estudo da interação de proteínas com nanopartículas de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
FLÁVIA ELISA GALDINO
ESTUDO DA INTERAÇÃO DAS PROTEÍNAS ALBUMINA E LISOZIMA COM
NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA: TERMODINÂMICA DA INTERAÇÃO E EFEITO
DA SUPERFÍCIE DAS PARTÍCULAS
CAMPINAS
2018
FLÁVIA ELISA GALDINO
ESTUDO DA INTERAÇÃO DAS PROTEÍNAS ALBUMINA E LISOZIMA COM
NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA: TERMODINÂMICA DA INTERAÇÃO E EFEITO
DA SUPERFÍCIE DAS PARTÍCULAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título
de Mestra em Química na área de Físico-Química.
Orientador: Prof. Dr. Watson Loh
Coorientador: Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA FLÁVIA ELISA GALDINO, E ORIENTADA PELO PROF.
DR. WATSON LOH.
CAMPINAS
2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2016/11118-0; CNPq,
135840/2016-3
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7799-3077
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Química
Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Galdino, Flávia Elisa, 1991-
G131e GaEstudo da interação das proteínas albumina e lisozima com nanopartículas
de sílica: termodinâmica da interação e efeito da superfície das partículas /
Flávia Elisa Galdino. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Watson Loh.
Coorientador: Mateus Borba Cardoso.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Química.
1. Albumina. 2. Lisozima. 3. Nanopartículas de sílica. 4. Calorimetria de
titulação isotérmica. I. Loh, Watson, 1965-. II. Cardoso, Mateus Borba. III.
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. IV. Título.
1 Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Albumin and lysozyme interaction with silica nanoparticles:
thermodynamics and effect of the nanoparticles surface properties
Palavras-chave em inglês:
Albumin
Lysozyme
Silica nanoparticles
Isothermal titration calorimetry
Área de concentração: Físico-Química
Titulação: Mestre em Química na área de Físico-Química
Banca examinadora:
Watson Loh [Orientador]
Edvaldo Sabadini
Fernando Carlos Giacomelli
Data de defesa: 17-07-2018
Programa de Pós-Graduação: Química
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Watson Loh (Orientador)
Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli (CCNH-UFABC/Santo André)
Prof. Dr. Edvaldo Sabadini (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo(a) aluno(a)
FLÁVIA ELISA GALDINO, aprovada pela Comissão
Julgadora em 17 de julho de 2018.
Dedico esta dissertação primeiramente a Deus, por
sempre iluminar o meu caminho. Dedico também às
pessoas mais valiosas da minha vida: meu pai
Wilson José Galdino, minha mãe Marilisa
Nascimento Galdino, minha irmã Caroline Elisa
Galdino e ao meu esposo Diogo Saboto Barros.
Agradecimentos
A Deus por sempre guiar o meu caminho e por me abençoar imensamente.
Aos meus pais e minha irmã que sempre me incentivaram e torceram por
mim durante a minha vida.
Ao meu esposo pela compreensão, apoio emocional e conversas que foram
fundamentais para que eu permanecesse forte durante a caminhada.
A todos os professores que passaram pela minha vida, plantando em mim
a semente da busca pelo conhecimento.
Aos meus orientadores Watson Loh e Mateus Cardoso pela orientação,
apoio, confiança e conselhos que contribuíram para o meu crescimento pessoal e
profissional.
A todos os meus colegas de laboratório (alunos de IC, pós-graduação e
técnicos) pelo auxílio, discussões, apoio e momentos de descontração que tornaram
essa caminhada mais leve.
Ao professor Edvaldo Sabadini por disponibilizar o equipamento PEAQ-
ITC.
À Unicamp, universidade que me recebeu de portas abertas e propiciou
para mim um universo de descobertas, oportunidades e aprendizados.
Ao IQ-Unicamp e ao CNPEM pela infraestrutura fornecida.
À Fapesp, processo: n° 2016/11118-0, Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro fornecido.
Ao CNPq (processo: 135840/2016-3) pelo apoio financeiro fornecido.
Resumo
O fenômeno conhecido como protein corona é caracterizado pela adsorção
espontânea e inespecífica de proteínas na superfície das nanopartículas (NPs). Essa
camada de proteínas adsorvida tem uma grande influência sobre a ação e eficiência
dos nanomateriais aplicados na nanomedicina. Dentre as estratégias para evitar a
ocorrência desse fenômeno está a funcionalização da superfície das partículas com
grupos zwitteriônicos (ZW) ou com polietilenoglicol (PEG). Em vista disso, o objetivo
do trabalho aqui descrito consiste em sintetizar nanopartículas de sílica e estudar a
interação delas com diferentes proteínas (albumina bovina e lisozima). Para tal, são
considerados três tipos de nanopartículas de sílica, sendo uma sem modificação
(SiO2NPs) e as outras duas modificadas (através de ligações químicas) com o PEG e
o zwitteriônico silano sulfobetaína (SBS), identificadas como SiO2NPs-PEG e
SiO2NPs-SBS, respectivamente. Essas nanopartículas foram caracterizadas por
espalhamento de luz dinâmico (DLS), potencial zeta, microscopia eletrônica de
varredura (MEV), termogravimetria (TGA) e ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (1H-RMN). Os estudos de interação foram realizados através das técnicas
de DLS, absorção na região do ultravioleta, dicroísmo circular (CD) e calorimetria de
titulação isotérmica (ITC). Três fatores foram considerados nesses estudos: pH,
temperatura e força iônica. As três nanopartículas apresentaram uma distribuição de
tamanho monomodal em torno de 100 nm e formato aproximadamente esférico. As
modificações de superfície com SBS e PEG foram comprovadas através das técnicas
de RMN e TGA. Mediante os experimentos de interação dessas nanopartículas com
as proteínas verificou-se a interação da proteína albumina bovina apenas com as
SiO2NPs. Portanto, para a albumina bovina, proteína carregada negativamente em pH
fisiológico, as modificações com SBS e PEG foram eficientes para evitar a adsorção
dessa proteína. Ainda com relação a esses experimentos, observou-se que a
interação da albumina bovina com as SiO2NPs é controlada pela entalpia e que os
fatores força iônica, pH e temperatura influenciaram nos resultados. Com relação à
lisozima, proteína carregada positivamente em pH fisiológico, foi observada a
interação com as três nanopartículas deste projeto. Ou seja, a propriedade corona
free das SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG não foi observada para essa proteína.
Abstract
Protein corona is a phenomenon characterized by the spontaneous and
nonspecific adsorption of proteins on nanoparticles’ surface. This protein shell
influences on the action and efficiency of nanomaterials applied in nanomedicine.
Particles functionalization with zwitterionic groups and polyethylene glycol (PEG) are
two strategies to avoid the occurrence of this phenomenon. Considering these facts,
this work’s motivation is to synthesize silica nanoparticles and to study their interaction
with different proteins (bovine serum albumin and lysozyme). For this, three types of
silica nanoparticles were considered: I) unmodified (SiO2NPs), II) modified with
zwitterionic sulfobetaine silane (SiO2NPs-SBS) and III) modified with polyethylene
glycol (SiO2NPs-PEG). These nanoparticles were characterized by dynamic light
scattering (DLS), zeta potential, scanning electron microscopy (SEM),
thermogravimetry (TGA) and nuclear magnetic resonance (NMR) measurements. The
interaction studies were performed using DLS, ultraviolet absorption, circular dichroism
(CD) and isothermal titration calorimetry (ITC). Three factors were considered in these
studies: pH, temperature and ionic strength. The three nanoparticles presented a
monomodal size distribution around 100 nm and approximately spherical shape.
Surface modifications with SBS and PEG were confirmed by NMR and TGA
techniques. Bovine serum albumin (BSA) was found to interact only with SiO2NPs.
Therefore, for BSA, a negatively charged protein at physiological pH, modifications
with SBS and PEG were efficient to avoid its adsorption. It was also observed that the
interaction of BSA with SiO2NPs is controlled by enthalpy and that the factors ionic
strength, pH and temperature influenced the results. Lysozyme, a positively charged
protein at physiological pH, interacted with three nanoparticles of this project. Thus,
the corona free property of SiO2NPs-SBS and SiO2NPs-PEG nanoparticles was not
verified for this protein.
Lista de Figuras
Figura 1. Representação esquemática do efeito EPR. Adaptado da Referência 13. 18
Figura 2. TEM das SiO2NPs obtida por Li e colaboradores.20 ................................... 19
Figura 3. Estratégias utilizadas para reverter a formação da protein corona não
específica. Imagem adaptada da Referência 35. ...................................................... 21
Figura 4. Ilustração de uma membrana celular e a fórmula estrutural do composto
zwitteriônico fosfatidilcolina. Adaptado da Referência 46. ......................................... 22
Figura 5. Mecanismo da resistência de adsorção: A) efeito estérico governado pela
instabilidade entrópica e B) formação da camada de hidratação via solvatação iônica
(ZW) e ligação de hidrogênio (PEG e ZW). Adaptado da Referência 49. ................. 23
Figura 6. Representação esquemática do aparato de um ITC, representativo dado
bruto de um experimento e representativa isoterma de ligação ajustada com o modelo
de One set of sites. Imagem adaptada da Referência 65. ........................................ 25
Figura 7. Estrutura química do SBS .......................................................................... 27
Figura 8. Estrutura química do PEG2000 silanizado. .................................................. 28
Figura 9. Ilustração da superfície das A) SiO2NPs, B) SiO2NPs-SBS e C) SiO2NPs-
PEG. .......................................................................................................................... 33
Figura 10. Distribuição de tamanho das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG em
função da intensidade. .............................................................................................. 34
Figura 11. Ilustração de algumas das possíveis associações do SBS na superfície das
nanopartículas de sílica. Adaptado da Referência 44. .............................................. 35
Figura 12. Variação do potencial zeta das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG
em função do pH. ...................................................................................................... 36
Figura 13. MEV e correspondente distribuição de diâmetro das A) SiO2NPs, B)
SiO2NPs-SBS e C) SiO2NPs-PEG ............................................................................ 37
Figura 14. Curvas de TGA das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG. ............... 38
Figura 15. Espectros de 1H-RMN das nanopartículas SiO2NPs, SiO2NPs-SBS,
SiO2NPs-PEG e dos compostos SBS e PEG2000-TESPI. .......................................... 40
Figura 16. Esquema das condições experimentais estudadas.................................. 41
Figura 17. Distribuição do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em presença de A)
BSA e B) lisozima. Estudos realizados na condição padrão. .................................... 42
Figura 18. A) Diâmetro hidrodinâmico (DH) e B) variação do DH das SiO2NPs em
função da concentração de BSA a 25 e 37 °C. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-
1 PB com o pH em 7,4. .............................................................................................. 43
Figura 19. A) Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs nas temperaturas de 25 e
37 °C obtidas através de medidas de absorbância da proteína. B) Gráfico utilizado no
cálculo de NS referente ao experimento a 25 °C. Dois pontos foram desconsiderados
da curva..................................................................................................................... 45
Figura 20. Dado bruto da titulação de 0,38 mmol.L-1 de BSA em 5 g.L-1 de SiO2NPs.
Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C. ................................... 46
Figura 21. Demonstração da baixa relação sinal/ruído observada durante as medidas
de ITC. Ampliação do pico da A) primeira injeção de diluição e B) penúltima injeção
de interação da Figura 20. ........................................................................................ 47
Figura 22. Isoterma da titulação calorimétrica: A) variação de calor e B) variação de
entalpia por mol de titulante após cada injeção de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-
1 BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de SiO2NPs. Experimentos realizados em 0,01
mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 e 37 °C. ................................................................................. 48
Figura 23. A) Somatória dos calores envolvidos nas interações entre BSA e SiO2NPs
em função do volume de BSA. Dados relacionados ao experimento realizado em 0,01
mol.L-1 PB, pH 7,4 a 25 e 37 °C. B) Isoterma da entalpia integral de adsorção (Δrh )
versus a fração molar obtida da titulação a 25 °C. A reta apresentada é a forma
linearizada da isoterma. ............................................................................................ 49
Figura 24. Níveis de organização estrutural das proteínas. Adaptado da Referência
80. ............................................................................................................................. 51
Figura 25. Espectro CD das estruturas secundárias mais comumente encontradas em
proteínas. O espectro foi adaptado da Referência 83 referente às análises de poli-L-
lisina nas diferentes estruturas secundárias.............................................................. 51
Figura 26. Dicroísmo circular da A) BSA livre a 25 e 37 °C, B) BSA livre e adsorvida
nas SiO2NPs incubadas a 25 °C e C) BSA livre e adsorvida nas SiO2NPs incubadas a
37 °C. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB com pH ajustado em 7,4. ........ 52
Figura 27. Gel de eletroforese revelado das soluções e suspensões utilizadas nos
testes de CD. ............................................................................................................. 53
Figura 28. Variação do A) diâmetro hidrodinâmico e da B) polidispersidade das
SiO2NPs em tampão PB contendo 0 e 2,3 μmol.L-1 de BSA em diferentes forças
iônicas. ...................................................................................................................... 54
Figura 29. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em função da
concentração de BSA. Estudos realizados a 0 e 4 g.L-1 de NaCl adicionados ao tampão
PB em pH 7,4, a 25 °C. ............................................................................................. 55
Figura 30. Ilustração de alguns dos possíveis posicionamentos da BSA sobre as
SiO2NPs. ................................................................................................................... 55
Figura 31. Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs em PB com 0 e 4 g.L-1 de NaCl
obtidas através de medidas de absorbância da proteína. Experimentos realizados em
pH 7,4 e a 25 °C. ....................................................................................................... 56
Figura 32. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-1 de BSA em uma suspensão
de 5 g.L-1 de SiO2NPs. Resultados obtidos variando-se a força iônica do meio: sem
adicionar NaCl ao PB e adicionando 4 g.L-1 desse sal. Experimentos realizados em
pH 7,4 e a 25 °C. ....................................................................................................... 57
Figura 33. Dicroísmo circular da A) BSA livre em PB sem NaCl e com 4 g.L-1 NaCl. B)
BSA livre e adsorvida em SiO2NPs em PB sem NaCl e C) BSA livre e adsorvida em
SiO2NPs em PB com 4 g.L-1 NaCl. ............................................................................ 58
Figura 34. Diagrama da variação do formato e das dimensões da BSA de acordo com
o pH. Adaptado da Referência 85. ............................................................................ 58
Figura 35. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em função da
concentração de BSA. Estudos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4.
.................................................................................................................................. 59
Figura 36. Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs pH 6,0 e 7,4 obtidas através
de medidas de absorbância da proteína. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB
a 25 °C. ..................................................................................................................... 60
Figura 37. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia após cada injeção
de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-1 de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4. .......... 61
Figura 38. Dicroísmo circular da A) BSA livre em PB pH 6,0 e pH 7,4, B) BSA livre e
adsorvida em SiO2NPs em PB pH 7,4 e C) BSA livre e adsorvida em SiO2NPs em PB
pH 6,0. Experimentos realizados a 25 °C. ................................................................. 62
Figura 39. Distribuição de diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-SBS na ausência e
presença de A) BSA na condição padrão, B) lisozima na condição padrão e C) lisozima
em PBS. .................................................................................................................... 63
Figura 40. Diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-SBS em diferentes concentrações de
proteínas. O experimento com a BSA foi realizado em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C.
O experimento com a lisozima foi realizado em 0,01 mol.L-1 PBS, pH 7,4 e 25 °C. .. 64
Figura 41. Dado bruto da titulação de A) BSA em 5 g.L-1 de SiO2NPs-SBS na condição
padrão e de B) lisozima em 5 g.L-1 de SiO2NPs-SBS em PBS. ................................ 64
Figura 42. Isoterma de titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL das soluções de proteínas em uma suspensão de 5 g.L-1
de SiO2NPs-SBS. Experimentos com BSA e lisozima realizados respectivamente, na
condição padrão e em PBS. ...................................................................................... 65
Figura 43. Isotermas de adsorção de BSA e lisozima nas SiO2NPs-SBS em PB e PBS,
respectivamente, obtidas através de medidas de absorbância das proteínas. ......... 65
Figura 44. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL de uma solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB pH 7,4 a 25 e 37 °C. .. 67
Figura 45. Isoterma da titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados a 25 °C, pH 7,4, 0,01 mol.L-1 PB sem adição
de NaCl e com 4 g.L-1 desse sal. .............................................................................. 68
Figura 46. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4. .. 68
Figura 47. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-PEG em função da
concentração das proteínas BSA e lisozima. Experimento realizado em 0,01 mol.L-1
PB, pH 7,4, 25 °C. ..................................................................................................... 69
Figura 48. Dado bruto da titulação de A) BSA e B) lisozima em 5 g.L-1 de SiO2NPs-
PEG. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C. .......................... 70
Figura 49. Isoterma da titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de proteínas em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-PEG. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C. .......... 70
Figura 50. Isotermas de adsorção de BSA e lisozima nas SiO2NPs-PEG obtidas
através de medidas de absorbância da proteína. ...................................................... 71
Lista de Tabelas
Tabela 1. Diâmetro hidrodinâmico médio (DH), polidispersidade (PDI) e potencial zeta
das SiO2NPs, SiO2NPs precursoras das modificações, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-
PEG. .......................................................................................................................... 33
Tabela 2. Parâmetros termodinâmicos e NS da interação entre BSA e SiO2NPs nas
temperaturas de 25 e 37 °C. ..................................................................................... 50
Tabela 3. Valores de DH e potencial zeta da BSA e das SiO2NPs nos pH 6,0 e 7,4. 59
Lista de Abreviaturas e Siglas
1H-RMN: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
BSA: Albumina de soro bovino
CD: Dicroísmo circular
DH: Diâmetro hidrodinâmico
DLS: Espalhamento de luz dinâmico
DMAPTMS: N,N-dimetil-3-aminopropiltrimetoxissilano
EPR (efeito): Efeito de aumento de permeabilidade e retenção das nanopartículas em
tecidos tumorais
ITC: Calorimetria de titulação isotérmica
Lys: Lisozima
MEV: Microscopia eletrônica de varredura
NPs: Nanopartículas
PB: Tampão fosfato
PBS: Tampão fosfato salino (9 g.L-1 NaCl)
PEG: Polietilenoglicol
PEG2000: Polietilenoglicol de massa molar 2000 g.mol-1
PEG2000-TESPI: Polietilenoglicol silanizado
SBS: Composto zwitteriônico silano sulfobetaína
SiO2NPs: Nanopartículas de sílica sem modificação
SiO2NPs-PEG: Nanopartículas de sílica modificadas com PEG
SiO2NPs-SBS: Nanopartículas de sílica modificadas com SBS
TEM: Microscopia eletrônica de transmissão
MEV: Microscopia eletrônica de varredura
TEOS: Ortosilicato de tetraetila
TGA: Análise termogravimétrica
UV-vis: Espectrometria na região de comprimento de onda do ultravioleta e visível
ZW: Composto zwitteriônico
Sumário
1. Introdução ......................................................................................................... 17
1.1. Nanomateriais .............................................................................................. 17
1.2. Nanopartículas de sílica ............................................................................... 18
1.3. Protein corona .............................................................................................. 20
1.4. Nanopartículas corona free .......................................................................... 21
1.5. Albumina e lisozima ...................................................................................... 24
1.6. ITC ................................................................................................................ 24
2. Objetivo ............................................................................................................. 26
3. Metodologia ....................................................................................................... 26
3.1. Síntese e purificação das nanopartículas de sílica (SiO2NPs)...................... 26
3.2. Síntese do Silano Sulfobetaína (SBS) .......................................................... 27
3.3. Funcionalização das SiO2NPs com SBS (SiO2NPs-SBS) ............................ 27
3.4. Síntese do PEG2000 silanizado (PEG2000-TESPI) .......................................... 28
3.5. Funcionalização das SiO2NPs com PEG2000-TESPI (SiO2NPs-PEG) ........... 28
3.6. Caracterização das nanopartículas .............................................................. 29
3.6.1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ........................................... 29
3.6.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) .................................................... 29
3.6.3. Potencial zeta ........................................................................................ 29
3.6.4. Análise termo-gravimétrica (TGA) ......................................................... 30
3.6.5. Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H-RMN) .................... 30
3.7. Estudo de interação de proteínas com nanopartículas ................................. 30
3.7.1. Titulação calorimétrica (ITC) .................................................................. 30
3.7.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) .................................................... 31
3.7.3. Quantificação de proteínas por espectroscopia UV-vis .......................... 31
3.7.4. Dicroísmo circular ................................................................................... 32
3.7.5. Eletroforese ............................................................................................ 32
4. Resultados e discussão ................................................................................... 32
4.1. Caracterização das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG ..................... 32
4.2. Avaliação do efeito Protein corona ............................................................... 41
4.2.1. Interação das proteínas albumina e lisozima com as SiO2NPs .............. 42
4.2.2. Efeito da temperatura ............................................................................. 43
4.2.3. Efeito da força iônica .............................................................................. 53
4.2.4. Efeito do pH ............................................................................................ 58
4.3. Avaliação do efeito corona free nas SiO2NPs-PEG e SiO2NPs-SBS ........... 62
4.3.1. Interação das proteínas albumina e lisozima com SiO2NPs-SBS .......... 62
4.3.2. Interação das proteínas albumina e lisozima com SiO2NPs-PEG .......... 69
5. Conclusões ....................................................................................................... 71
6. Bibliografia ........................................................................................................ 74
7. Apêndice ............................................................................................................ 82
17
1. Introdução
1.1. Nanomateriais
Nanomateriais são definidos como materiais que possuem pelo menos uma
de suas dimensões na escala nanométrica compreendida entre 1 e 100 nm.1 Além
disso, eles são conhecidos por apresentarem propriedades físicas, químicas e ópticas
diferentes de materiais na escala macroscópica de mesma composição. Devido a
essa singularidade, os nanomateriais vêm recebendo grande destaque em diversas
pesquisas e aplicações.2 Nesse contexto, uma área que despertou grande interesse
por essas características é a nanomedicina.3
O conceito de utilização de nanomateriais na nanomedicina é baseado na
possibilidade de criar nanopartículas com alta especificidade e afinidade a algum tipo
de célula. Essas características se tornam muito relevantes ao serem aplicadas tanto
em diagnósticos, como em terapias e na liberação controlada de fármacos.4 Para o
último caso, é possível citar algumas vantagens, como por exemplo: a) a diminuição
da dosagem do medicamento e dos efeitos colaterais em decorrência da entrega do
fármaco ser mais eficiente, b) a possibilidade de utilizar fármacos hidrofóbicos5,6, algo
completamente inviável nos métodos de dosagem convencional e c) propiciar
proteção ao medicamento contra alteração de pH, atuação de enzimas e/ou
degradação química, proporcionando maior estabilidade e tempo de circulação do
fármaco.7
Até o ano de 2016, a FDA (Food and Drug Administration – Administração
de comidas e remédios) dos Estados Unidos havia aprovado 51 agentes terapêuticos
ou de imageamento compostos por nanomateriais para aplicação na nanomedicina.8
De fato, mais de 50% dessas nanopartículas são compostas por lipossomas,
nanocristais e emulsões.9 Além disso, o direcionamento desses materiais até as
células cancerosas ocorre principalmente através de um mecanismo passivo,
chamado de Efeito EPR (Enhanced Permeability and Retention)10, conforme explicado
a seguir e ilustrado na Figura 1. O Efeito EPR é baseado no aumento da
permeabilidade das nanopartículas nos envoltórios dos vasos sanguíneos em regiões
próximas à tecidos tumorais. Essa permeabilidade é uma consequência da criação de
poros entre as células endoteliais que revestem esses vasos sanguíneos. Em
18
decorrência do tamanho desses poros formados, as nanopartículas de até 100 nm
apresentam a permeação facilitada.5 Dessa forma, elas conseguem atingir o tecido
tumoral e são internalizadas pelas células.11 No entanto, as internalizações ocorrem
tanto em células cancerosas como também em células sadias. Ou seja, esse
mecanismo leva a uma acumulação não específica do nanomaterial.12
Figura 1. Representação esquemática do efeito EPR. Adaptado da Referência 13.
Somente por meio de modificação da superfície das partículas é possível
obter uma acumulação do nanomaterial predominantemente em células doentes.
Esses grupos modificadores devem interagir especificadamente com moléculas alvos
presentes apenas na superfície dessas células. No entanto, não são todas as
nanopartículas que possibilitam esse tipo de modificação.
1.2. Nanopartículas de sílica
As nanopartículas de sílica estão entre as nanoestruturas mais promissoras
para aplicação na biomedicina.14,15,16 Sua síntese, baseada no método de Stöber, é
geralmente realizada em meio etanólico, por meio de condensação dos grupos
ortosilicatos de tetraetila (TEOS), utilizando hidróxido de amônio como catalisador. As
nanopartículas obtidas usualmente possuem tamanho uniforme, o qual pode ser
controlado pela concentração dos reagentes durante a síntese.17 Além disso, a
morfologia e a porosidade também podem ser controladas através de outras rotas
sintéticas.18
19
Li e colaboradores19,20 têm demonstrado que as nanopartículas de sílica
obtidas através do método de Stöber são formadas por um processo de agregação de
partículas primárias. Em decorrência disso, uma microporosidade interna é criada. Na
Figura 2 é apresentada a imagem de TEM obtida por tal grupo de pesquisa, mostrando
as partículas primárias constituindo cada nanopartícula de sílica.
Figura 2. TEM das SiO2NPs obtida por Li e colaboradores.20
A funcionalizações químicas dos poros e da superfície das nanopartículas
de sílica pode ser realizada de forma simples e eficiente através de reação com os
grupos silanóis (SiOH) presentes nessas regiões.21,22 Por exemplo, pode-se obter
nanopartículas com alta especificidade a um determinado tipo de célula por meio de
modificação da superfície com grupos direcionadores. Peptídeos, anticorpos,
proteínas, glicose, aptâmeros e moléculas pequenas são os principais tipos de
direcionadores estudados atualmente.23,24 Através desse tipo de funcionalização, a
entrega do medicamento às células doentes torna-se muito mais eficiente. Dessa
forma, no caso de células cancerosas, além do direcionamento pelo efeito EPR,
também obteria o direcionamento ativo através da interação específica entre as
superfícies das nanopartículas e das células. Consequentemente, as células sadias,
que também estão no meio ou próximas à massa tumoral, não seriam tão afetadas.
Contudo, em virtude do fenômeno conhecido como protein corona, as
funcionalizações com apenas grupos direcionadores não são suficientes para obter
nanopartículas eficazes em meios biológicos.25,26
20
1.3. Protein corona
Protein corona é um termo utilizado para descrever a formação de uma
camada de biomoléculas, geralmente proteínas, na superfície de nanomateriais
quando expostos aos meios biológicos.27 A protein corona pode ser dividida em duas
camadas. A primeira, conhecida por hard corona, é aquela que interage diretamente
com a superfície da nanopartícula, uma vez que possui alta afinidade por ela. A
segunda camada, denominada soft corona, é constituída por proteínas que possuem
baixa afinidade pela superfície, e interagem com a hard corona por interações fracas.28
Em decorrência da formação da protein corona, as nanopartículas adquirem uma
identidade biológica completamente diferente da identidade sintética.29,30 Além disso,
a protein corona encobre as modificações feitas previamente à sua formação.
Consequentemente, a acessibilidade do grupo direcionador ao receptor da célula é
reduzida.31
Atualmente duas estratégias estão sendo investigadas para reverter essas
limitações. A primeira é baseada em induzir apenas adsorção de proteínas que
possam atuar como direcionadores. Isso pode ser obtido tanto por meio de
modificações da superfície das nanopartículas que as tornem seletivas a um tipo de
proteína, como por recobrimento dessa superfície com uma proteína específica que
possa atrair apenas proteínas similares.32,33,34 Para tal estratégia, o principal objetivo
é entender como a protein corona é formada e quais são as classes de proteínas que
têm maior afinidade a um determinado tipo de superfície35 (Figura 3 – Protein corona
controlada).
A segunda estratégia é baseada em evitar a formação da protein corona.
Nesse caso, a superfície das nanopartículas pode ser modificada com moléculas que
impeçam esse processo, ocasionando o efeito corona free35 (Figura 3 –
Nanopartículas com grupos direcionadores).
21
Figura 3. Estratégias utilizadas para reverter a formação da protein corona não
específica. Imagem adaptada da Referência 35.
1.4. Nanopartículas corona free
Para se obter nanopartículas corona free, modificações nas superfícies
dessas nanoestruturas são realizadas. Os compostos utilizados nessas modificações
são ligados covalentemente à superfície do nanomaterial e devem possuir capacidade
de evitar a adsorção de proteínas, alta hidrofilicidade, neutralidade elétrica e
biocompatibilidade.36,37
O PEG (polietilenoglicol) é um dos principais compostos utilizados para se
obter o efeito corona free.38 A funcionalização com PEG de massas molares 2000 ou
5000 g.mol-1 torna esse efeito mais expressivo.39 Contudo, esse polímero não possui
capacidade de suprimir completamente a adsorção de proteínas.40,41 Estudos
realizados mostram que mesmo variando o comprimento da cadeia polimérica do PEG
ou alterando a distância entre as cadeias, não há sucesso na obtenção de
nanopartículas 100% corona free.42 Além disso, esse polímero pode sofrer oxidação
espontaneamente ou por ação de enzimas.26 Acrescenta-se ainda que estudos têm
observado a predisposição dos pacientes a produzirem anticorpos atuantes contra ele
já na segunda aplicação.43 Por outro lado, como uma alternativa ao PEG, compostos
zwitteriônicos (ZW) vêm sendo estudados, demonstrando sobretudo serem mais
adequados para esse tipo de aplicação.44,45
A ideia de utilizar compostos zwitteriônicos foi inspirada pela abundância
de fosfatidilcolina nas membranas celulares, principalmente na parte externa.46 Esse
composto possui um grupo fosfato carregado negativamente e um amônio quaternário
22
carregado positivamente (Figura 4). Em decorrência da presença dessa molécula
zwitteriônica, as membranas celulares possuem a capacidade de evitar a adsorção de
biomoléculas em sua superfície.36 Muitas pesquisas, posteriormente, surgiram afim de
obter superfícies não aderentes através da modificação dessas com compostos
zwitteriônicos. Os principais grupos iônicos utilizados são amônio quaternário como
cátion, e grupos fosfato, carboxilato e sulfonato como ânions.46
Figura 4. Ilustração de uma membrana celular e a fórmula estrutural do composto
zwitteriônico fosfatidilcolina. Adaptado da Referência 46.
A capacidade dos compostos zwitteriônicos e do PEG de evitar a
adsorção de proteínas é uma consequência de dois fatores. O primeiro fator é a
camada de hidratação formada na superfície, agindo como uma barreira física e
energética para evitar a adsorção (Figura 5).47 No entanto, as propriedades de
hidratação se diferenciam entre os compostos acima, conforme observado por Leng
e colaboradores.48 Uma interação mais forte entre os compostos zwitteriônicos e as
moléculas de água foi observada em comparação com o PEG. Logo, apesar de ambos
os compostos interagirem com as moléculas de água por ligações de hidrogênio, para
o ZW há também a contribuição da interação ainda mais forte da solvatação iônica.
Em decorrência disso, em presença de proteína, a alteração do ordenamento das
moléculas de água só é observada para o PEG, mas que ainda assim resiste à
adsorção. Entretanto, apenas essa hipótese não justifica o fenômeno observado.
Nanopartículas de sílica sem modificação também possuem camada de hidratação
23
devido às hidroxilas protonadas e/ou desprotonadas e mesmo assim a protein corona
é formada em sua superfície.
O segundo fator está diretamente relacionado ao fato dos modificadores
corona free portarem neutralidade de cargas e uma distribuição uniforme delas. Dessa
forma, uma redução das atrações eletrostáticas entre as cargas da proteína e da
nanopartícula ocorre, evitando a adsorção da proteína.47
O efeito corona free do PEG também possui a contribuição do Efeito
estérico (ou volume excluído). Para ocorrer a adsorção de proteínas em uma
superfície recoberta com esse polímero há uma penalidade entrópica devido a
compressão da cadeia polimérica (Figura 5). Com isso, o processo é caracterizado
por uma energia livre de Gibbs positiva e portanto, não espontâneo.36
Figura 5. Mecanismo da resistência de adsorção: A) efeito estérico governado pela
instabilidade entrópica e B) formação da camada de hidratação via solvatação iônica
(ZW) e ligação de hidrogênio (PEG e ZW). Adaptado da Referência 49.
Os compostos zwitteriônicos carboxibetaína, fosfobetaína e sulfobetaína
podem ser utilizados para se obter nanopartículas corona free. O composto
zwitteriônico sulfobetaína foi escolhido para este trabalho, pois, ele apresenta
neutralidade de cargas em toda a faixa de pH50 em decorrência do baixo valor de pKa
do grupo sulfonato (pKa = -9).51 Um estudo realizado mostrou que esse composto
possui a característica de manter os seus grupos carregados distantes entre si,
24
independentemente do número de carbonos presentes entre os grupos sulfato e
amino.52 Provavelmente isso ocorre devido à alta interação dessas cargas com as
moléculas de água, assim como possíveis efeitos estéricos.
1.5. Albumina e lisozima
Albumina de soro bovino (BSA) e lisozima são duas proteínas modelos
bastante estudadas na literatura.53,54,55 Elas são conhecidas por apresentarem
propriedades diferentes.
A BSA é uma proteína com massa molar de 66,430 kDa, dimensão de (9,0
x 6,0 x 5,0) nm3 e apresenta o ponto isoelétrico em pH 4,8.53,55,56 Ou seja, em pH
fisiológico essa proteína apresenta uma carga negativa. O interesse das pesquisas
por ela advém do fato da albumina ser a proteína mais abundante no plasma
sanguíneo humano.55 Como a BSA possui 76%57 de semelhança com a albumina
humana (HSA) e é mais acessível economicamente, geralmente os experimentos são
realizados com essa proteína. Embora diversos estudos de interação dessas
proteínas com nanopartículas de sílica já tenham sido reportados, nenhum deles
apresenta resultados sistemáticos da influência da temperatura, pH e força iônica na
termodinâmica dessa interação.
A lisozima é considerada uma proteína “hard” devido à sua alta estabilidade
estrutural.58 Essa proteína possui 129 resíduos de aminoácidos59, apresenta ponto
isoelétrico em pH 11, massa molar de 14,3 kDa e dimensão de (4,5 x 3,0 x 3,0)
nm3.56,58 Devido ao elevado ponto isoelétrico, ela apresenta carga positiva em uma
ampla faixa de pH. Em decorrência dessa carga positiva, estudos identificaram uma
forte adsorção dessa proteína em nanopartículas de sílica (carregada negativamente)
devido às interações eletrostáticas.58,60 Por esse motivo, ela se torna interessante para
verificar se as modificações da superfície com compostos zwittêriônicos ou PEG são
eficientes em evitar a formação de protein corona.
1.6. ITC
A técnica Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é a mais adequada
para os estudos termodinâmicos das interações entre nanopartículas e proteínas61 em
decorrência da alta sensibilidade. Além disso, é uma técnica simples que permite
25
trabalhar em sistemas com concentrações na escala micromolar.62 Através dela é
possível obter parâmetros termodinâmicos que possibilitam a caracterização das
interações, como estequiometria, constante de equilíbrio e variação da energia livre
de Gibbs, da entalpia e da entropia.63,64
O equipamento é composto por uma cela de referência e uma de amostra.
Entre as celas há um sensor de temperatura e para cada uma delas há também um
resistor, sendo todo esse sistema mantido dentro de um compartimento adiabático
(Figura 6). Através do sensor e dos resistores mencionados, as temperaturas das
celas são mantidas constantes e sob equilíbrio térmico durante todo o experimento.65
Figura 6. Representação esquemática do aparato de um ITC, representativo dado
bruto de um experimento e representativa isoterma de ligação ajustada com o modelo
de One set of sites. Imagem adaptada da Referência 65.
Nos estudos de protein corona o experimento consiste de injeções
sucessivas da solução de proteína em intervalos de tempo bem definidos na cela de
amostra já preenchida com a suspensão de nanopartícula, sendo todo esse processo
automatizado. Se eventualmente a interação entre a proteína e a nanopartícula for
exotérmica, uma menor potência é fornecida pela resistência de aquecimento à cela
de amostra; enquanto que para interações endotérmicas, uma maior potência é
requerida. O dado bruto dessa técnica é constituído por essa variação de potência
fornecida para a cela de amostra em função do tempo.66,67 O tratamento de dados
consiste na integração da área dos picos do dado bruto, obtendo um gráfico de
variação de entalpia por mol de titulante versus a proporção molar estudada. Os
26
parâmetros termodinâmicos entalpia (ΔH), energia livre de Gibbs (ΔG), entropia (ΔS),
constante de equilíbrio (K) e estequiometria (n) são calculados a partir desse último
gráfico mencionado (Figura 6).
2. Objetivo
O objetivo do trabalho aqui descrito consiste em sintetizar nanopartículas
de sílica e estudar a termodinâmica de interação dessas com diferentes proteínas
(albumina bovina e lisozima). Para tal, três nanopartículas de sílica são consideradas,
sendo uma sem modificação e as outras duas modificadas com grupos que produzem
superfícies corona free (zwitteriônico e polietilenoglicol, PEG). Três variáveis são
consideradas para o estudo de interação: pH, temperatura e força iônica.
3. Metodologia
3.1. Síntese e purificação das nanopartículas de sílica (SiO2NPs)
Síntese: 120 mL de etanol e 5,9 mL de NH4OH foram adicionados em um
balão de fundo chato de 250 mL. O balão foi vedado e a agitação branda foi mantida
por 30 min. Posteriormente, 2,5 mL de TEOS (ortosilicato de tetraetila) foram
adicionados. Após 4 h de agitação, 2,5 mL de TEOS foram novamente adicionados e
o sistema foi mantido em agitação por 24 h.
Purificação: O volume final da síntese foi dividido em quatro tubos Falcon
(aproximadamente 30 mL) e centrifugado a 10.000 rpm por 15 min a 20 °C. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e 15 mL de etanol foram adicionados
em cada tubo Falcon. As nanopartículas foram ressuspendidas com auxílio de um
vórtex e sonicadas por 15 min. Após uma nova centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e as nanopartículas foram ressuspendidas em 30 mL de água Milli-Q. Em
seguida elas foram mantidas em banho de ultrassom por 30 min. Esse procedimento
de lavagem com água foi repetido quatro vezes. A concentração das nanopartículas
sintetizadas foi determinada por gravimetria, obtendo o valor de 8,8 mg.mL-1.
27
3.2. Síntese do Silano Sulfobetaína (SBS)
12 mL de acetato de etila anidro foram adicionados em um balão de fundo
redondo, previamente purgado com N2 e aquecido a 45 °C em banho de óleo de
silicone. Posteriormente, 2,06 g de DMAPTMS (N,N-dimetil-3-
aminopropiltrimetoxissilano) e 1,27 g de 1,3-propano sultona foram adicionados em 2
mL de acetato de etila em frascos separados. A solução de DMAPTMS foi adicionada
ao balão reacional e após 5 min a solução de sultona foi então adicionada. A reação
foi realizada sob o fluxo constante de N2 e agitação. Após 2 h, mais 10 mL de solvente
foram adicionados e o fluxo de N2 foi retirado. Após 3 h, o aquecimento foi removido e
a reação foi mantida overnight. A estrutura química do SBS é apresentada na Figura
7:
Figura 7. Estrutura química do SBS
Purificação: Acetona foi adicionada sobre o precipitado formado e esse foi
transferido para um tubo Falcon. A solução foi centrifugada a 5.000 rpm por 5 min a
20 °C. O sobrenadante foi retirado e o precipitado foi redisperso em acetona com o
auxílio de um vórtex. Esse procedimento foi repetido três vezes. Secou-se o produto
com bomba de vácuo e o produto foi armazenado em um dessecador.
3.3. Funcionalização das SiO2NPs com SBS (SiO2NPs-SBS)
Para 80 mL de suspensão de SiO2NPs sem funcionalização, 281,9 mg de
SBS foram dissolvidos em 6,13 mL de água. Posteriormente, essa solução foi agitada
em vórtex e deixada em repouso por 30 min, para em seguida ser adicionada gota a
gota na suspensão de SiO2NPs. Após 20 h de reação sob agitação constante, 2 mL
de NH4OH foram adicionados e a solução foi aquecida por 4 h a 80 °C. Por fim, as
nanopartículas foram purificadas através de três lavagens com água conforme
descrito na seção 3.1.
28
3.4. Síntese do PEG2000 silanizado (PEG2000-TESPI)
1,476 g de PEG2000 foi adicionado em balão de duas bocas de 50 mL. O
balão foi fechado com septo e torneira de teflon. O sistema foi mantido sob vácuo e a
40 °C durante 24 horas. Posteriormente, o vácuo foi retirado e purgou-se argônio
durante 1 hora. 0,02 mL de Trietilamina e 0,2 mL de de 3-(trietoxisilil) propil isocianato
foram adicionados lentamente ao balão de reação. Manteve-se o sistema a 80 °C, sob
atmosfera de argônio por 8 horas. Posteriormente, o argônio foi retirado e o sistema
foi mantido em agitação a 80 °C por mais 20 horas. A estrutura química do PEG2000
silanizado é apresentada na Figura 8:
Figura 8. Estrutura química do PEG2000 silanizado.
3.5. Funcionalização das SiO2NPs com PEG2000-TESPI (SiO2NPs-PEG)
Para 60 mL de suspensão de SiO2NPs sem funcionalização, 0,9196 g de
PEG2000-TESPI foram dissolvidos em 4 mL de água. Posteriormente, essa solução foi
agitada em vórtex e adicionada em um erlenmeyer contendo a suspensão de SiO2NPs
e 1,5 mL de NH4OH. Após 16 h de reação sob agitação constante a temperatura
ambiente, o sistema foi aquecido a 80° e foi mantido nesta temperatura durante 4
horas. Por fim, as nanopartículas foram purificadas através de três lavagens com
água conforme descrito na seção 3.1.
29
3.6. Caracterização das nanopartículas
3.6.1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As imagens de microscopia eletrônica de varredura das nanopartículas
foram obtidas num microscópio de alta resolução FEI Inspect F50. As amostras foram
preparadas depositando uma gota (7 μL) da suspensão de nanopartículas diretamente
sobre um substrato de cobre. Os elétrons secundários foram coletados após o
retroespalhamento das amostras revestidas de Au atingidas por feixes de elétrons
com energia de 5 kV. As imagens obtidas foram analisadas com o software ImageJ.
3.6.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
O diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas foi avaliado utilizando o
equipamento Malvern Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., UK – ângulo de 173° e
comprimento de onda de 633 nm). As nanopartículas sintetizadas foram sonicadas e
diluídas em água Milli-Q anteriormente às medidas.
3.6.3. Potencial zeta
A carga superficial das nanopartículas foi avaliada através das medidas de
potencial zeta realizadas no equipamento Malvern Zetasizer ZS (Malvern Instruments
Ltd., UK). Previamente às medidas, as suspensões foram sonicadas e diluídas a 1
g.L-1 em 0,01 mol.L-1 tampão fosfato (PB) de pH 7,4.
No estudo de variação do potencial zeta das nanopartículas em função do
pH as seguintes soluções/suspensões foram preparadas: 1) 10 mL de 1 g.L-1 de NPs
em solução de 0,01 mol.L-1 de NaOH e 0,01 mol.L-1 de NaCl, 2) solução de 0,25 mol.L-
1 e 0,025 mol.L-1 de HCl contendo 0,01 mol.L-1 de NaCl. Adições das soluções ácidas
nas suspensões de nanopartículas foram realizadas, seguidas de agitação e medidas
de potencial zeta.
30
3.6.4. Análise termo-gravimétrica (TGA)
As análises termogravimétricas das nanopartículas foram realizadas no
equipamento Thermogravimetric Analyser Pyris 1 (Perkin-Elmer). As amostras foram
aquecidas de 110 a 850 ºC sob atmosfera de N2 a uma taxa de aquecimento de 10 ºC
por minuto.
3.6.5. Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H-RMN)
Para realizar as análises de 1H-RMN, 1,5 mL das amostras de
nanopartículas foram centrifugadas e concentradas a 100 μL de suspensão.
Posteriormente, 600 μL de água deuterada contendo o padrão ácido trimetilsilil
propiônico (TMSP) foram adicionados às suspensões. As amostras de SBS e PEG2000-
TESPI foram preparadas dissolvendo cerca de 20 mg desses compostos em 600 μL
de água deuterada. As análises foram realizadas no equipamento Agilent DD2 500
MHz.
3.7. Estudo de interação de proteínas com nanopartículas
3.7.1. Titulação calorimétrica (ITC)
Previamente às medidas de ITC, as proteínas foram dialisadas em tampão
PB ou PBS utilizando uma membrana de diálise retentora de proteínas maiores que
12 kDa. Os experimentos de calorimetria foram realizados no equipamento MicroCal
PEAQ-ITC (Malvern). Alíquotas de 2μL da solução de proteína foram adicionadas por
uma seringa de injeção automática em uma cela contendo 5 g.L-1 de nanopartículas
de sílica. Essa adição foi realizada até a indicação de saturação da superfície das
NPs. O mesmo procedimento foi realizado titulando a proteína em tampão, de modo
a permitir descontar os calores de diluição, restando apenas informação sobre a
interação entre os dois componentes.
Todos os tratamentos de dados do ITC foram baseados nos artigos de C.
Airoldi68,69 e V. Pravdic70, pois não foram obtidas as sigmoides completas para esses
31
experimentos, impossibilitando de realizar o tratamento de dados pelo método
convencional. Na seção 4.2.2 é descrito o tratamento de dados realizado.
3.7.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
A variação do diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas após a incubação
com as proteínas foi avaliado utilizando o equipamento Malvern Zetasizer ZS (Malvern
Instruments Ltd., UK). 1,43 mL da suspensão de 1 g.L-1 de nanopartículas foram
adicionados em uma cubeta e essa foi mantida em agitação por 8 min em um
termobloco Thermomixer C (Eppendorf, Germany) a 450 rpm na correspondente
temperatura do experimento. Posteriormente, realizou-se a medida de diâmetro
hidrodinâmico. Nessa mesma cubeta, adições de 3 e 5 μL de solução de 0,28 mmol.L-
1 de proteína foram feitas. Após cada adição, o sistema foi incubado por 8 min
utilizando o termobloco (450 rpm, 25 ou 37 °C) e posteriormente a medida no DLS foi
realizada.
3.7.3. Quantificação de proteínas por espectroscopia UV-vis
Medidas de absorbância foram realizadas para se obter a quantidade de
proteína que foi adsorvida na superfície das nanopartículas. Para isso, 0 – 34,5
μmol.L-1 de proteínas foram incubadas em 600 μL de 5 g.L-1 de nanopartículas durante
10 minutos a 450 rpm, a 25 ou 37 °C. Posteriormente, as suspensões foram
centrifugadas por 15 min a 14.000 rpm e 20 °C. O sobrenadante foi retirado e
centrifugado novamente nas mesmas condições. Similarmente às suspensões
encubadas, as soluções da curva de calibração foram preparadas, entretanto
substituindo as suspensões de nanopartícula por tampão PB. As medidas de
absorbância em 280 nm dos sobrenadantes e da curva de calibração foram realizadas
no espectrofotômetro UV-vis Agilent 8453. Determinou-se a concentração da BSA
(Sigma A7030, composição ≥ 98%) através da absorbância. Considerou-se ε = 38940
mol-1.L.cm-1 71 para os experimentos com lisozima (Sigma L2879, composição ≥ 80%).
Assim como realizado para as medidas de ITC, todos os tratamentos de dados do UV-
vis foram baseados nos artigos de C. Airoldi68,69 e V. Pravdic70 e na seção 4.2.2 é
descrito como foram feitos.
32
3.7.4. Dicroísmo circular
As seguintes soluções foram preparadas para as medidas de dicroísmo
circular: 0,01 mol.L-1 de tampão, 0,5 g.L-1 de SiO2NPs em tampão, 7,5 μmol.L-1 BSA
em tampão e uma suspensão de SiO2NPs com BSA (0,5 g.L-1 de SiO2NPs e 7,5
μmol.L-1 BSA em tampão). As suspensões/soluções ficaram durante 15 minutos no
termobloco Thermomixer C (Eppendorf, Germany) a 25 ou 37 °C e 450 rpm. Após este
tempo as suspensões foram centrifugadas 6 vezes por 15 min, a 20 °C e 14000 rpm,
sempre reservando 700 μL dos sobrenadantes e adicionando ao precipitado 700 μL
de tampão. Durante o experimento de dicroísmo circular 10 medidas foram feitas para
o tampão PB e suspensões de NP, enquanto que para a BSA foram realizadas 20
medidas.
3.7.5. Eletroforese
Após finalizada as medidas de dicroísmo circular, com as mesmas
soluções, incluindo os sobrenadantes das centrifugações, um gel de eletroforese
(SDS-PAGE) foi corrido. O tampão 5x Laemmli sample buffer (Biorad 161-0747)
contendo 2-mercaptoetanol foi adicionado às suspensões de nanopartículas e BSA e
posteriormente deixou incubado a 95 °C por 5 minutos. Posteriormente, 20 μL de cada
solução foram separados em um gel 12% SDS-PAGE. O gel foi corrido na voltagem
constante de 200 V por 1h, e posteriormente foi corado com Comassie Brilliant Blue
para visualização das bandas. PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo
Scientific #26616) foi utilizado como padrão.
4. Resultados e discussão
4.1. Caracterização das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG
Neste trabalho, três tipos de nanopartículas de sílica foram sintetizadas. A
primeira, identificada como SiO2NPs, tem a superfície constituída principalmente por
grupos hidroxilas (Figura 9A). A segunda, nomeada como SiO2NPs-SBS, foi obtida
após modificar a superfície das SiO2NPs com o composto zwitteriônico SBS (Figura
33
9B). A terceira, denominada como SiO2NPs-PEG, apresenta em sua superfície o
polímero PEG2000 (Figura 9C). Tanto as SiO2NPs, bem como as SiO2NPs-SBS e
SiO2NPs-PEG foram caracterizadas pelas seguintes técnicas: MEV, DLS, potencial
zeta, 1H-RMN e TGA.
Figura 9. Ilustração da superfície das A) SiO2NPs, B) SiO2NPs-SBS e C) SiO2NPs-
PEG.
As medidas de diâmetro hidrodinâmico (DH) e potencial zeta foram
realizadas a fim de verificar a formação das nanopartículas de sílica. Na Tabela 1 são
apresentados os resultados de DLS e de potencial zeta e na Figura 10 é apresentada
a distribuição de tamanho das nanopartículas por intensidade.
Tabela 1. Diâmetro hidrodinâmico médio (DH), polidispersidade (PDI) e potencial zeta
das SiO2NPs, SiO2NPs precursoras das modificações, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-
PEG.
Funcionalização Nanopartícula DH / nm PDI Potencial Zeta (𝜻) / mV
SiO2NPs 102 ± 1 0,06 ± 0,01 -48 ± 3
SBS SiO2NPsprecursora 102 ± 1 0,06 ± 0,01 -43 ± 2
SiO2NPs-SBS 98 ± 1 0,02 ± 0,02 -51 ± 1
PEG SiO2NPsprecursora 101 ± 2 0,05 ± 0,01 -52 ± 3
SiO2NPs-PEG 101 ± 1 0,02 ± 0,01 -9 ± 1
34
Figura 10. Distribuição de tamanho das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG em
função da intensidade.
É importante mencionar que as SiO2NPs apresentadas neste trabalho e as
SiO2NPs precursoras da funcionalização com SBS e com PEG foram sintetizadas em
momentos distintos. Entretanto, verificou-se na Figura 10 e na Tabela 1 que os
diâmetros hidrodinâmicos das três nanopartículas são semelhantes. Salienta-se ainda
que mesmo após a modificação da superfície com SBS e PEG não houve alteração
no DH e na polidispersidade.
De acordo com a Tabela 1, as SiO2NPs apresentaram um potencial zeta
negativo (-48 mV) em pH fisiológico. Essa observação é decorrente da desprotonação
das hidroxilas presentes na superfície (Figura 9A), uma vez que o ponto isoelétrico
das nanopartículas de sílica encontra-se na faixa de pH 2 a 3.72,73 Para as SiO2NPs-
PEG, foi observada uma alteração do 𝜁 para – 9 mV. Ou seja, a funcionalização da
superfície com PEG diminuiu a carga superficial negativa, conforme o esperado, visto
que o PEG é um polímero neutro. No entanto, para as SiO2NPs-SBS não foi
observado esse mesmo comportamento, apesar de compostos zwitteriônicos também
apresentarem carga total nula. Essa manutenção do potencial zeta negativo (-51 mV)
para nanopartículas modificadas com zwitteriônico não apenas foi observada neste
trabalho, como também já foi relatada na literatura.44,74 De acordo com Estephan et
al44, o potencial zeta negativo é um indicativo da presença de grupos silanóis
desprotonados oriundos da superfície das partículas e do SBS, conforme ilustrado na
Figura 11. Adicionalmente, existe a possibilidade dos grupos silanóis dos compostos
SBS se condensarem e formarem uma espécie de oligômero. Dessa forma, a
35
superfície das nanopartículas de sílica não apresenta modificações com várias
unidades de SBS, mas sim com algumas unidades do oligômero de SBS.
Figura 11. Ilustração de algumas das possíveis associações do SBS na superfície das
nanopartículas de sílica. Adaptado da Referência 44.
Um estudo da influência do pH sobre o potencial zeta das nanopartículas
foi realizado com o propósito de verificar a hipótese acima. O experimento consistiu
de adições de 0,25 mol.L-1 e 0,025 mol.L-1 de HCl nas nanopartículas suspendidas em
solução de 0,01 mol.L-1 de NaOH. Tanto na solução ácida, assim como também na
solução básica, havia 0,01 mol.L-1 de NaCl. Primeiramente, destaca-se que na faixa
de pH estudada as cargas presentes no composto zwitteriônico SBS não sofrem
alterações. Isso ocorre devido aos seguintes fatos: a) a carga do grupo amônio é
completamente independente do pH do meio e b) o grupo ácido sulfônico é
considerado um ácido forte e consequentemente permanece desprotonado na faixa
de pH estudada. Portanto, quaisquer variações no potencial zeta das nanopartículas
funcionalizadas com esse composto somente poderiam ser decorrentes dos grupos
hidroxilas presentes na superfície. Analisando os resultados da Figura 12 verificou-se
que as curvas obtidas para as SiO2NPs e as SiO2NPs-SBS apresentaram
comportamentos similares. Um deslocamento do potencial zeta dessas
nanopartículas para valores mais negativos ocorreu quando o pH do meio aumentou.
A variação do potencial zeta ficou entre -55 a -4 mV. Esses resultados estão de acordo
com a hipótese apresentada anteriormente, confirmando a presença dos grupos
silanóis livres nessas duas nanopartículas. As SiO2NPs-PEG também apresentaram
essa mesma tendência, no entanto, a variação no potencial zeta foi pequena e
próxima de -4 a -17 mV. Dessa forma, a funcionalização das SiO2NPs-PEG foi mais
eficiente em termos de reatividade dos silanóis em comparação com as SiO2NPs-SBS.
36
É importante mencionar que entre as três nanopartículas, apenas as SiO2NPs-SBS
apresentaram agregados em pH ~ 3,5.
Figura 12. Variação do potencial zeta das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG
em função do pH.
O tamanho e a forma das nanopartículas foram avaliados por MEV,
resultando nas imagens com as correspondentes distribuições de diâmetros
apresentadas na Figura 13. Verificou-se que as SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-
PEG possuem formato aproximadamente esférico e uma distribuição de tamanho
monomodal com uma média de diâmetro de (80 ± 9) nm, (77 ± 8) nm, e (84 ± 7) nm
respectivamente.
37
Figura 13. MEV e correspondente distribuição de diâmetro das A) SiO2NPs, B)
SiO2NPs-SBS e C) SiO2NPs-PEG
A diferença de tamanho observada para as nanopartículas utilizando DLS
e MEV é uma consequência dessas técnicas serem fundamentalmente diferentes. Por
DLS é obtido o diâmetro hidrodinâmico das partículas, visto que elas ficam em
suspensão. Dessa forma, a camada de hidratação (≈ 10 nm) é considerada no valor
de DH. Além disso, essa técnica é baseada no espalhamento de luz causado pela
amostra, sendo esse proporcional ao raio elevado à sexta potência (raio6). Desse
38
modo, as partículas maiores possuem uma contribuição maior para a intensidade
espalhada, deslocando o DH medido para valores superiores. Por outro lado, as
medidas de microscopia não só se diferenciam por usar amostra seca, como também
por considerar as partículas em número.75
Análises de DLS, potencial zeta e microscopia caracterizam muito bem o
tamanho, a forma e a carga superficial das nanopartículas. Entretanto, medidas de
TGA e RMN foram necessárias para caracterizar a funcionalização das SiO2NPs.
Observou-se por TGA um aumento percentual de matéria orgânica nas amostras de
SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG em relação à SiO2NPs (Figura 14). Uma perda de
massa de aproximadamente 4,5% foi observada após o aquecimento da amostra de
SiO2NPs até aproximadamente 850 °C. Isso pode estar relacionado tanto aos grupos
etóxi do TEOS que não reagiram5, como ao processo de desidratação envolvendo
esses grupos.
Figura 14. Curvas de TGA das SiO2NPs, SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG.
Para as SiO2NPs-SBS, verificou-se por TGA, uma variação da massa da
amostra num total de 6,7%. Dessa forma, 2,2% da massa perdida deve ser associada
ao SBS. Considerando as porcentagens acima e que o diâmetro e a densidade da
SiO2NPs são, respectivamente, 77 nm e 1,9 g.cm-3, 76 pode-se calcular a área ocupada
por uma molécula de zwitteriônico (cálculo demonstrado no apêndice). O resultado
obtido foi de 60 Å2/molécula de SBS. Comparativamente, um valor similar de 50
Å2/molécula foi relatado para o surfactante SDS na interface água-ar próximo à
concentração micelar crítica.77 Esse surfactante também é constituído por um grupo
sulfato em uma das pontas de sua cadeia. Assim sendo, o valor obtido para a
39
funcionalização com SBS está de acordo com dados reportados para composto
químico de estrutura similar, sugerindo uma alta cobertura da superfície das
nanopartículas.
Para as SiO2NPs-PEG foi observada uma perda de massa total de
aproximadamente 9,3%. Dessa forma, 4,8% da massa total da nanopartícula está
relacionada ao PEG. Semelhantemente às considerações feitas para as SiO2NPs-
SBS, a área ocupada por uma cadeia polimérica de PEG foi calculada. O valor obtido
foi de 264 Å2/PEG. Esse valor é 4 vezes maior do que a área ocupada por uma
molécula de SBS e pode indicar que o PEG não está na forma estendida na superfície.
As amostras SiO2NPs, SiO2NPs-SBS, SiO2NPs PEG, assim como SBS e
PEG2000-TESPI foram analisadas por 1H-RMN, com o propósito de complementar a
caracterização da funcionalização (Figura 15). Os espectros das nanopartículas foram
ampliados devido à baixa intensidade dos sinais de interesse.
40
Figura 15. Espectros de 1H-RMN das nanopartículas SiO2NPs, SiO2NPs-SBS,
SiO2NPs-PEG e dos compostos SBS e PEG2000-TESPI.
Verificou-se que o espectro das SiO2NPs, bem como das SiO2NPs-SBS e
SiO2NPs-PEG, apresentam sinais de baixa intensidade em deslocamentos químicos
semelhantes. Esses sinais podem estar associados aos grupos etóxi presentes na
superfície das nanopartículas. Todavia, para as SiO2NPs-SBS e SiO2NPs-PEG
também foram observados outros sinais de maior intensidade e com deslocamentos
químicos similares aos sinais presentes nos espectros do SBS e do PEG2000-TESPI,
respectivamente. Dessa forma, pode-se confirmar a modificação da superfície das
nanopartículas. Destaca-se ainda que enquanto foi observado no espectro do SBS o
pico de alta intensidade (*) relacionado aos grupos metóxi dessa molécula, no
espectro das SiO2NPs-SBS esse pico não está mais presente. Essa observação indica
41
que as modificações de superfície das nanopartículas ocorreram através dos grupos
silanóis.
Baseado nesses resultados, comprovou-se que as nanopartículas
sintetizadas possuem tamanhos e formas similares, e que as modificações das
superfícies com os grupos SBS e PEG foram efetivas. Diante disso, os estudos de
interação dessas nanopartículas com as proteínas albumina bovina e lisozima foram
iniciados.
4.2. Avaliação do efeito Protein corona
Os estudos de avaliação do efeito protein corona foram realizados
utilizando-se basicamente quatro técnicas: a) DLS, onde foi possível acompanhar se
os diâmetros hidrodinâmicos das nanopartículas variavam na presença das proteínas
em diferentes concentrações, b) UV-vis, a partir do qual foram obtidas as isotermas
de adsorção das proteínas nas nanopartículas, c) ITC, que possibilitou determinar os
parâmetros termodinâmicos das interações e d) CD, onde foi avaliado a existência de
interação hidrofóbica entre a proteína e a nanopartícula.
Nesses estudos foram considerados três fatores que poderiam influenciar
na interação das proteínas com as nanopartículas de sílica: temperatura, força iônica
e pH. Para cada um dos fatores acima, comparações foram realizadas entre uma
condição padrão (25 °C, em PB 0,01 mol.L-1 sem NaCl e pH 7,4) e a alteração
correspondente. Por exemplo, para o fator temperatura comparou-se a condição
padrão e a condição que alterava apenas a temperatura de 25 °C para 37 °C. O
esquema na Figura 16 representa essas alterações para cada fator estudado.
Figura 16. Esquema das condições experimentais estudadas.
42
4.2.1. Interação das proteínas albumina e lisozima com as SiO2NPs
O DLS foi a primeira técnica utilizada em todos os estudos de interação
entre proteínas e nanopartículas deste projeto. Através dela foi avaliado se no sistema
em estudo havia ou não interação por meio da variação do diâmetro hidrodinâmico.
Além disso, também foi avaliada a ocorrência de desestabilização do sistema devido
à formação de agregados.
Na Figura 17 são apresentadas as distribuições de DH das SiO2NPs em
presença de BSA e lisozima na condição padrão. Através desses dados, verificou-se
um pequeno deslocamento do DH das nanopartículas quando em presença de BSA
para valores maiores em decorrência da adsorção dessa proteína na superfície das
SiO2NPs. Contudo, agregados foram observados ao incubar essa mesma
nanopartícula com uma pequena concentração de lisozima. Igualmente ao observado
na condição padrão, esses agregados formados devido à adsorção da lisozima
também foram verificados em tampão fosfato salino (PBS). Esses resultados
demonstram a forte influência da carga da proteína na interação com as SiO2NPs.
Devido à forte atração eletrostática entre a lisozima (carregada positivamente) e as
SiO2NPs (carregadas negativamente) e, consequentemente, compensação das
cargas, o sistema se desestabiliza.
Figura 17. Distribuição do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em presença de A)
BSA e B) lisozima. Estudos realizados na condição padrão.
Visto que um dos objetivos desse trabalho é estudar a interação
termodinâmica entre proteínas e nanopartículas de sílica, sistemas em que
43
ocorressem a formação de agregados não poderiam ser considerados. Mediante ao
exposto, os estudos de interação entre as SiO2NPs e a lisozima foram inviáveis de
serem realizados. Dessa forma, apenas as interações das SiO2NPs com a BSA foram
investigadas.
4.2.2. Efeito da temperatura
Os estudos da influência da temperatura sobre a interação da BSA com as
SiO2NPs foram os primeiros a serem realizados. As temperaturas de 25 e 37 °C foram
escolhidas por serem respectivamente, o valor padrão de experimentos
termodinâmicos e a temperatura de sistemas biológicos.
Na Figura 18 estão apresentados os resultados do diâmetro hidrodinâmico
da nanopartícula (DH), assim como da variação desse parâmetro (Equação 1) após
incubação com diferentes concentrações de BSA.
∆𝐷𝐻 = 𝐷𝐻([𝐵𝑆𝐴] = 𝑥) − 𝐷𝐻([𝐵𝑆𝐴] = 0) 𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1
Figura 18. A) Diâmetro hidrodinâmico (DH) e B) variação do DH das SiO2NPs em
função da concentração de BSA a 25 e 37 °C. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-
1 PB com o pH em 7,4.
Na técnica de DLS o diâmetro hidrodinâmico das partículas é calculado a
partir da equação de Stokes-Einstein (Equação 2):
44
𝐷𝐻 =𝑘𝑇
3𝜋η𝐷 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 2)
onde DH é o diâmetro hidrodinâmico, k é a constante de Boltzmann, T é a temperatura,
η é a viscosidade do solvente e D é o coeficiente de difusão translacional. Nessa
equação, além da temperatura ser uma das variáveis, ela também influencia
diretamente nos valores de viscosidade e coeficiente de difusão. Adicionalmente, o
índice de refração do meio também é outra variável dependente da temperatura, que
igualmente influencia no DH por ser considerado nos cálculos previamente à aplicação
da equação de Stokes-Einstein. Durante o tratamento de dados do DLS, realizou-se
as devidas correções dessas variáveis. Entretanto, essas correções foram baseadas
em aproximações e variaram de acordo com a condição experimental. Por esse
motivo, é possível considerar que a pequena variação (1 nm) entre os resultados
obtidos para 25 e 37 °C (Figura 18A) pode advir de incertezas nos valores utilizados
em cada variável da equação. A mesma conclusão pode ser obtida ao analisar os
dados da Figura 18B, pois o aumento do DH relacionado à protein corona é
semelhante nas duas temperaturas. Portanto, concluiu-se que não foi constatada a
influência da temperatura sobre a interação da BSA com as SiO2NPs por DLS.
Ainda avaliando os gráficos da Figura 18, a curva obtida aparenta um
comportamento sigmoidal. Além disso, acima da concentração de BSA de 3 μmol.L-1,
a variação no DH é pequena, indicando uma saturação da superfície das
nanopartículas.
Um aumento da concentração das SiO2NPs de 1 g.L-1 para 5 g.L-1 foi
necessário para os experimentos de UV-vis e ITC. Igualmente, aumentou-se
proporcionalmente a faixa de concentração de BSA utilizada nesses experimentos.
Dessa forma, as absorbâncias dos sobrenadantes ficaram mais intensas e próximas
de 1, assim como também aumentou o calor total medido pelo ITC. As isotermas de
adsorção da BSA sobre as SiO2NPs nas temperaturas de 25 e 37 °C obtidas por UV-
vis estão apresentadas na Figura 19A. Do mesmo modo como foi observado por DLS,
não foi verificada a influência da temperatura na adsorção da proteína.
45
Figura 19. A) Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs nas temperaturas de 25 e
37 °C obtidas através de medidas de absorbância da proteína. B) Gráfico utilizado no
cálculo de NS referente ao experimento a 25 °C. Dois pontos foram desconsiderados
da curva.
Obteve-se por UV-vis a quantidade máxima de BSA adsorvida por grama
de partícula (NS), bem como as frações molares de BSA que permaneciam em solução
após o equilíbrio ser atingido. O NS foi calculado aplicando o modelo de Langmuir nos
resultados obtidos. Esse modelo faz as seguintes considerações: (a) todos os sítios
de adsorção são equivalentes e independentes, (b) à cada sítio de adsorção pode se
ligar apenas um soluto e (c) os solutos adsorvidos não interagem entre si.78 A equação
do modelo de Langmuir é dada por (Equação 3):
CS
NF=
CS
NS+
1
(NS. b) Equação (3)
onde CS é a concentração de BSA presente na solução após o equilíbrio (mol.L-1), NF
é a quantidade de BSA adsorvida (mol.g-1), NS é a quantidade máxima de BSA
adsorvida por grama de nanopartícula (mol.g-1) e b é um parâmetro relacionado à
constante de equilíbrio (L.mol-1). Aplicando a Equação 3 sobre a reta apresentada na
Figura 19B, obteve-se o valor de NS de 8,7.10-7 mol.g-1. Ou seja, para cada 1 grama
de SiO2NPs, são necessários 8,7.10-7 mols de BSA para se formar uma monocamada
de proteína na superfície da nanopartícula para os sistemas mantidos à 25 e 37 °C.
As medidas de ITC foram realizadas com o intuito de caracterizar
termodinamicamente a interação da BSA com as SiO2NPs. Através dos dados brutos
46
obtidos (Figura 20), verificou-se que a diluição da BSA é um processo endotérmico.
Dessa forma, quando esse processo ocorreu na cela de amostra do ITC, houve uma
diminuição da temperatura dessa cela, enquanto a temperatura da cela de referência
permaneceu constante. Com isso, uma maior potência foi fornecida à cela de amostra
pela resistência, conforme foi observado no gráfico como um aumento do DP
(“diferencial power”). Fazendo essa mesma análise para o dado bruto de interação,
observou-se no início da titulação um processo exotérmico lento (indicado por setas).
Entretanto, após as primeiras injeções, o processo era totalmente endotérmico e,
ademais, a maior parte desse calor envolvido pertencia ao processo de diluição.
Figura 20. Dado bruto da titulação de 0,38 mmol.L-1 de BSA em 5 g.L-1 de SiO2NPs.
Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C.
As análises de ITC foram as mais desafiadoras do trabalho em decorrência
da complexidade do sistema e da baixa relação sinal/ruído obtida durante as medidas.
Como observado na Figura 21, devido à baixa relação sinal/ruído, houve um erro
apreciável ao fazer a integração da área do pico para obter o calor envolvido na
interação. Para aumentar a intensidade desse sinal, uma quantidade muito maior de
nanopartículas seria necessária. No entanto, experimentos com o dobro da
concentração de nanopartículas (10 g.L-1) foram realizados e mesmo nessas
condições não foram obtidas mudanças significativas. Além disso, não foi possível
aumentar a concentração da proteína, pois ocasionaria a saturação da superfície das
SiO2NPs logo na primeira injeção.
47
Figura 21. Demonstração da baixa relação sinal/ruído observada durante as medidas
de ITC. Ampliação do pico da A) primeira injeção de diluição e B) penúltima injeção
de interação da Figura 20.
O ITC é uma técnica muito sensível e possui um controle maior de
temperatura se comparada às duas metodologias apresentadas anteriormente. Em
virtude disso, a influência da temperatura na interação da BSA com as SiO2NPs foi
verificada apenas por essa técnica. Na Figura 22 é apresentada a variação de calor e
de entalpia do sistema para os experimentos realizados a 25 e 37 °C. Nesses gráficos
os calores e entalpias de diluições já foram subtraídos. Essas subtrações são
realizadas para apontar apenas os processos de interação. Dessa forma, em análises
de ITC, o calor observado no final da titulação geralmente fica próximo de zero, visto
que apenas processos de diluições ocorrem nesse momento. Entretanto, esse
comportamento não foi observado em uma grande parte dos experimentos de
calorimetria realizados neste trabalho, havendo uma variação de entalpia residual de
algum processo secundário cuja origem não pôde ser identificada. Apesar disso, foi
constatado através da Figura 22 uma interação mais energética (mais exotérmica) a
25 °C.
48
Figura 22. Isoterma da titulação calorimétrica: A) variação de calor e B) variação de
entalpia por mol de titulante após cada injeção de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-
1 BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de SiO2NPs. Experimentos realizados em 0,01
mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 e 37 °C.
O processo endotérmico observado no final da titulação (Figura 22A) foi
considerado como um processo secundário (ainda desconhecido) que ocorre após a
saturação da nanopartícula com a proteína. Esse processo precisou ser
desconsiderado e descontado para realizar o tratamento de dados da adsorção.
Dessa maneira, uma constante foi subtraída de todos os pontos de uma mesma curva
(Q versus [BSA]) com o propósito de que os pontos finais estivessem próximos de
zero. Assim sendo, o próximo passo do tratamento de dados foi realizado aplicando
uma somatória dos calores envolvidos, conforme Figura 23A. Em seguida, cada ponto
da curva foi dividido pela massa de SiO2NPs que estava presente na suspensão,
obtendo o valor de Δrh (Figura 23B). Por fim, para cada ponto foi feita a divisão de
fração molar de BSA presente na solução após o equilíbrio (obtido através dos dados
do UV-vis) por Δrh. O gráfico dessa divisão versus a própria fração molar foi obtido,
apresentando uma reta (Figura 23B) que pôde ser relacionada à Equação 4, a
equação de Langmuir modificada:
X
∆rh=
X
∆inth+
1
(K − 1)∆inth (Equação 4)
49
onde X é a fração molar de BSA em solução após o equilíbrio, Δrh é a energia liberada
ou absorvida por massa de nanopartícula (J.g-1), Δinth é a energia envolvida na
formação da monocamada por massa de nanopartícula (J.g-1) e K é a constante de
equilíbrio (L.mol-1).
Figura 23. A) Somatória dos calores envolvidos nas interações entre BSA e SiO2NPs
em função do volume de BSA. Dados relacionados ao experimento realizado em 0,01
mol.L-1 PB, pH 7,4 a 25 e 37 °C. B) Isoterma da entalpia integral de adsorção (Δrh )
versus a fração molar obtida da titulação a 25 °C. A reta apresentada é a forma
linearizada da isoterma.
Assim, através da Equação 4 e dos coeficientes angulares e lineares da
reta da Figura 23B, o K (L.mol-1) e o Δinth (J.g-1) foram calculados. Com esses dados
e utilizando o valor de NS obtido por UV-vis, os parâmetros termodinâmicos ΔH, ΔG e
ΔS foram calculados a partir das equações:
∆H = ∆inth
NS (Equação 5)
∆G = −RTlnK (Equação 6)
∆G = ∆H − T∆S (Equação 7)
Os resultados obtidos por ITC e UV-vis estão apresentados na Tabela 2.
Avaliando os valores médios de entalpia e entropia, concluiu-se que a interação entre
50
a BSA e as SiO2NPs é entalpicamente favorável. As médias de ΔH e ΔG a 25 e 37 °C
foram comparadas. Observou-se que a interação da BSA é mais energética (mais
exotérmica), porém menos espontânea a 25 °C, estando de acordo com o que foi
mencionado anteriormente ao analisar o dado da Figura 22. Entretanto, desvios
padrões de 20 – 30% da média foram obtidos para o ΔH, enquanto que não foram
observadas variações significativas de ΔG em ambas temperaturas. Em vista disso,
concluiu-se que a influência dessa faixa de temperatura na interação é pequena.
Tabela 2. Parâmetros termodinâmicos e NS da interação entre BSA e SiO2NPs nas
temperaturas de 25 e 37 °C.
25 °C 37 °C
ΔH / kJ.mol-1 -73 ± 16 -55 ± 18
ΔG / kJ.mol-1 -40 ± 1 -44 ± 1
TΔS / kJ.mol-1 -33 ± 17 -11 ± 19
K / L.mol-1 (12 ± 5).106 (29 ± 14).106
Ns / mol.g-1 8,7.10-7 8,7.10-7
A técnica de dicroísmo circular foi utilizada para verificar a presença de
interações hidrofóbicas entre a BSA e as SiO2NPs. Quando esse tipo de interação
ocorre, a proteína altera a sua conformação a fim de tornar a parte hidrofóbica dela,
geralmente interna, acessível à superfície da partícula.79 A conformação das proteínas
é organizada em quatro níveis estruturais (Figura 24):
• Estrutura primária: constituída pela sequência de aminoácidos ligados
covalentemente por ligações peptídicas.
• Estrutura secundária: baseada principalmente por α-hélices e folhas-β
formadas através de ligações de hidrogênio entre aminoácidos próximos
da mesma cadeia polipeptídica.
• Estrutura terciária: determinada pelo arranjo espacial da proteína de
acordo com as interações hidrofóbicas, pontes salinas, ligações de
hidrogênio e de dissulfeto formadas.
• Estrutura quaternária: estabelecida pela associação de cadeias
polipeptídicas, formando um sistema mais complexo.80,81
51
Figura 24. Níveis de organização estrutural das proteínas. Adaptado da Referência
80.
A técnica de dicroísmo circular (CD) analisa diretamente a estrutura
secundária das proteínas. Essa técnica é exclusivamente destinada às análises de
compostos opticamente ativos (quirais). Ela é baseada na diferença de absorbância
da luz circularmente polarizada a esquerda e a direita. As cadeias peptídicas possuem
diversos carbonos quirais que absorvem na região de 190 a 250 nm e dependendo da
estrutura secundária da proteína possuem diferentes absorbâncias (Figura 25).82
Figura 25. Espectro CD das estruturas secundárias mais comumente encontradas em
proteínas. O espectro foi adaptado da Referência 83 referente às análises de poli-L-
lisina nas diferentes estruturas secundárias.
Ao ocorrer uma interação hidrofóbica entre uma proteína e uma superfície,
a organização estrutural da proteína deve se alterar em decorrência dos grupos
hidrofóbicos se localizarem na região interna da mesma. Portanto, se eventualmente
52
após a adsorção da proteína na superfície for observada uma alteração da estrutura
secundária, provavelmente, interação do tipo hidrofóbica pode estar ocorrendo. Ao
analisar os espectros da BSA em solução após tratamento a 25 e 37 °C não foi
observada alteração na estrutura secundária da proteína, composta principalmente
por α-hélice (Figura 26A). Esse resultado garante que a temperatura estudada não
afeta a estrutura da proteína. Para avaliar apenas as proteínas adsorvidas, as
amostras de nanopartículas incubada com BSA foram lavadas seis vezes por
centrifugação. Nesse caso, também foi observada a conservação da estrutura
secundária da proteína (Figura 26 B e C). Dessa forma, pode-se concluir que nessas
condições não houve interação hidrofóbica entre a BSA e a superfície da
nanopartícula.
Figura 26. Dicroísmo circular da A) BSA livre a 25 e 37 °C, B) BSA livre e adsorvida
nas SiO2NPs incubadas a 25 °C e C) BSA livre e adsorvida nas SiO2NPs incubadas a
37 °C. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB com pH ajustado em 7,4.
Através da técnica de eletroforese confirmou-se que as seis lavagens
realizadas na amostra de SiO2NPs incubada com BSA foram suficientes para manter
na suspensão apenas as proteínas adsorvidas (Figura 27). A partir da quarta lavagem
não foi mais detectada a banda de BSA (66430 Da) no sobrenadante. Portanto, o sinal
de dicroísmo obtido para essa amostra realmente pertence apenas a essas proteínas.
53
Figura 27. Gel de eletroforese revelado das soluções e suspensões utilizadas nos
testes de CD.
4.2.3. Efeito da força iônica
Força iônica foi o segundo parâmetro a ser avaliado na interação da BSA
com as SiO2NPs, uma vez que esse fator pode influenciar significativamente nas
interações, principalmente as eletrostáticas. A influência da força iônica foi observada
nos experimentos iniciais do projeto envolvendo a BSA quando o tampão fosfato
salino contendo 9 g.L-1 de NaCl foi utilizado como solvente. Nesses experimentos foi
verificada a desestabilização do complexo BSA-SiO2NPs, ocorrendo a formação de
grandes agregados. Por esse motivo, realizou-se um experimento para avaliar a
concentração de NaCl mais adequada para efetuar esse estudo, afim de que nessa
concentração não ocorresse desestabilização e a influência da força iônica pudesse
ser avaliada. Esse estudo foi realizado utilizando o DLS e os resultados são mostrados
na Figura 28.
54
Figura 28. Variação do A) diâmetro hidrodinâmico e da B) polidispersidade das
SiO2NPs em tampão PB contendo 0 e 2,3 μmol.L-1 de BSA em diferentes forças
iônicas.
Observou-se uma variação maior do DH das SiO2NPs em presença de BSA
quando a força iônica do meio aumentou (Figura 28A). Esse comportamento não foi
observado quando existiam apenas as suspensões de nanopartículas na solução,
demostrando que essas são estáveis nesses meios e que a instabilidade ocorreu
devido à presença da proteína. Baseado nesses resultados, a concentração de 4 g.L-
1 de NaCl foi escolhida pois nesta faixa de concentração não ocorreu desestabilização
do sistema, confirmada pela baixa variação do DH e da manutenção da baixa
polidispersidade. Desse modo, as condições de 0 e 4 g.L-1 de NaCl adicionados no
tampão PB foram consideradas para o fator força iônica.
Por meio das análises de DLS, foi observado um aumento considerável do
DH da protein corona em maiores forças iônicas quando comparado com PB sem NaCl
(Figura 29). Além disso, a polidispersidade permaneceu constante durante os
experimentos. Portanto, esse aumento do DH pode ser associado à uma maior
quantidade de proteínas adsorvidas na superfície das SiO2NPs. Entretanto, esse
comportamento também pode indicar apenas um posicionamento diferente das
proteínas na superfície conforme representado na Figura 30.
55
Figura 29. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em função da
concentração de BSA. Estudos realizados a 0 e 4 g.L-1 de NaCl adicionados ao tampão
PB em pH 7,4, a 25 °C.
Figura 30. Ilustração de alguns dos possíveis posicionamentos da BSA sobre as
SiO2NPs.
Nos resultados de UV-vis (Figura 31), verificou-se que o aumento do DH
observado no DLS foi consequência de um número maior de moléculas de BSA
adsorvidas na superfície das nanopartículas. De acordo com os cálculos realizados,
os NS para 0 g.L-1 e 4 g.L-1 de NaCl são, respectivamente, 8,7.10-7 mol.g-1 e 1,3.10-6
mol.g-1. Ou seja, o aumento da força iônica induziu uma adsorção maior da BSA,
podendo ser explicado pela blindagem das cargas eletrostáticas repulsivas presentes
tanto na BSA, como na superfície das SiO2NPs.84 Em outras palavras, a repulsão
eletrostática entre a proteína e a nanopartícula, assim como entre as proteínas livres
e as proteínas já adsorvidas, diminuiu. Dessa forma, a adsorção foi potencializada.
56
Figura 31. Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs em PB com 0 e 4 g.L-1 de NaCl
obtidas através de medidas de absorbância da proteína. Experimentos realizados em
pH 7,4 e a 25 °C.
Não foi possível concluir se a adsorção adicional observada ocorre em
“sítios” que ainda podem estar disponíveis na superfície da nanopartícula ou se uma
nova camada de proteína está sendo formada. Entretanto, como os valores de NS e
ΔDH encontrados para 4 g.L-1 de NaCl não atingiram o dobro do valor para a condição
padrão, é possível afirmar que essa adsorção adicional não forma completamente
uma bicamada. Além disso, também foi observado que até a concentração de
aproximadamente 33 μmol.L-1 ainda estava ocorrendo adsorção de proteína na
solução de maior força iônica. Ou seja, a saturação da superfície ainda não havia sido
atingida.
O modelo de Langmuir foi somente empregado para estimar a quantidade
máxima de BSA adsorvida na superfície das nanopartículas através dos dados do UV-
vis. Entretanto, esse modelo não é o mais adequado para a condição de maior força
iônica, pois a exigência do modelo de formação de uma monocamada pode não estar
sendo atendida. Devido à essa incompatibilidade do modelo de Langmuir e às
dimensões dos erros já observados no tratamento de dados do ITC, optou-se por
apenas apresentar a variação de entalpia por mol de titulante durante as injeções de
BSA sobre as SiO2NPs (Figura 32).
57
Figura 32. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-1 de BSA em uma suspensão
de 5 g.L-1 de SiO2NPs. Resultados obtidos variando-se a força iônica do meio: sem
adicionar NaCl ao PB e adicionando 4 g.L-1 desse sal. Experimentos realizados em
pH 7,4 e a 25 °C.
A influência da força iônica foi observada também nos dados de ITC (Figura
32). Porém, verificou-se que não há uma grande variação da inclinação da curva de
entalpia versus concentração de BSA, assim como também não há um deslocamento
significativo dos pontos da curva de 4 g.L-1 de NaCl em relação a curva da condição
padrão. Isto indica, respectivamente, que a espontaneidade da interação continua
próxima de 40 kJ.mol-1 e que o processo continua a ser controlado pela entalpia.
Os resultados de dicroísmo circular (Figura 33) confirmaram a conservação
da estrutura secundária da proteína com a variação da força iônica. Além disso, a BSA
também manteve a sua estrutura secundaria inalterada após adsorver na superfície
das SiO2NPs, indicando que não há contribuição de interações hidrofóbicas entre elas.
58
Figura 33. Dicroísmo circular da A) BSA livre em PB sem NaCl e com 4 g.L-1 NaCl. B)
BSA livre e adsorvida em SiO2NPs em PB sem NaCl e C) BSA livre e adsorvida em
SiO2NPs em PB com 4 g.L-1 NaCl.
4.2.4. Efeito do pH
Os valores de pH 6,0 e 7,4 foram escolhidos por serem comumente
encontrados em ambientes fisiológicos. Além disso, nesses valores de pH a BSA não
sofre grandes variações em sua estrutura, conforme a Figura 34. Dessa forma, foi
possível garantir que todas as variações observadas nos diferentes pH foram
consequências apenas da alteração da carga superficial da proteína.
Figura 34. Diagrama da variação do formato e das dimensões da BSA de acordo com
o pH. Adaptado da Referência 85.
Antes de iniciar os experimentos de protein corona, tanto a BSA como as
SiO2NPs foram analisadas por DLS e potencial zeta. Os resultados são apresentados
na Tabela 3. Uma manutenção do DH das SiO2NPs, bem como da BSA foi observado
com a alteração do pH. Entretanto, observou-se uma diminuição do potencial zeta em
pH 6,0, decorrente da protonação de alguns grupos das SiO2NPs (hidroxilas) e da
BSA.
59
Tabela 3. Valores de DH e potencial zeta da BSA e das SiO2NPs nos pH 6,0 e 7,4.
pH DH / nm Z-Pot. / mV
SiO2NPs 6,0 95,8 ± 0,2 -28 ± 1
7,4 95,1 ± 0,4 -48 ± 3
BSA 6,0 9,9 ± 0,1 -12 ± 2
7,4 8,8 ± 0,1 -20 ± 4
Nos estudos de protein corona, foi observado por DLS um aumento do
diâmetro hidrodinâmico da camada de proteína em pH 6,0 (Figura 35). Novamente, a
hipótese levantada para explicar esse aumento da adsorção da BSA é semelhante à
observada nos estudos de força iônica. Ou seja, uma menor repulsão entre as
proteínas e as nanopartículas, bem como entre as proteínas livres e adsorvidas está
ocorrendo. Isso acontece em decorrência da diminuição da carga negativa da BSA e
das SiO2NPs.
Figura 35. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs em função da
concentração de BSA. Estudos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4.
A adsorção maior de BSA em pH 6,0 foi confirmada por UV-vis (Figura 36).
Verificou-se que a superfície das nanopartículas foram saturadas com uma maior
quantidade de BSA em pH 6,0 (1,2.10-6 mol.g1) em comparação com o pH 7,4 (8,9.10-
7 mol.g-1).
60
Figura 36. Isotermas de adsorção de BSA em SiO2NPs pH 6,0 e 7,4 obtidas através
de medidas de absorbância da proteína. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB
a 25 °C.
Na Figura 37 estão apresentadas as isotermas de titulação calorimétrica da
interação da BSA com as SiO2NPs nos diferentes pH. Novamente, não foram
observadas alterações significativas na inclinação da curva, sugerindo
espontaneidade semelhante para as interações em ambos os pH. Entretanto, foi
observado um deslocamento dos pontos obtidos para o pH 6 em relação ao pH 7.
Esse deslocamento pode estar relacionado à variação na quantidade de BSA
adsorvida, bem como com diferentes contribuições das interações interiônicas e
intermoleculares. Observou-se também que em pH 6 a entalpia do final da titulação é
maior do que em pH 7,4. Essa variação pode estar associada à influência do pH no
processo secundário (ainda desconhecido) que ocorre após terminada a adsorção da
proteína. Igualmente à seção anterior, os resultados dos parâmetros termodinâmicos
que deveriam ser obtidos por ITC não foram apresentados pelos mesmos motivos.
61
Figura 37. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia após cada injeção
de 2 μL de uma solução 0,38 mmol.L-1 de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4.
Os espectros de dicroísmo circular da BSA livre e adsorvida considerando
os diferentes pH estão apresentados na Figura 38. Observou-se a manutenção da
estrutura secundária da BSA livre em ambos os pH. O mesmo foi verificado após a
adsorção nas SiO2NPs em pH 7,4. Entretanto, ao comparar os espectros da Figura
38C referente à BSA livre e à BSA adsorvida nas SiO2NPS em pH 6,0, observou-se
uma pequena alteração no formato da curva. Esse resultado indica uma pequena
variação da estrutura secundária da BSA adsorvida nessa condição experimental.
Uma análise da variação da composição da estrutura secundária poderia ser realizada
se a concentração da BSA na superfície da nanopartícula fosse conhecida. No
entanto, em decorrência do procedimento experimental seguido, a concentração e a
composição da estrutura secundária não puderam ser calculadas.
62
Figura 38. Dicroísmo circular da A) BSA livre em PB pH 6,0 e pH 7,4, B) BSA livre e
adsorvida em SiO2NPs em PB pH 7,4 e C) BSA livre e adsorvida em SiO2NPs em PB
pH 6,0. Experimentos realizados a 25 °C.
4.3. Avaliação do efeito corona free nas SiO2NPs-PEG e SiO2NPs-SBS
Como mencionado na introdução, existem duas estratégias para reverter o
fenômeno da protein corona. A primeira é tentar compreender suas características
para se obter o controle do fenômeno, assim como realizado na primeira parte deste
trabalho através dos estudos da influência da temperatura, pH e força iônica. A outra
estratégia é tentar evitar a formação dessa coroa de proteínas, sendo esse o objetivo
dessa segunda parte do trabalho, através da modificação da superfície das
nanopartículas com SBS e PEG2000.
4.3.1. Interação das proteínas albumina e lisozima com SiO2NPs-SBS
Os experimentos com as SiO2NPs-SBS foram realizados de modo
semelhante ao procedimento seguido nos estudos envolvendo as SiO2NPs.
Primeiramente, através de medidas de DLS, observou-se a estabilidade e
instabilidade das SiO2NPs-SBS em presença de albumina e lisozima na condição
padrão, respectivamente (Figura 39 A e B). Entretanto, uma maior estabilidade
coloidal entras essas nanopartículas e a lisozima foi verificada ao realizar o estudo em
PBS (Figura 39C).
63
Figura 39. Distribuição de diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-SBS na ausência e
presença de A) BSA na condição padrão, B) lisozima na condição padrão e C) lisozima
em PBS.
Provavelmente, o comportamento observado acima para a lisozima é uma
consequência da atuação dos grupos silanóis desprotonados presentes na superfície
das SiO2NPs-SBS. Esses grupos geram uma carga superficial negativa nas
nanopartículas, atraindo fortemente a lisozima (carregada positivamente) e levando à
desestabilização. Além disso, o efeito da força iônica também pode ser explicado
através do fenômeno de blindagem citado na Seção 4.2.3. Ou seja, a interação é
dificultada com o aumento da força iônica devido à blindagem das cargas
eletrostáticas atrativas entre a lisozima e as SiO2NPs-SBS.84 Com isso, a atração
eletrostática entre a proteína e a nanopartícula diminui, desfavorecendo a adsorção.
Em decorrência do resultado observado na Figura 39, a condição padrão
dos estudos foi mantida apenas para a BSA. Para a lisozima, a condição que utilizava
PBS, pH 7,4 e 25 °C foi considerada devido à estabilidade observada.
Nas medidas de DLS, o DH das SiO2NPs-SBS após incubação com BSA e
lisozima permaneceram constantes (Figura 40), diferentemente das SiO2NPs. Esses
dados sugerem que não há formação de protein corona nessas nanopartículas.
64
Figura 40. Diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-SBS em diferentes concentrações de
proteínas. O experimento com a BSA foi realizado em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C.
O experimento com a lisozima foi realizado em 0,01 mol.L-1 PBS, pH 7,4 e 25 °C.
O dado bruto e as isotermas de titulação calorimétrica para ambas as
proteínas são apresentadas na Figura 41 e na Figura 42. Observou-se que as
isotermas não possuem curvas com perfil de interação. No entanto, os resultados de
ITC indicam a presença do processo secundário apenas no estudo de interação com
a BSA, pois para a lisozima as entalpias ficaram muito próximos de zero. Além disso,
para a BSA também foi observado um desvio do primeiro ponto em relação aos
demais.
Figura 41. Dado bruto da titulação de A) BSA em 5 g.L-1 de SiO2NPs-SBS na condição
padrão e de B) lisozima em 5 g.L-1 de SiO2NPs-SBS em PBS.
65
Figura 42. Isoterma de titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL das soluções de proteínas em uma suspensão de 5 g.L-1
de SiO2NPs-SBS. Experimentos com BSA e lisozima realizados respectivamente, na
condição padrão e em PBS.
Diferentemente dos resultados de DLS e ITC, os dados de UV-vis sugerem
que a lisozima está adsorvendo nessas nanopartículas, mesmo em PBS (Figura 43).
Com relação à BSA, os dados estão de acordo com os resultados anteriores.
Figura 43. Isotermas de adsorção de BSA e lisozima nas SiO2NPs-SBS em PB e PBS,
respectivamente, obtidas através de medidas de absorbância das proteínas.
Essas discrepâncias entre os resultados podem ser explicadas. A lisozima
é uma proteína menor do que a BSA. Além disso, devido à carga positiva que ela
possui, essa proteína adsorve muito mais fortemente na superfície das SiO2NPs-SBS
66
(carregada negativamente). Com isso, em decorrência da técnica de DLS não possuir
sensibilidade à pequenas alterações no DH, não foi observada a adsorção da lisozima
nesses experimentos. No caso do ITC, provavelmente uma compensação entálpica
dentre os processos exotérmicos (ligação de hidrogênio, interação eletrostática e de
van der Waals) e endotérmicos (dessolvatação das moléculas de SBS) pode estar
ocorrendo.
Portanto, os resultados acima demonstram a propriedade corona free das
SiO2NPs-SBS apenas para proteínas carregadas negativamente. No entanto, a busca
por uma funcionalização mais eficiente dessas nanopartículas com o SBS, reagindo
todas as hidroxilas, pode levar a propriedade corona free também para as proteínas
carregadas positivamente, por evitar cargas negativas residuais sobre a superfícies
das nanopartículas.
Além do estudo da interação da BSA com as SiO2NPs-SBS na condição
padrão (resultados acima), também foram realizadas as investigações alterando os
parâmetros temperatura, pH e força iônica. No entanto, os resultados de UV-vis e DLS
desse sistema não se alteraram dos dados apresentados acima. A discrepância
somente foi observada nos experimentos de ITC, conforme descrito a seguir.
Os resultados de ITC apresentaram eventos térmicos em todos os estudos
com as SiO2NPs-SBS e BSA. Entretanto, não foi observado formato padrão de uma
curva de interação em nenhuma das curvas obtidas. No gráfico da Figura 44, foi
verificado que a temperatura influencia no processo envolvendo as SiO2NPs-SBS e
BSA. Entretanto, esse processo ainda não foi identificado, visto que de acordo com
os dados de UV-vis e DLS não há adsorção. Observou-se também que os calores
finais da Figura 44 são semelhantes aos encontrados no gráfico da Figura 22,
referente ao experimento com SiO2NPs a 25 e 37 °C. Baseado nessas observações,
criou-se a hipótese que o processo secundário que ocorre após a interação/saturação
da superfície das SiO2NPs é o mesmo observado nos experimentos com as SiO2NPs-
SBS e BSA.
67
Figura 44. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL de uma solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB pH 7,4 a 25 e 37 °C.
Os resultados de ITC do estudo da influência da força iônica na interação
entre as SiO2NPs-SBS e BSA são apresentados na Figura 45. Verificou-se que 90%
dos pontos obtidos nas duas condições experimentais estudadas estão dentro da
barra de erro. Portanto, não há influência da força iônica no processo que está
ocorrendo. Além disso, observou-se que existe uma divergência do comportamento
do primeiro ponto em relação aos demais. Possivelmente essa diferença é decorrente
da não homogeneidade da superfície das nanopartículas. Dessa forma, algum
processo altamente espontâneo poderia estar iniciando e terminando logo no primeiro
contato que tem com a proteína, não ocorrendo nas demais injeções.
68
Figura 45. Isoterma da titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados a 25 °C, pH 7,4, 0,01 mol.L-1 PB sem adição
de NaCl e com 4 g.L-1 desse sal.
Os resultados de calorimetria obtidos no estudo da influência do pH nos
experimentos envolvendo as SiO2NPs-SBS e a BSA foram os mais discrepantes
(Figura 46). Verificou-se em pH 6 um processo mais endotérmico do que em pH 7,4.
Ou seja, dentre os fatores estudados, o pH do meio é o que mais influencia no
processo ainda desconhecido.
Figura 46. Isoterma da titulação calorimétrica: variação de entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de BSA em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-SBS. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, 25 °C, pH 6,0 e 7,4.
69
Em síntese, os resultados descritos sugerem a existência de processos
endotérmicos ao misturar a BSA e as SiO2NPs-SBS, em todas as condições
estudadas. Além disso, há indícios de que esses processos sejam semelhantes aos
que são observados após a saturação da superfície das SiO2NPs com BSA.
4.3.2. Interação das proteínas albumina e lisozima com SiO2NPs-PEG
As SiO2NPs-PEG apresentaram estabilidade em presença de BSA e
lisozima na condição padrão. Consequentemente, os estudos de interação foram
realizados considerando exclusivamente a condição de PB sem NaCl, pH 7,4 e 25 °C.
Os dados de DLS são apresentados na Figura 47. Observou-se a
manutenção do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-PEG na faixa de concentração
estudada das proteínas. Esses dados sugerem que a BSA e lisozima não estão
adsorvendo nessa nanopartícula.
Figura 47. Variação do diâmetro hidrodinâmico das SiO2NPs-PEG em função da
concentração das proteínas BSA e lisozima. Experimento realizado em 0,01 mol.L-1
PB, pH 7,4, 25 °C.
Os dados brutos e as isotermas obtidas por ITC são apresentados,
respectivamente, na Figura 48 e Figura 49. Semelhantemente ao observado para as
SiO2NPs-SBS, as isotermas da titulação calorimétrica não apresentaram formato de
curva de adsorção (Figura 49). Além disso, verificou-se que as variações de entalpia
nos experimentos com lisozima foram menores em relação à BSA, sugerindo a
70
ocorrência do processo secundário exclusivamente com essa última proteína.
Também foi observada a discrepância do primeiro ponto da curva em relação aos
demais para ambas as proteínas.
Figura 48. Dado bruto da titulação de A) BSA e B) lisozima em 5 g.L-1 de SiO2NPs-
PEG. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C.
Figura 49. Isoterma da titulação calorimétrica: variação da entalpia por mol de titulante
após cada injeção de 2 μL da solução de proteínas em uma suspensão de 5 g.L-1 de
SiO2NPs-PEG. Experimentos realizados em 0,01 mol.L-1 PB, pH 7,4, 25 °C.
Também, de forma semelhante às SiO2NPs-SBS, apenas a lisozima
adsorveu nas SiO2NPs-PEG, de acordo com os dados de UV (Figura 50). Ou seja,
todos os resultados dos estudos de interação entre BSA e SiO2NPs-PEG convergem,
demonstrando que não há adsorção. No entanto, para a lisozima existe a divergência
entre os dados de UV e os demais (ITC e DLS). Da mesma forma que essa divergência
71
foi esclarecida para as SiO2NPs-SBS, pode-se aplicar nas nanopartículas modificadas
com o PEG2000. Ou seja, é provável que a lisozima, por ser uma proteína pequena,
possa estar se internalizando entre as cadeias do PEG2000 de tal modo que o DLS não
observe a alteração no DH.86 Além disso, os valores de variação de entalpia próximos
de zero também podem ser uma consequência da compensação entálpica entre os
processos exotérmicos (ligação de hidrogênio, interação eletrostática e de van der
Waals) e endotérmicos (dessolvatação do PEG).
Figura 50. Isotermas de adsorção de BSA e lisozima nas SiO2NPs-PEG obtidas
através de medidas de absorbância da proteína.
Portanto, os resultados acima mostram que as SiO2NPs-PEG também
possuem o efeito corona free exclusivamente para proteínas carregadas
negativamente. Como a modificação dessa nanopartícula foi altamente eficiente em
termos de reatividade dos silanóis, a princípio, não há como aprimorar o efeito corona
free.
5. Conclusões
Nanopartículas de sílica contendo grupos hidroxilas (SiO2NPs) e
modificadas com PEG (SiO2NPs-PEG) e o composto zwitteriônico SBS (SiO2NPs-
SBS) foram obtidas e caracterizadas. As três nanopartículas apresentaram formato
aproximadamente esférico com distribuição de tamanho monomodal, além de uma
média de tamanho similar. A busca por essa similaridade foi intencional visto que
72
grandes alterações de tamanho causariam discrepâncias na relação área/volume das
nanopartículas, influenciando nos experimentos de adsorção de proteínas.
Os experimentos de protein corona sugerem uma forte interação entre a
lisozima e as SiO2NPs, levando à formação de agregados. Nos experimentos
envolvendo essa nanopartícula e a BSA foi observado que os três parâmetros
escolhidos (temperatura, força iônica e pH) influenciam na interação.
Para o primeiro parâmetro, foi verificado que em menores temperaturas as
interações entre a BSA e as SiO2NPs são mais energéticas, ou seja, a entalpia
envolvida é maior. Por dicroísmo circular foi constatado que não há interação
hidrofóbica nesse sistema na condição estudada.
Com relação ao segundo parâmetro, foi observado que em maiores forças
iônicas ocorre uma maior adsorção de BSA na superfície das SiO2NPs sem atingir a
formação de multicamadas de proteínas. Os resultados indicam que em maiores
forças iônicas há uma menor repulsão entre a proteína e a nanopartícula, facilitando
a adsorção sem alterar a estrutura secundária da proteína. Devido à discordância
entre os resultados obtidos e o modelo de Langmuir utilizado para tratar os dados do
ITC, não foi possível obter os valores dos parâmetros termodinâmicos envolvidos na
interação.
Maior adsorção de proteína também foi obtida ao diminuir o pH do meio.
Possivelmente em valores de pH menores a repulsão entre a proteína e a
nanopartícula é reduzida. Porém, nesse caso, a menor repulsão é consequência da
protonação das hidroxilas na superfície das SiO2NPs e de alguns grupos presentes
na proteína. Além disso, por dicroísmo circular foi verificada a formação de interações
hidrofóbicas em pH 6,0. Pelo mesmo motivo do parâmetro força iônica, não foram
obtidos os parâmetros termodinâmicos das interações.
A influência dos fatores acima demonstra a importância do controle das
condições experimentais em estudos que envolvam nanopartículas em meios
biológicos.
Os experimentos realizados com as SiO2NPs-SBS confirmaram que o
composto zwitteriônico conferiu à nanopartícula a característica de corona free para
proteínas carregadas negativamente. Em contrapartida aos experimentos com a BSA,
as SiO2NPs-SBS não apresentaram propriedade corona free para a lisozima. No
entanto, existe a possibilidade de aperfeiçoar essa propriedade através de uma
funcionalização mais eficiente, com o propósito do potencial zeta da nanopartícula
73
ficar mais próximo de zero. Dessa forma, as interações eletrostáticas entre a lisozima
e as nanopartículas serão reduzidas.
Resultados semelhantes aos da SiO2NPs-SBS foram obtidos para as
SiO2NPs-PEG. Ou seja, o efeito corona free foi observado apenas para a BSA,
proteína carregada negativamente. Em decorrência da eficiente funcionalização
dessa nanopartícula, a princípio, não é possível aprimorar a propriedade corona free
dela. Portanto, esse resultado está de acordo com os outros resultados encontrados
na literatura42: o PEG não consegue evitar completamente a adsorção de proteínas.
74
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7. Apêndice
• Cálculo da área ocupada por uma molécula de SBS ou uma cadeia de PEG
Para esse cálculo foram considerados os seguintes dados:
SiO2NPs-PEG SiO2NPs-SBS
Diâmetro / nm 84 77
Densidade da partícula / g.cm-3 1,9 1,9
% mássica correspondente à
funcionalização
4,8 2,2
% mássica correspondente à sílica 90,7 93,3
Massa molar da funcionalização (sem os
grupos silanos: -Si(OCH2CH3) e -Si(OCH3))
2247 g/mol 208,3 g/mol
O volume e a área de uma única nanopartícula é dado por:
𝑉 =4
3𝜋 (
𝐷
2)
3
. 106
𝐴 = 4𝜋 (𝐷
2)
2
Considerando a densidade de 1,9 g.cm-3, pode-se calcular a massa de uma
nanopartícula.
𝑚 = 𝑑. 𝑉
A partir do valor de m obtido e sabendo a % mássica correspondente à
funcionalização e à sílica, fez-se a seguinte regra para calcular a massa da
funcionalização:
m ............................ % mássica correspondente à sílica
𝑚𝐿........................... % mássica correspondente à funcionalização
83
𝑚𝐿 =%𝑓𝑢𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎çã𝑜. 𝑚
%𝑠í𝑙𝑖𝑐𝑎
Obtendo a massa correspondente à funcionalização e sabendo a massa
molar do ligante (MM), o número de moléculas presente na superfície foi calculado:
𝑛 =𝑚𝐿 . 𝑁𝐴
𝑀𝑀
Onde NA é o número de Avogadro.
Com isso, a área ocupada por uma molécula do ligante é igual à:
𝐴1𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎 = 𝐴
𝑛