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FABIANE CAPONI
ESTUDO DA REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE DA
VITAMINA C
CANOAS, 2010
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FABIANE CAPONI
ESTUDO DA REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE DA
VITAMINA C
Trabalho de conclusão apresentado ao Curso Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química.
Profª Drª Ana Cristina Borba da Cunha.
CANOAS, 2010
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FABIANE CAPONI
ESTUDO DA REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE DA
VITAMINA C
Trabalho de conclusão de curso aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Barcharel em Química pelo Centro Universitário La Salle – Unilasalle
Aprovado pelo avaliador em 2010
Profª Drª Ana Cristina Cunha
Unilasalle
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Dedico este trabalho a todos que presenciaram e incentivaram para a realização do mesmo,
tornando esse sonho possível. Mas em especial, agradeço aos meus avós Mario e Jessy pelo
carinho e amor, à minha irmã Camila pelas ajudas, paciência e amizade, e aos meus pais
Vilnei e Rosane pelo incentivo e pelo infinito amor de sempre.
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AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus por sempre iluminar meus caminhos, por me trazer saúde, alegria,
sabedoria, e por ter colocado pessoas maravilhosas no meu caminho.
Aos meus pais, por incentivarem em todos os momentos de minha vida, e por tornar
possível a minha jornada para a conclusão da faculdade.
À minha irmã, pelas ajudas, pela leitura incessante do meu trabalho e pelo carinho de
sempre.
Aos meus avós, pelo afeto, carinho e por sempre tornarem agradáveis os dias que
passamos juntos.
Ao Cristiano pelo companheirismo, amor, compreensão nos momentos de stress da
faculdade.
À orientadora Ana Cunha, por desempenhar com excelente profissionalismo a
orientação no meu trabalho, por me incentivar e me direcionar na conclusão do mesmo e
pelo carinho e amizade nesse percurso.
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RESUMO
O presente trabalho apresenta a pesquisa teórico-prático, em que há a busca de melhorar a
porcentagem de Repetitividade de Reprodutibilidade da análise de doseamento da Vitamina
C de acordo com os parâmetros do Análise de Sistema de Medição (MSA). Foram realizadas
quatro análises de doseamento da Vitamina C e a partir da análise inicial foi elaborado o
Diagrama de Ishikawa, na qual através deste diagrama em cada análise foi realizado uma
melhoria no procedimento para que a variação de Repetitividade e Reprodutilidade esteja
aceitável na especificação da MSA (2002).
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ABSTRACT
This paper presents the theoretical and practical research, in which there is the quest to
improve the percentage of repeatability reproducibility of analysis for the determination of
vitamin C according to the parameters of the Measurement System Analysis (MSA). There
were four tests for the determination of Vitamin C and from the initial analysis was prepared
the Ishikawa Diagram, which through this diagram in each analysis was performed on an
improved procedure for the variation of Repeatability and reproducibility is acceptable in the
specification of the MSA ( 2002).
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
2 ÁCIDO ASCÓRBICO – VITAMINA C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
3 REPETITIVIDADE E REPRODUTIVIDADE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
3.1 Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
3.2 Exatidão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.3 Precisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.4 Repetitividade e Reprodutibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
4 MATERIAIS E REAGENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.1 Vidrarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
4.2 Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
4.3 Método Analítico para o Doeseamento de Ácido A scórbico (C 6H8O6) em Vitamina
C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
4.3.1 Preparo de Ácido Sulfúrico 10% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.3.2 Preparo da Solução Indicador Amido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
4.3.3 Preparo e Padronização do Iodo 0,05Mol.L-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.3.4 Doseamento da Pureza da Matéria-Prima Vitamina C (Ácido Ascórbico) . . . . . . . . . .19
4.4 Cálculo estatístico de Repetitividade e Reprodu tibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
5.1 Análises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
5.2 Primeiro Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
5.3 Segundo Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.4 Terceiro Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
5.5 Quarto Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
6 CONCLUSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
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1 INTRODUÇÃO
Atualmente, as empresas que seguem a Resolução da Diretória Colegiada nº204/2006,
têm como compromisso a validação dos métodos analíticos dos insumos trabalhados. E a
partir dessa resolução, que a empresa distribuidora de insumos farmacêutico inicia o seu
trabalho de validação de métodos.
De acordo com o Instituto Nacional de Metrologia (2003), o procedimento de validação
deve apresentar os seguintes dados: estabilidade, seletividade, linearidade, limite de
detecção, limite de quantificação, exatidão, precisão (Repetitividade e Reprodutibilidade),
robustez e incerteza de medição
Dentro deste processo de validação, foi escolhido iniciar pela análise estatística de
Repetitividade e Reprodutibilidade da Vitamina C. Deve-se saber, através da repetitividade e
reprodutibilidade, se o resultado da análise é confiável, ou seja, se segue a variação aceita
de acordo com o MSA antes de dar continuidade ao processo de validação.
De acordo com o fabricante chinês Yuanfu Industry (2010), o Ácido Ascórbico,
conhecido popularmente como Vitamina C, é um ácido carboxílico usado em medicamentos
para combater um simples resfriado, até em cremes corporais para capturar os radicais
livres, diminuindo o envelhecimento da pele.
Segundo Albano (2009), Instituto Nacional de Metrologia (2003) e Rodrigues et al.
(2008), o estudo do cálculo de repetitividade e reprodutibilidade baseia-se nas variações do
laboratório. Pois a repetitividade apresenta a menor variação e a reprodutibilidade a variação
máxima de um laboratório.
A repetitividade e reprodutibilidade apresentam importante significância na validação
de métodos, pois correlacionam valores identificados por analistas em diversas análises. Por
esse motivo o treinamento do analista é de grande importância em todo o processo de
validação.
Esse trabalho teve como objetivo atingir o valor aceitável de acordo com o MSA
(2002), será realizado um trabalho, em que irá modificar as variáveis da análise, como os
equipamentos utilizados, até treinamento com os analistas. Efetuando os cálculos
estatísticos, verificando se os resultados de Repetitividade e Reprodutibilidade estão de
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acordo com a Análise de Sistemas de Medição (2002) e estabelecendo assim, as condições
em que deverá ser realizado o teste de Doseamento da Vitamina C na prática do dia-a-dia do
laboratório, obtendo-se como resultado um valor confiável.
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2 ÁCIDO ASCÓRBICO - VITAMINA C
De acordo com o fabricante da Vitamina C, Yuanfu Industry (2010), o Ácido Ascórbico,
conhecido como Vitamina C é um pó fino ou cristalino de cor branca e tem sabor ácido com
gosto semelhante ao suco de laranja, possui C6H8O6 como sua fórmula molecular. Pertence
a um grupo orgânico chamado de LACTONAS que são ácidos carboxílicos que se
transformam em ésteres cíclicos, ou seja, ésteres de cadeia fechada.
A vitamina C é uma molécula polar que apresenta quatro hidroxilas, sendo que duas
delas na posição da ligação π entre carbonos (C=C), que podem interagir entre si por
ligações, resultando assim, no aumento de acidez da vitamina C, aumentando assim a sua
solubilidade.
De acordo com a Universidade Federal do Paraná (2010), a Vitamina C sintética é muito
semelhante ao ácido ascórbico presente em alimentos naturais. Isso ocorre porque a
vitamina sintética é produzida a partir de um açúcar natural, sendo uma dextrose (glicose,
açúcar de mel, açúcar de milho). Este açúcar de fórmula química C6H12O6 se converte em L-
ácido ascórbico (C6H8O6) por reação de oxidação onde quatro átomos de hidrogênio são
removidos para formar duas moléculas de água.
A vitamina C é um poderoso antioxidante, isto é impede a perda de elétrons de outros
compostos. As moléculas do ácido ascórbico sofrem oxidação antes que as outras moléculas
se oxidem, não só impedindo como também protegendo essas outras moléculas de sofrerem
a oxidação. Do mesmo modo que aumenta a resistência do organismo às infecções, em
cremes corporais, por exemplo, protege a pele contra a ação dos radicais livres, que são
uma espécie química não carregada que possui elétron desemparelhado, diminuindo o
envelhecimento da pele.
Conforme Silva (2001), Stadler (1999), Amaya-Farfan; Domino; Padovane (2001), há
discordância no consumo diário da Vitamina C. Então de acordo com o fabricante Chinês
Yuanfu Industry, deve-se seguir as seguintes doses:
- Como profilático, vias oral ou intramuscular, lactentes, durante os primeiros seis
meses de vida, 30 mg/dia; lactentes prematuros poderão exigir maior dose. Crianças e
adultos, 40 à 60 mg de ácido ascórbico por dia. Durante a gravidez, 70 mg/dia.
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Durante a lactação, 90 a 95 mg/dia. Nos períodos de necessidade maior (infecções,
traumas, etc), 150 mg/dia.
- Para tratamento de escorbuto, 100 mg três vezes ao dia até que se normalize a
saturação;
- Para queimaduras graves, 200 a 500 mg/dia até completar-se a cura.
Entretanto, quanto ingerida em excesso pode-se tornar tóxica. A dosagem cuja toxicidade
conhecida seria a ingestão de 4 gramas por Kg de peso corporal.
Atualmente, tem-se estudado o consumo da Vitamina C para prevenir a incidência do
câncer, doenças cardiovasculares e outras patologias. A prevenção tem sido estendida à
intoxicação por vários agentes químicos e outros agressores, como substâncias orgânicas,
fármacos, agentes físicos.
De acordo com Stadler (1999), a vitamina C pode ser encontrada principalmente no reino
vegetal, na forma livre. Alguns exemplos da presença do Ácido Ascórbico são nos vegetais
folhosos, como brócolis, salsa, couve, couve-de-bruxelas, couve-flor, mostarda, nabo, folhas
de mandioca e inhame, presente também nos legumes, como pimentões amarelos e
vermelhos) e frutas (cereja-do-pará, caju, goiaba, manga, laranja, acerola.
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3 REPETITIVIDADE E REPRODUTIVIDADE
Repetitividade e Reprodutibilidade são duas medidas de precisão (incerteza), que são
utilizadas para calcular a variabilidade da análise.
Para Pedott (2010), a repetitividade e a reprodutibilidade permitem calcular a variabilidade
de um sistema de medição, dando origem ao estudo de R&R, que é um método quantitativo.
É uma técnica de medição que é empregada para realizar os testes repetidas vezes. As
medições devem ser efetuadas em diferentes períodos de tempo, por diferentes operadores.
Segundo Medeiro et al. (2008), deve-se realizar a Repetitividade e Reprodutibilidade em
conjunto, pois estudar somente a repetitividade isoladamente não permite garantir que o
processo em questão seja aceitável. Pode-se estar trabalhando com um analista que possui
uma excelente repetitividade, porém não condiz com os resultados dos outros analistas do
laboratório, tendo assim, um processo que não seja não reprodutível.
3.1 Validação
Segundo ANVISA, através da Resolução da Diretória Colegiada (RDC) nº 204/2006
(ANVISA, 2006), a validação qualifica qualquer procedimento, processo, equipamento,
método, material, operação ou sistema.
De acordo com o INMETRO (INMETRO, 2003), a Validação de um método é um
processo que fornece uma evidência documentada, obtida através de estudos
interlaboratoriais, que garantem que a metodologia analítica seja exata, reprodutível e que
tenha variação sobre uma faixa específica, assegurando assim, os resultados das análises
realizados por esta metodologia validada, obtendo valores confiáveis.
A validação no laboratório (“in house validation”), é utilizada no intuído de validar um
método desenvolvido no local, ou seja, um método novo. A validação no laboratório também
é realizada para verificar se o método utilizado de fontes como a Farmacopéia Brasileira,
estão sendo bem aplicados, possuindo assim, um resultado confiável. (Ribani, 2004).
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Para Brito, et. al. (2003), é necessário para a validação do método analítico os seguintes
parâmetros: estabilidade, seletividade, limite de detecção e limite de quantificação,
linearidade, precisão (repetitividade e reprodutibilidade), exatidão, incerteza de medição e
por último robustez.
3.2 Exatidão
De acordo com o Freire (2008), Instituto Nacional de Metrologia (2003), Pedott (2010),
Ribani (2004) e Ribeiro et. al. (2008), a exatidão é o grau de concordância entre o resultado
de uma medição e um valor de referência aceito convencionalmente como verdadeiro. A
exatidão traduz a concordância dos valores experimentais com o valor verdadeiro e esta
sempre associada a um nível de confiança.
Segundo Albano (2009), alguns erros de exatidão podem ocorrer devido a valor
incorreto de padrão, a variação na temperatura, a variação no tempo de reação, a
modificação dos reagentes por deterioração, entre outros fatores.
A determinação da exatidão pode ser feita através de duas maneiras: analisando uma
amostra de concentração conhecida (padrão) e comparando o resultado ao valor
considerado verdadeiro, comparando os resultados da análise do método a ser avaliado ao
resultado obtido por um método validado cuja a exatidão é conhecida;
Ou seja, a exatidão que é a busca pelo valor verdadeiro, tem como objetivo realizar
uma análise em que o resultado é o mais próximo do valor “real” da amostra em análise.
3.3 Precisão
Para Skoog (2002), Ribeiro et. al. (2008), Paschoal; Rath; Airoldi; Reyes (2008),
Barros (2002), a precisão pode ser definida como sendo o grau de concordância de testes
independentes já realizados, ou seja, podendo ser expresso pelo desvio padrão ou pelo
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desvio padrão relativo. A precisão é baseada na dispersão dos resultados dos testes em
torno de um valor médio. Sendo avaliada através da repetitividade e reprodutibilidade.
Segundo o Instituto Nacional de Metrologia (2003), Sebben, et. al. (2010), Okada
(2207), Brito (2003), a precisão avalia a dispersão dos resultados, ou seja, quanto menor for
a amplitude das medidas, maior será a precisão dos ensaios realizados. Esta medida de
precisão, reflete a tendência de maior ou menor afastamento (erro) entre os resultados dos
ensaios. Este erro pode ser expresso pelo desvio padrão, variância ou coeficiente de
variação.
3.4 Repetitividade e Reprodutibilidade
Um dos métodos científicos empregados nas pesquisas de validações dos resultados de
análises sobre a validação de métodos inclui os testes estatísticos de Repetitividade e
Reprodutibilidade, também conhecidos como “R & R”.
Segundo Albano (2009) e Instituto Nacional de Metrologia (2003), em uma análise de
validação de método, existem alguns fatores que contribuem para a variabilidade dos
procedimentos de ensaios, como por exemplo: a amostragem e coleta, as condições
ambientais, o operador, o instrumental analítico, a calibração do equipamento e/ou vidraria, o
manuseio de itens de ensaio, os materiais de referência e reagentes químicos e também os
métodos de ensaio.
Considera-se que todos estes fatores afetam na variação das análises, por isso eles
devem ser minimizados, afim de ter maior confiabilidade nos resultados.
A variabilidade entre os resultados de ensaios realizados por diferentes operadores e/ou
diferentes equipamentos, normalmente será maior que a variabilidade entre os resultados de
ensaios realizados por um mesmo operador utilizando o mesmo equipamento.
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3.4.1 Repetitividade
Este procedimento é a realização dos ensaios em que possuem as condições mais
constantes possíveis.
De acordo com o Skoog (2002); Rodrigues et al. (2008), Lima, Frota (2007), o limite de
repetitividade é a máxima diferença aceitável entre duas repetições. Ou seja, é a
variabilidade das medidas obtidas por um laboratorista treinado, mesmo item repetidamente.
A Repetitividade também é conhecida como a precisão intrínseca dos equipamentos de
medição, erros aleatórios. A repetitividade é a confirmação dos resultados a partir da
repetição do experimento.
Segundo Albano (2009) e Fechio (2009), Cassiano (2009), a repetitividade é obtida a
partir de dois resultados independentes, obtidos através do mesmo procedimento de
medição, do mesmo analista, do mesmo instrumento de medição, utilizando as mesmas
condições, do mesmo local e da repetição em curto período de tempo.
Para Pedott (2010), Feitas; Lemos; Marin (2006), Nascimento et. al (2008), a
repetitividade se refere à variação dos instrumentos, fornecendo resultados muito próximos,
em repetidas vezes, sob as mesmas condições. Ou seja, é a concordância dos resultados de
várias medições de um mesmo mensurando, realizadas sob as mesmas condições, em um
curto período de tempo.
Apesar de manter todas as condições, como mesmo analista, vidraria e equipamento,
não há necessidade de manter a mesma amostra inicial. Sendo assim, a Repetitividade
possui a menor variação dos resultados.
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3.4.2 Reprodutibilidade
Segundo Fechio (2009), Albano (2009), Feitas; Lemos; Marin (2006), Nascimento, et.
al. (2008), a reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições de
um mesmo mensurando, efetuadas sob condições variadas. Também é usado como
parâmetro de validação de métodos analíticos quando se iguala aos resultados obtidos por
meio de comparações interlaboratoriais.
De acordo com o Instituto Nacional de Metrologia (2003), Skoog (2002), Cassiano
(2009), Silva et. al (2010), concluí-se que no caso da análise do Doseamento da Vitamina C,
foi realizado a reprodutibilidade interna, também denominada de precisão intermediária, que
refere-se à precisão avaliada sobre a mesma amostra. É obtida a partir de amostras
idênticas ou padrões, ou seja, obtidas do mesmo processo contendo o mesmo número de
lote, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais as
condições a variar, tais como diferentes analistas, diferentes equipamentos, diferentes
condições ambientais, diferentes métodos de medição e diferentes padrões de referência.
Então dessa forma, para se ter a variação máxima de um laboratório, a análise é
realizada por vários operadores, utilizando vidrarias e/ou equipamentos diferentes, podendo
apresentar temperatura e umidade do laboratório diferente.
Conforme Pedott (2010), a reprodutibilidade se refere à capacidade de um sistema de
medição apresentar resultados próximos com a alteração nas condições das análises.
Para Medeiros et al. (2008), esta medida de precisão é reconhecida como a mais
representativa da variabilidade dos resultados em um laboratório. O limite de
reprodutibilidade é a máxima diferença aceitável entre dois resultados individuais, obtidos em
diferentes laboratórios, para um mesmo processo analítico em condições especificadas. Este
limite também pode ser considerado para uma mesma amostra em um mesmo laboratório,
quando for analisada por diferentes instrumentos com desvio aceitável e compatível.
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4 MATERIAIS E REAGENTES
4.1 Vidraria
Para o preparo das soluções utilizadas, assim como a realização da análise de
doseamento, foram utilizados os seguintes materiais e vidrarias: balança analítica; béqueres
de 100 mL, provetas de 50 mL e 100 mL, pipeta volumétrica calibrada de 10 mL, pipeta
volumétrica calibrada de 20 mL, pipeta volumétrica calibrada de 25 mL, pipeta volumétrica
calibrada de 3mL, bastão de vidro, vidro de relógio, balão volumétrico calibrado de 1000 mL,
erlenmeyer de 250mL, Bureta calibrada de 50 mL e espátula de inox.
Toda a vidraria calibrada, foi aferida em laboratório reconhecido pela Rede
Metrológica, e teve o seu valor corrigido através da sua carta de calibração
4.2 Reagentes
Para a análise de doseamento da Vitamina C foi utilizado os seguintes reagentes:
Água Deionizada, Ácido Sulfúrico P.A (H2SO4), Amido P.A (C6H10O5), Iodeto de Potássio
P.A (KI) e Iodo P.A.
4.3 Método Analítico para o Doseamento de Ácido Asc órbico (C 6H8O6) em Vitamina C
Para as análises de Doseamento da Vitamina C, foram utilizadas vidrarias calibradas
por empresas certificadas. As soluções assim como o método de doseamento do Ácido
Ascórbico (C6H8O6) foram realizados de acordo com a Farmacopéia Brasileira (2001).
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4.3.1 Preparo do Ácido Sulfúrico 10%
Foi preparada em um béquer, uma solução em que foram colocados cerca de 50mL
de água deionizada e 10mL de ácido sulfúrico (H2SO4) PA. adicionados lentamente. Quando
a solução retornou a temperatura ambiente, foi transferido para um balão volumétrico de
100mL e completou-se o volume com água deionizada até o menisco.
4.3.2 Preparo da Solução Indicador Amido
Dissolveu-se em um béquer 2 g de amido (C6H10O5) P.A em 100 mL de água
deionizada quente e deixou esfriar em temperatura ambiente. A solução final pode
apresentar uma pequena opalescência, ou seja, pode turvar, por isso deve-se preparar na
hora do uso.
4.3.3 Preparo e Padronização do Iodo 0,05 Mol.L-1
Preparou-se uma solução de Iodo 0,05 Mol.L-1, pesando-se aproximadamente 36,0 g
de iodeto de potássio (KI) P.A, 12,75 g de iodo (I) P.A e misturou-se os dois reagentes a
seco em béquer de vidro, adicionando de 20 a 50 mL de água deionizada e dissolvendo
completamente a mistura, transferindo qualitativamente para um balão volumétrico de 1000
mL e completou-se o volume com água deionizada para 1 litro.
Para a Padronização da Solução seguiu-se os seguintes procedimentos:
a) Foi pipetado exatamente 20 mL de solução padrão de iodo 0,05 Mol L-1 para um
erlenmeyer de 250 mL;
b) A solução foi titulada com tiossulfato de sódio 0,1005 Eqg L-1 utilizando 2 mL de
amido como indicador;
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c) Titulou-se até que a solução mudou de castanho para incolor;
d) Realizou-se uma prova em branco da mesma maneira, mas com 20 mL de água no
lugar da amostra;
4.3.4 Doseamento da Pureza da Matéria-Prima Vitamina C ( Ácido Ascórbico)
Foram pesados em uma balança analítica cerca de 0,2 g da amostra e dissolvidos em
mistura de 100 mL de água deionizada fria recentemente fervida e 25 mL de ácido sulfúrico
10% (conforme item 4.3.1). Acrescentou-se 3 mL de amido (conforme item 4.3.2) e titulou-se
imediatamente com iodo 0,05 Mol L-1 (conforme item 4.3.3). Cada mL de iodo 0,05 Mol L-1
equivale a 8,806 mg de C6H8O6. Especificação: entre 99,0% e 100,5% de C6H8O6
4.4 Cálculo estatístico de Repetitividade e Reprodutibi lidade
Primeiramente, antes de realizar o cálculo estatístico de Repetitividade e
Reprodutibilidade, foram realizados em todos os testes, o Teste Q, na qual indicou se deverá
descartar algum resultado de doseamento da Vitamina C. Para calcular o Coeficiente Q,
todos os resultados foram colocados em ordem crescente e foi utilizado o dado que possui
maior diferença entre um valor e outro, sendo o “valor duvidoso”.
Após o estudo do Teste Q, os cálculos de porcentagem de repetitividade e
reprodutibilidade foram baseados na média da amplitude dos resultados do doseamento da
Vitamina C dos analistas, sendo calculada pelos seguintes procedimentos:
- Para obter-se a variação de Repetitividade e Reprodutibilidade, calculou-se a
Variabilidade Total (VT). A Variabilidade total é a variação dos resultados, da análise de
doseamento da Vitamine C que pode ocorrer, de modo geral, em todas as reproduções
destas análises no laboratório em questão e pode ser calculada de duas maneiras:
a) através do limite de especificação conhecido (tolerância);
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b) através do Desvio Padrão histórico do processo.
A Variabilidade Total foi calculado pelo Desvio Padrão Histórico multiplicado por seis
(número de incertezas).
O Desvio Padrão Histórico, foi um dado fornecido pela empresa distribuidora de
insumos farmacêuticos referente a análise de Doseamento da Vitamina C, realizada no
período de um ano, de junho de 2009 à junho de 2010, cujo valor é de 0,3678. Sendo
assim, o valor da Variabilidade Total é 2,2068;
- Os analistas devem realizar o teste analiticamente em cinco vias, seus valores
devem ser colocados em ordem crescente, relacionando a diferença de amplitude de cada
via de um analista com o outro, após calcular a relação da amplitude das cinco vias é
calculada a média da amplitude;
- A média da amplitude deve ser multiplicada pela constante k. Esta constante é um
desvio de medição, que varia com o número de operadores e a quantidade de vias. Como
neste estudo, a pesquisa foi realizada sempre por dois analistas em cinco vias, o valor da
constante k é de 4,3277;
- Por último, para a obtenção da variação de repetitividade e reprodutibilidade,
multiplica-se o valor obtido no item anterior por cem (porcentagem), dividindo pela
Variabilidade Total.
A interpretação dos dados da porcentagem de Repetitividade e
Reprodutibilidade, deve ser realizada de acordo com o quadro a seguir:
R&R (%) Interpretação
<10% Aceitável
10% até 30% Até pode ser aceito, mas necessita de
melhorias
>30% Inaceitável
Quadro 1 – Interpretação do Valor R&R (%) Fonte: Validação e Garantia de Ensaios Laboratoriais, 2009
Para a interpretação do resultado deverá ser consultado o quadro 1, que tem por
finalidade indicar se o valor encontrado é aceitável ou não.
21
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Análises
O estudo de Repetitividade e Reprodutibilidade, foi realizado com os analistas da
distribuidora farmacêutica, sendo o total de dois analistas, que tiveram como objetivo calcular
a variação de Repetitividade e Reprodutibilidade do Laboratório da empresa em estudo,
verificando se o processo de doseamento da Vitamina C é aceitável ou não, e dentro destes
resultados foi realizado um estudo para as que este valor seja o menor possível.
As análises de doseamento foram efetuadas de acordo com o item 4.3.4. Na qual,
foram preparadas todas as soluções de acordo com os itens 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3.
De acordo do a Farmacopéia Brasileira (2001), a concentração de Ácido Ascórbico
(C6H8O6) presente na matéria-prima Vitamina C deve variar de 99,0 à 100,5%.
5.2 Primeiro Teste
A primeira análise de Repetitividade e Reprodutibilidade da Vitamina C foi realizada
com a balança analítica reprovada na calibração.
A tabela 1 apresenta os valores de massa, volume e volume verdadeiro, doseamento
e amplitude relacionando os dois analistas em estudo. O volume verdadeiro é o volume
corrigido pelo teste branco, fator do titulante, ou seja, é o valor “real” da concentração da
solução titulante e pela correção da calibração da bureta utilizada.
22
Tabela 1 – Resultados Obtidos no Primeiro Teste
Fonte: Autoria própria, 2010.
23
A Tabela 1 traz as informações necessárias para calcular a variação de Repetitividade
e Reprodutibilidade.
Também foi realizado o Teste Q, com os dados do Doseamento (%) da Tabela 1, o
valor do Qexperimental foi menor que o Qcrítico, não sendo rejeitado nenhum resultado.
Calculou-se a variação da Repetitividade e Reprodutibilidade conforme descrito no
item 4.4, utilizando a informação da média da Amplitude da Tabela 1. O valor encontrado foi
de 22,68%
De acordo com o quadro 1, foi possível classificar que o valor da porcentagem de
Repetitividade e Reprodutibilidade, referente ao Doseamento da Pureza da Matéria-Prima
Vitamina C (Ácido Ascórbico), realizada no primeiro teste foi aceitável. Entretanto, é
necessário apontar os erros, conforme o Quadro 2 – Diagrama de Ishikawa - da análise para
implantar suas melhorias, diminuindo assim, a porcentagem de Repetitividade e
Reprodutibilidade, tornando os resultados da análise mais confiável.
Na análise da Vitamina C, foi observada as seguintes incertezas que influenciam no
confiabilidade dos resultados, podendo assim, diminuir a porcentagem de Repetitividade e
Reprodutibilidade:
a) Erro na calibração da Balança Analítica;
b) erro na calibração da Bureta;
c) erro na calibração da Pipeta Volumétrica;
d) erro na incerteza do volume gasto na titulação da amostra;
e) erro na incerteza do volume gasto na titulação do branco.
Para a análise de Doseamento da Vitamina C, durante as atividades, constatou-se
através do Diagrama de Ishikawa conforme a figura 1 – Diagrama de Ishikawa, as seguintes
causas e efeitos para a porcentagem de Repetitividade e Reprodutibilidade que foi
considerada elevada, considerando-se encontrar um melhor resultado para o doseamento do
ácido ascórbico.
24
Figura 1 – Diagrama de Ishikawa Fonte: Autoria própria, 2010
Como visualizado do Diagrama de Ishikawa, as possíveis incertezas de medição são
oriundas de diversos fatores, como a exposição a luz no ambiente, a calibração das vidrarias
e erro do analista.
Baseando-se nesses resultados preliminares e com objetivo de melhorar os valores da
Repetitividade e Reprodutibilidade, foi realizada uma nova análise para que fosse atingido o
valor aceitável de acordo com a Análise de Sistemas de Medição (2002).
Material
Conservação inadequada das soluções
Solução de iodo sensível a luz
Método Meio Ambiente
Exposição da amostra à luz
Solução de iodo exposta a luz
Porcentagem de Repetibilidade e Reprodutibilidade elevado no Doseamento da Vitamina C
Mão-de-obra
Operadores não conheciam o método
Sensibilidade do analista no ponto de viragem
Máquina
Calibração da Balança
Calibração da pipeta
Calibração bureta
Medição
Calibração da Vidraria e da Balança
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5.3 Segundo Teste
Nesta segunda etapa, a balança analítica utilizada nos testes foi calibrada por
empresa reconhecida pela Rede Metrológica, posteriormente aprovada pelo INMETRO,
sendo esta a única correção para verificar a variação de Repetibilidade e Reprodutibilidade
nesta etapa.
Na tabela 2 são apresentados os resultados das análises efetuadas pelos analistas,
com as suas respectivas massas pesadas da Vitamina C, o volume do titulante gasto e o
volume verdadeiro (volume corrigido com o fator de correção da solução de titulante de iodo
e a correção da bureta), o resultado do doseamento e a Amplitude em cada via e a média da
amplitude.
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Tabela 2 – Resultado Obtidos no Segundo Teste
Fonte: Autoria própria, 2010.
27
Conforme apresentado na tabela 2, os resultados obtidos no Segundo Teste,
reproduzem o ensaio realizado no laboratório. Com os resultados do Doseamento da
Vitamina C, foi realizado o Teste Q, e verificou-se que todos os dados foram aceitos, não
havendo descarte para o cálculo de porcentagem de Repetitividade e Reprodutiblidade.
Através da Amplitude do doseamento, foi obtida a média da amplitude, também foi
calculada a variação de Repetitividade e Reprodutibilidade do Doseamento da Vitamina C,
apresentando a balança analítica calibrada e aprovada pelo INMETRO. A porcentagem de
R&R foi de 16,10%, sendo, de acordo com MSA de 2002, aceitável, mas precisando realizar
melhorias. Entretanto, é necessário ressaltar que este valor em relação a primeiro teste teve
uma melhora significativa, diminuindo a variação de repetitividade e reprodutibilidade em erro
na 6,58%.
5.4 Terceiro Teste
Nesta terceira etapa, contamos com a balança analítica calibrada e aprovada pelo
INMETRO do segundo teste, e acrescentamos o treinamento dados aos analistas.
O treinamento, é referente a velocidade do gotejar da bureta, a viragem do ponto final
e o padrão, pois quando se tem o primeiro resultado da titulação, o ponto final com o tempo
vai escurecendo, devido a Vitamina C e ao iodo, sendo esta solução não podendo ser de
referência para as próximas titulações. Concluindo, foram realizadas essas correções para
verificar a variação de Repetitividade e Reprodutibilidade desta etapa.
Na tabela 3 são apresentados os resultados das análises efetuadas pelos analistas,
com a massa da Vitamina C pesada, o volume do titulante gasto e o volume verdadeiro
( volume corrigido com o fator de correção da solução de titulante de iodo e a correção da
bureta), resultado do doseamento e a amplitude calculada.
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Tabela 3 – Resultados Obtidos no Terceiro Teste
Fonte: Autoria própria, 2010
De acordo com as informações da Tabela 3, observamos que a média (amplitude) já é
bem menor que a realizada no primeiro teste, tendo assim, a variação de Repetitividade e
Reprodutilibidade menor que a realizada no primeiro teste.
Após aplicar o teste Q não foi necessário rejeitar nenhum valor.
Com os dados da tabela 3, em que demonstra as informações obtidas no laboratório,
em que nesta etapa apresenta a balança analítica calibrada e com o treinamento dos
analistas, a variação da porcentagem de R&R foi de 6,74%, obtendo o valor menor que dez
por cento, sendo assim, de acordo com MSA de 2002, o valor da porcentagem de
Repetitividade e Reprodutibilidade aceitável.
29
5.5 Quarto Teste
Na quarta e última etapa, continuamos a trabalhar com a balança analítica calibrada e
aprovada pelo INMETRO da segunda análise, os analistas receberam treinamentos e todas
as soluções foram preparadas momentos antes das análises.
Como a solução de Iodo é sensível a luz, esta foi preparada e padronizada momentos
antes dos testes de doseamento. Apesar de nas análises anteriores, a solução de iodo estar
armazenada em frasco de vidro âmbar, verificaremos nesta etapa se o acondicionamento é
ideal, e a real interferência desse na análise.
A tabela 4 apresenta os resultados das análises efetuadas pelos analistas, com a
massa da Vitamina C, o volume do titulante gasto e o volume verdadeiro (volume corrigido
com o fator de correção da solução de titulante de iodo e a correção da bureta), resultado do
doseamento e a amplitude entre os dados de doseamento.
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Tabela 4 – Resultados Obtidos no quarto teste
Fonte: Autoria própria, 2010.
A Tabela 4 – Resultados Obtidos no Quarto Teste traz as informações da reprodução
no laboratório, necessárias para realizar o Teste Q e calcular a variação da Repetitividade e
Reprodutibilidade. Conseguimos observar que a Média da Amplitude não teve uma
diminuição significativa em relação ao terceiro teste.
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Foi realizado o Teste Q com base em todos os resultados de doseamente, e nenhum
valor foi rejeitado.
Nesta fase, mantendo a balança analítica calibrada, o treinamento dos analistas e com
a solução de iodo (solução titulante) preparada e padronizada momentos antes da análise, a
variação da porcentagem de Repetitividade e Reprodutibilidade foi de 6,66%, considerando o
valor aceitável de acordo com MSA de 2002.
Observa-se que este valor não obteve grande variação em relação a terceira etapa,
em que o valor de R&R foi de 6,74%, podendo-se concluir que a solução de iodo utilizada
nas outras etapas, apesar de não ser preparada no momento da análise, estava em
condições ideais de armazenamento.
Apesar de neste quarto teste ter diminuído da variação de Repetitividade e
Reprodutibilidade, a diferença não foi significativa, não compensando, no entanto o custo
benefício, pois esse procedimento necessita de tempo do analista para preparar e padronizar
a solução de iodo momentos antes da titulação, quantidade gasta de reagentes, tempo maior
do analista na análise e também irá aumentar o tempo de análise da Vitamina C,
aumentando assim, o valor para a empresa do custo da análise.
32
6 CONCLUSÃO
Esta pesquisa foi realizada na empresa distribuidora de insumos farmacêuticos, que
tem por finalidade atender as normas da legislação vigente, de acordo com a RDC 204/06
(ANVISA, 2006) dos insumos farmacêuticos, na qual é necessário realizar a validação de
equipamentos, métodos analíticos e processos.
A Validação de Métodos é composta por diversos parâmetros, e por determinação da
empresa e interesses comerciais e financeiros iniciou-se pela análise estatística de
Repetitividade e Reprodutibilidade da Vitamina C. Em que no primeiro momento, foi
observado que este valor era superior, de acordo com os parâmetros da Análise de Sistemas
de Medição (2002). Com isso, foi realizado um estudo para que a variação de Repetitividade
e Reprodutibilidade esteja dentro do aceitável.
De acordo com Cassiano (2009), Rodrigues et. al. (2008), Nascimento et. al. (2008) e
Pedott (2010), a repetitividade é a confirmação dos resultados a partir da repetição do
experimento, ou seja, a análise deve ser realizada por um mesmo laboratorista treinado,
mesmo equipamento e vidrarias calibradas.
Segundo Fechio (2009), Silva et. al (2010) e Medeiros et. al. (2008), a
reprodutibilidade é obtida no estudo de um mesmo teste sob condições diferentes. Ou seja,
utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, porém variando os analistas,
equipamentos de condições ambientais. Sendo este, a variação máxima do laboratório.
As análises da variação de repetitividade e reprodutibilidade foram realizadas por dois
analistas, sendo cada teste em cinco vias. As soluções, assim como o método analítico
foram realizadas de acordo com a Farmacopéia Brasileira.
Com base em cálculos estatísticos, se obteve o valor da porcentagem de
repetitividade e reprodutibilidade. Para esta análise, foi utilizado o Desvio Padrão Histórico,
dado fornecido pela empresa no período de um ano, em que o resultado foi comparado com
a Análise de Sistemas de Medição (2002), determinando se o valor é aceitável.
Como no primeiro teste realizado, a porcentagem de doseamento da Vitamina C estar
próximo do limite aceitável, foi necessário apontar suas incertezas para implantar melhorias,
para tornar os resultados desta análise mais confiáveis.
33
Após o primeiro teste, para visualizar erros do valor elevado de repetitividade e
reprodutibilidade, foi elaborado o Diagrama de Ishikawa, mostrando algumas possíveis
incertezas como a calibração de equipamentos e vidrarias, treinamento de analistas,
exposição da amostra à luz, entre outros.
Em cada teste foi realizado uma modificação, como no segundo teste, em que a
balança analítica foi calibrada e aprovada pelo INMETRO. No terceiro teste foi realizado
treinamento com os analistas, nesta etapa já foi obtido o valor aceitável de acordo com o
MSA (2002). Entretanto, seguiu-se o cronograma, com o quarto teste, em que se preparou
momentos antes das análises a solução titulante de iodo, que é sensível à luz, apesar de
diminuir a porcentagem de repetitividade e reprodutibilidade, a melhora não foi tão
significativa comparando com o custo benefício de se realizar a solução pouco antes da
análise.
Este trabalho, através da pesquisa, alcançou seu objetivo em ter a variação de
repetitividade e reprodutibilidade do doseamento da Vitamina C dentro do parâmetro
aceitável da Análise de Sistemas de Medição (2002), possuindo assim, um resultado mais
confiável da sua análise. Concluindo, em toda a análise em que possui um estudo é possível
melhorar a confiabilidade de seu resultado, encontrando-se dentro da especificação aceitável
do MSA (2002).
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