada especificidad de las uniones, esta
técnica se puede emplear para medir compuestos biológicos que se encuentren en
muy baja concentración indetectables por la técnica de ELISA. El RIA se basa en
la competición entre un antígeno no marcado (Ag) y una cantidad determinada del
antígeno marcado radiactivamente (Ag*), por los sitios de unión a un anticuerpo
Material y métodos
79
(Ac) a concentración fija, ya que ambos (Ag) y (Ag*) se comportan de igual
manera frente al anticuerpo. La curva de calibrado se realiza con cantidades
conocidas de antígeno libre y cantidades fijas de anticuerpo y antígeno marcado,
de esta forma se determina la cantidad de antígeno marcado unido al anticuerpo
respecto de la cantidad conocida de antígeno libre en cada caso.
Los tubos con las diferentes condiciones se preparan a temperatura
ambiente y en un lugar acondicionado para el trabajo con radiactividad. Todos los
puntos se preparan por duplicado, incluidos los tubos totales (radiactividad total),
los tubos NSB “non specific binding” (unión inespecífica) y los tubos B0 (unión
máxima específica). Tras la preparación de los tubos (cuadro) se agitan
vigorosamente y se incuban toda una noche a 4ºC. Posteriormente, se les añade el
carbón activo-dextrano a todos los tubos que lo requieran para precipitar el
complejo y se vuelven a agitar en un vórtex. Se incuban con el carbón activo-
dextrano 10 min a 4ºC antes de su centrifugación a 2200 rpm durante 15 min a
4ºC. Del sobrenadante obtenido de la centrifugación se transfieren 400 µl a un vial
de centelleo con 3 ml de líquido de centelleo (Optiphase, Wallac) preparado
recientemente (170 ml de Supermix + 830 ml de High Safe). La mezcla se agita
por inversión y las cuentas se miden en el contador de centelleo Microbeta Trilux
(Wallac, Turku, Finland). TUBO
Vol (µl)
TAMPÓN
A1
TAMPÓN
B1
MUESTRAS/
PATRÓN
Anti-
PGE2
PGE2
tritiado
CARBÓN ACTIVO-
DEXTRANO
TOTALES 400 100 NO NO 100 NO
NSB 200 100 NO NO 100 200
B0 100 100 100 100 100 200
PATRÓN NO 100 100 100 100 200
MUESTRA Completar 100 100 100 100 200
Material y métodos
80
3.4.4.2 Inmunodetección por Western blot
Las proteínas contenidas en la muestra se separan en geles de
poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato sódico) mediante electroforesis donde se
obtienen bandas de proteína según su peso molecular. Las bandas de proteína, a su
vez, se transfieren a membranas que permiten su inmunodetección.
El protocolo comienza con la preparación de la muestra con una cantidad
conocida de proteína (30 µg) que se diluye 1:1 en tampón de muestra
desnaturalizante y se hierve durante 5 min. El porcentaje de acrilamida del gel
determina el tamaño del poro de la matriz por donde va a correr la mezcla de
proteínas, y por tanto el rango de proteínas que serán separadas más
eficientemente. Según el peso molecular de la proteína que se pretenda estudiar,
se escogerá un porcentaje u otro de acrilamida. Las bandas de proteína del gel se
transfieren a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Amersham), tras
ser activadas con metanol durante 30 segundos y posteriormente lavadas con agua
y tampón de transferencia. Una vez transferidas las bandas, la membrana se tiñe
con “solución Ponceau” durante 1 min para comprobar que la transferencia ha
sido completa. Tras lavar la membrana con PBS-Tween 20 (0,1%)
abundantemente, se bloquea con 3% de leche desnatada en polvo en PBS-Tween
20 durante toda una noche a 4ºC para luego ser lavadas con abundante PBS-
Tween 20 hasta eliminar los restos del bloqueo. Posteriormente, se procedió a la
inmunodetección de diferentes anticuerpos preparados en PBS-Tween 20 con 2%
BSA a la dilución indicada por el fabricante. Los anticuerpos secundarios
empleados fueron específicos para el primario a detectar y estaban marcados con
peroxidasa. La detección de la banda seleccionada se realizó por un sistema de
quimioluminiscencia intensificada con el reactivo de detección que contiene
luminol y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa unida al anticuerpo secundario
Material y métodos
81
cataliza, en presencia del peróxido de hidrógeno, la oxidación del luminol
pasando éste a emitir quimioluminiscencia, que se detecta con un sistema
computerizado (UV Transiluminador, AutochemiTM System, UVP® Bioimaging
System) que registra la secuencia de imágenes del desarrollo del marcaje (García-
Segura et al., 1996).
3.4.4.3 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
La técnica de ELISA es utilizada para la detección de sustancias que
presentan propiedades antigénicas como son las proteínas o moléculas pequeñas
como la glucosa o el ácido hialurónico.
El antígeno a cuantificar se une a un anticuerpo específico al que se unirá,
por su región constante, un anticuerpo secundario. Este anticuerpo secundario
puede estar conjugado con un enzima capaz de catalizar una reacción
colorimétrica (ELISA directo) o, bien necesitar de una segunda incubación con el
enzima que proporcionará la reacción colorimétrica (ELISA indirecto)
El protocolo experimental habitual es, en un primer lugar realizar la
incubación del anticuerpo primario (o anticuerpo de recubrimiento) en la placa
multipocillo donde quedarán adheridos. Tras lavar la placa, habitualmente con
PBS, se bloquea con 2% BSA en PBS-Tween20. Una vez eliminados los restos de
PBS-BSA se procede a incubar la placa con el antígeno problema (suero,
homogeneizado). Los restos de muestra biológica se eliminan y los pocillos se
lavan de nuevo. Según el ELISA que se realice, se prosigue con la incubación del
anticuerpo secundario o con el conjugado de anticuerpo secundario y enzima. La
reacción colorimétrica se inicia cuando se incuba con el sustrato del enzima y se
mide la densidad óptica del producto originado en la reacción a la longitud de
onda apropiada en cada caso en un espectofotómetro (García-Segura et al., 1996)
Material y métodos
82
3.4.4.4 Inmunoensayo de biomarcadores por la técnica de Multiplex de
Luminex
La técnica del Multiplex se utilizó, en nuestro caso, para medir
osteocalcina y RANKL, marcadores del metabolismo óseo presentes en suero de
ratón STR/ort que se encuentran en proporciones indetectables para la técnica de
ELISA.
3.4.4.4.1 Fundamento de la técnica
Los inmunoensayos de biomarcadores Multiplex de Luminex® se basan en
la tecnología xMAP® la cual utiliza microesferas de poliestireno que contienen
distintas proporciones de dos fluorocromos en su interior que al ser excitadas por
el láser del citómetro de flujo emiten señales diferentes, siendo así posible separar
las distintas poblaciones de microesferas por composición de fluorocromos. Con
distintas proporciones de los dos fluorocromos que componen cada microesfera se
puede llegar a distinguir 100 grupos de éstas. La superficie de cada población de
microesferas está recubierta con un anticuerpo prefijado al cual se unirá el analito
a estudio. Posteriormente, se utiliza un anticuerpo secundario frente al analito
marcado con fluorescencia. La cuantificación de las moléculas a medir se realiza
basándose en los principios de la tecnología láser. Se utiliza un citómetro de 2
láseres donde uno, el rojo, discrimina las poblaciones de microesferas y el otro el
verde, discrimina intensidad de fluorescencia, siendo ésta proporcional a la
cantidad de analito unido a la microesfera.
3.4.4.4.2 Protocolo
Los sueros, antes de su utilización, se centrifugaron a 1000 g durante 10
min. Tras reconstituir todos los reactivos según las indicaciones del fabricante, se
Material y métodos
83
hidrató la placa con tampón durante 10 min y se eliminaron los restos de tampón
para proceder a poner la curva estándar, los controles de calidad internos y las
muestras de suero a estudio. A continuación se añade a cada pocillo la mezcla de
microesferas marcadas con los anticuerpos para la osteocalcina y el RANKL y el
anticuerpo secundario de detección. La placa se incuba durante toda una noche a
4ºC en agitación. Los pocillos se lavan 3 veces con el tampón de lavado,
eliminando los restos de tampón entre lavado y lavado por filtración por vacío. Se
añade a cada pocillo un volumen fijo de estreptavidina-ficoeritrina junto con un
cóctel comercial que contiene los anticuerpos de detección para cada microesfera
utilizada. Se incuba la placa durante 30 min en oscuridad y en agitación a
temperatura ambiente, y de nuevo se lavan los pocillos por filtración por vacío. Al
pocillo seco se le añaden 100 µl de líquido del sistema y, en oscuridad se agita
durante 10 min para resuspender las microesferas y asegurar una distribución
homogénea de éstas en el pocillo para, posteriormente introducir la placa en el
citómetro de flujo que aspira la mitad del volumen de la muestra y contará las
primeras 50 de las microesferas que pasen por el lector.
Material y métodos
84
4. RESULTADOS
Resultados
85
4. RESULTADOS
El grado de desarrollo de artrosis en cada uno de los modelos
experimentales se estudió tanto a nivel histológico como radiológico. Para evaluar
los daños ocasionados sobre el cartílago articular con la progresión de la
enfermedad, se empleó el sistema de evaluación histopatológica descrito por la
OARSI (Pritzker et al., 2006).
Posteriormente, se midieron variables importantes para el estudio de la
evolución de la enfermedad en cada uno de los modelos, como son los
biomarcadores de degradación del cartílago o los mediadores inflamatorios
implicados en el proceso artrósico.
La caracterización de la progresión de la enfermedad en cada uno de los
modelos experimentales desarrollados, nos permitió evaluar su posible utilidad
para testar los efectos de los fármacos SnPP y BIS069. Por tanto, aquellos
modelos que demostraron una buena reproducibilidad y representaban
características de la enfermedad suficientemente cuantificables como para poder
evaluar los efectos de los fármacos se emplearon en una segunda fase de
experimentos para realizar un estudio farmacológico de SnPP y BIS069.
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
86
4.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR COLAGENASA
INTRAARTICULAR
4.1.1 DEGRADACIÓN ARTICULAR
En el modelo de la artrosis inducida por colagenasa, se provoca la
degradación del cartílago articular de forma local en sólo una de las rodillas del
animal, por tanto tenemos la posibilidad de comparar los efectos de la colagenasa
sobre la rodilla inyectada con el estado de la articulación en ausencia de la acción
del enzima.
En primer lugar evaluaremos el modelo para determinar las posibilidades
que presenta de cara a su posterior utilización en el testado de fármacos.
4.1.1.1 Estudio histológico
Como ya hemos mencionado en el apartado de material y métodos, el
estudio histológico se realizó únicamente en la articulación de la rodilla, a los
diferentes tiempos de supervivencia a los que se planteó el estudio.
Tinciones químicas
Cabe destacar, en primer lugar, que en una gran proporción de las rodillas
inyectadas con colagenasa no se observó, a ninguno de los tiempos estudiados,
ninguna degradación del cartílago concordante con la artrosis (G0E0; P0).
Únicamente algunos individuos desarrollaron una degradación articular con
alguna similitud a la encontrada en humanos, aunque con algunas diferencias que
más tarde comentaremos.
En la figura 31 observamos cortes histológicos teñidos con
eosina/hematoxilina de rodillas de ratón Balb/c transcurridos 8 días de la
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
87
inyección de colagenasa intraarticular. En las imágenes observamos, no sólo una
membrana sinovial (MS) desarrollada y rica en infiltrado celular como respuesta a
la agresión enzimática a la que se ha sometido la rodilla, sino que aparece una
zona del platillo tibial con una importante pérdida de componentes de la matriz
del cartílago debida a la acción de la colagenasa. También cabe destacar de la
figura 31A la formación de un osteofito periférico de grandes dimensiones (G6E1;
P6).
La formación del osteofito ha sido rápida, ya que en sólo 8 días la
actividad proliferativa de los condrocitos del cartílago articular ha dado como
fruto un osteofito marginal de considerables dimensiones, como respuesta a la
grave agresión que supone la actividad enzimática de la colagenasa. En la figura
Figura 31: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina a 10x (A) y 40x (B) de rodillas de ratones balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa. A : se observa una leve pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago y destaca la aparición de un osteofito (O) en desarrollo. La membrana sinovial (MS) se presenta desarrollada y con una importante infilt ración de células inflamatorias. B: En el osteofito en desarrollo se puede apreciar una activa pro liferación celu lar pero con una composición de la matriz extracelular pobre en proteoglicanos. Se distingue la capa más externa con un mayor número de condrocitos.
TIBIABA TIBIA
MS MS
O O
Figura 31: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina a 10x (A) y 40x (B) de rodillas de ratones balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa. A : se observa una leve pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago y destaca la aparición de un osteofito (O) en desarrollo. La membrana sinovial (MS) se presenta desarrollada y con una importante infilt ración de células inflamatorias. B: En el osteofito en desarrollo se puede apreciar una activa pro liferación celu lar pero con una composición de la matriz extracelular pobre en proteoglicanos. Se distingue la capa más externa con un mayor número de condrocitos.
TIBIABA TIBIA
MS MS
O O
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
88
31B se observa el osteofito en crecimiento, donde destacan los agregados
celulares rodeados por una pobre matriz extracelular. Es de destacar que la
aparición en este modelo experimental de artrosis de un osteofito a tiempos tan
cortos del experimento no es en respuesta a una dislocación articular, puesto que
no existe dislocación ni en la articulación femororrotuliana ni en la femorotibial,
sino que su formación es únicamente una reacción celular a la agresión enzimática
a la que se ha sometido la articulación. La actividad de la colagenasa intraarticular
sigue desarrollando sus efectos a lo largo del tiempo. En la figura 32 observamos
la comparación entre el cartílago del platillo tibial de articulaciones de rodillas
inyectadas con el enzima 8 días (G1E4; P4) ó 36 días (G1,5E3; P4,5) tras la
inyección. La degradación de la matriz del cartílago es progresiva, aunque en
ninguno de los casos aparece erosión de la superficie en contacto como cabría
esperar en estos estadios de la enfermedad. A los 36 días de la inyección de
Figura 32: Fotografías de cortes parafinados teñidos eosina/hematoxilina. A : rodilla de ratón balb/c 8 d ías tras la inyección de colagenasa (40x): es patente una leve pérd ida de proteoglicanos en la superficie del cartílago art icular junto con un aumento de la cantidad de condrocitos. B: rodilla de ratón balb/c 36 días tras la inyección con colagenasa (40x). La pérdida de componentes de la matriz extracelu lar es severa aunque no aparece erosionada la superficie del cart ílago. Existe una pérdida local de condrocitos (*) rodeada de un área con mayor densidad celular. La membrana sinovial (MS) está ampliamente desarrollada y rica en células inflamatorias.
A BTIBIA TIBIA
MS
*
Figura 32: Fotografías de cortes parafinados teñidos eosina/hematoxilina. A : rodilla de ratón balb/c 8 d ías tras la inyección de colagenasa (40x): es patente una leve pérd ida de proteoglicanos en la superficie del cartílago art icular junto con un aumento de la cantidad de condrocitos. B: rodilla de ratón balb/c 36 días tras la inyección con colagenasa (40x). La pérdida de componentes de la matriz extracelu lar es severa aunque no aparece erosionada la superficie del cart ílago. Existe una pérdida local de condrocitos (*) rodeada de un área con mayor densidad celular. La membrana sinovial (MS) está ampliamente desarrollada y rica en células inflamatorias.
A BTIBIA TIBIA
MS
*
A BTIBIA TIBIA
MS
*
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
89
colagenasa la pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago
articular es prácticamente completa.
Transcurridos 36 días de la inyección intra-articular de colagenasa, las
rodillas de los ratones presentan una severa pérdida de componentes de la matriz
extracelular del cartílago del platillo tibial, así como la existencia de osteofitos
marginales y centrales, aunque éstos ya no tienen el aspecto que se observó a los 8
días de la inyección.
En la figura 33 se aprecia un osteofito marginal y uno central rodeados de
zonas de gran pérdida de componentes del cartílago aunque sin erosión de la
superficie articular. El osteofito marginal formado en los primeros días tras la
agresión enzimática (fig. 33B), ha perdido con el paso de los días gran cantidad de
células, quedando únicamente matriz extracelular pobre en proteoglicanos, como
demuestra la tinción de O-safranina. El osteofito central es prácticamente acelular
y posee únicamente matriz de colágeno.
Figura 33: Fotografías de cortes parafinados teñidos O-safranina a 4x (A) y 40x (B) de rodillas de ratón balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa. A: en la micrografía se observan osteofitos marginales y centrales (O). B: la imagen a más aumentos revela un pérdida importante de células y de componentes de la matriz del cartílago.
A B
O
O
O
Figura 33: Fotografías de cortes parafinados teñidos O-safranina a 4x (A) y 40x (B) de rodillas de ratón balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa. A: en la micrografía se observan osteofitos marginales y centrales (O). B: la imagen a más aumentos revela un pérdida importante de células y de componentes de la matriz del cartílago.
A B
O
O
O
A B
O
O
O
A B
O
O
O
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
90
A los 36 días de la inyección intraarticular de colagenasa seguían sin
observarse las características típicas de la artrosis humana, como son la
dislocación de la articulación femororrotuliana, seguida de la femorotibial, la
erosión de las superficies del cartílago articular que soportan mayor rozamiento y
su previa pérdida de proteoglicanos. Sin embargo, sí que se observaron hitos
importantes de la progresión de la artrosis como es la formación de osteofitos,
pero estas formaciones no ocurrieron con la suficiente incidencia como para
considerar que este modelo de artrosis sea el modelo adecuado para representar
los procesos involucrados en dicha enfermedad.
El estudio de los cortes histológicos siguiendo el sistema de la OARSI de
evaluación de la histopatologíca de la artrosis reveló las siguientes puntuaciones:
4.1.1.2 Estudio de biomarcadores
En el suero de ratones balb/c inyectados intraarticularmente con
colagenasa se midieron por ELISA diferentes marcadores de la degradación del
cartílago como HA, CTX-II o COMP, pero no se pudieron obtener niveles
cuantificables por dicha técnica a ninguno de los tiempos de supervivencia
P6 G6E1Con colagenasa. Día 36
P6 G6E1Con colagenasa. Día29
P6 G6E1Con colagenasa. Día 8
P1 G1E1Sin colagenasa. Día 36
P0 G0E0Sin colagenasa. Día 8
P GnERODILLA
Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular
91
estudiados. Por tanto, no ha sido posible cuantificar por medio de biomarcadores
la progresión de la enfermedad.
Dada la baja incidencia de ratones que desarrollan la enfermedad, la
levedad con que ocurre y la dificultad para cuantificar en suero biomarcadores de
la degradación del cartílago, descartamos el modelo de artrosis inducida por
colagenasa intraarticular para el estudio de posibles efectos de moléculas
experimentales sobre el desarrollo de la artrosis.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
92
4.2 MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort
En este modelo animal
se realizó un seguimiento del
peso a lo largo del estudio,
para poder comparar la
progresión del peso de los
animales que debían
desarrollar la artrosis de forma
espontánea (STR/ort), con el
peso de la cepa que no
desarrolla artrosis (CBA). En
las gráficas de la figura 34
observamos cómo el peso de
los ratones CBA prácticamente
no aumenta a lo largo de
cuatro semanas, mientras lo
ratones STR/ort incrementan
su peso notablemente. Estos resultados nos confirman la capacidad de esta cepa
para desarrollar una obesidad independiente de la dieta.
4.2.1 Degradación articular
Dado que los ratones STR/ort desarrollan de forma espontánea artrosis en
sus articulaciones, nos dispusimos a realizar el estudio histológico de la
progresión de la enfermedad, en las articulaciones de mayor prevalencia de
artrosis en humanos.
7 8 9 10 1110
20
30
40
CBA
peso
(g)
Edad (semanas)
7 8 9 10 1110
20
30
40
STR/ort
peso
(g)
Figura 34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort.
7 8 9 10 1110
20
30
40
CBA
peso
(g)
Edad (semanas)
7 8 9 10 1110
20
30
40
STR/ort
peso
(g)
Figura 34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
93
4.2.1.1 Estudio histológico
Se realizó el estudio histológico previo de las articulaciones
interfalángicas, la articulación del tobillo y la articulación de la rodilla, con la
finalidad de escoger la articulación más adecuada para estandarizar el futuro
estudio de la progresión de la artrosis y de los efectos de moléculas
experimentales sobre dicha patología.
Una vez escogida la articulación objeto de nuestro estudio, se realizó el
estudio inmunohistoquímico y la medición de biomarcadores y mediadores
inflamatorios.
4.2.1.1.1 Articulaciones interfalángicas
Dado que en humanos las articulaciones interfalángicas son las más
frecuentemente afectadas por la artrosis, nos dispusimos a realizar un estudio
histopatológico de dichas articulaciones, empleando las tinciones químicas con
eosina/hematoxilina y O-safranina.
La articulación interfalángica es una articulación sinovial susceptible de
padecer artrosis, siendo frecuente el desarrollo de nódulos de Heberden en las
articulaciones distales y de Bouchard en las proximales, característicos de la mano
artrósica. En el caso de los ratones STR/ort no se observó macroscópicamente el
desarrollo de los nódulos anteriormente citados, aunque sí deformaciones de las
falanges como muestra la figura 35. El estudio histológico de las articulaciones
interfalángicas (fig. 36) reveló que existe una severa alteración del cartílago
articular similar a la encontrada en la artrosis humana y coherente con las
deformaciones macroscópicas encontradas en las articulaciones interfalángicas de
las patas traseras de algunos de los ratones STR/ort.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
94
Todas estas características específicas de la artrosis hacen que dicha
articulación pueda ser una buena candidata para el estudio comparativo a lo largo
del desarrollo de la patología y para la evaluación de fármacos en estudio, pero
existen limitaciones. En primer lugar, la deformidad de las falanges de las patas
de los ratones STR/ort y su consecuente degradación del cartílago articular
observado en los cortes histológicos, ocurren con frecuencia muy baja, y en
segundo lugar, el estudio de los dedos de las patas de ratón es complicado por
dificultades técnicas asociadas a su pequeño tamaño como, por ejemplo, la escasa
disponibilidad de muestra y la dificultad para realizar adecuadamente los cortes
histológicos.
Figura 35: Patas traseras de ratones STR/ort. A: Fotografía de la pata trasera de un ratón STR/ort con deformaciones de las falanges características de la artrosis. B: radiografía de la pata trasera de un ratón STR/ort donde se observa dislocaciones de varias articulaciones interfalángicas.
A B
Figura 35: Patas traseras de ratones STR/ort. A: Fotografía de la pata trasera de un ratón STR/ort con deformaciones de las falanges características de la artrosis. B: radiografía de la pata trasera de un ratón STR/ort donde se observa dislocaciones de varias articulaciones interfalángicas.
A BA B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
95
Figura 36: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (A y B) y coneosina/hematoxilina (C y D) de falanges de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A:se observan las dos articulaciones interfalángicas presentes en un dedo trifalángico (4x). B:las articulaciones no se presentan dislocadas pero sí que aparece el cartílago dañado conpérdida de matriz extracelular (10x). C: la matriz extracelular del cartílago de unaarticulación interfalángica proximal muestra una alteración en su composición (20x). D: enotra articulación interfalángica proximal aparece una acusada pérdida de condrocitos delcartílago articular así como una membrana sinovial (MS) rica en infiltrado inflamatorio(20x).
BA
C D
MS
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
96
4.2.1.1.2 Articulación del tobillo
La articulación del tobillo aparece, a nivel macroscópico, frecuentemente
deformada y/o dislocada en los ratones STR/ort (fig. 35). Por este motivo nos
propusimos realizar el estudio histológico previo de los tobillos de los ratones. En
la figura 37A observamos la gran cantidad de pequeños huesos que componen la
articulación del tobillo del ratón, aunque a más aumentos (37B , 37C y 37D) no se
observa degradación en ninguna de las articulaciones que la componen. Por tanto,
descartamos la articulación del tobillo como control del desarrollo de la artrosis en
ratones STR/ort. Las dislocaciones observadas en algunos de los ratones pueden
deberse, por tanto, a movimientos compensatorios para minimizar los
movimientos de las articulaciones dolorosas, como las interfalángicas o las de la
rodilla.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
97
Figura 37: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) ycon O-safranina (B, C y D) de tobillos de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A:se observa multitud de articulaciones que componen el tobillo del ratón (4x). B, C: lasarticulaciones no presentan ninguna característica de la artrosis (10x). D: la matrizextracelular del cartílago articular no presenta alteraciones en su composición (20x).
BA
C D
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
98
4.2.1.1.3 Articulación de la rodilla
La articulación de la rodilla es otra de las que más frecuentemente se
encuentran afectadas en pacientes artrósicos humanos, por tanto realizamos un
estudio histológico previo para evaluar su utilidad en los próximos objetivos de la
presente tesis.
En ratones STR/ort no se observa macroscópicamente inflamación o
dislocación de la articulación de la rodilla, aunque el estudio histológico reveló
que la rodilla era la articulación que más frecuentemente aparecía dañada y más
severamente. En la figura 38 se observa microscópicamente la dislocación
ocasionada por la degradación del cartílago articular, que confiere la estabilidad al
movimiento de la articulación sana.
Figura 38: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y coneosina/hematoxilina a 10x (B) de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad.A: se observa una severa dislocación de la articulación de la rodilla. B: la degradación de lasuperficie del cartílago articular se hace patente junto con una importante pérdida decondrocitos.
BA
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
99
En los estudios presentados en los apartados anteriores se muestran las
diferentes articulaciones del ratón STR/ort, que se estudiaron a fin de decidir la
articulación que servirá para comparar los procesos que suceden durante el
desarrollo de la artrosis y su posible tratamiento con moléculas experimentales.
Por todos los motivos anteriormente expuestos, de ahora en adelante, los
estudios que se realizarán en ratones STR/ort se centrarán en las rodillas del
animal.
En primer lugar, se estudiaron los ratones CBA que no desarrollan artrosis
y que se estabularon en idénticas condiciones que los ratones STR/ort, como
referencia del estado de la articulación de la rodilla en ausencia de artrosis. El
estudio histológico mediante tinciones químicas de las rodillas de los ratones
CBA indica que en ninguna de las edades estudiadas, existe degradación en el
cartílago articular coherente con la enfermedad de artrosis (G0E0, P0).
En la figura 39 podemos observar una articulación de ratón CBA de 11
semanas de edad que no presenta dislocación, ni aparente pérdida de componentes
del cartílago articular, ya que la tinción de safranina no denota una pérdida de
coloración en ninguna de las superficies articulares. A más aumentos (fig 39B) no
se observan desgarros de la superficie del cartílago articular ni pérdida de
condrocitos. Por tanto, el estudio de las articulaciones de ratones CBA, aún en los
animales de más edad, nos indica que son articulaciones sanas, carentes de
características artrósicas.
En este punto, nos dispusimos a llevar a cabo el estudio longitudinal de la
progresión de la artrosis en ratones STR/ort. El estudio histológico llevado a cabo
empleando tinciones químicas nos reveló una marcada progresión de las
características más importantes de la enfermedad.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
100
En la figura 40 observamos cortes histológicos teñidos con O-safranina de
rodillas de ratones STR/ort a tiempo inicial del experimento, 7 semanas de edad,
con el fin de evaluar la degradación del cartílago articular. Al inicio del
experimento, cuando los animales son relativamente jóvenes, no se observa
dislocación de la rótula ni afectación de las superficies del cartílago articular. Por
tanto, los animales poseen, a tiempo 0 del experimento, rodillas aparentemente no
artrósicas.
Como ya se describió en el apartado de Material y métodos, los ratones
STR/ort se sacrificaron a diferentes tiempos a fin de poder estudiar los posibles
cambios histológicos a lo largo de la evolución de la enfermedad. Así, los
animales de 9 semanas de edad (fig. 41) aún no presentaban dislocación rotuliana
pero sí un marcado deterioro del cartílago articular patente en la pérdida de
coloración de la tinción de O-safranina de las superficies articulares. No aparece
tampoco pérdida de condrocitos ni erosión de la matriz del cartílago.
Figura 39: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 10x (A) y 40x(B) de rodillas de ratones CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías no seobserva ninguna característica fisiopatológica de la artrosis como puede ser la alteración enla composición de proteoglicanos del cartílago o la discontinuidad de la superficie articular.
FÉMUR FÉMUR
RÓTULA RÓTULA A B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
101
Figura 40: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 10x(A) y20x(B) de rodillas de ratones STR/ort de 7 semanas de edad. A: Se puede observar queno existe dislocación de la rótula (R). B: La superficie del cartílago articular de la rótula sepresenta prácticamente sin alteraciones y existe una aparente homogeneidad de loscomponentes de la matriz extracelular.
A B
R R
FÉMUR
Figura 41: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 20x (A) y 40x(B) de rodillas de ratones STR/ort de 9 semanas de edad. A: se observa una importantepérdida de proteoglicanos en las diferentes capas del cartílago articular. A más aumentos (B)se observan algunas lagunas condrocitarias vacías por la muerte de los condrocitos que lasocupaban.
FÉMUR FÉMUR
RÓTULA RÓTULA
BA
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
102
El estudio histopatológico continúa con rodillas de ratones STR/ort de ll
semanas de edad (fig. 42), y en ellos se observan ya, de forma patente, todas las
características de la rodilla artrósica. En la figura 42A se observa una marcada
dislocación de la rótula, así como una formación periférica coherente con un
osteofito, creado probablemente con la finalidad de estabilizar la articulación
gravemente dañada por el aumento de las fuerzas de fricción entre las superficies
articulares, dado el desplazamiento de la rótula respecto del fémur. En la fig 42B,
a más aumentos, se observa cómo el incremento de la fricción ha ocasionado
graves pérdidas celulares, siendo los más afectados los condrocitos más
periféricos y una importante erosión de la matriz del cartílago articular. Los
cambios en la coloración de la tinción de O-safranina de la matriz del cartílago
observados en las rodillas de ratones 2 semanas más jóvenes no se observan, en
este caso, probablemente porque el cartílago pobre en proteoglicanos que
Figura 42: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y coneosina/hematoxilina a 20x (B) de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad. A:aparece una dislocación de la rótula (R) respecto del fémur (F) característico de ladesestabilización de la articulación durante el proceso artrósico. También se observa unincipiente osteofito (*). B: se hace presente una importante erosión de la superficie delcartílago articular de la rótula (R) con pérdida de condrocitos y una alteración de lacomposición de la matriz extracelular.
A
R
F
*
RB
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
103
observábamos anteriormente se ha erosionado y ha desaparecido de la superficie
articular.
Hasta este momento, sólo aparecía dañada de forma importante la
articulación femororrotuliana pero, cuatro semanas más tarde, cuando los ratones
STR/ort alcanzan la edad de 15 semanas, observamos (fig. 43) afectada ya la
articulación femorotibial. En la micrografía 43A se observa una leve dislocación
coherente con la encontrada en la articulación femororrotuliana, con
desplazamiento del menisco medial. Además la articulación presenta una pérdida
completa de componentes de la matriz extracelular del cartílago del platillo tibial
medial, que se hace patente por la pérdida de coloración de safranina de la zona.
La pérdida de proteoglicanos se agrava con una pérdida de gran parte del
cartílago en la zona de mayor contacto, como muestra la figura 43B, entre el
menisco medial y el platillo tibial medial.
Figura 43: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y 20x (B)de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A: Se hace presente una dislocaciónmedial de la tibia (T) respecto del fémur (F) con una severa afectación del menisco medial(MM) patente en la pérdida de componentes de la matriz extracelular. La membrana sinovial(MS) aparece desarrollada B: la superficie articular del cóndilo femoral (F) se observa unacompleta pérdida de proteoglicanos con fibrilaciones y la desaparición de los condrocitos delas capas más superficiales. La degradación del cartílago se hace patente también en elmenisco medial (MM).
MM
MM
ML
F
T
MS
T A B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
104
Con este estudio histológico a lo largo de 8 semanas de la vida de los
ratones STR/ort se ha podido observar la degradación secuencial de la articulación
de la rodilla, similar a la descrita en pacientes artrósicos. La comparación con las
rodillas de ratones CBA, que no desarrollan artrosis, demostró que la degradación
articular observada no era únicamente la provocada por la edad del animal, sino
que es representativa de la patología objeto de la presente tesis.
La evaluación de los cortes histológicos de las rodillas de los animales de
este estudio según los criterios descritos por la OARSI (fig. 44) demostró un
incremento paulatino de la puntuación del daño articular en las rodillas de los
ratones STR/ort. Este incremento en la puntuación no ocurre en las rodillas de
ratones CBA de la misma edad.
Por tanto, concluimos que el modelo de desarrollo espontáneo de artrosis
en ratones STR/ort es un modelo animal apto para el estudio de posibles nuevos
fármacos para el tratamientos de la artrosis, ya que la degradación articular,
7.5 10.0 12.5 15.00
5
10
15
20
25CBASTR/ort
edad (semanas)
punt
uaci
ón (U
A)
Figura 44: Puntuación según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI del cartílago de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis
7.5 10.0 12.5 15.00
5
10
15
20
25CBASTR/ort
edad (semanas)
punt
uaci
ón (U
A)
Figura 44: Puntuación según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI del cartílago de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
105
siguiendo el sistema de puntuación histopatológica de la artrosis descrito por la
OARSI, posee unos valores suficientemente elevados como para considerar que la
enfermedad se ha desarrollado en los ratones STR/ort a las edades estudiadas y, la
enfermedad se desarrolla en un 80-90% de los animales estudiados.
4.2.1.2 Estudio radiológico
Además del estudio histológico se realizó un estudio radiológico de la
articulación de la rodilla para comprobar su grado de afectación durante el
proceso artrósico. Dado el pequeño tamaño de la articulación del ratón, el análisis
de la imagen es difícil. Tal y como se observa en la figura 45, las rodillas de los
ratones CBA a las 11 semanas edad presentan una articulación normal, donde se
aprecian claramente las delimitaciones de los cóndilos femorales y del platillo
tibial sin ningún indicio de dislocación. Sin embargo, los ratones STR/ort poseen
rodillas típicamente artrósicas. En la figura 45B se aprecian las superficies del
cartílago articular levemente desdibujadas aunque sin rastros de dislocación aún.
A las 11 semanas de edad (fig. 45C) las rodillas de los ratones STR/ort
presentan la superficie articular discontinua, que se agrava notablemente a las 15
semanas de edad cuando la articulación se presenta dislocada y con gran cantidad
de artefactos en la cápsula articular provenientes de la erosión del cartílago
articular y una pronunciada sinovitis.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
106
CBA 11 semanas
STR/ort 7 11 15 semanas
A
B C D
Figura 45: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort y CBA. A: rodilla de ratón CBA de11 semanas de edad donde se observan perfectamente delimitados los cóndilos femorales yplatillo tibial; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad sin ninguna alteraciónradiológica aparente. C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con indicios deafectación de la superficie del cartílago articular; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas deedad donde se observa la articulación dislocada y con una severa alteración del cartílago.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
107
4.2.2 Estudio de biomarcadores
El estudio histológico de la progresión de la artrosis en ratones STR/ort y
su comparación con el estado de las articulaciones de rodilla de ratones CBA que
no desarrollan artrosis, se completó con la medición de posibles biomarcadores
locales de la progresión de la enfermedad (en homogenados de tejidos de pata) y
sistémicos (en suero), con la finalidad de evaluar de una forma global los procesos
que ocurren durante el desarrollo de la enfermedad en el modelo de desarrollo
espontáneo de artrosis en ratones STR/ort.
Proteína Oligomérica de la Matriz del Cartílago (COMP)
Se midieron los niveles de COMP en el suero de ratones STR/ort y ratones
CBA por la técnica de ELISA, utilizando el kit comercial de MDbiosciences
siguiendo las indicaciones del fabricante. Se compararon los niveles obtenidos en
los sueros extraídos cada dos semanas, durante las cuatro semanas que duró el
experimento (fig. 46).
El estudio de los niveles de COMP en suero muestra que los niveles
obtenidos en ratones STR/ort están significativamente elevados, respecto de los
niveles encontrados en ratones CBA que no desarrollan artrosis. También se
observa en la gráfica un leve pero progresivo aumento de los niveles de COMP
con la edad, tanto en los CBA como en los ratones STR/ort. Los niveles elevados
de COMP en ratones STR/ort respecto de los encontrados en animales que no
desarrollan artrosis son característicos de la cepa (Jaeger et al., 2008). La
presencia de esta proteína en el suero se ha propuesto como un biomarcador de la
degradación del cartílago en la artrosis humana (Vilim et al., 2002).
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
108
Ácido Hialurónico (HA)
El ácido hialurónico es uno de los glicosaminoglicanos de mayor
importancia en el cartílago articular y su presencia en suero se ha sugerido como
biomarcador de la progresión de la artrosis (Pavelka et al., 2004). Los niveles de
HA se midieron utilizando un ELISA de Echelon, según las instrucciones del
fabricante, en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA a las 11 semanas de
edad (fig. 47), transcurridas las cuatro semanas que duró el experimento. Los
resultados obtenidos sugieren que no existen diferencias entre los niveles
presentes en ratones STR/ort y los niveles en ratones CBA. De forma contraria a
cómo ocurría en el biomarcador COMP, el ácido hialurónico no parece ser
Figura 46: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) enel suero de ratones STR/ort y ratones CBA. Se compararon los sueros de ratonesCBA y STR/ort a tres tiempos del desarrollo del experimento. Media ±ε. * test de Student. p<0,05.
edad (semanas) 7 9 11
1.5
2.0
2.5CBASTR/ort
** *
U/L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
109
representativo de la degradación patente en el cartílago de ratones STR/ort. Por
tanto, no consideramos que el ácido hialurónico sea un biomarcador apto para la
evaluación de los efectos de tratamientos con fármacos experimentales sobre la
progresión de la enfermedad en ratones STR/ort.
Metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3)
La metaloproteinasa 3 es uno de los enzimas implicados en la destrucción
del cartílago articular durante la progresión de la artrosis. Sus niveles están
relacionados con el estrechamiento del espacio articular en la rodilla artrósica
Figura 47: Niveles de ácido hialurónico en el suero de ratones STR/ort yratones CBA de 11 semanas de edad. Se compararon los niveles de ácidohialurónico en sueros de ratones CBA y STR/ort tras 4 semanas de estudio y nose observaron diferencias significativas entre ratones artrósicos y ratones que nodesarrollan la enfermedad. Media ±ε.
11 semanas de edad
CBA STR/ort
0
10
20
30
ng/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
110
(Lohmander et al., 2005; Samuels et al., 2008; Tchetverikov et al., 2005). Por
ello, se midieron los niveles de MMP3 utilizando un ELISA de R&D Systems en
el suero de ratones STR/ort y ratones CBA para observar las posibles diferencias
entre animales que desarrollan artrosis y los que no desarrollan ningún tipo de
degeneración articular. Se compararon las medidas obtenidas en los sueros
extraídos cada dos semanas a lo largo de las cuatro semanas que duró el
experimento (fig. 48).
Los resultados muestran cómo en las dos primeras semanas de estudio los
niveles de MMP3 están significativamente incrementados en el suero de los
edad (semanas)
Figura 48: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratonesSTR/ort y ratones CBA. Se compararon los sueros de ratones CBA y STR/ort a trestiempos a lo largo del desarrollo del experimento.** test de student p<0,01 STR/ortvs CBA. ## test de Dunett p<0,01; 11 semanas vs 9 y 7 semanas
7 9 110.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
CBASTR/ort
* *
* *
##ng/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
111
ratones STR/ort respecto de los ratones CBA. Los niveles de la metaloproteinasa
se normalizan en la última semana del experimento, probablemente porque la
actividad destructiva del enzima se haya paralizado o estabilizado a estos tiempos
del estudio.
Osteocalcina (OC)
Esta proteína es un marcador del metabolismo óseo y su incremento en
suero se ha relacionado con la progresión radiológica de la artrosis de rodilla
(Bruyere et al., 2003). Por tanto, encontramos interesante estudiar las posibles
diferencias existentes entre ratones que desarrollan de forma espontánea la artrosis
y ratones que, a la misma edad, no desarrollan procesos artrósicos (ratones CBA).
Los niveles de osteocalcina se midieron en el suero de ratones CBA y
11 semanas de edad
Figura 49: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort yratones CBA. Se compararon los niveles de OC en los sueros de ratones STR/ort yCBA de 11 semanas de edad. Media ± ε. * test de student p<0,05.
CBA STR/ort0
50000
100000
150000
200000
250000
*
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
112
ratones STR/ort utilizando la técnica Luminex, aunque por limitación de muestra
sólo se pudo medir los niveles de osteocalcina a tiempo final del experimento. Los
ratones STR/ort presentan, a la edad de 11 semanas, niveles de osteocalcina
aumentados respecto de los ratones CBA (fig. 49), lo que sugiere que la
osteocalcina puede ser un biomarcador candidato para el estudio del pronóstico de
la artrosis.
Ligando del Receptor Activador del NF-κB (RANKL)
Dado que el sistema Osteoprotegerina/RANK/RANKL desempeña un
importante papel en el remodelado óseo, y se ha propuesto como biomarcador en
la artrosis de rodilla (Pilichou et al., 2008), procedimos a medir los niveles del
ligando soluble del receptor activador del NF-κB (RANKL) en suero, utilizando
11 semanas de edad
Figura 50: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA. Se compararon los niveles de RANKL en los sueros de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad. Media ± ε. ** test de student p<0,01
CBA STR/ort0
50
100
150
200
250
**pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
113
la técnica de Luminex. De nuevo, por limitación de la muestra sólo se pudieron
cuantificar los niveles de RANKL a tiempo final. Se compararon los niveles
obtenidos en el suero, de ratones STR/ort con los obtenidos en suero de ratones
CBA, ambos de 11 semanas de edad (fig. 50). En el suero de los ratones STR/ort
aparecen significativamente disminuidos los niveles de RANKL respecto de los
valores obtenidos en ratones CBA, sugiriendo una alteración en el sistema
OPG/RANK/RANKL en la progresión de la artrosis en ratones STR/ort.
4.2.3 Inflamación
Para evaluar el grado de inflamación relacionado con la degradación
articular propia de la artrosis, nos dispusimos a medir diferentes mediadores
inflamatorios implicados en el proceso artrósico en ratones STR/ort, que
desarrollan la enfermedad y en ratones CBA, que no padecen la patología.
Interleucina-1β (IL-1β)
La citocina proinflamatoria IL-1β se midió en el suero extraído de los
ratones STR/ort cada 2 semanas durante las 8 semanas que duró el experimento de
observación del progreso de la enfermedad. Se utilizó para medir los niveles de
IL-1β un kit de ELISA de R&D Systems.
El estudio de la expresión de IL-1β durante la progresión de la artrosis en
ratones STR/ort durante ocho semanas demuestra que no existe un incremento
progresivo dependiente de la edad sino que los niveles oscilan a lo largo de la
evolución de la enfermedad (fig. 51).
También se midieron los niveles de IL-1β en suero de los ratones STR/ort
de 11 semanas, para compararlos con los obtenidos en ratones CBA de la misma
edad (fig. 52). En el estudio comparativo de los niveles de IL-1β a las 11 semanas
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
114
edad (semanas)
Figura 51: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ortde diferentes edades. Se compararon los niveles de IL-1ß en los sueros de ratonesSTR/ort a diferentes edades. Media ± ε.
7 9 11 150
500
1000
1500
pg/m
L
11 semanas de edad
Figura 52: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort yratones CBA. Se compararon los niveles de IL-1ß en los sueros de ratones STR/orta las 11 semanas de edad con los niveles en ratones CBA de la misma edad. Media ±ε. * test de student p<0,05
CBA STR/ort0
500
1000
1500
2000
2500
*
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
115
de edad se observa una disminución en el suero de ratones STR/ort en
comparación con los obtenidos en el suero de ratones CBA.
Interleucina 17 (IL-17)
También se midió en suero la citocina proinflamatoria IL-17 para estudiar
su posible implicación en el desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort, a lo largo
de las 8 semanas que duró el experimento de observación del proceso degradativo
de la artrosis. Para su medición se utilizó un ELISA de R&D Systems siguiendo
las indicaciones del fabricante.
edad (semanas)
Figura 53: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ortde diferentes edades. Se compararon los niveles de IL-17 en los sueros de ratonesSTR/ort a diferentes edades. Media ± ε. * test de student p<0,05; 15 semanas vs 7semanas
7 9 11 150
10
20
*
pg/m
l
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
116
El estudio de la citocina IL-17 mostró un incremento progresivo de los
niveles en suero a lo largo del experimento (fig. 53), lo que puede justificar la
progresión del componente inflamatorio observada en el estudio histológico de la
evolución de la artrosis en ratones STR/ort.
También se midieron los niveles de la IL-17 en el suero de ratones CBA de
11 semanas y se compararon con los obtenidos en los ratones STR/ort de la misma
edad (fig. 54), y se observó que los niveles de la citocina aparecían disminuidos
en el suero de los ratones que desarrollan la artrosis de forma espontánea en
comparación con los ratones CBA.
11 semanas de edad
Figura 54: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort yCBA. Se compararon los niveles de IL-17 en los sueros de ratones STR/ort a las11 semanas de edad con los niveles en ratones CBA de la misma edad. Media ± ε
CBA STR/ort0
5
10
15
20
25
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
117
Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα )
El factor de necrosis tumoral es una citocina implicada tanto en las
reacciones de inflamación de fase aguda como en la inflamación crónica. Aunque
la artrosis es una patología caracterizada por la degradación paulatina del cartílago
articular y su componente inflamatorio involucrado es minoritario, pensamos que
sería interesante cuantificar los niveles de TNFα en el suero de los ratones
STR/ort a lo largo del desarrollo de la patología. Por tanto, utilizamos un ELISA
de R&D Systems y, siguiendo las indicaciones del fabricante, cuantificamos los
niveles de TNFα existentes en el suero de ratones STR/ort a lo largo del
desarrollo de la artrosis (fig. 55).
edad (semanas)
Figura 55: Niveles de TNFα en el suero de ratones STR/ort dediferentes edades. Se estudió los niveles del factor de necrosis tumoral a lolargo del desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort. Media ± ε. * test de student p<0,05; 11 semanas vs 7 semanas
7 9 11 150
100
200
300
400
500
600
700 *
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
118
Observamos cómo existe un incremento significativo durante las 4
primeras semanas (de la 7 a la 11) aunque decaen los niveles más tarde,
probablemente porque ya ha finalizado la fase inflamatoria en la que estaría
implicado el TNFα .
También comparamos los niveles de TNFα existentes en el suero de
ratones STR/ort con los encontrados en suero de ratones CBA a la edad de 11
semanas (fig. 56). En la gráfica no se observan diferencias entre los niveles de
TNFα en el suero de ratones que padecen artrosis respecto de los ratones CBA
que están carentes de la degradación articular que conlleva la artrosis.
11 semanas de edad
Figura 56: Niveles de TNFα en el suero de ratones CBA y STR/ort de 11semanas de edad. Se compararon los niveles del factor de necrosis tumoral entrelos ratones que no desarrollan artrosis y aquellos que desarrollan de formaespontánea la enfermedad. Media ± ε.
CBA STR/ort0
100
200
300
400
500
600
700
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
119
Prostaglandina E2 (PGE2)
La PGE2 se midió en el suero de ratones STR/ort por radioinmunoensayo
empleando el protocolo explicado en el apartado de material y métodos. Se
compararon los resultados obtenidos en los sueros extraídos cada dos semanas de
los ratones STR/ort, con la finalidad de estudiar los niveles de PGE2 durante el
desarrollo de la artrosis en dichos animales (fig. 57).
En los resultados obtenidos no se observó un patrón de aumento
progresivo de los niveles de PGE2 como cabría esperar, sino que la prostaglandina
se encontraba mucho más elevada en el suero de los ratones STR/ort durante las
cuatro primeras semanas del experimento y sus niveles disminuían muy
significativamente a partir de la semana 11 de edad.
Se compararon también los niveles de PGE2 en el suero de ratones STR/ort
edad (semanas)
Figura 57: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort de diferentes edades. Se midieron los niveles de PGE2 en el suero deratones STR/ort durante 8 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett p<0,01; 11 y 15semanas vs 7 semanas
7 9 11 150
25
50
75
** **
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
120
de 11 semanas de edad con los niveles obtenidos en los sueros de ratones CBA de
la misma edad (fig. 58). En este caso se observó una disminución significativa de
los niveles de la prostaglandina en los sueros de ratones enfermos de artrosis. De
nuevo, encontramos en la cepa de ratones STR/ort una disminución de niveles de
marcadores proinflamatorios respecto de animales que no desarrollan la
enfermedad, a la semana 11 de edad.
11 semanas de edad
Figura 58: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort y CBA a las 11 semanas de edad. Se compararon los niveles de PGE2 enlos sueros de ratones STR/ort de 11 semanas de edad con los ratones CBA de lamisma edad. Media ± ε. ** test de student p<0,01.
CBA STR/ort0
25
50
75
**
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
121
Ciclooxigenasa 2 (COX-2)
Para evaluar la implicación de la COX-2 en el proceso inflamatorio
coexistente con la degradación articular que se desarrolla de forma espontánea en
este modelo animal, la COX-2 se midió utilizando tanto la técnica de western blot
a partir del extracto de proteína microsomal obtenido de los homogenados de
rodillas de ratones STR/ort y CBA, como por inmunohistoquímica sobre tejido
parafinado.
En la gráfica de la figura 59A se muestran las bandas obtenidas en el
western blot para COX-2. Los resultados obtenidos del densitometrado de las
bandas correspondientes a la COX-2, normalizados respecto de los valores
obtenidos del densitometrado de la banda de actina se muestran en la figura 59B.
En ella observamos cómo los niveles de COX-2 en la cepa de ratones
STR/ort disminuyen progresivamente con el paso del tiempo y la progresión de la
enfermedad. Los niveles de COX-2 a la edad de 11 semanas son
significativamente mayores en el caso de los ratones STR/ort que en los ratones
CBA.
La inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 60) se realizó para corroborar
los resultados obtenidos por la técnica de inmunodetección por western blot y con
el fin de conocer su localización. De nuevo se compararon los resultados
obtenidos en las rodillas de ratones STR/ort a diferentes edades, con los obtenidos
en ratones CBA que no desarrollan la artrosis y se observó que la expresión de la
COX-2 se reduce con el paso del tiempo y el deterioro de la articulación de los
ratones STR/ort.
El marcaje por inmunohistoquímica de COX-2 aparece tanto en los
condrocitos superficiales del cartílago articular como en los sinoviocitos que
constituyen la membrana sinovial. El recuento de condrocitos positivos para la
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
122
inmunotinción demuestra una reducción significativa del número de células que
expresan COX-2 en el cartílago articular con la progresión de la enfermedad en
los ratones STR/ort (fig. 60E). Mientras que la expresión de COX-2 en rodillas de
ratones CBA es significativamente superior al número de condrocitos que
expresan COX-2 en ratones STR/ort de la misma edad (fig. 60F).
Figura 59: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal dehomogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades. A: Imagen delwestern blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado alvalor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. * test de student p<0,05; STR/ort vs CBA11 semanas de edad. ## test de Dunett p<0,01; 15 semanas vs 7 semanas
11 7 11 150
1000
2000
3000
4000
5000
6000CBASTR/ort
*
##
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
OI)
11 7 11 15
cepa edad (semanas)
CBA STR/ort
edad (semanas)
A
B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
123
Figura 60: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) encostes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotulianade ratón CBA de 11 semanas de edad donde se observa una intenso marcado de condrocitospositivos frente a COX-2; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con gran númerode condrocitos positivos para COX-2; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad conun número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para COX-2; D:rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad donde se observa la articulación dislocada, unasevera alteración del cartílago pero sin condrocitos positivos para la inmunohistoquímica deCOX-2. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas deratones STR/ort de diferentes edades. t de Student * p<0,05; *** p<0,001 F: Comparación delnúmero de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 obtenidas en rodillas deratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** t de Student p<0,001.
CBA 11 semanas
ASTR/ort 7 11 15 semanas
B C D
CBA STR/ort0
50
100
150
200
250
***
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
7 11 150
50
100
150
*
***
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
F E
edad (semanas) 11 semanas de edad
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
124
Hemo oxigenasa-1 (HO-1)
Dado que posteriormente se empleará como tratamiento experimental un
potente inhibidor de la HO-1, la estaño protoporfirina IX (SnPP), se decidió
estudiar la expresión de dicho enzima en las rodillas de los ratones STR/ort y
CBA. Por tanto, se midió la expresión de HO-1 como marcador de estrés
oxidativo en la progresión de la artrosis en este modelo experimental.
De nuevo, este mediador se estudió por la técnica de western blot (fig 61)
y mediante inmunohistoquímica sobre tejido parafinado (fig 62).
La gráfica de la figura 61B muestra los valores del densitometrado de las
bandas de HO-1 obtenidas por western blot, normalizados respecto de los valores
de actina de cada muestra. Los niveles de HO-1 no parecen variar a lo largo del
proceso artrósico en ratones STR/ort. La comparación de los niveles del enzima
en rodillas de ratones CBA y STR/ort de 11 semanas de edad no denota ninguna
diferencia aunque sí que aparece una reducción significativa en la expresión de
HO-1 en las rodillas de ratones STR/ort de 7 y 15 semanas en comparación con
los niveles hallados en ratones CBA
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
125
11 7 11 15
cepa edad (semanas)
CBA STR/ort
Figura 61: Western blot para hemo oxigenasa 1 (HO-1) en fracción microsomal dehomogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades. A: Imagen delwestern blot para HO-1; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado alvalor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. * t de Student p<0,05; 11 semanas vs 7semanas.
edad (semanas)
11 7 11 150
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000CBASTR/ort
*
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
OI)
A
B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
126
Figura 61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemooxigenasa-1 (HO-1) en costes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotuliana de ratón CBA de 11 semanas de edad con un importante número de condrocitos positivos para HO-1; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con células marcadas frente HO-1; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con un número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para HO-1; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad con una importante erosión del cartílago pero prácticamente sin condrocitos positivos para HO-1. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 en rodillas de ratones STR/ort de diferentes edades. test de Student *** p<0,001; F: Comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 obtenidas en rodillas de ratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** test de Dunett p<0,001.
CBA 11 semanas
A
STR/ort 7 11 15 semanas
B C D
E
edad (semanas)
7 11 15
0102030405060708090
******
nºce
l pos
itiva
s H
O-1
F
11 semanas de edad
CBA STR/ort0
50
100
150
200
250
***nºce
l pos
itiva
s H
O-1
Figura 61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemooxigenasa-1 (HO-1) en costes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotuliana de ratón CBA de 11 semanas de edad con un importante número de condrocitos positivos para HO-1; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con células marcadas frente HO-1; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con un número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para HO-1; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad con una importante erosión del cartílago pero prácticamente sin condrocitos positivos para HO-1. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 en rodillas de ratones STR/ort de diferentes edades. test de Student *** p<0,001; F: Comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 obtenidas en rodillas de ratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** test de Dunett p<0,001.
CBA 11 semanas
A
CBA 11 semanasCBA 11 semanas
A
STR/ort 7 11 15 semanas
B C D
STR/ort 7 11 15 semanasSTR/ort 7 11 15 semanas
B C D
E
edad (semanas)
7 11 15
0102030405060708090
******
nºce
l pos
itiva
s H
O-1
E
edad (semanas)
7 11 15
0102030405060708090
******
nºce
l pos
itiva
s H
O-1
F
11 semanas de edad
CBA STR/ort0
50
100
150
200
250
***nºce
l pos
itiva
s H
O-1
F
11 semanas de edad
CBA STR/ort0
50
100
150
200
250
***nºce
l pos
itiva
s H
O-1
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort
127
Los resultados del
recuento de condrocitos
positivos para HO-1 de
la superficie del cartílago
articular no se
corresponde con los
resultados obtenidos con
la técnica del Western
blot. Esta diferencia se
podría explicar por el
hecho de que la mayor
parte de las células
positivas para HO-1 aparecen en la membrana sinovial, como muestra la figura 62
y, por tanto, no aparecen en el recuento de condrocitos positivos para este enzima.
MS
Figura 62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente HO-1 de rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad
MS
Figura 62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente HO-1 de rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
128
4.2.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069
El modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratones STR/ort ha
quedado validado por el estudio histológico y el estudio de niveles de
biomarcadores de degradación del cartílago y de mediadores inflamatorios. Por
tanto, dado que el modelo animal de artrosis es reproducible y presenta
características similares a las encontradas en la patología humana, nos propusimos
testar los posibles efectos de fármacos experimentales sobre la progresión de la
enfermedad.
Como ya se ha expuesto en el apartado de material y métodos, los
fármacos que nos dispusimos a estudiar son SnPP y BIS069. Los ratones STR/ort
se trataron diariamente durante 4 semanas con cada uno de los fármacos. SnPP se
administró intraperitonealmente a la dosis de 12 mg/kg/día en una suspensión
homogénea en 1% DMSO y BIS069 se administró por vía oral a 80 mg/kg/día
disuelto en agua. De nuevo se realizó el estudio histológico y el seguimiento de
sus posibles efectos sobre los biomarcadores de degradación del cartílago y sobre
los mediadores inflamatorios.
4.2.4.1 Evolución del peso de los animales
De igual forma que se procedió en el estudio de la progresión de la artrosis
en el modelo de desarrollo espontáneo de la enfermedad de los ratones STR/ort, se
realizó un seguimiento semanal de los pesos de los animales para evaluar la
influencia de los fármacos sobre el estado general de salud de los animales y se
observó que los animales tratados con SnPP presentaban un incremento del peso
levemente superior al de los animales sin tratar (fig. 63). Sin embargo, los ratones
tratados con BIS069 estabilizaron su peso sin presentar prácticamente incremento
a lo largo de las cuatro semanas que duró el tratamiento.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
129
4.2.4.2 Estudio radiológico
Las radiografías de las rodillas de los ratones STR/ort tratados con SnPP y
BIS069 (fig. 64) muestran unas articulaciones en un estadio más temprano de la
enfermedad. En el caso de los ratones tratados con SnPP no aparece dislocada la
articulación, pero sí desdibujada, denotando una degradación del cartílago
articular. En cambio la rodilla del ratón tratado con BIS069 no aparece dañada
aunque sí levemente dislocada.
7 8 9 10 1110
20
30
40
Controlpe
so (g
)
Edad (semanas)
7 8 9 10 1110
20
30
40
SnPP
peso
(g)
7 8 9 10 1110
20
30
40
BIS069
peso
(g)
Figura 63: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones STR/ort tras cuatrosemanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
130
Figura 64: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanasde edad tratados durante cuatro semanas con estaño protoporfirinaIX (SnPP) y BIS069. A: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas sintratar; B: rodilla de ratón STR/ort tratado con SnPP donde no parecedislocada la articulación aunque sí aparece levemente afectada lasuperficie articular; C: rodilla de STR/ort tratado con BIS069 y se observauna articulación exenta de características artrósicas a nivel radiológico.
STR/ort SnPP BIS069
B C
A
STR/ort 11
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
131
4.2.4.3 Estudio histológico
Se realizó el estudio histológico de las rodillas de los ratones STR/ort que
habían recibido los tratamientos con SnPP y BIS069, para evaluar los efectos de
estos fármacos sobre la degradación del cartílago en este modelo experimental. El
estudio histológico se llevó a cabo empleando el sistema de evaluación
histopatológico del cartílago descrito por la OARSI (fig. 65).
En las imágenes de los cortes histológicos teñidos con eosina/hematoxilina
de las rodillas de los animales tratados, observamos cómo la erosión de la
superficie del cartílago es menor (G1E2; P2) a la que se observa en la imagen del
ratón STR/ort control (G4E4; P16). Por tanto, a nivel histológico, tanto el
tratamiento con SnPP como con BIS069 parece estar protegiendo el cartílago
articular de la degradación articular observada en el modelo de artrosis espontánea
en ratones STR/ort.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
132
STR/ort SnPP BIS0690
10
20
Punt
uaci
ón (U
A)
Figura 65: Estudio histopatológico del cartílago de ratones STR/ort de 11 semanas deedad sometidos al tratamiento con SnPP y BIS069 durante 4 semanas. A: articulaciónfemororrotuliana de ratón STR/ort de 11 semanas de edad, donde se observa una importantedegradación del cartílago; B: rodilla de ratón STR/ort tras 4 semanas de tratamiento con SnPP;C: rodilla de ratón STR/ort tras 4 semanas de tratamiento con BIS069; D: puntuación obtenidatras el estudio de los cortes histológicos según el sistema de evaluación histopatológica de laOARSI.
STR/ort Control
A
B C
STR/ort SnPP BIS069
D
4 semanas de tratamiento
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
133
4.2.4.4 Estudio de biomarcadores
Proteína Oligomérica de la Matriz del Cartílago (COMP)
Dado que los estudios sobre la progresión de la artrosis en ratones STR/ort
mostraron unos niveles de COMP elevados respecto a los resultados obtenidos en
el suero de ratones CBA que no desarrollan artrosis y que su incremento se veía
aumentado con el tiempo, se procedió a estudiar los efectos de los fármacos sobre
los niveles de la proteína oligomérica del cartílago. Se compararon los niveles de
COMP de los ratones STR/ort tratados con los fármacos, con los niveles de
COMP de ratones STR/ort sin tratar de la misma edad (fig. 66).
edad (semanas)
Figura 66: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) ensuero de ratones STR/ort tratados y sin tratar con moléculas a estudio. Secompararon los niveles encontrados en sueros de ratones STR/ort a tres tiempos deltratamiento con los niveles correspondientes a los ratones STR/ort sin tratar. Media ± ε.
7 9 111.5
2.0
2.5CONTROLSnPPBIS069
U/L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
134
La medición se realizó en los sueros extraídos cada 2 semanas a lo largo de
las 4 semanas que duró el tratamiento. En la gráfica no se observa ningún efecto
significativo de los tratamientos sobre los niveles de COMP en suero, a ninguno
de los tiempos estudiados.
Metaloproteinasa 3 (MMP3)
También se estudiaron los efectos sobre los niveles de MMP3, que puede
ser un biomarcador de la progresión de la enfermedad en este modelo
experimental, a lo largo de las 4 semanas que duraron los tratamientos.
En el estudio, anteriormente mencionado, sobre la progresión de la artrosis
en ratones STR/ort se observó que los niveles de la MMP3 aparecían aumentados
las dos primeras semanas pero en la última semana los niveles se estabilizaban
(fig. 47). A tiempo 0 (7 semanas de edad), medimos los niveles basales de MMP3.
En la figura 67 podemos observar que a las 2 semanas de tratamiento (9 semanas
de edad) se observa una disminución en los niveles de esta proteína en suero para
los dos tratamientos. A las 4 semanas del tratamiento (11 semanas de edad) los
niveles del grupo control están muy reducidos y ya no se observan diferencias
significativas con los grupos tratados.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
135
Osteocalcina (OC)
Dado que los estudios sobre la progresión de la artrosis en ratones STR/ort
demostraron que dicho biomarcador se encontraba elevado en ratones que
desarrollan de forma espontánea la artrosis respecto de los niveles encontrados en
ratones que no presentan esta patología, se evaluaron los posibles efectos del
tratamiento con SnPP y BIS069 sobre los niveles de osteocalcina. Se compararon
los valores obtenidos en el suero de ratones STR/ort sin tratar de 11 semanas de
edad, con los obtenidos en los sueros de ratones tratados durante 4 semanas (fig.
68).
edad (semanas)
Figura 67: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Se compararon los sueros de ratones STR/ort sin tratar con los sueros de los ratones tratados durante cuatrosemanas a tres tiempos del desarrollo del experimento. Media ± ε. * test de student p<0,05; tratamientos vs control.
7 9 110.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
CONTROLSnPPBIS069
*
*
ng/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
136
Los resultados mostraron que el tratamiento con SnPP durante 4 semanas
disminuye significativamente los niveles en suero de osteocalcina respecto de los
ratones STR/ort de la misma edad que no fueron tratados. La administración de
BIS069 redujo los niveles de osteocalcina en ratones STR/ort pero no alcanzó
significación estadística.
4 semanas de tratamiento
Figura 68: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/orttratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatrosemanas. Se compararon los niveles de OC en los sueros de ratones STR/ort sintratar con los ratones tratados durante cuatro semanas con SnPP y BIS069. Media± ε. * test de student p<0,05; SnPP vs control.
CONTROL SnPP BIS0690
50000
100000
150000
200000
250000
*
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
137
Ligando del Receptor Activador del NF-κB (RANKL)
Como ya se ha mostrado, la evaluación de los niveles de RANKL en
ratones STR/ort en comparación con los encontrados en ratones CBA, libres de
padecer la patología de la artrosis, demostró que dicho parámetro se encontraba
alterado en animales enfermos. Por ello, se estudiaron también los efectos de los
tratamientos experimentales sobre los niveles de RANKL en el suero de ratones
STR/ort tras cuatro semanas de administración de las moléculas (fig. 69). Como
muestra la gráfica, no se observan variaciones en los niveles de RANKL en el
suero de ratones tratados con SnPP y BIS069 durante 4 semanas.
4 semanas de tratamiento
Figura 69: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort tratados conestaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas. Secompararon los niveles de RANKL en los sueros de ratones STR/ort sin tratarcon los tratados durante cuatro semanas con los fármacos a estudio. Media ± ε.
CONTROL SnPP BIS0690
25
50
75
100
125
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
138
4.2.4.5 Inflamación
También se evaluaron los posibles efectos de los tratamientos
experimentales sobre los mediadores inflamatorios implicados en el desarrollo de
la artrosis en ratones STR/ort.
Interleucina 1β (IL 1β)
Se midió la citocina proinflamatoria, IL 1β, tras haber finalizado el
tratamiento de los ratones STR/ort con los fármacos a estudio (fig 70), aunque
recordemos que en el estudio de los mediadores inflamatorios implicados en la
progresión de la artrosis en ratones STR/ort se observaron unos valores en los
4 semanas de tratamiento
Figura 70: Niveles de interleucina 1ß (IL 1ß) en el suero de ratones STR/orttratados durante 4 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Secompararon los niveles de IL 1ß en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanasde edad con los animales de la misma edad tras haber sido tratados con dichosfármacos. Media ± ε. ** t de Student p<0,01.
CONTROL SnPP BIS0690
1000
2000 **
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
139
ratones artrósicos inferiores a los de los ratones CBA (fig. 51).
En los resultados obtenidos tras los tratamientos observamos un
incremento significativo de los niveles de dicha citocina en el suero de ratones
STR/ort tras la administración de SnPP, recobrando valores similares a los
encontrados en el suero de ratones CBA de la misma edad. También se observó
un incremento, aunque en menor medida, de los niveles de IL 1ß en el suero de
ratones STR/ort tratados con BIS069.
Interleucina-17 (IL-17)
Se midieron por ELISA los niveles de la citocina proinflamatoria, IL-17,
en el suero de ratones tratados con las moléculas a estudio durante cuatro semanas
y se compararon con los niveles obtenidos en sueros de ratones STR/ort de la
misma edad que no habían sido tratados (fig. 71), con el fin de observar los
posibles efectos de los tratamientos sobre otro de los mediadores inflamatorios.
En los estudios sobre el desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort se
observó que los niveles de IL-17 aumentaban progresivamente con la evolución
de la enfermedad sugiriendo la participación de esta citocina en el proceso
inflamatorio relacionado con la progresión de la artrosis en ratones STR/ort. Los
resultados obtenidos demuestran una reducción importante de los niveles de la
citocina IL-17, provocada por ambos tratamientos. Por tanto, podríamos suponer
que los tratamientos en estudio reducirían el componente inflamatorio mediante la
intervención sobre la interleucina-17.
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
140
Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα )
También se estudiaron los efectos de estos fármacos sobre los niveles de
TNFα en el suero de los ratones STR/ort empleando la técnica de ELISA.
En la figura 72 se puede observar que ambos tratamientos provocan una
leve disminución de los niveles de esta citocina proinflamatoria tras el tratamiento
durante 4 semanas con BIS069, aunque no es significativa estadísticamente.
4 semanas de tratamiento
Figura 71: Niveles de interleucina 17 (IL 17) en el suero de ratones STR/orttratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Se compararon losniveles de IL 17 en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanas de edad con losratones STR/ort tratados durante cuatro semanas con los fármacos. Media ± ε.
CONTROL SnPP BIS0690
10
20
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
141
Prostaglandina E2 (PGE2)
La prostaglandina E2 se midió de nuevo por radioinmunoensayo en el
suero de ratones STR/ort tratados con los fármacos en estudio durante cuatro
semanas y en el suero de ratones STR/ort sin tratar de la misma edad (fig. 73), con
el fin de estudiar los posibles efectos de los tratamientos sobre la PGE2. En la
gráfica se observa como ninguno de los dos tratamientos es capaz de alterar los
niveles de PGE2 tras cuatro semanas de administración.
4 semanas de tratamiento
Figura 72: Niveles de Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα ) en el suero deratones STR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Secompararon los niveles de TNFα en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanasde edad con los ratones STR/ort tratados durante cuatro semanas con los fármacos.Media ± ε.
STR/ort SnPP BIS0690
100200300400500600700800
pg/m
l
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
142
Ciclooxigenasa 2 (COX-2)
El estudio de los niveles de la COX-2 se realizó por western blot a partir
de la fracción microsomal del homogeneizado de rodillas de ratones STR/ort, tras
haber recibido cuatro semanas de tratamiento con SnPP y BIS069. La figura 74
muestra los valores obtenidos del densitometrado de las bandas de COX-2
normalizados con los valores obtenidos del densitometrado de las bandas de
actina.
4 semanas de tratamiento
Figura 73: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durantecuatro semanas. Se compararon los niveles de PGE2 en los sueros de ratonesSTR/ort de 11 semanas de edad con los ratones de la misma edad tratados durantecuatro semanas con BIS069. Media ± ε.
CONTROL SnPP BIS0690
10
20
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
143
En la gráfica se observa cómo los niveles de COX-2 aparecen
significativamente aumentados en los valores obtenidos de las rodillas de ratones
STR/ort tratado con SnPP. Los valores de COX-2 tras el tratamiento con BIS069
se muestran levemente elevados respecto de los animales sin tratar. La
inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 75) no muestra diferencias significativas en
la expresión de la COX-2 tras ambos tratamientos.
Figura 74: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal dehomogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad tras 4semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagendel western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una veznormalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. ** test de studentp<0,01; SnPP vs control.
CBA CONTROL SnPP BIS0690
50010001500200025003000350040004500
**
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
OI)
CBA STR/ort SnPP BIS069
4 semanas de tratamiento
A
B
Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort
144
STR/ort SnPP BIS069
STR/ort Control
A
B C
Control SnPP BIS0690
25
50
75
100
nº c
el p
ositi
vas
CO
X-2
D
4 semanas de tratamiento
Figura 75: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) encortes histológicos de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad tras haberrecibido 4 semanas de tratamiento con SnPP y BIS069. A: articulación femororrotuliana deun ratón STR/ort control donde se observan los condrocitos positivos frente a COX-2; B: rodillade ratón STR/ort de tras la administración de SnPP durante 4 semanas con gran número decondrocitos positivos para COX-2; C: rodilla de ratón STR/ort tras el tratamiento con BIS069durante 4 semanas con un menor número de condrocitos del cartílago articular marcados paraCOX-2; D: comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2en rodillas de ratones STR/ort sin tratar y tratados.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
145
4.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN
DEL LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR (ACLT)
4.3.1. Degradación articular
En el modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en
rata Wistar, estudiamos la progresión de la artrosis desde el tiempo 0 del
experimento (24 horas postcirugía) hasta 10 semanas tras la cirugía. Como en los
anteriores modelos, realizaremos un estudio histológico inicial que
complementaremos con la medición de biomarcadores de degradación articular y
de mediadores inflamatorios. En este caso estudiaremos únicamente la
articulación femorotibial y no la femororrotuliana, ya que es la articulación más
afectada por la transección del ligamento cruzado anterior que une y estabiliza el
fémur y la tibia.
Tras el sacrificio de los animales, algunas rodillas se intervinieron
quirúrgicamente para separar el fémur y la tibia con la precaución de no afectar
las superficies de cartílago articular. Tanto los cóndilos femorales como el platillo
tibial de rodillas sin operar y de rodillas sometidas a la transección del ligamento
cruzado anterior, se fotografiaron para obtener una primera información del estado
de la rodilla tras las 10 semanas que duró el estudio de la progresión de la artrosis
en este modelo experimental
Las rodillas izquierdas, que permanecieron intactas en las ratas Wistar a las que se
les practicó la ACLT se fotografiaron (fig. 76) y se pudo observar que las
superficies del cartílago articular de los cóndilos femorales se presentan libres de
erosión y con un aspecto brillante. El platillo tibial también aparece intacto, así
como el ligamento cruzado anterior que no ha sido seccionado, que presenta un
color brillante nacarado.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
146
La fotografía de la rodilla sometida a la transección del ligamento cruzado
anterior 10 semanas después de la cirugía (fig. 77), muestra una erosión del
cartílago en la zona medial de los cóndilos femorales que aparece como una
pérdida de la coloración nacarada del cartílago articular. Además, en el platillo
tibial (fig 77B y C) se observa una pérdida del brillo del cartílago articular,
probablemente por la pérdida de componentes de la matriz extracelular y destacan
dos nuevas formaciones de distinta coloración en la región medial de ambos
platillos que, observadas a más aumentos (fig. 77C) son tridimensionales. Estas
formaciones podrían ser osteofitos similares a los encontrados en la artrosis
humana para estabilizar la articulación.
Figura 76: Fotografías de rodillas de rata Wistar sana realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A, B:las imágenes muestran las superficies de los cóndilos femorales y del platillo tibial intactos. El ligamento cruzado anterior aparece señalado con * y se puede apreciar el brillo nacarado característico del ligamento sano en B.
FÉMUR TIBIA
*
BA
Figura 76: Fotografías de rodillas de rata Wistar sana realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A, B:las imágenes muestran las superficies de los cóndilos femorales y del platillo tibial intactos. El ligamento cruzado anterior aparece señalado con * y se puede apreciar el brillo nacarado característico del ligamento sano en B.
FÉMUR TIBIA
*
BA
FÉMUR TIBIA
*
BA
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
147
4.3.1.1 Estudio radiológico
Las rodillas de ratas Wistar sometidas a las transección del ligamento
cruzado anterior fueron radiografiadas para poder evaluar a nivel macroscópico el
daño producido por el desarrollo de la artrosis en este modelo experimental. En la
A
Figura 77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A: fotografía de los cóndilos femorales donde aparece en la superficie de la zona medial del cóndilo una leve erosión del cartílago. En el platillo tibial aparecen dos formaciones nuevas de cartílago (B) que, observadas a más aumentos (C) se asemejan a los osteofitos característicos en la artrosis humana. El ligamento cruzado anterior (*) aparece cicatrizado y contraído.
*
B
C
A
Figura 77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A: fotografía de los cóndilos femorales donde aparece en la superficie de la zona medial del cóndilo una leve erosión del cartílago. En el platillo tibial aparecen dos formaciones nuevas de cartílago (B) que, observadas a más aumentos (C) se asemejan a los osteofitos característicos en la artrosis humana. El ligamento cruzado anterior (*) aparece cicatrizado y contraído.
*
B
C
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
148
figura 78 observamos la rodilla de una rata Wistar sin haber sido intervenida, que
presenta perfectamente delimitadas las superficies articulares. Sin embargo, 24 h
tras la transección del ligamento cruzado anterior (tiempo 0) se observa una
importante sinovitis, como respuesta a la agresión mecánica a la que se le ha
sometido. Transcurridas 6 semanas de la cirugía, la sinovitis ha remitido
parcialmente pero las superficies de los cóndilos femorales aparecen erosionadas
de forma importante y la articulación se encuentra levemente dislocada. La
imagen radiográfica de una rodilla típicamente artrósica es la correspondiente a la
rodilla operada de ACLT 10 semanas postcirugía. La hendidura entre los cóndilos
femorales y el platillo tibial prácticamente ha desaparecido, denotando la pérdida
de gran parte del cartílago. Además, se pueden observar formaciones osificadas
coherentes con osteofitos.
0 6 10
10
AC
LT
si
n op
erar
Figura 78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia.En las radiografías se observa una rodilla intacta en el caso de la rodilla de rata Wistar sin operar 10 semanas tras el inicio del estudio y cómo las rodillas operadas sufren un progresivo deterioro con el paso de las semanas.
0 6 10
10
AC
LT
si
n op
erar
0 6 10
10
AC
LT
si
n op
erar
Figura 78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia.En las radiografías se observa una rodilla intacta en el caso de la rodilla de rata Wistar sin operar 10 semanas tras el inicio del estudio y cómo las rodillas operadas sufren un progresivo deterioro con el paso de las semanas.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
149
4.3.1.2 Estudio histológico
Compararemos el grado de afectación de la articulación femorotibial
operada, con el estado de la rodilla contralateral que mantiene el ligamento
cruzado anterior intacto. Para ello realizaremos el estudio histopatológico
siguiendo las indicaciones de la OARSI.
4.3.1.2.1 Tinciones químicas
Las rodillas de rata Wistar sometidas a la ACLT muestran, como cabría
esperar, transcurridas 24 horas de la operación, el ligamento cruzado anterior
seccionado completamente y contraído formando una cicatriz (fig. 79) rica en
infiltrado leucocitario. En las articulaciones femorotibiales de todos los
ejemplares estudiados, aparece la membrana sinovial desarrollada y con un
importante infiltrado inflamatorio, como respuesta a la agresión que supone la
cirugía (fig. 80).
Por el contrario, la intervención desestabilizadora que supone el cercenar
el ligamento cruzado anterior, que a las 24 horas ha provocado una respuesta
inflamatoria importante, no ha afectado a las superficies del cartílago articular,
como muestra la figura 81. Estos datos sugieren que la desestabilización de la
articulación femorotibial provoca la erosión del cartílago articular a lo largo del
tiempo y no como causa de la manipulación quirúrgica. En las micrografías de la
figura 81 no se observa ni erosión de la superficie del cartílago ni una pérdida de
proteoglicanos de éste. Por tanto, concluimos que a tiempo 0 del estudio las
rodillas de rata Wistar no presentan las características propias de la degradación
articular que conlleva la artrosis.
A las 6 semanas de la intervención se sacrifica otro grupo de ratas Wistar
como se explicó en el apartado de Material y métodos, y se realiza el estudio
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
150
histológico de dichas rodillas. Se observa la progresiva degradación del cartílago
articular y un aumento en la erosión de las superficies articulares que se hacen
TIBIA
FÉMUR
ACL
*
TIBIA
FÉMUR
ACL*
A B
Figura 79: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) y O-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior (ACL) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0). En ambasmicrografías se observa el ligamento cruzado anterior seccionado y contraido formando unacicatriz. También se puede observar la membrana sinovial (*) con infiltrado leucocitario.
ACL
TIBIA
FÉMUR
MS
A
ACL
TIBIA
FÉMUR
MS
B
Figura 80: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) y O-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior (ACL) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0). Se puedeobservar el ligamento cruzado anterior seccionado y la membrana sinovial (MS) másdesarrollada y con un infiltrado leucocitario notable, coherente con una sinovitis.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
151
mucho más patentes al final del estudio, cuando han transcurrido 10 semanas
desde la transección del ligamento cruzado anterior.
A tiempo final del estudio de la evolución de la artrosis en el modelo de
ACLT en rata Wistar, observamos (fig. 82) la cicatriz tibial dejada por el corte del
ligamento que unía la tibia y el fémur levemente reducida, y una membrana
sinovial ampliamente desarrollada, aunque con menor infiltrado inflamatorio que
a las 24 horas de la cirugía. También observamos el menisco medial gravemente
afectado por la erosión provocada por la desestabilización de la articulación
femorotibial, que implica no sólo la pérdida de proteoglicanos de la matriz
extracelular del cartílago, como muestra el cambio de coloración en la tinción con
O-safranina, sino la erosión de la superficie con una importante pérdida de
condrocitos.
Figura 81: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) yO-safranina (B) de los cóndilos femorales de rodillas de rata Wistar sometidas a latransección del ligamento cruzado anterior y sacrificadas 24 horas tras la cirugía(tiempo 0). En la micrografía A no se observa ninguna agresión de la capa más superficialdel cartílago articular ni pérdida de células y en la tinción con safranina no se observacambios de coloración del cartílago articular debidos a la pérdida de componentes de lamatriz extracelular.
BA
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
152
Las rodillas sometidas a la operación simulada donde únicamente se les
realizaban las incisiones pero sin seccionar el ligamento cruzado anterior, no
mostraron ningún tipo de alteración de la articulación, ni degradación del cartílago
articular. Sin embargo, sí presentaron una inflamación de la membrana sinovial
similar a la encontrada en los animales operados, probablemente como respuesta
inflamatoria a la agresión quirúrgica.
Hay que prestar una especial atención a los cambios histopatológicos que
sufre la membrana sinovial, a lo largo de la progresión de la artrosis en el modelo
que en este apartado estudiamos. La membrana sinovial, como ya hemos descrito
anteriormente, a las 24 horas de la intervención, aparece ampliamente desarrollada
y rica en infiltrado. Es decir, presenta características más propias de una sinovitis
que de un proceso artrósico. En cambio, al final del estudio la membrana sinovial
Figura 82: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) yO-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior y sacrificadas 10 semanas tras la cirugía. En las micrografías seobservan lesiones en el cartílago articular del menisco medial (MM) y del platillo tibial,además de la membrana sinovial (MS) ampliamente desarrollada y vascularizada.Trancurridas 10 semanas desde la cirugía se distingue claramente la cicatriz formada en ellugar de inserción del ligamento cruzado anterior (*).
MM
MS
TIBIAA
MM MS
TIBIA B
* *
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
153
se observa inflamada aunque no en el grado que presentaba inicialmente, teniendo
un aspecto más coherente con la artrosis descrita en humanos.
Otro hecho a destacar es el incremento de la vascularización de la
membrana en los tiempos finales del experimento. Como muestra la figura 83, la
aparición de vasos en todas las membranas sinoviales de ratas Wistar estudiadas
es abundante en número y todos ellos presentan un calibre considerable. La
membrana sinovial ampliamente vascularizada puede ser la respuesta a una
inflamación crónica, como es el proceso degradativo que conlleva la artrosis.
Como ya se expuso en la introducción, la degradación del cartílago
articular produce la liberación de gran cantidad de componentes de la matriz
extracelular y restos celulares que activan el proceso inflamatorio de la membrana
sinovial. Por tanto, en el modelo de artrosis provocada por la transección del
ligamento cruzado anterior, se observa no sólo la degradación del cartílago
articular propia de la artrosis sino la progresión que sigue la membrana sinovial en
la patología que intenta representar este modelo.
*
*
*
*
*
Figura 83: Fotografía de corte parafinadoteñido con eosina/hematoxilina de lamembrana sinovial de una rodilla de rataWistar sometida a ACLT transcurridas 10semanas desde la cirugía. En la imagen seobserva, además del infiltrado linfocitario, unincremento de la vascularización (*) de lamembrana sinovial.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
154
En este modelo también se realizó la evaluación histopatológica definida
por la OARSI de las rodillas sometidas a ACLT y se comparó la puntuación con
la obtenida de rodillas sin operar (fig. 84).
Las puntuaciones obtenidas a lo largo de la progresión de la enfermedad en
las articulaciones sometidas a ACLT demostraron que este modelo experimental
desarrolla una degradación articular similar a la artrosis humana.
Además, este modelo posee un desarrollo de la patología en todas las
rodillas operadas y con la suficiente gravedad como para poder evaluar la
progresión de la artrosis. Por todo lo expuesto anteriormente, consideramos que
este modelo era adecuado para realizar el estudio de la evaluación de los posibles
efectos de fármacos experimentales para el tratamiento de la artrosis.
0 2 4 6 8 100
10
20Sin operarOperada
Punt
uaci
ón (U
A)
Semanas tras la cirugía
0 2 4 6 8 100
10
20Sin operarOperada
Punt
uaci
ón (U
A)
Semanas tras la cirugía
Figura 84: Puntuación del estudio histopatológico según los criterios de la OARSI de las articulaciones de las ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
155
4.3.2. Estudio de biomarcadores
Con el fin de evaluar el progreso de la degradación articular, tras la
transección quirúrgica del ligamento cruzado anterior, además de realizarse el
estudio histológico e inmunohistoquímico, se midieron en suero los niveles de
biomarcadores de degradación del cartílago, como son el C-telopéptido del
colágeno tipo II (CTX-II), la proteína oligomérica de la matriz del cartílago
(COMP) y el ácido hialurónico (HA). Estos biomarcadores pueden ayudar a
determinar las similitudes de este proceso experimental con la degradación
articular desarrollada en humanos.
C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II)
Para medir los niveles del C-telopéptido del colágeno tipo II en el suero de
rata Wistar se utilizó el ELISA comercial de Cartilaps®, siguiendo las
indicaciones del fabricante.
Se cuantificaron los fragmentos resultantes de la degradación del colágeno
tipo II en el suero de animales a tiempo 0 del experimento, es decir, 24 horas tras
haber sido sometidos a la cirugía y a las 6 y 10 semanas postcirugía.
En los resultados obtenidos (fig. 85) se observa un aumento progresivo de
los niveles de CTX-II, que indican un aumento de la degradación del cartílago
articular con el paso del tiempo. A las 10 semanas tras la cirugía, el incremento de
los niveles del biomarcador es significativo respecto de los animales recién
operados, que representarían nuestras condiciones iniciales del experimento. Estos
datos, coherentes con la degradación del cartílago observada en el estudio
histológico, demuestran que el modelo de artrosis provocada por la transección
del ligamento cruzado anterior presenta incrementos en los niveles del
biomarcador CTX-II similares a los descritos en la patología humana.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
156
Proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP)
Otro de los biomarcadores de gran importancia que se midieron en el
presente estudio fue la proteína oligomérica de la matriz del cartílago. Esta
medición se realizó en suero con un ELISA comercial de MDbiosciences,
siguiendo las indicaciones del fabricante.
De nuevo, se compararon los niveles obtenidos en ratas Wistar a tiempo 0
del experimento (24 h tras la cirugía) con los obtenidos en suero de ratas
sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior 6 ó 10 semanas tras la
cirugía (fig. 86).
Figura 85: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en elsuero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se compararon los niveles presentes a las 24h (tiempo 0) de la cirugía conlos obtenidos a las 6 y 10 semanas de la transección. Media ± ε * test de Dunett p<0,05; 10 semanas postcirugía vs tiempo 0
Semanas postcirugía
0 6 100
10
20
30
40
50
60
70 *
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
157
Los resultados mostraron un incremento significativo a las 6 semanas tras
la cirugía en comparación con los niveles obtenidos 24 h después de la cirugía.
Dichos niveles se mantuvieron elevados transcurridas 10 semanas del inicio del
experimento, de forma significativa respecto de los niveles obtenidos a las 6
semanas. Los resultados demuestran que la transección del ligamento cruzado
anterior provoca una degradación de la matriz del cartílago articular que puede ser
seguida mediante la determinación de los niveles séricos de COMP, de forma
similar a la descrita en la artrosis humana, aunque los niveles medidos son muy
reducidos.
Figura 86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles en suero a tiempo 0 (24h tras la cirugía) con los niveles a las 6 ó 10 semanas de la cirugía.Media ± ε. ** Test de Dunett. p<0,001; 6 y 10 semanas postcirugía vs tiempo 0.
Semanas postcirugía
0 6 100.000.050.100.150.200.250.300.350.40
* ** *ng
/mL
Figura 86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles en suero a tiempo 0 (24h tras la cirugía) con los niveles a las 6 ó 10 semanas de la cirugía.Media ± ε. ** Test de Dunett. p<0,001; 6 y 10 semanas postcirugía vs tiempo 0.
Semanas postcirugía
0 6 100.000.050.100.150.200.250.300.350.40
* ** *ng
/mL
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
158
Ácido hialurónico (HA)
En el suero de ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado
anterior también se midieron los niveles de ácido hialurónico, componente de gran
importancia en el cartílago, con un ELISA comercial de Echelon biosciences.
Los valores de HA obtenidos en sueros de ratas Wistar sometidas a la
ACLT (fig. 87) no presentan ninguna modificación por la progresión de la
enfermedad, siendo los valores muy similares al principio y al final del estudio.
4.3.3 Inflamación
Como ya se ha observado en el estudio histológico de la progresión de la
enfermedad en el modelo de artrosis producida por la transección del ligamento
Figura 87: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Secompararon los sueros a las 24h de la cirugía (tiempo 0) con los niveles obtenidos alas 6 y 10 semanas tras la ACLT. Media ± ε.
Semanas postcirugía
0 6 100
1000
2000
3000
ng/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
159
cruzado anterior en rata Wistar, el componente inflamatorio está presente desde
las 24 horas posteriores a la cirugía. Destacan la sinovitis y el importante
infiltrado leucocitario que aparece inmediatamente tras la sección del ligamento.
Por tanto, creímos conveniente realizar un estudio de los principales
mediadores inflamatorios.
Interleucina-1β (IL-1β)
Dado que los niveles de IL-1β eran indetectables por la técnica de ELISA
en el suero de las ratas Wistar operadas de ACLT, se optó por medir los niveles de
IL-1β en el homogenado de tejidos de la articulación de la pata. De esta forma se
compararon los niveles obtenidos en homogenado de patas sin operar, patas
sometidas a la operación simulada y las patas operadas de ACLT (fig. 88).
En la gráfica podemos observar cómo existe un aumento importante de los
niveles de IL-1β local en las patas sometidas a la ACLT respecto de aquellas sin
operar. Es de destacar el caso de las rodillas sometidas a la operación simulada
que presentan niveles elevados de IL-1β aún transcurridas 10 semanas de la
operación. En la cirugía simulada, únicamente se accedía a la cápsula articular sin
seccionar el ligamento cruzado anterior, por tanto la inflamación que representan
los niveles de IL-1β locales elevados corresponden a la agresión que puede
suponer la manipulación quirúrgica y no el proceso degradativo que conlleva el
cercenar el ligamento cruzado anterior.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
160
Figura 88: Niveles de IL-1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar con las sometidas a una operación simulada ylas sometidas a la ACLT transcurridas 10 semanas de la ACLT. Media ± ε. * test de Dunnett p<0,05; operada vs sin operar.
sin opera
r
operació
n simulad
a
operada
0
100
200
300
400
500
600
700 *pg
/mL
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
161
Factor de Necrosis Tumoral α (TNF α)
Los niveles de TNFα se midieron por la técnica de ELISA tanto en suero
(fig. 89 ) como en homogeneizado de rodilla de rata Wistar (fig. 90).
En la medición de los niveles en suero se compararon los valores
obtenidos a las 24 horas de la intervención (tiempo 0) con los obtenidos a las 6 y
10 semanas tras la ACLT .
En la gráfica podemos observar cómo el proceso inflamatorio relacionado
con el desarrollo de la artrosis, en el modelo de transección del ligamento cruzado
anterior en rata Wistar, no se corresponde con aumentos en los niveles séricos de
Figura 89: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar sometidas a la transeccióndel ligamento cruzado anterior (ACLT). Se comparan entre los niveles obtenidosen ratas a tiempo 0 (24h tras la transección) con los niveles obtenidos 6 ó 10 semanaspostcirugía. Media ± ε.
Semanas postcirugía
0 6 100
100
200
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
162
TNFα , no observándose ninguna diferencia entre los resultados obtenidos a las
24 horas de la cirugía y los correspondientes a ratas tras 10 semanas de la ACLT.
En la medida de los niveles de TNFα en homogeneizado de pata se
compararon los niveles presentes en las patas operadas con los niveles en las patas
sometidas a la cirugía simulada y las patas no operadas (fig. 90 ).
A diferencia de lo observado en suero, los niveles locales de TNFα sí
presentan un leve incremento, no significativo, de los niveles en patas de ratas
operadas tras 10 semanas de desarrollo de la artrosis.
Figura 90: Niveles de TNFα en homogenado de patas de ratas Wistartranscurridas 10 semanas desde la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se compararon los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar, sometidasa una operación simulada y las sometidas a la ACLT. Media ± ε.
sin opera
r
operació
n simulad
a
operada
0100200300400500600700800900
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
163
Interleucina-17 (IL-17)
Dado que la citocina proinflamatoria IL-17 parece estar implicada en el
desarrollo del proceso inflamatorio en la artrosis, estudiamos los cambios en los
niveles de esta citocina durante la progresión de la artrosis en este modelo
experimental. Para su cuantificación se utilizó la técnica de ELISA y se empleó un
kit comercial de eBiosciences, siguiendo las indicaciones del fabricante.
En el suero de los animales no hubo niveles detectables ni a las 6 ni a las
10 semanas. Por tanto, se muestran los resultados obtenidos a nivel local en
Figura 91: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistartranscurridas 10 semanas de la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se han comparado los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar,sometidas a una operación simulada y las sometidas a la ACLT. Media ± ε. * test deDunnett p<0,05; operada vs sin operar.
sin opera
r
operació
n simulad
a
operada
0
10
20
30 *
pg/m
l
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
164
Figura 92: Niveles de IL-6 en suero de ratas Wistar sometidas a latransección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon losniveles obtenidos a diferentes tiempos tras la cirugía para estudiar loscambios en los niveles de IL-6 a lo largo de la progresión de la artrosis.Media ± ε.
Semanas postcirugía
0 6 100
100
200
300
400
500
600
700
pg/m
l
homogeneizado de rodillas de rata Wistar, transcurridas las 10 semanas que duró
el estudio de la progresión de la artrosis (fig. 91). Se observó que los niveles
aumentaban levemente en las rodillas sometidas a la operación simulada, mientras
que el incremento de la citocina proinflamatoria en las rodillas ACLT era
aproximadamente del 100% respecto de los niveles presentes en las rodillas sin
operar.
Interleucina-6 (IL-6)
La IL-6 también parece estar implicada en la inflamación asociada a la
progresión de la artrosis, por tanto nos dispusimos a medirla tanto a nivel
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
165
sistémico (suero) como local (homogeneizado de pata), empleando un ELISA
comercial de Peprotech.
En el estudio de IL-6 en suero (fig. 92), observamos cómo los niveles
aumentan progresivamente desde los presentes en animales 24 horas tras la
cirugía hasta 10 semanas después. Estos resultados confirman la presencia del
proceso inflamatorio subyacente a la degradación articular, inducido en este
modelo experimental.
Los niveles obtenidos a nivel local (fig. 93) demuestran que tanto la
cirugía simulada como la ACLT inducen un incremento significativo de los
Figura 93: Niveles de IL-6 en homogeneizado de patas de ratas Wistar transcurridas 10 semanas de la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles de la citocina en patas de ratas sin operar con los presentes en rodillas sometidasa la operación simulada y a la ACLT. Media ± ε. ** test de Dunnett p<0,01; op. simulada y operada vs sin operar.
sin opera
r
operació
n simulad
a
operada
0
250
500
750 ** **
pg/m
l
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
166
niveles de IL-6 respecto de la rodilla sin intervenir. Lo que indicaría que la
intervención quirúrgica, y no la transección del ligamento cruzado anterior estaría
induciendo la respuesta inflamatoria mediada por la IL-6.
Prostaglandina E2 (PGE2)
Los niveles de PGE2 se midieron por radioinmunoensayo. En primer lugar
se estudió en el suero de ratas Wistar, para comparar los valores presentes en
suero a las 24 horas de la cirugía, 6 semanas ó 10 semanas tras la transección del
ligamento cruzado anterior (fig. 94). En la gráfica observamos cómo, desde un
nivel basal, a las 24 horas de la intervención, los niveles de PGE2 aumentan
Figura 94: Niveles de prostagladina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Secompararon los sueros de ratas a tiempo 0 (24h tras la ACLT) con ratas operadastras 6 ó 10 semanas de la intervención. Media ± ε. test de Dunnett p<0,05; * 6 y10 semanas vs tiempo 0; # 10 semanas vs 6 semanas
Semanas postcirugía
0 6 100
100
200
*
#*
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
167
progresivamente con el paso del tiempo y la progresión de la enfermedad. Los
niveles de PGE2 que aparecen a las 10 semanas de la transección del ligamento
cruzado anterior son significativamente mayores que los que encontramos a
tiempo 0 y a las 6 semanas.
Cuantificamos también los niveles de PGE2 en el homogeneizado de
rodillas de rata Wistar para estudiar los efectos de la ACLT a nivel local (fig. 95).
En la gráfica observamos el nivel basal de PGE2 correspondiente a las
patas sin operar y cómo este nivel se ve levemente incrementado por la operación
simulada, donde aparece una leve respuesta inflamatoria. Es de destacar el
importante aumento de PGE2 en las patas sometidas a la ACLT respecto de las
rodillas intactas.
Figura 95: Niveles de prostagladina E2 (PGE2) en los homogeneizados derodillas de ratas Wistar transcurridas 10 semanas de la transección delligamento cruzado anterior (ACLT). Se observa un incremento de los niveles deprostaglandina local en las rodillas sometidas a la ACLT en comparación con lasrodillas sin operar. Media ± ε.
sin opera
r
operacio
n simulad
a
operada
0
10
20
30
40
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
168
Ciclooxigenasa 2 (COX-2)
Los niveles locales de COX-2 se midieron los homogeneizados de patas de
rata Wistar por las técnicas de Western blot y en cortes histológicos de la
articulación femorotibial por inmunohistoquímica.
Los resultados del western blot se presentan en la figura 96A. Los valores
del densitometrado de las bandas se normalizaron frente a la densidad óptica
obtenida de la banda de actina (fig. 96B). En la gráfica podemos observar que los
niveles basales de COX-2 no parecen aumentar tras la operación simulada,
mientras que aparece un incremento muy significativo en los niveles de COX-2 10
semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior.
La inmunohistoquímica para COX-2 corroboró los resultados obtenidos
por western blot (fig. 97). El número de condrocitos positivos en la superficie del
cartílago articular fue significativamente mayor en las articulaciones sometidas a
operación simulada y las sometidas a la transección del ligamento cruzado
anterior que en el cartílago de rodillas sin operar.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
169
Sin op. Sim operada
A
B
sin operar simulada operada0
50
100
150 **
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(IO
D)
10 semanas tras la operación
Figura 96: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de homogeneizado de pata de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Transcurridas las 10 semanas tras la cirugía, los niveles de COX-2 han aumentado significativamente. ** test de Dunett p<0,01.
Sin op. Sim operada
A
B
sin operar simulada operada0
50
100
150 **
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(IO
D)
10 semanas tras la operación
Sin op. Sim operada Sin op. Sim operada
A
B
A
B
sin operar simulada operada0
50
100
150 **
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(IO
D)
10 semanas tras la operación
Figura 96: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de homogeneizado de pata de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Transcurridas las 10 semanas tras la cirugía, los niveles de COX-2 han aumentado significativamente. ** test de Dunett p<0,01.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
170
Operada
Sin operar Operación simulada
A
B C
sin operar op simulada operada0
25
50
75
100
****
**
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
10 tras la cirugía
Figura 97: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata Wistas sin operar; C: rodilla de rata sometida a una operación simulada; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas de ratas Wistar . * test de Dunett p<0,05; ** test de Dunett p<0,01.
Operada
Sin operar Operación simulada
A
B C
sin operar op simulada operada0
25
50
75
100
****
**
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
10 tras la cirugía
Operada
Sin operar Operación simulada
A
B C
sin operar op simulada operada0
25
50
75
100
****
**
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
Operada
Sin operar Operación simulada
Operada Operada
Sin operar Operación simuladaSin operar Operación simulada
A
B C
sin operar op simulada operada0
25
50
75
100
****
**
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
sin operar op simulada operada0
25
50
75
100
****
**
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
10 tras la cirugía
Figura 97: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata Wistas sin operar; C: rodilla de rata sometida a una operación simulada; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas de ratas Wistar . * test de Dunett p<0,05; ** test de Dunett p<0,01.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
171
4.3.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069
Según el estudio histológico anteriormente expuesto y el análisis de
biomarcadores de la degradación del cartílago, el modelo de artrosis provocada
por la transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar puede ser un
modelo apto para el estudio de nuevos posibles tratamientos de la enfermedad.
Por tanto, nos dispusimos a testar los fármacos estudiados anteriormente
en el modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratones STR/ort, en el
presente modelo experimental de artrosis.
4.3.4.1 Evolución del peso de los animales
Para evaluar los efectos de los fármacos sobre la salud de los animales,
éstos fueron pesados semanalmente a lo largo de las diez semanas que duró el
tratamiento (fig. 98) y se comprobó que ninguno de los dos tratamientos estaba
afectando el estado de salud de las ratas operadas de ACLT, ya que presentan un
incremento de pesos similar a las ratas control.
4.3.4.2 Estudio radiológico
Los posibles efectos de los tratamientos con SnPP y BIS069 a nivel
macroscópico se evaluaron mediante estudio radiográfico (fig. 99). Las imágenes
de rodillas de ratas control muestran erosionada la superficie del cartílago
articular, tanto de los cóndilos femorales como del platillo tibial y una importante
sinovitis. Las rodillas de ratas tratadas con SnPP muestran erosionada la superficie
de los cóndilos femorales, aunque en menor medida que en las rodillas control y
no están presentes los signos de sinovitis. En la rodilla de las ratas tratadas con
BIS069 resalta la sinovitis, pero la degradación del cartílago articular es
significativamente menor que en la rodilla de las ratas sometidas a ACLT control.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
172
Semanas de tratamiento
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400Control
peso
(g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400SnPP
peso
(g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400BIS069
peso
(g)
Figura 98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas.
Semanas de tratamiento
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400Control
peso
(g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400SnPP
peso
(g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9200
300
400BIS069
peso
(g)
Figura 98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
173
4.3.4.3 Estudio histológico
Para evaluar los posibles efectos de los fármacos SnPP y BIS069, tras las
10 semanas de tratamiento se realizó un estudio histológico de las articulaciones.
En la figura 100 observamos las imágenes de cortes histológicos de
rodillas sometidas a ACLT. La figura 100A muestra la articulación femorotibial
de una rata control (sin tratamiento) con una importante erosión del cartílago
articular (G5E3; P15) a las 10 semanas de iniciar el estudio.
Los cortes de rodillas operadas tras las 10 semanas de tratamiento
demuestran una menor puntuación en la evaluación de la OARSI. Tras la
administración de SnPP (fig. 100B) el cartílago no presenta erosión del cartílago y
posee los condrocitos superficiales intactos (G1E1; P1).
Control SnPP BIS069
Figura 99: Radiografías de rodillas de rata Wistar 10 semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas conestaño protoporfirina IX (snPP) y BIS069.
Control SnPP BIS069Control SnPP BIS069
Figura 99: Radiografías de rodillas de rata Wistar 10 semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas conestaño protoporfirina IX (snPP) y BIS069.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
174
ACLT SnPP BIS069
Control SnPP BIS0690
10
20
Punt
uaci
ón (U
A)
ACLT Control
A
B C
D
4 semanas de tratamiento
Figura 100: Evaluación histopatológica del cartílago articular según los criterios de la OARSI de rodillas de ratas Wistar sometidas a ACLT.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
175
Aunque el sistema de evaluación de la OARSI no recoja este parámetro, es
de destacar también la presencia de sinovitis. Además, los animales tratados
presentan una importante reducción de la sinovitis que se observa en los animales
control.
En cambio, los animales que han sido tratados con BIS069 (fig. 100C)
presentan pequeñas fisuras en el cartílago con pérdida de algunos condrocitos
superficiales (G2E3; P6), y la disminución de la sinovitis es muy leve tras el
tratamiento. En la gráfica (fig. 100D) observamos la importante disminución entre
la puntuación del cartílago control y el cartílago procedente de animales que han
recibido los tratamientos.
4.3.4.4 Estudio de biomarcadores
Dado que el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo
experimental de artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado en
rata Wistar presentó modificaciones evaluables de diversos biomarcadores de
degradación del cartílago, se procedió a medir los posibles cambios en los niveles
de éstos para conocer la implicación de los fármacos que se han testado y así
evaluar los efectos de dichos tratamientos sobre la progresión de la enfermedad.
C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II)
Un parámetro de gran importancia para evaluar los posibles efectos
protectores de la SnPP y el BIS069 es el C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-
II), ya que es un marcador de la degradación del colágeno tipo II presente en el
cartílago articular. Por ello nos planteamos medir los niveles de CTX-II en el
suero de las ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
176
(control) y compararlo con los animales tratados (fig. 101). Para su medición se
empleó un ELISA de Cartilaps, según indicaba el fabricante.
En el estudio de la progresión de la artrosis en este modelo, el CTX-II
resultó ser un buen indicador de la degradación articular, con valores que
aumentan en relación con la progresión de la enfermedad (fig. 85). En la gráfica
podemos observar cómo únicamente el SnPP reduce significativamente los
niveles de CTX-II en suero tras 10 semanas de tratamiento, mientras que el
BIS069 no parece estar protegiendo al cartílago de su pérdida de colágeno.
10 semanas de tratamiento
Figura 101: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los sueros de las ratas control 10 semanas tras la cirugía. Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.
Control SnPP BIS0690
10
20
30
40
50
60
70
* *pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 101: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los sueros de las ratas control 10 semanas tras la cirugía. Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.
Control SnPP BIS0690
10
20
30
40
50
60
70
* *pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
177
Proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP)
Para medir los niveles de COMP en el suero de rata se utilizó un ELISA
comercial. La proteína oligomérica de la matriz del cartílago, en este modelo
animal experimental, ha resultado ser un buen biomarcador, ya que en el estudio
de la progresión de la enfermedad presentó un aumento significativo de sus
niveles con el empeoramiento de la artrosis (fig. 86).
Se compararon los niveles en el suero de ratas control con los obtenidos en
las ratas operadas a las que se les administró SnPP ó BIS069 durante 10 semanas
(fig. 102) y no se observaron diferencias en los niveles de COMP tras ambos
tratamientos.
Figura 102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño-protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los de ratas operadas de la misma edad. Media ± ε. * Test de Dunett. p<0,05; SnPP vs control.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS069
0.010.060.110.160.210.260.310.36
U/L
Figura 102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño-protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los de ratas operadas de la misma edad. Media ± ε. * Test de Dunett. p<0,05; SnPP vs control.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS069
0.010.060.110.160.210.260.310.36
U/L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
178
Ácido hialurónico (HA)
La evaluación de los efectos de los tratamientos sobre la degradación del
cartílago articular durante la progresión de la artrosis se completó con la medida
de HA en suero. Se compararon, de nuevo, los niveles presentes en el suero de
ratas operadas sin tratamiento con las operadas y tratadas durante 10 semanas (fig.
103), para conocer los efectos que hayan podido tener los tratamientos con SnPP
ó BIS069 sobre la progresión de la artrosis en este modelo experimental. En los
resultados encontramos un aumento significativo en los niveles de HA en el suero
de ratas tratadas durante 10 semanas con BIS069.
10 semanas de tratamiento
Figura 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.
Control SnPP BIS0690
1000
2000
3000 **
ng/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.
Control SnPP BIS0690
1000
2000
3000 **
ng/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
179
4.3.4.5 Inflamación
Dado que en el modelo de artrosis provocada por la transección del
ligamento cruzado anterior en rata Wistar se ha observado que el componente
inflamatorio está presente desde el inicio del proceso, nos dispusimos a estudiar
los posibles efectos de los fármacos testados sobre los mediadores inflamatorios
que se expresan en este modelo experimental.
Interleucina-1β (IL-1β)
Los niveles de IL-1β en el suero de las ratas Wistar sometidas a la
transección del ligamento cruzado anterior fueron indetectables para la técnica de
ELISA, por tanto se decidió medir los niveles en los homogeneizados de patas
usando un ELISA comercial. Y, así, comparamos los efectos de los tratamientos
administrados sobre la inflamación local (fig. 104).
En la figura observamos una ligera disminución, no significativa
estadísticamente, de los niveles de IL-1β en el caso de las ratas Wistar sometidas a
ACLT y tratadas con SnPP durante 10 semanas. La administración de BIS069 no
afecta los niveles de IL-1β en las rodillas de estos animales.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
180
Factor de Necrosis Tumoral α (TNF α)
Los resultados obtenidos en el estudio de los niveles de TNFα en suero a
lo largo del desarrollo de la artrosis en este modelo experimental no mostraron
ninguna modificación con la progresión de la enfermedad (fig. 89). Por tanto,
como cabría esperar, el tratamiento con SnPP ó BIS069 no produjo ninguna
modificación de los niveles de TNFα en suero (fig. 105).
Dado que en el estudio de la influencia del TNFα sobre este modelo de
artrosis sólo apareció un leve incremento de los niveles de TNFα en la medición
sobre homogenados de rodillas de ratas transcurridas 10 semanas desde la
Figura 104: Niveles de IL 1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
100
200
300
400
500
600
pg/m
L
Figura 104: Niveles de IL 1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
100
200
300
400
500
600
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
181
transección del ligamento cruzado anterior (fig. 90), nos dispusimos a medir los
niveles de TNF α en el homogenado de rodillas para comparar los resultados con
los obtenidos tras las 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX
(SnPP) ó BIS069 (fig. 106).
En la gráfica observamos que ambos tratamientos disminuían los niveles
de TNFα levemente aunque la administración de BIS069 lo hacía en mayor grado,
sin llegar a tener significación estadística.
10 semanas de tratamiento
Figura 105: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar operadas de ACLT tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Comparando los niveles obtenidos en ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 10 semanas después de la cirugía con los sueros de ratas operadas de ACLT tras el tratamiento de 10 semanas con las moléculas a estudio. Media ± ε.
Control SnPP BIS0690
50
100
150
200
250
pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 105: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar operadas de ACLT tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Comparando los niveles obtenidos en ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 10 semanas después de la cirugía con los sueros de ratas operadas de ACLT tras el tratamiento de 10 semanas con las moléculas a estudio. Media ± ε.
Control SnPP BIS0690
50
100
150
200
250
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
182
Interleucina-17 (IL-17)
Dado que la IL-17 parece estar implicada en el proceso inflamatorio
asociado a la artrosis en este modelo experimental, nos dispusimos a evaluar si los
tratamientos con los fármacos en estudio tenían algún efecto sobre los niveles de
esta citocina proinflamatoria (fig 107). De nuevo, se realizaron las mediciones en
homogeneizado de pata dado que en el suero de los animales no eran detectables
sus niveles y, para ello se empleó un ELISA comercial.
10 semanas de tratamiento
Figura 106: Niveles de TNFα en el homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles presentes en patas de ratas tratadas con los niveles de las ratas control 10 semanas después de la ACLT. Media ± ε.
Control SnPP BIS0690
100200300400500600700800900
pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 106: Niveles de TNFα en el homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles presentes en patas de ratas tratadas con los niveles de las ratas control 10 semanas después de la ACLT. Media ± ε.
Control SnPP BIS0690
100200300400500600700800900
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
183
Los resultados obtenidos revelaron una disminución de los niveles de la IL-17
asociada a ambos tratamientos, aunque sólo de forma significativa en los animales
tratados con SnPP durante 10 semanas.
Interleucina-6 (IL-6)
Los posibles efectos de los fármacos en estudio sobre los niveles de IL-6
se evaluaron a nivel sistémico (suero) y a nivel local (homogeneizado de pata).
Los resultados obtenidos en suero demuestran que sólo el tratamiento con
SnPP durante 10 semanas es capaz de reducir significativamente los niveles de la
citocina (fig 108).
Control SnPP BIS0690
10
20
30
*
pg/m
l
10 semanas de tratamiento
Figura 107: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras haber sido tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.
Control SnPP BIS0690
10
20
30
*
pg/m
l
10 semanas de tratamiento
Figura 107: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras haber sido tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
184
En cambio, los niveles de IL-6 a nivel local no parecen estar modificados
por ninguno de los dos tratamientos (fig 109), presentando en ambos casos niveles
similares a los encontrados en las rodillas de los animales control de la misma
edad. Como se ha indicado con anterioridad, los niveles de esta citocina estarían
más relacionados con la respuesta inflamatoria producida por la intervención
quirúrgica y no como consecuencia de la progresión de la enfermedad (fig. 93).
Figura 108: Niveles de IL-6 en sueros de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
250
500
750
*pg/m
l
Figura 108: Niveles de IL-6 en sueros de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
250
500
750
*pg/m
l
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
185
Prostaglandina E2 (PGE2)
Los posibles efectos antiinflamatorios de los tratamientos administrados
durante 10 semanas se evaluaron midiendo los niveles de PGE2 por
radioinmuniensayo en el suero de las ratas Wistar sometidas a ACLT (fig. 110).
En el estudio sobre la progresión de la artrosis en este modelo
experimental, observamos que la PGE2 era uno de los mediadores inflamatorios
que más se incrementaba con el paso del tiempo y la progresión de la enfermedad.
Por tanto, nos planteamos si PGE2 podría estar desempeñando un papel
importante en el proceso inflamatorio que acompaña a la artrosis en este modelo
(fig. 94-95).
Control SnPP BIS0690
100200300400500600700800900
pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 109: Niveles de IL-6 en homogeneizados de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.
Control SnPP BIS0690
100200300400500600700800900
pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 109: Niveles de IL-6 en homogeneizados de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
186
En la figura 110 podemos observar cómo ambos tratamientos disminuyen
muy significativamente los niveles de PGE2 en el suero de ratas Wistar sometidas
a ACLT y tratadas durante 10 semanas con los fármacos en estudio. Por tanto,
podríamos suponer que los efectos antiinflamatorios de dichos compuestos están
mediados por la PGE2 .
En la figura 111 se muestran los niveles de PGE2 presentes en el
homogenado de las rodillas operadas, comparando los niveles obtenidos en las
rodillas sometidas a ACLT sin recibir tratamiento con aquellas ratas operadas a
las que se les ha administrado durante 10 semanas los fármacos en estudio.
Figura 110: Niveles de prostagladina E2(PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
50
100
150
** **
pg/m
L
Figura 110: Niveles de prostagladina E2(PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
50
100
150
** **
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
187
La gráfica muestra cómo a nivel local, los fármacos han ejercido también
su acción antiinflamatoria, reduciendo significativamente los niveles de la
prostaglandina tras ambos tratamientos.
Ciclooxigenasa 2 (COX-2)
La COX-2 se midió tanto por western blot en el homogenado de pata de
rata como por inmunohistoquímica en cortes histológicos de la articulación
femorotibial.
10 semanas de tratamiento
Figura 111: Niveles de prostaglandina E2(PGE2) en el homogenado de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles locales de PGE2 en ratas tratadas durante 10 semanas con los niveles obtenidos en patas de ratas operadas 10 semanas después de la cirugía. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.
Control SnPP BIS0690
5
10
15
20
25
30
35
** **
pg/m
L
10 semanas de tratamiento
Figura 111: Niveles de prostaglandina E2(PGE2) en el homogenado de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles locales de PGE2 en ratas tratadas durante 10 semanas con los niveles obtenidos en patas de ratas operadas 10 semanas después de la cirugía. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.
Control SnPP BIS0690
5
10
15
20
25
30
35
** **
pg/m
L
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
188
Los resultados obtenidos por western blot muestran una reducción
significativa de los niveles de COX-2 tras las 10 semanas de tratamiento con
SnPP y BIS069. Esta reducción de los niveles de COX-2 es también observada en
la inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 113), siendo en este caso también
significativa la reducción de condrocitos articulares positivos para el anticuerpo
para COX-2 tras ambos tratamientos.
control SnPP BIS069
Control SnPP BIS0690
50
100
150
* *
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
.O.I.
)
A
B
10 semanas de tratamiento
Figura 112: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en homogenado de pata de ratas Wistar sometidas a ACLT tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Tras el tratamiento con SnPP y BIS069 durante 10 semanas los niveles de COX-2 han disminuido significativamente. * test de Dunett p<0,05.
control SnPP BIS069
Control SnPP BIS0690
50
100
150
* *
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
.O.I.
)
A
B
10 semanas de tratamiento
control SnPP BIS069control SnPP BIS069
Control SnPP BIS0690
50
100
150
* *
Den
sida
d óp
tica
inte
grad
a(D
.O.I.
)
A
B
A
B
10 semanas de tratamiento
Figura 112: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en homogenado de pata de ratas Wistar sometidas a ACLT tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Tras el tratamiento con SnPP y BIS069 durante 10 semanas los niveles de COX-2 han disminuido significativamente. * test de Dunett p<0,05.
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
189
Control
SnPP BIS069
A
B C
Figura 113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar tras 10 semanas de tratamiento con estñoprotoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de SnPP; C: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de BIS069; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en cartílago de rodillas de ratas Wistar . ** test de Dunettp<0,01.
D
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
25
50
75
100
****
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
Control Control
SnPP BIS069
A
B C
Figura 113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar tras 10 semanas de tratamiento con estñoprotoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de SnPP; C: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de BIS069; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en cartílago de rodillas de ratas Wistar . ** test de Dunettp<0,01.
D
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
25
50
75
100
****
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
D
10 semanas de tratamiento
Control SnPP BIS0690
25
50
75
100
****
nºce
l pos
itiva
s C
OX-
2
Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT
190
5. DISCUSIÓN
Discusión
191
5. DISCUSIÓN
La artrosis es una de las enfermedades de mayor prevalencia entre la
población anciana. Es una enfermedad incapacitante y, por tanto, su diagnóstico
precoz es de gran importancia. El estudio de biomarcadores posee un gran interés
porque puede ayudar a establecer un diagnóstico más precoz, conocer mejor la
patología de la artrosis, identificar dianas moleculares para el desarrollo de
tratamientos más eficaces que los actuales, así como a seguir la evolución de la
enfermedad y el resultado de las intervenciones terapéuticas (Williams y Spector,
2008; Rousseau y Delmas, 2007).
Los modelos animales constituyen una importante herramienta para
conocer las bases del desarrollo de la enfermedad, estudiar los posibles
biomarcadores expresados a lo largo de la progresión de la artrosis y caracterizar
los efectos de nuevos fármacos.
En la presente Tesis se han puesto a punto 3 modelos experimentales de
artrosis con la finalidad de poder validarlos, para posteriormente ser empleados en
el estudio de los fármacos estaño proporfirina IX (SnPP) y BIS069.
El trabajo con animales de experimentación es delicado, laborioso y
requiere de una formación especializada. Es importante conocer y caracterizar
todos los parámetros de cada modelo que puedan servir para poder evaluar y
conocer la progresión de la enfermedad. Como ya se menciona en la introducción
de este trabajo, los modelos animales reproducen algunos de los aspectos de la
patología que representan, pero difícilmente reproducen todas las variables
implicadas en la etiopatogénesis y la progresión de la artrosis.
Los modelos desarrollados en esta Tesis intentan representar entre todos
ellos todo el abanico de características de la enfermedad. Así, en primer lugar, el
Discusión
192
modelo de artrosis inducida por la inyección intraarticular de colagenasa,
todo y siendo un modelo controvertido, lo escogimos con la finalidad de observar
un proceso artrósico relativamente rápido y poder estudiar el desarrollo de los
osteofitos, formaciones de gran importancia en la artrosis características de este
modelo.
Una de las limitaciones principales de este estudio fue el hecho de que, al
tratarse de una artrosis monoarticular, la liberación al suero de los diversos
biomarcadores de degradación del cartílago y los mediadores inflamatorios no era
detectable por las técnicas empleadas habitualmente en nuestro laboratorio. Dado
que este modelo no permitía realizar un seguimiento sistémico de la enfermedad y
que ésta no se desarrolló con la gravedad suficiente ni con la suficiente incidencia,
no creímos conveniente emplear este modelo experimental para ensayar los
fármacos que se estudian en esta Tesis.
El segundo modelo que se puso a punto fue el desarrollo espontáneo de
la artrosis en ratones STR/ort. Como se explica más adelante, se realizaron
estudios preliminares para poder reproducir la proporción de animales que
desarrollan la enfermedad y la gravedad de ésta. Este modelo, al tratarse de una
artrosis poliarticular, requirió de un estudio inicial de todas las articulaciones
candidatas a padecer una degradación evaluable, como se presenta en el apartado
de resultados. Este modelo consiguió reproducir una artrosis de rodilla que se
estimó susceptible de ser empleada para el estudio de los fármacos SnPP y
BIS069.
El último modelo desarrollado, la artrosis provocada por la transección
del ligamento cruzado anterior en rata Wistar, resultó un modelo muy
reproducible y con muestras de una desarrollo artrósico que englobaba tanto la
degradación articular como la inflamación asociada a ésta. Aunque se trataba de
Discusión
193
una artrosis provocada únicamente en una articulación, la degeneración era
suficientemente severa como para poder detectar en el suero de los animales gran
parte de los mediadores inflamatorios y biomarcadores de degradación del
cartílago característicos de la enfermedad.
MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR LA INYECCIÓN
INTRAARTICULAR DE COLAGENASA EN RATÓN Balb/c
En los experimentos presentados en esta Tesis no se ha conseguido
reproducir la degeneración articular descrita en la bibliografía (Rudolphi et al.,
2003;Yeh et al., 2008;Kikuchi et al., 1998) aunque sí hemos podido realizar el
estudio de la formación de osteofitos marginales característicos de la artrosis
(Felson et al., 2005; van der Kraan y van den Berg, 2007). Se trata de un modelo
controvertido, ya que diversos autores han señalado que podría asemejarse más a
un modelo de artritis reumatoide (Kikuchi et al., 1998; van der Kraan et al., 1989)
que a un modelo de artrosis. Aunque los modelos de inducción de la artrosis por
sustancias químicas como papaína (Kikuchi et al., 1998) o iodoacetato (Janusz et
al., 2004) están siendo utilizados actualmente para el estudio de la progresión de
la artrosis, la inducción de la artrosis por colagenasa tiene bastantes detractores.
Estudios in vitro han confirmado que la colagenasa tipo IA únicamente actúa
sobre el colágeno tipo I presente en ligamentos y estructuras anexas de la
articulación, pero presenta una actividad muy baja sobre el colágeno tipo II
característico del cartílago articular (Botter et al., 2008). De esta forma, la
degradación del cartílago articular observada en el estudio presentado en esta
Tesis, sería consecuencia del debilitamiento de tendones y ligamentos que
mantienen las fuerzas biomecánicas de la articulación, aumentando el rozamiento
Discusión
194
y la erosión entre las superficies articulares. Por ello, la formación de osteofitos es
tan característica en este modelo experimental (Felson et al., 2005; van der Kraan
y van den Berg, 2007), ya que estas formaciones óseas en la periferia de la
articulación tienen como objeto estabilizar los movimientos erráticos de la
articulación y evitar una mayor degeneración articular.
Dado que se trata de una artrosis monoarticular y en este estudio no se ha
conseguido una degradación de la articulación lo suficientemente grave como para
obtener una respuesta sistémica cuantificable, este modelo sólo podría ser
utilizado para ensayar fármacos implicados en la protección de la matriz
extracelular del cartílago. Ya que, al no ser cuantificables en suero los mediadores
inflamatorios ni los biomarcadores de degradación del colágeno sólo se puede
hacer una evaluación de la patología a nivel histológico (Pritzker, 1994).
De acuerdo con los resultados de algunos autores, el modelo experimental
de artrosis inducida por colagenasa intraarticular podría reproducir mejor la
severidad de los caracteres típicos de la artrosis, si se utilizan ratones C57Bl/6 que
presentan menor densidad ósea o ratones deficientes para IL-6 (IL-6-/-) (de Hooge
et al., 2005).
MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort
En el estudio realizado con la cepa de ratones STR/ort , no hemos tenido
acceso a los animales que habían desarrollado la artrosis a edades más tempranas,
ya que no está permitido suministrar animales enfermos. Por ello, la proporción de
individuos que desarrollaron la enfermedad durante nuestro estudio fue algo
inferior a la indicada en la bibliografía. No obstante, todos los animales que
Discusión
195
desarrollaron la artrosis lo hicieron con la gravedad esperada (Munasinghe et al.,
1995; Mahr et al., 2003; Jaeger et al., 2008).
También realizamos un seguimiento exhaustivo del estado de salud de los
animales, ya que la bibliografía indicaba que esta cepa era susceptible de padecer
otras patologías además de la artrosis, como enfermedades periodontales,
hepatomas,... (Jaeger et al., 2008). A ninguno de los individuos que participaron
en el estudio se les detectó ninguna de las patologías descrita, y el estudio
histológico postmortem de los hígados de los animales tampoco reveló la
presencia de hepatomas.
De acuerdo con la bibliografía (Chambers et al., 1997; Chambers et al.,
2001; Chambers et al., 2002), empleamos ratones CBA como animales control
para nuestro estudio. El estudio histológico siguiendo el sistema de evaluación
descrito por la OARSI demostró que la afectación articular encontrada en los
ratones STR/ort era significativamente mayor a la encontrada en las articulaciones
de los ratones CBA de igual edad y peso similar. También el estudio de los
biomarcadores de degradación del colágeno presentes en el suero de los animales
demostró que los ratones que desarrollan de forma espontánea la artrosis
presentan unos niveles elevados de COMP, MMP3 y OC en suero respecto a los
ratones CBA, mientras que los valores eran similares a los de los ratones CBA en
el caso del HA y menores para RANKL.
En cambio, en la cepa CBA los niveles de prácticamente todos los
mediadores inflamatorios estudiados aparecían elevados respecto de los animales
STR/ort. Estas discrepancias podrían ser debidas a las diferencias genéticas entre
ambas cepas de ratones y sugieren que la cepa CBA podría no ser un control
adecuado para el estudio del proceso inflamatorio en ratones STR/ort.
Discusión
196
Contrariamente a lo que ocurre con los valores de IL-1β, que no sufren
variaciones con la progresión de la enfermedad, se debe destacar la expresión de
las citocinas proinflamatorias IL-17 y TNFα. Ambas presentan un aumento
progresivo paralelo al incremento de la degradación articular, lo que sugiere su
implicación en la inflamación asociada a la artrosis. Por otro lado, los niveles
séricos de PGE2 disminuyen en las semanas 11 y 15 y la expresión de COX-2 en
condrocitos articulares también disminuye al final del estudio, indicando una
participación de esta prostaglandina en las fases más iniciales del proceso.
El estudio de la implicación de la hemo oxigenasa-1 en el proceso
artrósico demostró que los niveles encontrados en los ratones STR/ort fueron
significativamente menores a los encontrados en la cepa CBA, con una tendencia
a aumentar su expresión en la semana 11.
Dado que el estudio de la progresión de la artrosis en este modelo animal
desarrolló gran parte de las características de la artrosis humana decidimos testar
los fármacos SnPP y BIS069 en este modelo experimental.
MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL
LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR EN RATA Wistar
El modelo ACLT en rata Wistar ha demostrado ser un modelo
experimental robusto y con menor variabilidad, aunque es el modelo experimental
que más dedicación ha necesitado para su puesta a punto y validación dada la
dificultad de la microcirugía.
El modelo ha demostrado ser reproducible y la comprobación postmortem
demostró que en todos los casos el ligamento cruzado anterior aparecía
completamente seccionado y que las superficies del cartílago articular no estaban
Discusión
197
dañadas por la manipulación quirúrgica, sino como consecuencia de la
desestabilización de la articulación.
Este modelo experimental ha sido tradicionalmente realizado en perros
(Brandt et al., 1991) y conejos (Wu et al., 2008). Con frecuencia aparece
combinado con una meniscectomía (eliminación del menisco medial), que
ocasiona una desestabilización articular mucho más agresiva y permite el
desarrollo de la enfermedad en menos tiempo.
La elección de realizar la ACLT sin afectar los meniscos mediales tuvo su
origen en la artrosis secundaria a una lesión deportiva tan común como la ruptura
del ligamento cruzado anterior. Es bien conocido que esta lesión, común en
deportistas profesionales, provoca una importante erosión del cartílago articular
en la articulación de la rodilla. Por ello, y en un intento de reproducir la artrosis
secundaria a lesiones mecánicas, decidimos prolongar el tiempo de desarrollo de
la enfermedad sin aumentar la intervención sobre la articulación ni añadir el
efecto del ejercicio físico. De esta forma hemos podido observar, tanto en el
estudio histológico como en el estudio de los biomarcadores de degradación de
colágeno, que la degradación articular era similar a la encontrada en la
enfermedad desarrollada en humanos. También se ha conseguido reproducir, en
las 10 semanas que duró el estudio de la progresión de la enfermedad, la sinovitis
característica que aparece asociada a la artrosis.
El estudio en suero de los principales biomarcadores de degradación del
cartílago demostró que la degeneración articular era progresiva, y así lo
demostraba el incremento de los niveles séricos de CTX-II y COMP. Este
incremento de CTX-II y de COMP era coherente con la degradación del cartílago
observada en el estudio histológico. Sin embargo, no aparecen variaciones en los
niveles de HA en suero, lo que sugiere que dicha molécula no es un biomarcador
Discusión
198
apropiado en este modelo experimental, contrariamente a lo que se ha indicado en
la artrosis humana (Pavelka et al., 2004). Con este modelo hemos podido
corroborar que CTX-II y COMP serían unos biomarcadores válidos para el
diagnóstico precoz de la enfermedad ya que presentan un incremento progresivo
paralelo al deterioro articular, en la artrosis humana y en este modelo
experimental (Vilim et al., 2002; Sharif et al., 2006; Fernandes et al., 2007;
Charni-Ben et al., 2008).
La inflamación asociada a la artrosis se ha visto representada en este
modelo de forma similar a como ocurre en la artrosis humana. La operación
simulada, donde se sometía a la articulación a toda la manipulación quirúrgica a
excepción de la transección del ligamento cruzado anterior, ha permitido excluir
la reacción inflamatoria en respuesta a la agresión que supone la cirugía de la
asociada a la enfermedad como tal. Así, transcurridas 10 semanas de la cirugía,
encontramos elevados, a nivel local, IL-1β, TNFα, IL-17, IL-6, PGE2 y COX-2.
Aunque, a nivel sistémico, TNFα no modificó sus niveles a lo largo del desarrollo
de la enfermedad, IL-6 y PGE2 sí que presentaron un aumento progresivo paralelo
a la degradación de la articulación. El resto de citocinas también fueron medidas
en el suero de los animales pero no alcanzaron niveles detectables por la técnica
de ELISA.
Este modelo experimental, a lo largo de las 10 semanas que duró el
estudio, logró representar tanto la degradación articular como la sinovitis asociada
a la enfermedad y, por tanto, se consideró adecuado para realizar el estudio de los
fármacos SnPP y BIS069.
Discusión
199
ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS ESTAÑO PROTORPORFIRINA IX
(SnPP) Y BIS069 EN MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS
Cada uno de los modelos seleccionados para el estudio de los fármacos
presenta unas ventajas y unos inconvenientes. El modelo de artrosis espontánea en
ratones STR/ort tiene la ventaja de poder trabajar con animales pequeños que
permiten poder estudiar un mayor número de individuos. Pero presenta la
dificultad de ser una cepa que desarrolla de forma espontánea la enfermedad, lo
que implica una gran variabilidad entre individuos. El modelo de artrosis por
ACLT en rata Wistar es muy reproducible y representa tanto la degradación
articular como la inflamación asociada a ésta, aunque tiene varios inconvenientes.
El primero de ellos es la dificultad que conlleva realizar una cirugía y los cuidados
postquirúrgicos que permitan la supervivencia del animal al menos 10 semanas,
con la seguridad de que los resultados observados son únicamente consecuencia
de la desestabilización articular y no de ningún tipo de infección o secuela de la
manipulación. En segundo lugar, la limitación de espacio que supone trabajar con
animales de experimentación de tamaño medio y el hecho que la enfermedad
necesita de más tiempo para desarrollarse dado que la cepa posee una mayor
esperanza de vida. En último lugar, y no menos importante, es el hecho de que, al
tratarse de animales de mayor peso, es necesaria una mayor cantidad de fármaco
para realizar el estudio y podría llegar a ser una factor limitante.
Discusión
200
ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS SnPP Y BIS069 SOBRE LA ARTROSIS
ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort
La administración de SnPP a la dosis de 12 mg/kg/día i.p. o de BIS069 (80
mg/kg/día, p.o.) durante cuatro semanas, disminuyó de forma significativa las
manifestaciones histológicas y radiológicas de la artrosis espontánea.
En el modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort, el tratamiento con
SnPP redujo significativamente los niveles séricos de los biomarcadores MMP3 y
OC, mientras que tras la administración de BIS069 únicamente disminuyeron
significativamente los niveles de MMP3. En cambio, los biomarcadores de
degradación del cartílago COMP y RANKL no modificaron sus niveles en suero
tras el tratamiento con ninguno de los dos fármacos.
También se estudiaron los efectos de estos fármacos sobre los mediadores
inflamatorios. El tratamiento con SnPP incrementó los niveles de IL-1β en suero y
la expresión de COX-2 en homogenado de pata y en condrocitos de la articulación
femororrotuliana. Sin embargo, no parece tener influencia sobre los niveles
séricos de TNFα ni PGE2. Además, los niveles séricos de la citocina
proinflamatoria IL-17 sufrieron una ligera disminución tras el tratamiento con
ambos fármacos.
BIS069 provocó un leve incremento en los niveles de IL-1β y una ligera
disminución de TNFα. En cambio, no afectó los niveles de PGE2 ni la expresión
de COX-2.
Discusión
201
ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS SnPP Y BIS069 SOBRE LA ARTROSIS
PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL LIGAMENTO CRUZADO
ANTERIOR EN RATA Wistar
La administración de SnPP (12 mg/kg/día/i.p.) o BIS069 (90 mg/kg/día
p.o.), durante 10 semanas, protegió frente al desarrollo de la lesión articular en el
modelo de transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar. Los
animales tratados mostraron un grado menor de afectación del cartílago y de
sinovitis, en comparación con el grupo control, con un efecto superior de SnPP
frente a BIS069.
El tratamiento con SnPP durante 10 semanas redujo significativamente los
niveles de CTX-II. Estos resultados son coherentes con el estudio histológico que
demuestra que el cartílago articular de las rodillas sometidas a ACLT tras el
tratamiento con SnPP presenta una puntuación significativamente menor que las
rodillas de aquellos animales que no han recibido el tratamiento. En cambio, los
niveles de HA no son modificados. Aunque se ha publicado que HA podría ser un
biomarcador en la artrosis humana (Pavelka et al., 2004), los estudios de la
progresión de la artrosis en este modelo indican que HA no es un biomarcador
adecuado para realizar un pronóstico de la enfermedad en este modelo
experimental, de forma similar a lo observado en el modelo de artrosis
espontánea.
En cambio, la administración de BIS069 durante 10 semanas no tuvo
ningún efecto sobre los niveles de CTX-II, ni COMP; pero sí incrementó
significativamente los niveles de HA. Estos resultados no son coherentes con la
menor puntuación obtenida en la evaluación histopatológica de la OARSI.
Discusión
202
Como ya se ha descrito anteriormente, este modelo experimental de
artrosis presenta una sinovitis similar a la encontrada en humanos. El tratamiento
con SnPP redujo significativamente los niveles séricos de IL-6 y PGE2 y los
niveles locales de IL-17, PGE2 y COX-2. Estos resultados de los efectos
antiinflamatorios de la SnPP coinciden con el estudio histológico donde se aprecia
una disminución de la sinovitis, así como una menor infiltración monocítica.
Los efectos antiinflamatorios de SnPP han sido descritos en modelos de
artritis reumatoide, como la artritis por colágeno en ratón y la artritis por
adyuvante en rata (Devesa et al., 2005b; Devesa et al., 2005a).
BIS069 también redujo de forma muy significativa los niveles de PGE2,
tanto a nivel sistémico como local, ello dependería de la reducción que produce en
la expresión de COX-2. El tratamiento con BIS069 provocó además una leve
reducción de las citocinas proinflamatorias IL-17 y TNFα.
Todo ello parece indicar que el tratamiento con SnPP parece estar
ejerciendo un efecto protector sobre la degradación del cartílago y un efecto
antiinflamatorio sobre la sinovitis asociada a la artrosis que padecen las ratas
sometidas a ACLT, mientras que BIS069 ha mostrado una menor efectividad
6. CONCLUSIONES
Conclusiones
203
6. CONCLUSIONES
1.- En el modelo experimental de artrosis inducida por la inyección intraarticular
de colagenasa, se ha observado el desarrollo prematuro de osteofitos en este
modelo animal en respuesta a la desestabilización articular provocada por la
degradación del colágeno tipo I presente en ligamentos y tendones. Sin embargo,
no se han detectado niveles séricos de biomarcadores de degradación del cartílago
ni mediadores inflamatorios. La gravedad de las lesiones del cartílago tras la
agresión enzimática no es representativa de la artrosis humana.
2.- El modelo experimental de artrosis espontánea en la cepa de ratones STR/ort
presenta signos radiológicos de artrosis, así como una degradación articular
evaluada histopatológicamente muy superior a la encontrada en ratones CBA, y
que aumenta progresivamente con el tiempo. Los niveles sistémicos de COMP,
MMP3 y RANKL son significativamente superiores a los presentes en los ratones
CBA, mientras que los niveles de OC se encuentran disminuidos
significativamente. IL-1β no parece estar implicada en el proceso inflamatorio en
este modelo experimental, mientras que IL-17, TNFα y PGE2 podrían ser
responsables de la respuesta inflamatoria en los ratones STR/ort.
3.- El modelo de transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar
demostró radiológica e histológicamente un desarrollo de la enfermedad coherente
con la artrosis humana, en todos los animales operados. Los niveles séricos de los
biomarcadores CTX-II y COMP incrementaron progresivamente con el desarrollo
de la enfermedad. El modelo representó la inflamación asociada a la artrosis, con
niveles elevados a nivel local de los mediadores inflamatorios IL-1β, TNFα, IL-
Conclusiones
204
17, IL-6, PGE2 y COX-2. A nivel sistémico, TNFα no modificó sus niveles pero
IL-6 y PGE2 sí que presentaron un aumento progresivo paralelo a la degradación
de la articulación.
4.- El tratamiento con SnPP administrado durante 4 semanas a los ratones STR/ort
protegió frente al desarrollo de la enfermedad. También redujo significativamente
los niveles sistémicos de MMP3 y OC, sin afectar los niveles séricos de COMP y
RANKL. SnPP disminuyó los niveles de IL-17 en el suero de los animales
tratados.
Los ratones STR/ort tratados con BIS069 durante 4 semanas presentaron
una menor degradación articular en comparación con el grupo control. La
administración de BIS069 disminuyó significativamente los niveles séricos de
MMP3 y en menor grado los de TNFα e IL-17.
5.- El tratamiento con SnPP o BIS069 durante 10 semanas en ratas Wistar tras la
ACLT produjo una menor degradación articular que en los animales control. SnPP
redujo significativamente los niveles séricos de CTX-II, IL-6 y PGE2 y los niveles
locales de IL-17, PGE2 y COX-2.
La administración de BIS069 durante 10 semanas incrementó
significativamente los niveles de HA, sin afectar los niveles de CTX-II ni de
COMP. Además, BIS069 redujo los niveles de PGE2, tanto a nivel sistémico
como local y produjo una leve reducción de las citocinas proinflamatorias IL-17 y
TNFα.
7. BIBLIOGRAFÍA
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