estudo quÍmico e biolÓgico de - ppbio.inpa.gov.br · resumo . as espécies pertencentes à...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTI-INSTITUCIONAL EM

BIOTECNOLOGIA – PPGBIOTEC INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA – LABB

ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE

Duroia macrophylla HUBER (RUBIACEAE)

DAIANE MARTINS

MANAUS

2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTI-INSTITUCIONAL EM

BIOTECNOLOGIA – PPGBIOTEC INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA – LABB

DAIANE MARTINS

ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE

Duroia macrophylla HUBER (RUBIACEAE)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Multi-Institucional em Biotecnologia – PPGBiotec da Universidade Federal do Amazonas, como requisito para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia.

Orientadora: Profa. Dra. Cecilia Veronica Nunez

MANAUS

2014

ii

FICHA CATALOGRÁFICA

(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)

M739e Martins, Daiane

Estudo químico e biológico de Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) / Daiane Martins. – Manaus, 2014.

231f. il. color.

Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Amazonas.

Orientador: Profª. Drª. Cecilia Verônica Nunes

1. Quimica vegetal 2. Rubiaceae 3. Antioxidante 4. Alcaloides I Nunez, Cecília Verônica (Orient.) II. Universidade Federal do Amazonas III. Título

CDU 1997 582.972(043.3)

iv

DEDICO ESTE TRABALHO

Ao meu esposo Cleverson Agner Ramos,

pelo amor, abnegação e apoio nos

mínimos gestos e nos máximos

esforços.

v

AGRADECIMENTOS

À Deus por me conceder tantas conquistas e permitir que este momento tão especial acontecesse.

Um agradecimento especial à Profa. Dra. Cecilia Veronica Nunez, um exemplo de profissional e dedicação. Agradeço pela orientação, apoio, incentivo, compreensão e amizade. Agradeço também por possibilitar a execução deste trabalho, pela confiança depositada em mim e pelos valiosos ensinamentos.

A TODOS os colegas e amigos do Laboratório de Biotecnologia e Bioprospecção do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, que contribuíram direta ou indiretamente para a concretização deste trabalho, em especial a Lorena, Nerilson, Pierre, Fábio, Maitê, Manoel, Giselle, Laila, Izabel...

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela infraestrutura essencial para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação Multi-institucional em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela a oportunidade de realizar o curso de doutorado. E aos docentes pelos ensinamentos, principalmente à Profa. Dra. Maria Lúcia Belém pela oportunidade de realizar o estágio docente na disciplina de Determinação Estrutural de Compostos Orgânicos, no curso de Química.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Técnológico – CNPq, processo 142201/2010-3, pela bolsa de doutorado concedida e ao Programa Ciência sem Fronteiras pela bolsa de doutorado sanduíche concendida sob processo 237514/2012-5.

Aos professores Dr. François Bailleul, Dr. Thierry Hennebelle, Dr. Vincent Roumy, Dra. Céline Rivière e Dra. Sevsen Sahpaz do Laboratoire de Pharmacognosie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Lille, France, pela atenção, orientação e pelo espaço cedido para a realização do doutorado sanduíche.

Ao professor Andersson Barison e ao colega Kahlil Schwanka Salomé da Universidade Federal do Paraná (UFPR) pelo auxílio nas análises de RMN. Ao professor Pedro Eduardo Almeida da Silva da Fundação Universidade do Rio Grande (FURG) pela colaboração para a realização dos ensaios antimicobacteriano. A professora Marne Carvalho de Vasconcellos da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela parceria e colaboração para realizar o ensaio antitumoral.

E a todos aqueles que de alguma forma ajudaram na realização deste trabalho.

vi

RESUMO

As espécies pertencentes à família Rubiaceae revelaram grande diversidade de metabólitos secundários, os quais são responsáveis por uma gama de atividades biológicas. Entre estas espécies encontra-se Duroia macrophylla Huber, endêmica da Floresta Amazônica, conhecida popularmente como cabeça-de-urubú, apuruí ou puruí-grande-da-mata. A escassez de estudos de plantas do gênero Duroia e a ausência de estudos químicos e de atividade biológica para D. macrophylla, instigaram este trabalho, cujo o objetivo foi isolar os constituintes químicos e avaliar os extratos e substâncias isoladas quanto às atividades: antioxidante, toxicidade frente à Artemia salina, antibacteriana, antimicobacteriana e antitumoral. Foram realizadas duas coletas desta espécie, extraída com diclorometano (DCM) ou hexano (Hex) e metanol (MeOH). Os extratos foram testados como antioxidante, citotóxico, antibacteriano, antimicobacteriano e antitumoral, com intuito de ampliar as chances de obter moléculas ativas e/ou protótipos de fármacos. As substâncias isoladas foram identificadas por métodos espectroscópicos (RMN de 1H, de 13C e bidimensionais) e por espectrometria de massas e testadas como antimicobacteriana e antitumoral. Na prospecção fitoquimica todos os extratos apresentaram indícios de terpenos e apenas os extratos DCM de folhas e galhos da 1ª coleta não apresentaram capacidade antioxidante frente ao revelador DPPH. Os extratos MeOH de ambas as coletas apresentam compostos aromáticos. A presença de alcaloides foi detectada apenas nos extratos dos galhos da 2ª coleta. Foram isoladas e identificadas quatro substâncias dos extratos da 1ª coleta: dois triterpenos do extrato DCM das folhas (ácido oleanólico e ácido ursólico), uma chalcona do extrato MeOH das folhas (4,4’dihidroxi-3’-chalcona) e um ácido fenólico do extrato MeOH dos galhos (ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico). Dos extratos da 2ª coleta foram identificados oito alcaloides indólicos monoterpênicos: 10-metoxi-ajmalicina, 11-metoxi-ajmalicina, 11-metoxi-3-isoajmalicina, 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina, 9-metoxi-3-isoajmalicina, 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina, 10-metoxi-3-isorauniticina e 10-metoxi-rauniticina. Todas as substâncias isoladas neste estudo estão sendo descritas pela primeira vez no gênero Duroia. A atividade antioxidante dos extratos MeOH de folhas e galhos de ambas as coletas foi bastante significativa. No ensaio citotóxico frente A. salina apenas o extrato metanólico das folhas da 2ª coleta apresentou toxidade na concentração letal (CL50) de 120 μg/mL. Os extratos apresentaram atividade bacteriostática sobre as bactérias Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium corumnare, Salmonella enteridis e Pseudomonas aeroginosa. Das substâncias testadas apenas o ácido oleanólico apresentou atividade antibacteriana frente à Nocardia brasiliensis e Serratia marcescens, com uma CIM de 500 μg/mL. Dos extratos submetidos ao bioensaio antimicobacteriano, o extrato DCM das folhas (1ª coleta) apresentou melhor resultado frente às três cepas de Mycobacterium tuberculosis, com uma CMI de 6,25 µg/mL para a cepa INHr, de 25 µg/mL para a cepa RMPr e ≤ 6,25 µg/mL para a cepa H37Rv. Os alcaloides 10-metoxi-ajmalicina, a mistura de 9-metoxi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina, 10-metoxi-3-isorauniticina e 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina foram ativos frente ao M. tuberculosis (cepa INHr). Os extratos e alcaloides apresentaram baixo potencial citotóxico sobre as linhagens de células neoplásicas: HCT116 (carcinoma colorretal humano), MCF-7 (carcinoma de mama), SK-Mel-19 (melanoma humano) e sobre a linhagem não neoplásica: MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano). Palavras-chave: alcaloides, antioxidantes, antibacteriana, antimicobacterina, antitumoral.

vii

ABSTRACT

The species of Rubiaceae revealed great diversity of secondary metabolites, which are responsible for a range of biological activities. Among these species is Duroia macrophylla Huber, endemic to the Amazon Rainforest, popularly known as “cabeça-de-urubú, apuruí ou puruí-grande-da-mata”. The absence of studies of plants of the genus Duroia and the absence of chemical studies and biological activity to D. macrophylla, the aim of this work was to isolate the chemical constituents and evaluate the extracts and compounds isolated on activities: antioxidant, toxicity against Artemia salina, antibacterial, antimycobacterial and antitumor. The plant material was collected two times, dried, grounded and extracted with dichloromethane or hexane and methanol. The extracts were subjected to phytochemical screening by comparative thin layer chromatography and to determine specific telltale signs of chemical classes. The extracts were tested as antioxidant, cytotoxic, antibacterial, antimycobacterial and antitumor, to increase the chances of obtaining active molecules and/or prototypes of drugs. The isolated compounds were identified by spectroscopic methods (1H, 13C and two-dimensional NMR) and mass spectrometry and essayed as antimicrobial and antitumor. All extracts showed signs of terpenes and only the dichloromethane extracts of leaves and branches of the 1st collection did not reveal with DPPH. The methanol extracts of both collections showed aromatic compounds. The presence of alkaloids was detected only in extracts from the branches of the 2nd collection. There were isolated and identified four substances of the extracts of the 1st collection: two triterpenes from dichloromethane extract of the leaves (oleanolic acid and ursolic acid), one chalcone from methanol extract of the leaves (4,4'- dihydroxy-3'-chalcone) and a phenolic acid from methanol extract of the branches (m-methoxy-p-hydroxy-benzoic acid). Were identified of the extracts of the 2nd collection, eight monoterpene indole alkaloids: 10-methoxy-ajmalicine, 11-methoxy-ajmalicine, 11-methoxy-3-isoajmalicine, 9-methoxy-3-isoajmalicine, 9-methoxy-19-epi-3-isoajmalicine, 10-methoxy-19-epi-3-isoajmalicine, 10-methoxy-3-isorauniticine and 10-methoxy-rauniticine. All compounds isolated in this study were described for the first time in the genus Duroia. The methanol extracts from leaves and branches in both collections showed a good antioxidant activity. In cytotoxic assay against A. salina only the methanol extract of the leaves (2nd collection) presented toxicity at lethal concentration (LC50) of 120 mg/mL. The extracts showed bacteriostatic activity against the bacteria Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium corumnare, Salmonella enteridis and Pseudomonas aeruginosa. Of the substances tested only oleanolic acid showed antibacterial activity against Nocardia brasiliensis and Serratia marcescens, with a MIC of 500 mg/mL. Extracts subjected to antimycobacterial bioassay, the dichloromethane extract of the leaves (1st collection) showed better results against all strains of Mycobacterium tuberculosis with an MIC of 6.25 mg/mL for INHr strain, 25 mg/mL for the strain RMPr and ≤ 6.25 mg/ml for H37Rv strain. Only the alkaloids 10-methoxy-3-isorauniticine, the mixture of 9-methoxy-3-isoajmalicine with 9-methoxy-19-epi-3-isoajmalicine, 10-methoxy-3-isorauniticine and 10-methoxy-rauniticine tested against M. tuberculosis (strain INHr) showed better results rather those obtained from crude extracts. The extracts and alkaloids showed low cytotoxic potential on neoplastic cell lines: HCT116 (human colorectal carcinoma), MCF-7 (breast carcinoma), SK -Mel-19 (human melanoma) and on the non-neoplastic line: MRC-5 (human lung fibroblast). Keywords: alkaloids, antioxidant activity, antimycobacterial activity.

viii

RÉSUMÉ

Les espèces de Rubiaceae révlent une grande diversité de métabolites secondaires, qui sont responsables pour une gamme d'activités biologiques. Parmi ces espèces se trouve Duroia macrophylla Huber, endémique à la Forêt Amazonienne, populairement connue sous le nom de “cabeça-de-Urubú, apuruí ous Purui-grande-da-mata". Au vu de labsence d'études de plantes du genre Duroia et l'absence d'études chimiques et l'activité biologique de D. macrophylla, le but de ce travail était d'isoler les constituants chimiques et d'évaluer les extraits et les composés isolés de D. macrophylla sur les activités: antioxydantes , la toxicité contre la Artemia salina, antibactérienne, antimycobactérienne et antitumorale. Deux échantillons de cette espèce ont été réalisés, les organes végétaux ont été séchés, broyés et extraits avec du dichlorométhane, de l'hexane et du méthanol. Les extraits ont ensuite été soumis à un criblage phytochimique par chromatographie sur couche mince et comparative pour déterminer des signes révélateurs spécifiques de classes chimiques. Les extraits ont été testés comme antioxydant, cytotoxique, antibactérien, antimycobactérien et antitumoral, pour augmenter les chances d'obtenir des molécules et/ou des prototypes de médicaments actifs. Les composés isolés ont été identifiés par des méthodes spectroscopiques (RMN 1H et RMN à deux dimensions et la spectrométrie de masse) et l'extrait dichlorométhanique à été identifié comme antimicrobien et antitumoral. Tous les extraits ont montré des signes de terpènes et seuls les extraits de dichlorométhane de feuilles et de brindilles de la 1ère collection n'ont rien révélé avec le DPPH. Les extraits au méthanol de deux collections ont marqué la présence de composés aromatiques. La présence d'alcaloïdes a été détectée seulement dans les extraits des branches de la deuxième collection: quatre substances. Ont été isolé et identifié des extraits de la première collection: deux triterpènes à partir de l'extrait de dichlorométhane des feuilles (acide oléanolique et l'acide ursolique), une chalcone à partir de l'extrait au méthanol des feuilles (4,4 '- dihydroxy-3'-chalcone) et un acide phénolique à partir de l'extrait au méthanol des branches (m-méthoxy-p-hydroxy-benzoïque). Huit alcaloïdes indoliques monoterpènes Ont été identifiées des extraits de la deuxième collection, huit alcaloïdes indoliques monoterpènes: 10-méthoxy-ajmalicine, 11-méthoxy-ajmalicine, 11-méthoxy-3-isoajmalicine, 9-méthoxy-19-epi-3isoajmalicine, 9-méthoxy-3-isoajmalicine, 10-méthoxy-19-epi-3isoajmalicine, le 10-déméthoxy-3-isorauniticine et 10-méthoxy-rauniticine. Tous les composés isolés dans cette étude ont été décrits pour la première fois dans le genre Duroia. Les extraits au méthanol des feuilles et des branches dans les deux collections ont montré une bonne activité antioxydante. En test cytotoxique contre l' A. saline, seul l'extrait de méthanol des feuilles (2ème collection) a présenté une toxicité à la concentration létale (CL50) de 120 mg/ml. Tous les extraits ont montré une activité bactériostatique contre les bactéries Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium corumnare, Salmonella enteritidis et Pseudomonas aeruginosa. Parmi les substances que l'acide oléanolique testés ont montré une activité antibactérienne contre Nocardia brasiliensis et Serratia marcescens, avec une CMI de 500 mg/mL. Sur les Extraits soumis à l'essai biologique antimycobactérien, l'extrait de dichlorométhane des feuilles (1er collection) a montré de meilleurs résultats contre toutes les souches de Mycobacterium tuberculosis avec une CMI de 6,25 mg/ml pour la souche INHr , 25 mg / ml pour la souche RMPr et ≤ 6,25 mg/ml pour la souche H37Rv. Seule les alcaloides 10- méthoxy-ajmalicine, le mélange de 9-méthoxy-3-isoajmalicine avec le 9-méthoxy- 19-epi-3-ajmalicine, 10-méthoxy-3-isorauniticine et 10-méthoxy-rauniticine testé contre M. tuberculosis (souche INHr) a montré de meilleurs résultats plutôt que ceux obtenus à partir d'extraits bruts . Les extraits d' alcaloïdes ont démontré un potentiel cytotoxique faible sur des lignées cellulaires néoplasiques : HCT116 (carcinome colorectal humain) , MCF-7 (cancer du sein), SK-Mel-19 (mélanome humain) et sur la ligne non - néoplasique : MRC- 5 (humaine fibroblastes pulmonaires).

Mots-clés: alcaloïdes, activité antioxydante, activité antimycobactérienne.

ix

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Subfamílias e tribos com representantes no Brasil, com destaque para o gênero estudado no presente trabalho. .................................................................................................................................... 3

Figura 2: Algumas substâncias identificadas em Rubiaceae. ................................................................ 7

Figura 3: Diversidade química e distribuição dos principais metabólitos secundários dentre as subfamílias de Rubiaceae. ..................................................................................................................... 10

Figura 4: Imagens da espécie D. macrophylla. .................................................................................... 34

Figura 5: Fluxograma da preparação dos extratos de galhos e folhas de Duroia macrophylla. .......... 41

Figura 6: Fracionamento do extrato DCM das folhas da 1ª coleta. ..................................................... 51

Figura 7: Extração líquido-líquido de folhas e galhos dos extratos metanólico da 1ª coleta. .............. 52

Figura 8: Fracionamento da fase DCM do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta. ............................. 55

Figura 9: Fracionamento da fase AcOEt do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta ............................ 57

Figura 10: Fracionamento da fase AcOEt do extrato MeOH dos galhos da 1ª coleta ......................... 58

Figura 11: Fracionamento do extrato DCM dos galhos da 2ª coleta. ................................................... 63

Figura 12: Fracionamento do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta .................................................. 69

Figura 13: Estrutura do ácido oleanólico e suas correlações no HMBC. ............................................. 79

Figura 14: Espectro de RMN de 1H do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz). ............................... 80

Figura 15: Mapa de contorno HSQC do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz). .............................. 81

Figura 16: Mapa de contorno HMBC do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz). ............................ 82

Figura 17: Estrutura do Ácido ursólico e suas correlações no HMBC.. .............................................. 84

Figura 18: Espectro de RMN de 1H do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz). ................................... 85

Figura 19: Mapa de contorno HSQC do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz). ................................. 86

Figura 20: Mapa de contorno HMBC do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz). ................................ 87

Figura 21: Estrutura da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona e suas correlações no HMBC................... 89

Figura 22: Espectro de RMN de 1H da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz). ... 90

Figura 23: Expansão do espectro de RMN de 1H da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz). .................................................................................................................................................... 91

Figura 24: Mapa de contorno HSQC da 4,4’-dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz) .. 92

Figura 25: Mapa de contorno HMBC da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz). . 93

Figura 26: Estrutura do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico e suas correlações no HMBC. .............. 95

x

Figura 27: Espectro de RMN de 1H do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico, em CDCl3 (400 MHz). 96

Figura 28: Mapa de contorno HSQC do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico em CDCl3 (400 MHz).. 97

Figura 29: Mapa de contorno HMBC do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico em CDCl3 (400 MHz).98

Figura 30: Estereoquímica relativa dos centros estereogênicos C-3, C-15 e C-20, que caracteriza a estereoquímica do anel D dos alcaloides indólicos nas séries normal, pseudo, allo e epiallo. ........... 100

Figura 31: Estrutura da 10-metoxi-ajmalicina e suas correlações no HMBC. ................................... 104

Figura 32: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz)....................... 106

Figura 33: Espectro de RMN de 13C-APT da 10-metoxi-ajmalicina, com destaque para deslocamentos que definem a estereoquímica (125 MHz). ......................................................................................... 107

Figura 34: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz). .................... 108

Figura 35: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz). .................. 109

Figura 36: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).................... 110

Figura 37: Estrutura da 11-metoxi-ajmalicina e suas correlações no HMBC. ................................... 113

Figura 38: Espectro de RMN de 1H da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz)....................... 115

Figura 39: Espectro de RMN de 13C -APT da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (125 MHz). ........... 116

Figura 40: Mapa de contorno HSQC da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz). .................... 117

Figura 41: Mapa de contorno HMBC da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz). .................. 118

Figura 42: Mapa de contorno COSY da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz). ................... 119

Figura 43: Estrutura da 11-metoxi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC. ........................... 121

Figura 44: Espectro de RMN de 1H da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz)............... 123

Figura 45: Mapa de contorno HSQC da 11-metoxi-3-isoajmalicina, com destaque para alguns deslocamentos que definem a estereoquímica em C3D6O (500 MHz). ............................................... 124

Figura 46: Mapa de contorno HMBC da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz). .......... 125

Figura 47: Mapa de contorno COSY da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz). ............ 126

Figura 48: Estrutura da 9-metoxi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC. ............................. 130

Figura 49: Estrutura da 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC. ................. 130

Figura 50: Espectro de RMN de 1H da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz). ................................................................................................. 133

Figura 51: Espectro de RMN de 13C- APT da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (125 MHz). .................................................................................. 134

xi

Figura 52: Mapa de contorno HSQC da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-akuamigina, com destaque para alguns dos deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N (500 MHz). .......................................................................................................................................... 135

Figura 53: Mapa de contorno HMBC da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina, com destaque para alguns dos deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N (500 MHz). .......................................................................................................................................... 136

Figura 54: Mapa de contorno COSY da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz). .................................................................................................. 137

Figura 55: Estrutura da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC. ............... 139

Figura 56: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz). .. 141

Figura 57: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina, com destaque para os deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N. ................................................................. 142

Figura 58: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz). 143

Figura 59: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz). 144

Figura 60: Estrutura da 10-metoxi-3-isorauniticina e suas correlações no HMBC. .......................... 146

Figura 61: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz). ........... 148

Figura 62: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz)........... 149

Figura 63: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz). ........ 150

Figura 64: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz)........... 151

Figura 65: Estrutura da 10-metoxi-rauniticina e suas correlações no HMBC. .................................. 153

Figura 66: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz). ..................... 154

Figura 67: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz).................... 155

Figura 68: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz). ................. 156

Figura 69: Atividade antioxidante do extrato dos galhos da 1ª coleta. .............................................. 158

Figura 70: Atividade antioxidante do extrato metanólico das folhas da 2ª coleta. ............................ 159

Figura 71: Atividade antioxidante do extrato metanólico dos galhos da 2ª coleta. ........................... 159

Figura 72: Estrutura molecular da Isoniazida (INH). ........................................................................ 170

Figura 73: Estrutura molecular da Rifampicina (RMPr). .................................................................. 170

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Algumas classes de metabólitos identificados em espécies de Rubiaceae ................ 5

Tabela 2: Monoterpenos .......................................................................................................... 10

Tabela 3: Ácidos fenólicos ...................................................................................................... 11

Tabela 4: Iridoides ................................................................................................................... 11

Tabela 5: Diterpeno ................................................................................................................. 15

Tabela 6: Triterpenos ............................................................................................................... 15

Tabela 7: Saponinas ................................................................................................................. 19

Tabela 8: Triterpenos cicloartano ............................................................................................ 22

Tabela 9: Esteróide glicosilado ............................................................................................... 23

Tabela 10: Carotenoides .......................................................................................................... 23

Tabela 11: Flavonoides ........................................................................................................... 25

Tabela 12: Derivados fenólicos ............................................................................................... 26

Tabela 13: Proantocianidinas .................................................................................................. 27

Tabela 14: Lignanas glicosiladas............................................................................................. 29

Tabela 15: Cumarinas .............................................................................................................. 30

Tabela 16: Glicosídeos cianogênicos ...................................................................................... 30

Tabela 17: Alcaloide ............................................................................................................... 30

Tabela 18: Ácidos graxos ........................................................................................................ 31

Tabela 19: Substâncias relatadas para espécies do gênero em estudo. .................................... 32

Tabela 20: Dados da coleta de Duroia macrophylla e número de voucher no herbário do INPA. ........................................................................................................................................ 40

Tabela 21: Eluentes utilizados para o fracionamento do extrato FDCM ................................ 43

Tabela 22: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 1-4 ...................................... 44

Tabela 23: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 6-12 .................................... 44

Tabela 24: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 6-12.38-63 .......................... 45

Tabela 25: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 17-21 .................................. 45

Tabela 26: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 17-21.1-5 ............................ 46

xiii


Tabela 28: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 25-40.6 ............................... 47

Tabela 29: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 25-40.7 ............................... 48

Tabela 30: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 45 ........................................ 49


Tabela 32: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 57 ........................................ 50

Tabela 33: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase FMeOH-DCM ......................... 52

Tabela 34: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 7-10 ............. 53

Tabela 35: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 13-25 ........... 54

Tabela 36: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 13-25.110-187 .................................................................................................................................................. 55

Tabela 37: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase FMeOH-AcOEt ....................... 56

Tabela 38: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-AcOEt ...................... 57

Tabela 39: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GDCM..................................... 58

Tabela 40: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GDCM 54-62 ....................... 59

Tabela 41: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GDCM 133-136 ................... 61

Tabela 42: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GDCM 137-43 ..................... 62

Tabela 43: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-DCM ........................ 64

Tabela 44: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 8.................. 65

Tabela 45: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 9-10 ............ 65

Tabela 46: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 9-10. 22-23 . 66

Tabela 47: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 22-25 .......... 67

Tabela 48: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-AcOEt ...................... 68

Tabela 49: Quantidade de massa e rendimento dos extratos ................................................... 75

Tabela 50: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido oleanólico. .................................................................................................................. 78

Tabela 51: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido ursólico. ...................................................................................................................... 83

xiv

Tabela 52: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona. ....................................................................................... 89

Tabela 53: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico. ................................................................................... 94

Tabela 54: Deslocamentos químicos típicos para C-3 e C-6 para alcaloides de esqueleto ioimbina. ................................................................................................................................. 100

Tabela 55: Deslocamentos químicos típicos para C-14 e C-20 para alcaloides de esqueleto ioimbina. ................................................................................................................................. 101

Tabela 56: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-ajmalicina. ........................................................................................................ 103

Tabela 57: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x 1H COSY de 10-metoxi-ajmalicina. ............................................................................................ 105

Tabela 58: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 11-metoxi-ajmalicina. ........................................................................................................ 112

Tabela 59: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 11-metoxi ajmalicina. ............................................................................................. 113

Tabela 60: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 11-metoxi-3-isoajmalicina. ................................................................................................ 120

Tabela 61: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 11-metoxi-3-isoajmalicina. .................................................................................... 122

Tabela 62: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 9-metoxi-3-isoajmalicina. .................................................................................................. 128

Tabela 63: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina. ...................................................................................... 129

Tabela 64: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 9-metoxi-3-isoajmalicina. ...................................................................................... 131

Tabela 65: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 9-metoxi-3-isoajmalicina. ...................................................................................... 131

Tabela 66: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina. .................................................................................... 138

Tabela 67: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina. ......................................................................... 140

Tabela 68: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-3-isorauniticina................................................................................................. 145

xv

Tabela 69: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 10-metoxi-3-isorauniticina. .................................................................................... 147

Tabela 70: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-rauniticina......................................................................................................... 153

Tabela 71: Resultado das reações dos extratos de Duroia macrophylla com o oxidante DPPH. ................................................................................................................................................ 157

Tabela 72: Resultados da análise de toxicidade sobre Artemia salina dos extratos de Duroia macrophylla. ........................................................................................................................... 160

Tabela 73: CIM dos extratos de Duroia macrophylla frente às bactérias testadas. .............. 163

Tabela 74: CIM das substâncias isoladas de Duroia macrophylla frente às bactérias testadas. ................................................................................................................................................ 164

Tabela 75: Determinação da CIM dos extratos de D. macrophylla frente ao M. tuberculosis. ................................................................................................................................................ 166

Tabela 76: Determinação da CIM das frações do extrato DCM dos galhos da 1ª coleta. ..... 167

Tabela 77: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta ..... 168

Tabela 78: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH dos galhos da 1ª coleta. ... 168

Tabela 79: Determinação da CIM das frações do extrato DCM dos galhos da 2ª coleta. ..... 169

Tabela 80: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta, ... 169

Tabela 81: Determinação da CIM das substâncias isoladas de D. macrophylla. .................. 171

Tabela 82: Determinação da viabilidade celular das substâncias isoladas de D. macrophylla em linhagens de células tumorais. .......................................................................................... 173

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN= Acetonitrila AcOEt = Acetato de etila ANT = Antirheoideae APT= Teste do Hidrogênio Ligado CC = Coluna Cromatográfica CCDC = Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CCDP = Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CDCl3= Clorofórmio Deuterado CDO3D= Metanol Deuterado C3D6O= Acetona Deuterada C5D5N= Piridina Deuterada CIM = Concentração Inibitória Mínima CBM = Concentração Bactericida Mínima CIN = Cinchonoideae CI50 = Concentração Inibitória CL50 = Concentração Letal CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COSY= Espectroscopia de Correlação Homonuclear COTI= Coordenação de Tacnologia e Inoavação DCM = Diclorometano DMSO = Dimetilssulfóxido DPPH = 2,2-difenil-1-picril-hidrazila Hex = Hexano HMBC= Espectroscopia de Correlação Heteronuclear de Múltiplos Quanta HSQC= Espectroscopia de Correlação Heteronuclear de um Único Quantum INH = Isoniazida IXO = Ixoroideae MeOH = Metanol Rt = Tempo de retenção REMA= Resazurin Microtitre Assay RMP = Rifampicina RMN = Ressonância Magnética Nuclear RPPN = Reserva Particular de Patrimônio Natural RUB = Rubioideae UV = Ultra-violeta TB= Tuberculose

xvii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 2

2.1 A Família Rubiaceae ............................................................................................................... 2

2.1.1 Características Botânicas ................................................................................................. 2

2.1.2 Aspectos Químicos, Biológicos e Botânicos ................................................................... 3

2.1.3 Quimiossistemática ......................................................................................................... 8

2.1.4 Tribo Gardeniae ............................................................................................................. 10

2.1.5 Características do gênero Duroia .................................................................................. 31

2.1.6 A espécie Duroia macrophylla Huber ........................................................................... 33

2.1.7 Atividades Química e Biológica.................................................................................... 34

3. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 39

3.1 Geral ...................................................................................................................................... 39

3.2 Específicos ............................................................................................................................ 39

4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 40

4.1. Coleta do Material e Preparo dos Extratos ............................................................................ 40

4.2. Especificações dos Equipamentos e Materiais Utilizados..................................................... 41

4.3. Estudo Fitoquímico dos Extratos da 1ª Coleta ...................................................................... 43

4.3.1. Fracionamento dos Extratos Diclorometânico das Folhas ............................................ 43

4.3.2. Fracionamento dos Extratos Metanólico de Folhas e Galhos ....................................... 52

4.4. Estudo Fitoquímico dos Extratos da 2ª Coleta ...................................................................... 58

4.4.1. Fracionamento dos Extratos Diclorometânico dos Galhos ........................................... 58

4.4.2. Fracionamento dos Extratos Metanólico dos Galhos .................................................... 64

4.5. Atividades Química e Biológica ........................................................................................... 69

4.5.1. Atividade Antioxidante ................................................................................................. 69

4.5.2. Toxicidade frente a Artemia salina ............................................................................... 70

4.5.3. Atividade Antibacteriana ............................................................................................... 71

4.5.4. Atividade Antimicobacteriana ....................................................................................... 72

4.5.5. Avaliação da citotoxicidade in vitro .............................................................................. 73

xviii

RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................................... 75

5.1. Prospecção Fitoquímica ........................................................................................................ 75

5.2. Identificação das Substâncias Isoladas dos Extratos da Primeira Coleta de Duroia macrophylla ....................................................................................................................................... 76

5.2.1 Identificação dos triterpenos ......................................................................................... 77

5.2.2 Identificação da Sustância III ........................................................................................ 88

5.2.3 Identificação da Sustância IV ........................................................................................ 94

5.3. Identificação das Substâncias Isoladas dos Extratos da Segunda Coleta de Duroia macrophylla ....................................................................................................................................... 99

5.3.1. Identificação da Substância V ..................................................................................... 102

5.3.2. Identificação da Substância VI .................................................................................... 111

5.3.3. Identificação da Substância VII .................................................................................. 120

5.3.4. Identificação das Substâncias VIII e IX ...................................................................... 127

5.3.5. Identificação da Substância X ..................................................................................... 138

5.3.6. Identificação da Substância XI .................................................................................... 145

5.3.7. Identificação da Substância XII .................................................................................. 152

5.4. Atividades Química e Biológica ......................................................................................... 157

5.4.1. Atividade Antioxidante ............................................................................................... 157

5.4.2. Toxicidade sobre Artemia salina ................................................................................. 160

5.4.3. Atividade Antibacteriana ............................................................................................. 161

5.4.4. Atividade Antimicobacteriana ..................................................................................... 165

5.4.5. Atividade citotóxica in vitro ........................................................................................ 171

5. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 174

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 176

7. ANEXOS ..................................................................................................................................... 213

xix

1

1. INTRODUÇÃO

Estudos na área de produtos naturais têm sido desenvolvidos com o biomonitoramento de

seus extratos vegetais, fato que otimiza as pesquisas de substâncias bioativas de interesse

econômico. Portanto, há uma demanda de estudos científicos que envolvam plantas com

atividade biológica, de modo que tal prática deve ser incentivada, constituindo um caminho

promissor e eficaz para a descoberta de novos medicamentos. Estes novos produtos podem,

além de trazer divisas, oferecer oportunidade para geração de emprego ao longo da cadeia

produtiva, não só na zona urbana, mas, sobretudo, na zona rural, contribuindo para a

desconcentração de renda e, consequentemente, para a interiorização do desenvolvimento da

Amazônia (ENRÍQUEZ, 2010).

A grande diversidade vegetal da Amazônia abriga centenas de espécies pertencentes a

diferentes famílias, entre elas estão as espécies da família Rubiaceae, uma das famílias mais

representativas da flora brasileira. Estas plantas possuem importância econômica, agrícola,

ornamental e medicinal (JOLY, 1983), além de contribuir com a bioprodução de metabólitos

especiais com um grande potencial farmacológico (HEITZMAN et al., 2005).

A família Rubiaceae destaca-se pela produção de alcaloides bioativos que originam

diversos fármacos, sendo estes ainda considerados marcadores quimiotaxônomicos de

determinadas subfamílias e gêneros (BARREIRO, 1990 e FARIAS, 2006). A quantidade de

produtos descritos, sua diversidade estrutural e variadas atividades farmacológicas fazem dos

alcaloides, junto com antibióticos, um dos grupos mais importantes entre as substâncias

naturais com interesse terapêutico (CORDELL et al., 2001).

Ao escolher as plantas a serem investigadas devem-se considerar as informações

botânicas e quimiotaxonômicas, pois a probabilidade de encontrar substâncias bioativas sejam

elas inéditas, ou já descritas na literatura é bem maior. Estas fontes de biodiversidade menos

exploradas ou inexploradas estão frequentemente associadas à nova diversidade química

(CLARDY e WALSH, 2004). Entre estas fontes, podem ser citadas algumas espécies

endêmicas da Floresta Amazônica que ainda permanecem sem estudo químico e/ou biológico

como é o caso da espécie Duroia macrophylla. Com base nestas informações e devido à

escassez de estudos sobre o gênero Duroia este trabalho propõe o estudo químico e de

atividade biológica de Duroia macrophylla Huber.

2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A Família Rubiaceae

2.1.1 Características Botânicas

A família Rubiaceae possui distribuição cosmopolita, concentrada nos trópicos, é uma

das maiores da classe Magnoliopsida, ocupando o quarto lugar em diversidade de espécies

entre as Angiospermas (MABBERLEY, 1997). Inclui aproximadamente 637 gêneros e 10.700

espécies e 39 tribos, as quais estão principalemente nas regiões tropicais e subtropicais do

globo (PEREIRA et al., 2007; MONGRAND et.al, 2005). No Brasil ocorrem cerca de 130

gêneros e 1.500 espécies, correspondendo a uma das principais famílias de nossa flora e

ocorrendo como um importante elemento em quase todas as formações naturais (SOUZA e

LORENZI, 2008).

Esta família está divida em quatro subfamílias (Rubioideae, Antirheoideae, Ixorideae e

Cinchonoideae) e 44 tribos. As subfamílias e tribos com representantes no Brasil estão

relacionadas na Figura 1 (JOLY, 1983; ROBRECHT, 1988).

As espécies possuem os mais variados portes e hábitos, desde ervas, subarbustos,

arbustos, árvores e raramente lianas. As folhas são opostas, menos freqüentemente

verticiladas, simples, quase sempre com estípulas interpeciolares, ocasionalmente

transformadas em espinhos e a margem é inteira. As flores geralmente são vistosas e os frutos

do tipo cápsula, drupa ou baga (SOUZA e LORENZI, 2008).

3

1. Subfamília Rubioideae

Tribo 1. Psychotrieae

Tribo 2. Coussareae

Tribo 4. Schradereae

Tribo 3. Morindeae

Tribo 7. Hedyotideae

Tribo 6. Hamelieae

Tribo 5. Coccocypseleae

Tribo 8. Spermacoceae

Tribo 9. Rubieae

2. Subfamília Cinchonoideae

Tribo 11. Naucleae

Tribo 10. Cinchoneae

Tribo 13. Rondeletieae

Tribo 12. Henriquezieae

Tribo17. Coffeeae

Tribo 16. Gardenieae (Duroia)

Tribo 18. Chiococceae

Tribo 15. Retiniphylleae

Família Rubiaceae

4. Subfamília Antirheoideae

Tribo 14. Mussaendeae

3. Subfamília Ixorideae

Tribo 20. Cephalantheae

Tribo 19. Guettardeae

Figura 1: Subfamílias e tribos com representantes no Brasil, com destaque para o gênero

estudado no presente trabalho. Fonte: BARROSO et al. (1991).

2.1.2 Aspectos Químicos, Biológicos e Botânicos

A família Rubiaceae destaca-se pela produção de alcaloides bioativos e por sua

taxonomia complexa (FARIAS, 2006). Segundo Hoehne (1939), os três principais alcaloides

da medicina provêm desta família: a quinina, a emetina e a cafeína. Os alcaloides são

exemplos de metabólitos secundários que originam diversos fármacos (BARREIRO, 1990). A

quantidade de produtos descritos, sua diversidade estrutural e variadas atividades

4

farmacológicas fazem dos alcaloides, junto com antibióticos, um dos grupos mais importantes

entre as substâncias naturais com interesse terapêutico (CORDELL et al., 2001).

Estudos fitoquímicos revelaram que os alcaloides das rubiáceas pertencem a mais de

dez classes diferentes, destacando-se os isoquinolínicos, com 44 substâncias descritas; os

quinolínicos, com 70 alcaloides; e os indólicos, com 391 compostos isolados (CORDELL et

al., 2001). Os alcaloides indólicos são os principais marcadores químicos desta família

(CARBONEZI et al., 2004). Além destes compostos, também foram evidenciados agliconas e

heterosídeos de iridoides, antraquinonas, saponina triterpênica, flavonoides, lignoides,

terpenoides e derivados fenólicos (HAMERSKI et al., 2005a; SILVA et al., 2006).

Os alcaloides indólicos são derivados do metabolismo do triptofano que são

característicos em Rubiaceae (BRUNETON e BARTON, 1991). Os alcaloides exercem uma

função importante na elucidação de efeitos farmacológicos, respostas fisiológicas e

mecanismos bioquímicos.

Muitas destas substâncias foram e continuam sendo empregadas no tratamento de

diferentes enfermidades (CORDELL et al., 2001). Exemplos destes alcaloides são: cafeína

(Coffea arabica); emetina (Cephaelis ipecacuanha) com atividade anti-emética e amebicida;

quinidina (Cephaelis ledgeriana) anti-arrítmico; quinina (Cinchona ledgeriana) anti-malárica

e tônica e ioimbina (Pausinystalia yoimba) afrodisíaca (CORDELL et al., 2001).

Cephaelis ipecacuanha Rich. é uma planta clássica brasileira usada na medicina

mundial. Desta espécie, em 1817, Pelletier e Magandie isolaram o princípio ativo emetina,

substância largamente utilizada no tratamento de desinterias. A droga da ipecacuanha possui

efeito anti-emético apreciável e expectorante em doses atenuadas, sob a forma de pó ou

xarope. O Brasil exportava suas raízes secas e já produziu emetina cristalizada (HOEHNE,

1939; RIZZINI e MORS, 1995).

A quinina foi isolada no ano de 1820, por Pelletier e Caventou, durante

aproximadamente 200 anos esta substância foi o único princípio ativo contra a malária, e pode

ser considerado como responsável pelo desenvolvimento dos antimaláricos sintéticos

(BARREIRO, 1990; VIEGAS et al., 2006).

A Psychotria viridis Ruiz et Pavón, mais conhecida como “chacrona”, é utilizada em

cerimônias e rituais religiosos em associação com o cipó Banisteriopsis caapi (Spruce)

Morton (“caapi”), uma Malpighiaceae, no preparo de uma bebida com propriedades

alucinógenas conhecida como “ayahuasca”, que significa “vinho das almas”. A mistura é

utilizada em várias regiões da floresta Amazônica pelas comunidades do “Santo Daime” e

“União do Vegetal” (CALLAWAY et al., 1996; GROB et al., 1996). O efeito alucinógeno da

5

bebida é devido à presença do alcaloide N,N-dimetiltriptamina (DMT), encontrado nas folhas

da “chacrona” e que tem atividade agonista de receptores 5-HT2A (serotonina) em associação

com alcaloides indólicos β-carbolínicos (a harmina, a harmalina e a tetraidroarmina) presentes

nas cascas de “caapi”. O alcaloide harmalina é um potente inibidor da monoaminoxidase tipo

A (MAO-A), enzima que promove a degradação da DMT no organismo. Como consequência

deste mecanismo, observa-se um aumento da biodisponibilidade oral da DMT intensificando

e prolongando seus efeitos alucinógenos (DEULOFEU, 1967; FREEDLAND e

MANSBACH, 1999).

Do fruto do genipapo (Genipa americana L.) foi isolado a genipina, iridoide incolor,

mas que produz cor preta após reagir com as proteínas da pele, a matéria corante era utilizada

pelos indígenas nas tatuagens. Este mesmo fruto atualmente é utilizado para fazer vinhos,

licores, compotas, refrescos, etc. (PINTO, 1995; RIZZINI e MORS, 1995).

A família caracteriza-se pela produção de metabólitos especiais com um grande

potencial farmacológico, dentre os quais podemos citar: anti-inflamatório, tóxico, antiviral,

propriedades antioxidantes, efeitos em doenças vasculares e do sistema nervoso central,

mutagenicidade, atividade antibacteriana (HEITZMAN et al., 2005) e atividade analgésica

(TAKAYAMA, 2004).

Foi realizado o levantamento bibliográfico de trabalhos publicados sobre a fitoquímica

da família Rubiaceae de 1990 a 2013 (Anexo 1). Com base nos dados de literatura, foi

observada a ocorrência principalmente de alcaloides indólicos, antraquinonas, ácidos

fenólicos, iridoides, triterpenoides e glicosídeos variados, estas substâncias foram isoladas das

mais diversas espécies de Rubiaceae. Porém, as espécies com maior número de estudos

fitoquímico registrados nesses anos, pertencem aos gêneros Cephaelis, Galium, Gardenia,

Hedyotis, Morinda, Ophiorrhiza, Psychotria e Uncaria. Algumas das estruturas destas

substâncias isoladas de espécies pertencentes à família Rubiaceae encontram-se na Tabela 1 e

Figura 2.

Tabela 1: Algumas classes de metabólitos identificados em espécies de Rubiaceae

Gêneros Classe Substância Número

Cephaelis

Alcaloide Emetina 1

Lactona Ácido Chelidônico 2

Alcaloide Cefalina 3

Alcaloide Psicotrina 4

6

continuação da Tabela 1.

Cinchona

Alcaloide Quinina 5

Triterpeno Ácido Cinchólico 6

Triterpeno Ácido Quinóvico 7

Alcaloide Quinidina 8

Alcaloide Cinconina 9

Alcaloide Cinconidina 10

Coffea

Metil-xantina Cafeína 11

Diterpeno Cafestol 12

Antraquinona Galiosina 13

Antraquinona Copareolatina 14

Antraquinona Munjistina 15

Corynanthe Alcaloide Yohimbina 16

Galium Iridoide Macedonina 17

Genipa Monoterpeno Genipina 18

Hedyotis Antraquinona Alizarina 19

Landerbergia




Morinda Antraquinona Alizarina 19

Mussaenda Triterpeno Ácido Arjunólico 20

Oldenlandia Antraquinona Alizarina 19

Psychotria Alcaloide Psicotrina 4

Alcaloide Cefalina 3

Relbunium Antraquinona Purpurina 21

Remijia




Rubia Antraquinona Purpurina 21

Antraquinona Alizarina 19

Fonte: Zuleta, 1997.

7

NH

NH5C2

HHH

OMeOMe

H

MeO

MeO

Emetina (1)

O

O

COOHHOOC

Ácido Chelidônico (2)

NH

N

H

CH2CH3

OH

CH3O

CH3O

OMe

H

Cefalina (3)

N

N

OH

H H

H

H3CH2C

OMe

OMeOMe

Psicotrina (4) N

NOHH

H

MeO

H

Quinina (5)

OH

COOH

COOH

Ácido Cinchólico (6)

OH

COOH

COOH

Ácido Quinóvico (7) N

OHH H

N

H

MeO

Quinidina (8) N

OHH H

N

H

Cinconina (9) N

OHH

N

H

H

Cinconidina (10)

O

OH

CH2OHCH3

Cafestol (12)

O

O

OGliOH

OH

COOH

Galiosina (13)

N

N N

N

O

O

CH3CH3

CH3

Cafeína (11)

O

O

OH

OH

OH

OHOH

COOH

Copareolatina (14)

O

O

OH

OH

COOH

Munjistina (15)

N

OH

NH

H3COOC

H

H

Yohimbina (16)

OHOH2C

OHCOOH

Macedonina (17)

O OH

O

OHH

H

MeO

Genipina (18) O

OH

OHO

Alizarina (19) OH

OHCOOH

HOH2C Ácido Arjunólico (20) O OH

OH

OHO

Purpurina (21)

Figura 2: Algumas substâncias identificadas em Rubiaceae.

8

2.1.3 Quimiossistemática

A subdivisão mais importante da família Rubiaceae foi feita por Robbrecht (1988),

que a dividiu em quatro subfamílias: Cinchonoideae, Ixoroideae, Antirheoideae e Rubioideae.

O autor introduziu, para sua análise filogenética, caracteres como placentação, morfologia e

anatomia de frutos e sementes. Entretanto, ficou determinado que o posicionamento das

subfamílias e a determinação das tribos, gêneros e espécies ainda permanecia difícil, em geral

devido à falta de informação acerca da distribuição geográfica e de caracteres

morfoanatômicos de diversas espécies.

Com a crescente preocupação em se obter uma classificação mais confiável das

subfamílias e tribos, a definição de metabólitos secundários é bem consolidada e neste caso

fator imprescindível na classificação taxonômica desta família (BREMER, 1996). Uma boa

correlação entre as vias biossintéticas e os aspectos morfológicos das subfamílias Ixoroideae,

Cinchonoideae e Rubioideae, são obtidos pela avaliação dos dados químicos, aliados aos

parâmetros citados por Robbrecht (1988). Cada uma destas subfamílias apresenta um perfil

diferente e típico para alcaloides indólicos, iridoides, e antraquinonas, que são considerados

marcadores quimiotaxonômicos de Rubiaceae. Já na subfamília Antirheoideae não foi

observada uma ocorrência padronizada de nenhum desses marcadores químicos (BOLZANI

et al., 2001), conforme ilustrado na Figura 3.

Na subfamília Ixoroideae, os iridoides são encontrados como marcadores

quimiotaxonômicos exclusivos. São exemplos de espécies de Ixoroideae: o gênero Coffea, do

cafeeiro (Coffea arabica), fonte de uma das bebidas mais famosas e apreciadas no Brasil,

assim como de vários compostos de com atividade farmacológica; Genipa, do jenipapo

brasileiro; e Gardenia, importante fonte de espécies ornamentais (BOLZANI et al., 2001; DI

STASI e HIRUMA-LIMA, 2003).

Em Cinchonoideae os alcaloides indólicos predominam. As espécies de Cinchona são

fonte de quinino e outros compostos de valor terapêutico (BOLZANI et al., 2001; DI STASI e

HIRUMA-LIMA, 2003).

As espécies de Rubioideae possuem antraquinonas como a principal classe de

metabólitos secundários. Nesta subfamília estão os gêneros: Psychotria, que inclui várias

espécies com substâncias de ação no SNC e muito usadas em rituais. Cephaelis da conhecida

C. ipecacuanha, importante fonte de emetina e outros constituintes e Palicourea responsável

por cerca da metade das mortes por intoxicação natural em bovinos no País. A intoxicação é

atribuída ao ácido monofluoroacético, substância de alta toxidez para diversos mamíferos,

9

inclusive o homem. A utilização indiscriminada para fins medicamentosos de plantas do

gênero Palicourea por grande parte da população, sem conhecimento ou preocupação com

possíveis efeitos tóxicos, despertou o interesse químico e farmacológico de plantas deste

gênero (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2003; DE-MORAES-MOREAU et al., 1995).

Já na subfamília Antirheoideae não há a ocorrência de nenhum destes marcadores

químicos, o que é consistente com a divisão proposta por Robbrecht, considerando somente as

informações morfológicas (BOLZANI et al., 2001).

Em um estudo quimiotaxonômico foi realizada uma triagem para iridoides glicosilados

em várias espécies e baseado em dados obtidos por cromatografia em fase gasosa acoplada à

espectrometria de massas pode-se concluir que estes metabólitos estão presentes em todas as

subfamílias de Rubiaceae (INOUYE et al., 1988).

Os Alcaloides indólicos ocorrem essencialmente nas famílias que pertencem à ordem

Gentianales (Loganiaceae, Rubiaceae, Naucleaceae e Apocynaceae), onde são observados

principalmente alcaloides indólicos monoterpênicos. A ocorrência de alcaloides indólicos fora

da ordem Gentianales é bastante rara e, quando encontrados, são normalmente alcaloides

indólicos simples (SCHRIPSEMA et al., 2004).

Considerando o perfil químico da família Rubiaceae, existem muitas espécies sem

qualquer estudo, o que impede que os taxonomistas realizem divisões na família e subfamília

(BOLZANI et al., 2001). Sendo assim, o conhecimento aprofundado da família Rubiaceae, de

grande diversidade metabólica e pronunciado potencial farmacológico pode abrir perspectivas

para a química, farmacologia e quimiotaxonomia desta família. Sendo estes estudos uma

ferramenta importante para a classificação quimiotaxônomica das espécies dentro dos

gêneros. A distribuição dos principais metabólitos secundários dentre as subfamílias de

Rubiaceae está ilustrada na Figura 3.

10

Iridoides

Alcaloides IndólicosAntraquinonasFlavonoides

TriterpenosDerivados de FenolAlcaloides

Figura 3: Diversidade química e distribuição dos principais metabólitos secundários dentre as

subfamílias de Rubiaceae. IXO: Ixoroideae, CIN: Cinchonoideae, RUB: Rubioideae, ANT:

Antirheoideae (BOLZANI et al., 2001).

2.1.4 Tribo Gardeniae

Dado aos poucos estudos encontrados para o gênero Duroia e considerando que a tribo

é o clado intermediário entre a subfamília e gênero, realizou-se um levantamento bibliográfico

das espécies estudadas que pertencem à tribo Gardenieae. Estudos morfológicos e

moleculares relatam 40 gêneros pertencentes a esta tribo (ANDREASEN e BREMER, 1996;

BREMER, 2009) os quais possuem distribuição pantropical e a maioria apresenta hábito

arbóreo ou arbustivo (CHIQUIERI et al., 2004). Segundo Robbrecht et al. (1996) os iridoides

são considerados o principal marcador quimiotaxonômico desta tribo. Algumas das

substâncias isoladas de espécies desta tribo estão descritas nas Tabelas de 2 a 18.

Tabela 2: Monoterpenos

Espécie Substâncias Referências Genipa americana Genipacetal (22) ONO et al., 2006

Ácido genípico (23) TALLENT, 1964 Ácido genipínico (24)

Psydrax livida Psidrina (25) NAHRSTEDT et al., 1995

11


OO

H

HOH

HCOOCH3

22

O

COOH

OH

23

O

COOH

OH

COOCH3

24

OO

OHHOHO

HO

O

O

25

Tabela 3: Ácidos fenólicos

Espécie Substâncias Referências Lamprothamnus zanguebaricus

1-(3-Hidroxi-4-metoxi-5-metilfenil)-etanona (26)

KHAN et al, 2003

1-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-etanona (27)

C

OCH3

CH3OCH3

OH

26

C

OCH3

OCH3

OH

27

Tabela 4: Iridoides

Espécie Substâncias Referências Alibertia sessilis Ácido geniposídico (28) SILVA et al., 2007

Geniposídeo (29) 6α-Hidroxigeniposideo (30) 6β-Hidroxigeniposideo (31)

Burchellia bubalina β-Gardiol (32) DREWES et al., 1999 α-Gardiol (33) Garjasmine (34)

Canthium gilfillanii Ácido geniposídico (28) NAHRSTEDT et al., 1995

12

continuação da Tabela 4. Feretia apodanthera Gardenosídeo (35) BAILLEUL et al., 1980

Éster acetílico do ácido desacetil asperulosídico (36)

Gardenia jasminoides Genipina 1-O-β-D-isomaltoside (37)

CHEN et al., 2009

Genipina 1,10-di-O-β-D-glucopiranoside (38) Genipina 1-O-β-D-gentiobioside (39)

ENDO e TAGUCHI, 1973

Geniposídeo (29) Éster metílico escandoside (40)

GUVENALP et al., 2006

Éster metílico do ácido deacetilasperulosidico (41)

DAMTOFT et al., 1981

Éster metílico do ácido 6-O-etildeacetilasperulosidico(42)

MACHIDA et al., 2003

Gardenosídeo (35) FARID et al., 2002 Genipa americana Genipaol (43) ONO et al., 2007

Genipina (44) TALLENT, 1964 Tarenosídeo (45) Ácido geniposídico (28) Geniposídeo (29) Genamesídeo A (46) Genamesídeo B (47)

Genipa americana Genamesídeo C (48) TALLENT, 1964 Genamesídeo D (49) Genipina gentiobiosídeo (50) Gardenosídeo (51) Gardendiol (52) Shanzhisídeo (53)

Rothmannia globosa α-Gardiol (33) JENSEN, 1983 β-Gardiol (32)

Tocoyena formosa

α-Gardiol (33) KARIKAS et al. 1987 β-Gardiol (32) Gardenosídeo (35)

O

H

HHO

ORO

OGlcH

28 R=H 29 R=CH3

O

H

HHO

OCH3O

OGlcH

R2R1

30 R1=OH, R2=H 31 R1=H, R2=OH

13


H

H

HOO

O

OH

R1 R2

32: R1=COOMe, R2=H 33: R1=H, R2= COOMe

O

H

HCOOMe

HOO

34

O

O

OHHOHO

HO

O

H

HCOOCH3

OHHO

35

O

HCOOCH3

HO

HO H OGlc

36

O

H

HOR1

R3

R4

R2O

COOCH3

37: R1=Z, R2=R3=R4=H 37a: R1=Z(Ac)7, R2=Ac, R3=R4=H 38: R1=R2=X, R3=R4=H 38a: R1=R2= R3=R4=H 39: R1=Y, R2=R3=R4=H 40: R1=X, R2= R4=H, R3=OH 41: R1=X, R2=R3=H, R4=OH 42: R1=X, R2=R3=H, R4=OCH3

14


OHO

OH

HOOH

X= β-glucopiranosil

OHO

OH

HOOH

O

OHO

HOOH

Y=β-gentiobiosil

OHO

OH

HOOH

OO

HOHO

OH Z=β-isomaltosil

O

H2H

COOCH3

OHO

HOH

43

O

COOCH3

HO OH

44

O

CHO

HOOGIC

45

O

O

OHHOHO

HO

O

H

HCO2Me

R4

R2

R1

R3

46: R1=R4=OH, R2=H, R3=CH2OH 47: R1=H, R2= R3=OH, R4=CH2OH

O

O

OHHOR3O

R4O

O

H

HCOOR2

R1O

48: R1= R4=H, R2=CH3, R3= Glc 49: R1= Glc, R2= CH3, R3=R4=H 50: R1=R3= H, R2=CH3, R4=Glc

15


O

O

OHHOHO

HO

O

H

HCOOCH3

OHHO

51

O

OH

H

OH

OHHO

52

O

H

H

COOH

OGIC

HO

HO

53

Tabela 5: Diterpeno

Espécie Substâncias Referências Amaioua guianensis tipo caurano (54) OLIVEIRA, 2009

CO2H

54

Tabela 6: Triterpenos

Espécie Substâncias Referências Alibertia myrciifolia Éster metílico de ácido

pomólico (55) AHMAD, 1994

Éster metílico do ácido ursólico (56) Éster metílico do ácido oleanólico (57)

Amaioua guianensis 3β, 6β, 19α, 23 tetrahidroxiolean-12-en-28-óico (58)

OLIVEIRA, 2009

3β, 6β, 19α, 23 tetrahidroxiurs-12-en-28-óico (59)

16

continuação da Tabela 6. Gardenia collinsae 20R,24R-epoxy-3-oxo-

dammarane-25ξ, 26-diol (60) NUANYAI et al., 2011

Epímero do 60 no C-24 (61) 20R,24R-ocotillone (62)

Gardenia saxatilis Lupenona (63) SUKSAMRARN et al., 2003 Lupeol (64)

Ácido betulinico (65) Gardenia saxatilis Ácido (27-O-

feruloiloxibetulinico) (66) SUKSAMRARN et al., 2003

Ácido messagenico A (67) Ácido messagenico B (68) Ácido oleanólico (69) Ácido ursólico (70) Ácido uncarinico E (Ácido 27-O-p-(E)-coumaroiloxioleanólico) (71) 27-O-p-(E)- Ácido coumaroiloxiursólico (72)

Oxyanthus pallidus Ácido oleanólico (60) TIGOUFACK et al., 2010

COOCH3

HO

R

55: R=OH 56: R=H

HO

COOCH3

57

17


CO2H

HO

HO

OHOH

58

CO2H

HO

HO

OHOH

59

H

O H

OHH OH

OH

60

H

O H

OHH

OH

OH

61

18


H

O H

OHH OH

62

HO H

CH2R1

R2

63: C-3 didehidro análogo de 64 64: R1=H, R2=CH3 65: R1=H, R2=COOH 66: R1=A, R2=COOH 67: R1=B, R2=COOH 68: R1=C, R2=COOH

HO H

CH2R1

COOH

R2R3

69: R1=R2=H, R3=CH3 70: R1=R3=H, R2=CH3 71: R1=C, R2=H, R3=CH3 72: R1=C, R2= CH3, R3= H

19


OH

C O

O

CR4

OHO

O

A: R4= OCH3 B

C: R4= H

Tabela 7: Saponinas

Espécie Substâncias Referências Catunaregam nilotica

Oleanolate 28-O-β-D-Glucopiranosil-3-O{O-α–L-ramnopiranosil-(1→3)-O-β-D-glucopiranosil]-(1→3)]-β-D-glucopiranosil} (73)

LEMMICH et al., 1995

Ácido oleanólico 3-O-[2’,3’-di-O-(β-D-glucopiranosil)-β-D-glucopiranosil] (74) ácido oleanólico 3-O-{O-α-L-ramnopiranosil-(1→3)-O-[O-β-D-glucopiranosil-(1→3)]-β-D-glucopiranosil} (75) ácido oleanólico 3-O-[O-β-D-glucopiranosil-(1→3)-β-D-glucopiranosil] (76) Ácido 3-O-β-D-glucopiranosídeo-quinóvico (77) Ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo-cinchólico (78)

Catunaregam spinosa

Catunarosideo A (79)

GAO et al., 2011

Catunarosideo B (80) Catunarosideo C (81) Catunarosideo D (82) Swartziatriosideo (83) Aralia-saponina V (84) Aralia-saponina IV (85)

Tocoyena brasiliensis Ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo-quinóvico (86) AQUINO et al., 1988

Tocoyena brasiliensis

Ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo -cinchólico (78)

HAMERSKI et al., 2005

Ácido 3-O-β-D glucopiranosídeo-quinóvico (87)

YÉPES et al., 1991

Ácido 28-O-β-D-glucopiranosídeo quinóvico (88) SOUSA et al., 1984

20

continuação da Tabela 7

O

OHHO

OH

R3OO

O

OR2

HO

OH

OCH3

H

CH3

H

CH3

H

CH3

CH3

H

COOR1

CH3 CH3

73: R1=β-D-Gluc, R2=H, R3=α-L-Rap 74: R1=H, R2=β-D-Gluc, R3=H 75: R1=H, R2=H, R3=α-L-Rap 76: R1=H, R2=H, R3=H

COOH

OH

O

HO

O

OH

HO OOH

77

COOH

OH

O

HO

O

OH

OOH

78

21


O

OHHOHO

OH O

OR1OHO

OH

O

OR2

O

R3

79: R1=β- D -Xil, R2=H, R3=OH 80: R1=α-L-Rap, R2=H, R3=H 81: R1=α-L-Rap, R2= β-D-Glc, R3=OH 82: R1= β-D-Xil, R2= β-D-Glc, R3=OH 83: R1= β-D-Xil, R2= H, R3=H 84: R1= β-D-Glc, R2= β-D-Glc, R3=H 85: R1= β-D-Xil, R2= β-D-Glc, R3=H

COOH

OH

O

HO

O

OH

OOH

86

COOH

OH

O

HO

O

OH

OOH

HO

87

22


COOH

O

O

HO

O

OH

OH

OHOH

88

Tabela 8: Triterpenos cicloartano

Espécie Substâncias Referências Oxyanthus pallidus Palidioside A (89) TIGOUFACK et al., 2010

Palidioside B (90) Palidioside C (91)

OHH

O

CH3

ROH

CH3

CH3

OHCH3

R2

R1

89: R=H, R1=Glc, R2=O 90: R=H, R1=Glc, R2=H/ α-OH 91: R=H, R1=Glc, R2=H/β-OH

23

Tabela 9: Esteróide glicosilado

Espécie Substâncias Referências Oxyanthus pallidus 3-O-β-D-glicopiranosil

sitosterol (92) TIGOUFACK et al., 2010

O

HO

HO

HO HO

O

H

92

Tabela 10: Carotenoides

Espécie Substâncias Referências Gardenia jasminoides

Crocetina (93) PFISTER et al., 1996 Éster crocetina mono (β-

D-glucosil) (94) Éster crocetina di (β-D-glucosil) (95) Éster crocetina mono (β-

gentiobiosil) (96)

Éster crocetina (β-D-glucosil)-(β-gentiobiosil) (97) Éster crocina [crocetina-di- (β- gentiobiosil)] (98) Éster crocetina (β-gentiobiosil)-(β-neapolitanosil) (99) Éster crocetina-di (β- neapolitanosil) (100) 13Z-crocina (101) SPERANZA et al., 1984

OR2

R1O

O

O

24


O

OHHOHO

OH

X

O

OHHOHO

O

OHHOHO

O

OH

A

B

Y

O

HOHO

O

OHHOHO

O

OH

O

OHHOHO

OOH

Z

93: R1=R2=H 94: R1=H, R2=X 95: R1=R2=X 96: R1=H, R2=Y 97: R1=X, R2=Y 98: R1=R2=Y 99: R1=Y, R2=Z 100: R1=R2=Z

R1O

O OR2

CH3 CH3

CH3

CH3

101: R1=R2=Y

25

Tabela 11: Flavonoides

Espécie Substâncias Referências Alibertia myrciifolia Corimbosina (102) ZANI et al., 1995

Letedocina (103) Apometzgerina (104) ROFI e POMILIO, 1985 Acacetina (105) AGRAWAL e BANSAL,

1989 Apigenina (106) Tocoyena brasiliensis Ramanzina-3-O-

rutinosídeo (107) AGRAWAL e BANSAL, 1989

O

OOH

R1

R2

R3

R4

102: R1=R2=R3=R4=OCH3 103: R1=R2=R3= OCH3; R4=OH 104: R1=R4=OH; R2=R3=OCH3 105: R1=OH; R2=R4=H; R3=OCH3 106: R1=R3=OH; R2=R4=H

OHO

OO

HO

OH

OHOH

HO

O

OOH

HO

OH

O

OCH3

107

26

Tabela 12: Derivados fenólicos

Espécie Substâncias Referências Alibertia sessilis 3,4,5-trimetoxifenil-1-O-β-

D-(5-Osiringoila)- apiofuranosil-(1→6)-β-D-glicopiranosideo (108)

SILVA et al., 2007

Amaioua guianensis Ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (109)

OLIVEIRA, 2009

Ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila (110)

Oxyanthus speciosus subsp. gerrardii

2-(2-hidroxi)-etanol-β-D-glucopiranosideo (111)

NAHRSTEDT et al., 1995

Psydrax lívida Psidrosideo (112)

O

OHO

OCH3

HO

CH3O OO

O O

OCH3

OCH3

OCH3

OH

OHOHOH

108

HO

HO

CO

O

CHO

O

OH

OH

O C

O

OH

OH 109

HO

HO

CO

O

CHO

O

OCH3

OH

O C

O

OH

OH 110

27


OO

OHHOHO

HO

111

HO

HO

O

OO

OH OH

OO

OHHOHO

O

O 112

Tabela 13: Proantocianidinas

Espécie Substâncias Referências Pavetta owariensis epicatequin-

(4β→8,2β→O→7)-ent-epicatequin-(4α→8, 2α→O→7)-ent-catequina (113)

BALDE et al., 1991

epicatequin-(4β→6)-epicatequin-(4β→8, 2β→O→7)-epicatequin- (4β→8)-epicatequina (114)

Pavetta owariensis epiafzelequin-(4β→8,2β→O→7)-epicatequin-(4β→8)-epicatequin-(4β→8)-epicatequina (115)

BALDE et al., 1991

epiafzelequin-(4β→8,2β→O→7)-ent-afzelequin-(4α→8)-ent-epicatequin-(4α→8,2α →O→7)-ent-catequina (116) epiafzelequin-(4β→8,2β→O→7)-ent-catequin-(4α→8)-ent-epicatequin-(4α→8,2β→O→7)-ent-catequina (117)

28


OH

O

OH O

HO

HO

OH

OH

O

HO

HO HO

OHO

OH

OH

OH

OH

HO OH

OOH

OH

OH

113

OH

O

OH O

HO

HO

OH

OH

O

HO

HO HO

OHO

OH

OH

OH

OH

HO OH

OOH

OH

OH

114

OH

O

OH O

HO

HO

OH

OH

O

HO

HO HO

OHO

OH

OH

OH

OH

HO OH

OOH

OH

OH

115

29


OH

O

OH O

HO

HO

OH

OH

O

R

HO HO

OHO

OH

OH

OH

OH

OHO

OOH

OH

OH

116: R=H 117: R=OH

Tabela 14: Lignanas glicosiladas

Espécie Substâncias Referências Alibertia sessilis (+)-lioniresinol-3α-O-β-D-

glicopiranosideo (118) SILVA et al., 2007

(-)-lioniresinol-3α-O-β-D-glicopiranosideo (119)

O

OH

OHOH

OHO

OHH3CO

HO

OCH3

H3COOH

OCH3

118

O

OH

OHOH

OHO

OHH3CO

HO

OCH3

H3COOH

OCH3

119

30

Tabela 15: Cumarinas

Espécie Substâncias Referências Alibertia myrciifolia Escopoletina (120) SILVA et al., 2004 Amaioua guianensis Escoparona (121) OLIVEIRA, 2009

O OOH

H3CO

120

O OH3C

H3C

121

Tabela 16: Glicosídeos cianogênicos

Espécie Substâncias Referências Oxyanthus pyriformis subsp. pyriformis

Prunasina (122) ROCKENBACH et al., 1992 Amigdalina (123)

O. speciosus subsp. gerrardii Holocalina (124)

CNH O

O

OH

OH

OHOH

122

O

HOHO

O

OHHOHO

O

OH

OC

NC

OH

123

H

O

OHHOHO

HO

O

CN

124

Tabela 17: Alcaloide

Espécie Substâncias Referências Amaioua guianensis Amaiouina (125) OLIVEIRA et al., 2009

N

O

H

HNO

HN

NHO O

H

H

OH

125

31

Tabela 18: Ácidos graxos Espécie Substâncias Referências Catunaregam spinosa

Ácido 11, 14-eicosadienoico (126)

ZENG et al., 2005

Ácido palmítico (127) Ácido esteárico (128) Ácido mirístico (129)

CHO

O

126

OH

O

127

OH

O

128

OH

O

129

2.1.5 Características do gênero Duroia

Duroia apresenta cerca de 30 espécies neotropicais, sendo uma localizada na Costa

Rica e as demais na América do Sul (TAYLOR et al. 2004). Estudos moleculares de filogenia

verificaram que este gênero é muito próximo ao Amaioua, tornando difícil a diferenciação

entre eles (BREMER, 2009). Porém, flores pistiladas e frutos solitários são características

exclusivas a Duroia (TAYLOR e CAMPOS, 2007). Geralmente são árvores, arvoretas ou

arbustos. Ramos quadrangulares ou cilíndricos, frequentemente fistulosos, glabros ou pilosos.

Estípulas unidas num capuz cônico sobre a gema terminal, decíduas, seríceas ou pilosas.

Folhas opostas ou verticiladas, decussadas, sésseis ou pecioladas, às vezes dotadas de

protuberâncias basais cuja presença está associada com a presença de formigas.

Inflorescências estaminadas terminais, cimosas, fasciculadas ou capitadas. Frutos bacáceos,

bem desenvolvidos, ovoides ou oblongos, coriáceos ou lenhosos, geralmente pardos;

sementes numerosas, comprimidas ou suborbiculares, envolvidas numa polpa gelatinosa

32

(TAYLOR e CAMPOS, 2007). A posição taxonômica deste gênero está elucidada na Figura 1

(pág. 3).

São comuns as associações com formigas, a maioria ocorrendo em ramos ocos, os

quais servem de abrigo para as várias espécies de formigas que os utilizam. Em alguns casos,

as formigas constroem ninhos em várias partes externas da planta, como ramos, folhas, e até

mesmo frutos (RIBEIRO et al., 1999). Como é o caso da simbiose existente entre Duroia

hirsuta e a formiga Mymelachista schumanni (FREDERICKSON, 2005). Enquanto a formiga

vive no interior do caule da planta, se beneficiando do abrigo que esta lhe confere, D. hirsuta

é beneficiada pelo ácido fórmico sintetizado pela M. schumanni como um herbicida natural,

impedindo que outras plantas cresçam ao seu redor, assim, eliminando as espécies

competitivas. Os cientistas imaginavam que as árvores de D. hirsuta secretavam alguma

substância que mataria outras plantas (alelopatia), mas descobriram que é o primeiro caso em

que o ácido fórmico é empregado pelos insetos como herbicida. Isso, no entanto, não exclui a

possibilidade da ocorrência simultânea da alelopatia (FREDERICKSON et al., 2005).

Poucos estudos têm sido encontrados na literatura para Duroia. Dentre as poucas

espécies estudadas está D. hirsuta que é utilizada pela população como cicatrizante e

apresentou atividade antibacteriana in vitro (LOPEZ et al., 2001), atividade antivirótica

contra HSV (Herpes simplex virus) (KHAN et al., 2005). E do extrato de suas folhas foram

isolados flavona, iridoide lactona e um flavonol (AQUINO et al., 1999) e um iridoide

tetracíclico (PAGE et al., 1994), mostrados na Tabela 19. Porém um grande número de

espécies ainda permanece sem qualquer estudo químico e/ou biológico.

Tabela 19: Substâncias relatadas para espécies do gênero em estudo.

Espécie Substâncias Referência

Duroia hirsuta Duroina (130), éteres flavonol-3-O-metil (131 e 132), novo flavonol (133)

AQUINO et al., 1999;

Plumericina (134) PAGE et al., 1994

O

O

O

O H

H

H

COOCH315

1314

1011

9

12

1

34

57

6

8

Plumericina 134 Duroina 130

33


O

OH

OR1

OR

O

MeO

OMe

7 2 5'

4'3'

(131) R = R1 = CH3, éter flavonol-3-O-metil (132) R = CH3, R1 = H, éter flavonol-3-O-metil (133) R = H, R1 = CH3 flavonol

2.1.6 A espécie Duroia macrophylla Huber

É conhecida popularmente como cabeça-de-urubú, apuruí ou puruí-grande-da-mata e

sua sinonímia é Coupoui brasiliensis Wernham (TAYLOR e CAMPOS, 2007; The plant list,

2013). É uma árvore de subdossel, variando de 15–20 m de altura e 12–25 cm diâmetro.

Tronco circular, base às vezes acanalada, digitada. Ritidoma marrom a marrom avermelhado,

levemente fissurado, escamoso; exterior da casca marrom ou bege; casca internamente

marrom, alaranjada ou rosada; odor forte. Os ramos são quadrangulares, espessos, fistulosos,

ferrugíneo-hirsutos. Folhas ternadas, longamente pecioladas; pecíolo 5– 8,5 cm compr.;

lâmina ovada a lanceolada, 30–40 × 14–24 cm, coriácea, ápice acuminado, base obtusa, face

adaxial glabra exceto as nervuras seríceas, face abaxial com as nervuras tomentosas; nervuras

laterais 18–21 pares, impressas na face adaxial. Flores estaminadas pediceladas e corola

creme. Bagas solitárias, sésseis e ferrugíneo-tomentosas; sementes orbiculares, comprimidas e

pubescentes (TAYLOR e CAMPPOS, 2007). A Figura 4 ilustra detalhes da espécie como seu

aspecto geral, folhas, detalhe da estípula, inflorescência e frutos.

É uma espécie endêmica da Amazônia, ocorrendo especialmente na porção centro-sul,

no Peru, Venezuela e Brasil. Habita tanto a mata virgem de terra firme como a campinarana,

como planta de sub-bosque, sendo rara e pouco conhecida. Segundo Campos e Brito (1999),

esta espécie ocorre nas florestas de baixio, vertente e platô e floresce em novembro a

dezembro e frutifica de janeiro a junho. É uma frutífera tipicamente silvestre, não cultivada,

de valor em situações de sobrevivência na floresta. A polpa dos frutos é acidulada, bastante

agradável, lembrando o tamarindo. Os registros de herbário indicam frutificação nos meses de

outubro a fevereiro (CAVALCANTE, 1996; BAZE et al., 2003).

http://www.theplantlist.org/tpl/record/kew-48391

34

Desta espécie foram isolados alcaloides indólicos, sendo um deles inédito na literatura

(NUNEZ et al., 2009, 2012), dentre estes alcaloides, o de caráter inédito apresentou alta

atividade antitumoral e baixa toxicidade em células sadias, devido a este potencial químico-

biológico da espécie em estudo, foi depositada a patente: "novo alcaloide antitumoral de

Duroia macrophylla” (NUNEZ e VASCONCELOS, 2012). Até o momento, não foi

encontrado nenhum estudo químico e nem de atividade biológica de Duroia macrophylla na

literatura consultada, salvo estes, realizados pelo grupo de pesquisa. Com base nestas

informações e devido à escassez de estudos sobre o gênero Duroia, este trabalho propõe o

estudo químico e biológico de Duroia macrophylla.

Figura 4: Imagens da espécie D. macrophylla. (A) aspecto geral da árvore, (B) exsicata, (C)

folha, (D) detalhe da estípula, (E) inflorescência, (F) frutos (G) flor. Fonte: RIBEIRO et al.

(1999) E,F,G; FOTOS: MARTINS, D A, B, C, D.

2.1.7 Atividades Química e Biológica

Mesmo com o desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, microbiologia industrial

e biologia molecular, muitos fármacos continuaram sendo obtidos a partir de fontes vegetais,

seja pela dificuldade de se obter moléculas com a mesma estereoquímica, como pela

inviabilidade econômica de produzi-los sinteticamente (GUERRA e NODARI, 2003;

SCHENKEL et al., 2003).

Devido a esta busca por novos fármacos, os produtos naturais destacam-se pela

diversidade estrutural e, assim, as plantas são candidatas importantes para screening de novos

A B C

D

E

F

G

35

compostos bioativos. Ao considerar as informações etnobotânicas e quimiotaxonômicas, a

escolha das plantas a serem investigadas aumenta as probabilidades de novas descobertas de

substâncias bioativas sejam elas inéditas, ou já descritas na literatura.

Considerando esse conjunto de fatores, a família Rubiaceae, desponta como uma fonte

promissora de novas substâncias bioativas. Muitos laboratórios de Produtos Naturais têm

inserido dentro de suas rotinas de isolamento, purificação e elucidação estrutural, diversos

ensaios biológicos simples, no intuito de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de

extratos vegetais na procura de substâncias bioativas. Dentre estes bioensaios realizados neste

trabalho, encontra-se, antioxidante, toxicidade sobre Artemia salina, antibacteriano,

antimicobacteriano e antitumoral in vitro.

2.1.7.1 Atividade Antioxidante

Entre as atividades produzidas pelos metabólitos secundários das plantas destaca-se a

atividade antioxidante. O interesse em encontrar antioxidantes naturais para o emprego em

produtos alimentícios ou para uso farmacêutico tem aumentado consideravelmente, com o

intuito de substituir antioxidantes sintéticos, os quais têm sido restringidos devido ao seu

potencial de carcinogênese, bem como pela comprovação de diversos outros efeitos

indesejáveis (YILDIRIM et al., 2001; ZHENG e WANG, 2001; MELO e GUERRA, 2002;

SIMÃO, 1985). A adição de compostos antioxidantes é, sem dúvida, uma prática constante,

razão que justifica o atual interesse pela pesquisa de novas substâncias com capacidade

antioxidante (SILVA et al., 1999).

Estas substâncias, com ação comprovada contra o efeito nocivo de radicais livres,

atuam como inibidores dos processos de peroxidação e de envelhecimento dos tecidos, assim

como, também podem agir de modo a complexar o ferro, suprimindo um dos processos

catalisadores da oxidação da vitamina C e dos lipídios. Está provado que a maior parte das

substâncias polifenólicas tem atividade antioxidante e que podem ser administradas para

prevenir e tratar algumas doenças (DA CUNHA e DA GRAÇA, 2005).

Muitos destes efeitos benéficos relacionados à prevenção de diversas enfermidades

estão associados à própria natureza química deste grupo de moléculas, devido à sua estrutura,

polifenóis são em geral bons agentes redutores e juntamente com outros agentes redutores

encontrados na dieta tais como vitamina C, vitamina E e carotenóides, podem proteger tecidos

e estruturas celulares contra danos oxidativos (MAURÍCIO, 2006).

36

2.1.7.2 Toxicidade sobre Artemia salina

O ensaio da letalidade de organismos simples, como o microcrustáceo marinho

Artemia salina Leach, permite a avaliação da toxicidade geral e o biomonitoramento de

extratos vegetais e metabólitos especiais com potencial atividade biológica (MEYER et al.,

1982; CAVALCANTE et al., 2000).

Este ensaio é um método rápido, confiável e de baixo custo, que pode ser empregado

para a determinação de toxicidade. Utilizando-se a concentração letal média (CL50) é possível

determinar e avaliar a atividade biológica (toxicidade) de uma molécula, fração ou de extratos

vegetais. A toxicidade sobre Artemia salina pode ser correlacionada com atividades como

antifúngica, viruscida e antimicrobiana (MACBAE et al., 1988), entre outras.

Os resultados podem ser interpretados observando o valor médio (CL50). Assim,

quanto menor o valor de CL50, mais tóxico é o composto perante um organismo-teste e maior

é a sua atividade citotóxica, sugerindo maior potencial como antitumoral (ANDRIOLLI et al.,

2009).

2.1.7.3 Atividade Antibacteriana

O desenvolvimento da resistência de micro-organismos a antibióticos tem sido rápido

e progressivo. Este problema, associado à baixa taxa de descoberta de novas substâncias com

potencial antimicrobiano, confirma a necessidade de estudos de novas moléculas, de fonte

natural ou sintética, com atividade antimicrobiana (WHITE et al., 2003). Sendo assim, a

diversidade de moléculas encontradas em plantas faz destas, uma fonte promissora de novos

agentes antimicrobianos (LEITÃO et al., 2006; SILVA et al., 2007, 2008; COUTINHO et al.,

2008).

Dentre as inúmeras bactérias patogênicas estão Klebsiella pneumoniae,

Flavobacterium corumnare, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Escherichia coli,

Edwardsella tarda, Salmonella enteridis, Staphylococus aureus, Providencia rettgeri,

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa e Nocardia brasiliensis. No entanto, o

uso de antibióticos contra esses micro-organismos tem selecionado linhagens resistentes,

levando assim, à busca por novas substâncias bioativas (HOSHINA et al., 1962; COSTA et

al., 2003; POWELL et al., 2009). Portanto, a busca de novos antibacterianos constitui-se num

campo de investigação aberto, amplo e contínuo.

37

2.1.7.4 Atividade Antimicobacteriana

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada por uma bactéria em

forma de bacilo pertencente ao gênero Mycobacterium, descoberta por Robert Koch, em 1882

e denominada de Mycobacterium tuberculosis (SMITH, 2003).

Mycobacterium compreende cerca de 100 espécies, sendo 25 identificadas como

patogênicas ao homem. Além do complexo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M.

microti, M. bovis, M. africanum, M. canetti) existem espécies saprófitas e outras que atuam

como patógenos oportunistas causando enfermidades denominadas de micobacterioses

(POZNIAK et al.,1996; RAYNAUD et al.,1998; CORTINAS et al., 2002).

Conforme WORLD HEALTH ORGANIZATION [WHO] (2009), o número anual de

novos casos de tuberculose é estimado em 8,7 milhões, 80% estão concentrados em 22 países,

dentre eles o Brasil. Em 1999, cerca de 1/3 dos infectados pelo HIV eram também pelo bacilo

de Koch e juntas constituem, hoje, uma calamidade sem precedentes na história. O impacto

desta inter-relação se faz criticamente alarmante quando se tem presente que o HIV, na

atualidade, é o maior fator de risco para o desenvolvimento da tuberculose em pessoas

previamente infectadas. No Brasil, houve grande expansão da epidemia de AIDS o que

acabou refletindo na epidemiologia da tuberculose e o principal problema relacionado é a

resistência aos fármacos, a associação desta doença à infecção por HIV e o longo tempo de

duração da terapia (BETHLEM et al., 1990).

Segundo as estimativas do Banco Mundial, se o controle da tuberculose não se efetivar

de forma satisfatória e não houver inovações terapêuticas e profiláticas, em 2020 a

tuberculose contribuirá com 55% das mortes observadas em adultos nos países em

desenvolvimento (LAXMINARAYAN et al., 2007).

O aumento na prevalência de cepas resistentes, a co-infecção com HIV, somados ao

fato de que nenhum novo antimicrobiano específico para a TB foi introduzido nos últimos 40

anos, reforçam a necessidade de desenvolver novos medicamentos que sejam mais eficazes

frente a cepas resistentes, reduzam o tempo de tratamento e que possam atuar frente ao bacilo

em estado de latência (O’BRIEN e NUNN, 2001). Assim, apesar do arsenal existente de

quimioterápicos de combate à tuberculose, o problema de resistência requer a busca constante

por novas drogas eficazes no combate a essa doença (ROSSETTI et al., 2002).

Mesmo com o desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, microbiologia industrial

e biologia molecular, muitos fármacos continuaram sendo obtidos a partir de fontes vegetais,

seja pela dificuldade de se obter moléculas com a mesma estereoquímica, como pela

38

inviabilidade econômica de produzi-los sinteticamente (GUERRA e NODARI, 2004;

SCHENKEL et al., 2003). Desta forma, a pesquisa por produtos biologicamente ativos que

possam atuar de maneira mais eficaz para o controle da TB e a diversidade química dos

produtos de origem vegetal tem mostrado novas opções terapêuticas (SWENSON et al.,1985;

PIETRO et al., 2000; CANTRELL et al., 2001; CALIXTO e YUNES, 2001; JANÚARIO et

al., 2002).

Esses dados mostram a necessidade de realizar estudos para a descoberta de novas

drogas para o tratamento da tuberculose. Principalmente por drogas que sejam de tratamento

mais simples, que permitam maior adesão do paciente ao tratamento.

2.1.7.5 Atividade Antitumoral

A atividade antitumoral das substâncias isoladas pode ser estabelecida em cultura de

células tumorais de várias linhagens. Para o desenvolvimento de novas drogas bioativas são

necessários modelos adequados para a identificação de alvos moleculares que sejam

essenciais para o crescimento celular seja in vitro ou in vivo (MACIEL et al. 2002). O câncer,

por ser doença crônico-degenerativa, tem evolução prolongada e progressiva (BARBOSA,

2008), fato que incentiva a busca por novas drogas eficazes no seu tratamento.

Muitos dos fármacos utilizados no tratamento de câncer são derivados de produtos

naturais, como o taxol que possui eficácia clínica no tratamento de câncer de ovário, mama,

pulmão e próstata (WALL e WANI, 1996), os alcaloides da vinca (Catharanthus), vincristina

e vimblastina, que são utilizados como agentes antitumorais para o tratamento de leucemia,

linfomas e alguns tumores sólidos, esses alcaloides agem impedindo a divisão celular durante

a metáfase das células tumorais (SCHRIPSEMA et al., 2004).

Atualmente a busca por substâncias antitumorais sintéticas ou naturais tem sido

desenvolvida por meio de uma triagem utilizando diversas linhagens de células tumoarais in

vitro, possibilitando a análise de muitas substâncias em diferentes linhagens (NEIDLE et al,

2005). Portanto, a pesquisa de novas substâncias bioativas que possam gerar novos produtos

(moléculas ativas ou protótipos de fármacos) é de fundamental importância, dada a variedade

de estruturas químicas de produtos naturais que certamente irão desempenhar um papel

importante no desenvolvimento de novas gerações de drogas antitumorais.

39

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Realizar o estudo fitoquímico dos extratos de Duroia macrophylla e avaliar suas

atividades química e biológica.

3.2 Específicos

Purificar as substâncias presentes nos extratos de folhas e galhos de D. macrophylla;

Testar extratos, frações e substâncias isoladas de D. macrophylla frente ao

Mycobacterium tuberculosis e sobre células tumorais: carcinoma colorretal humano,

carcinoma de mama, melanoma humano e fibroblasto de pulmão humano.

Avaliar os extratos de D. macrophylla quanto às atividades biológica e quimica:

toxicidade (sobre Artemia salina), antioxidante e antibacteriana;

Identificar ou elucidar a estrutura química das substâncias isoladas através da combinação

de métodos espectroscópicos (RMN de 1H e de 13C, mono e bidimensionais, UV, IV) e

espectrométricos (CLAE/EM e CG/EM), conforme as características estruturais.

40

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Coleta do Material e Preparo dos Extratos

Para obtenção do material vegetal, foram realizadas duas coletas: a primeira na

Reserva Florestal A. Ducke uma área de 100 km2, localizada a 26 km NE de Manaus, na

rodovia AM-010 e a segunda em uma Reserva Particular de Patrimônio Natural –

RPPN, Cachoeira da Onça, localizada no município de Presidente Figueiredo, AM. O

material botânico de D. macrophylla foi identificado e depositado no Herbário do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA (Tabela 20).

Tabela 20: Dados da coleta de Duroia macrophylla e número de voucher no herbário do INPA.

Local da coleta Data da coleta Registro herbário

Reserva Ducke-Manaus 05/12/2008 222501 RPPN – Presidente Figueiredo 18/05/2011 238337

O material vegetal (folhas e galhos) foi seco em estufa a 50 oC e posteriormente

triturado em moinho de facas. Folhas e galhos foram submetidos à extração com

solventes de polaridade crescente (diclorometano ou hexano, metanol e água). Foram

realizadas três extrações utilizando banho de ultrassom por 20 minutos. Após filtração,

os extratos diclorometânico ou hexânico e metanólico foram concentrados em rota-

evaporador (Figura 5). Em 2008, o laboratório ainda adotava diclorometano como

solvente de baixa polaridade, mas por motivos ecológicos, esse solvente foi substituído

por hexano, salvo em casos como a extração dos galhos da 2ª coleta, na qual foi

utilizada DCM, devido ao pouco rendimento obtido com o hexano.

41

Figura 5: Fluxograma da preparação dos extratos de galhos e folhas de Duroia

macrophylla.

4.2. Especificações dos Equipamentos e Materiais Utilizados

Para a evaporação dos solventes, utilizou-se rota-evaporador a vácuo

(FISATOM). E para o preparo dos extratos utilizou-se banho de ultrassom (UNIQUE).

Os solventes utilizados para as extrações, fracionamentos em coluna aberta e

análises cromatográficas em camada delgada possuíam grau comercial de pureza, sendo

previamente destilados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia - LABB

(INPA).

Os extratos obtidos foram analisados por CCDC a fim de detectar as classes

químicas existentes e também determinar o sistema de eluição adequado para o

fracionamento cromatográfico. Estes extratos foram submetidos a uma série de

cromatografias em coluna, utilizando a fase estacionária mais adequada dependendo da

composição amostral e sistemas de eluição determinados por CCDC. Todas as frações

obtidas dos fracionamentos foram reunidas por características químicas semelhantes.

Para a Cromatografia em Camada Delgada (CCDC), utilizaram-se

cromatoplacas de sílica gel 60, com indicador de fluorescência UV254, com 0,20 mm

de espessura (MACHEREY – NAGEL -MN). As quais foram eluídas com sistemas

apropriados e reveladas com luz UV (λ= 254 e 365 nm), DPPH, anisaldeído sulfúrico,

sulfato de cério (IV) (Ce(SO4)2) e cloreto de ferro (III) (FeCl3). As frações obtidas que

42

se apresentaram mais interessantes quimicamente e que possuíam maiores quantidades

de massa foram analisadas por RMN de 1H (60 MHz), a fim de conhecer a sua

composição química, bem como direcionar o fracionamento para a purificação de suas

moléculas.

As fases estacionárias (FE) empregadas para a cromatografia em coluna (CC)

para o fracionamento dos extratos da 1ª coleta foram: Sílica Gel 60 (230-400 mesh –

ASTM) e cartucho de Florisil Sep-pak (10g/60 mL) Phenomenex. As colunas

cromatográficas variaram de acordo com a quantidade de amostra, mas a proporção de

amostra/sílica manteve-se em torno de 1:70.

O fracionamento dos extratos da 2ª coleta foi realizado no Laboratoire de

Pharmacognosie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Lille, France.

As FE utilizadas para o fracionamento foram: Sílica Gel 60 (0,063-0,2 mm - Merck

KGaAl) para fracionamento de extratos brutos e Sílica Gel 60 (0,015-0,04 mm –

Machery-Nagel) para o fracionamento de frações.

Algumas das frações semi-puras foram analisadas e purificadas utilizando

Comatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Nesta técnica, os solventes utilizados

foram degaseificados e ultrafiltrados, e tinham grau espectroscópico (TEDIA). O

equipamento utilizado da marca Shimadzu possui Degaseificador DGU-14A, injetor

automático modelo SIL-10AF; duas bombas do modelo LC 6AD, um Coletor FRC

10A, e Interface modelo SCL 10AVP. O detector possui arranjo de fotodiodos (DAD),

modelo SPDM20A. Foram utilizadas colunas analíticas (250 x 4,5 mm),

semipreparativas (250 x 10 mm) e pré-colunas, todas da marca Phenomenex, com

partículas de 5µ. A fase estacionária utilizada foi a ciano (amino-propil-ciano).

Para o ensaio da atividade antioxidante, utilizaram-se os reagentes: ácido

ascórbico P.A (VETEC) e DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) (SIGMA ALDRICH).

A leitura da absorbância foi feita em um espectrofotômetro FENTOM (modelo Cirrus

80ST).

As substâncias isoladas foram analisadas por Espectrometria de Massas em

equipamento LC-MS 8030 (Shimadzu), com fonte de ionização por elétrons (EI) e

analisador do tipo quadrupolo. Foram solubilizados 1 mg de cada amostra em 100 μL de

metanol e, dessa solução, 1 μL foi injetado por injeção direta.

As frações que apresentaram elevado grau de pureza foram analisadas por RMN,

sendo as substâncias I, II, III e IV analisadas em aparelho Varian Inova (400 MHz) e as

substâncias V, VI, VII, VIII, IX, X, XI e XII em aparelho Bruker Avance (500 MHz).

43

Os experimentos foram realizados a 30 oC, utilizando solventes deuterados conforme a

solubilidade das amostras: acetona (C3D6O), clorofórmio (CDCl3), metanol (CDO3D) e

piridina (C5D5N), e calibrados em relação ao TMS como referência interna (0,00 ppm).

Para o espectro de RMN de 1H, foi utilizada a sequência de pulsos s2pul, tempo de

relaxamento de 1,0 seg, pulso de 45,0o, tempo de aquisição de 7,3925 seg, janela

espectral de 4432,49 Hz, intervalo entre os pulsos de 1,0 seg, com 32 repetições e

largura da banda de 0,2 Hz. As análises de correlação ¹H-¹³C (HSQC e HMBC) foram

otimizados para uma constante de acoplamento média ¹J(C,H) de 140 Hz e LRJ(C,H) de

8 Hz, respectivamente.

4.3. Estudo Fitoquímico dos Extratos da 1ª Coleta

4.3.1. Fracionamento dos Extratos Diclorometânico das Folhas

O extrato diclorometânico das folhas (FDCM) com 9 g foi fracionado em

cromatografia em coluna (CC) aberta (150 x 3,2 cm), recheada com sílica gel (332g). O

sistema de eluição utilizado foi AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100%)

(Tabela 21). O volume de cada eluente da fase móvel da coluna cromatográfica foi de

900 mL e para as frações foram recolhidos volumes de 50 a 100 mL. Foram coletadas

99 frações, e aquelas que apresentavam perfis cromatográficos semelhantes foram

reunidas e novamente analisadas em CCDC para a escolha do método cromatográfico

de refracionamento, da fase estacionária e dos eluentes mais eficientes na separação.

Após, foram fracionadas em CC aberta, em sílica gel, utilizando como fase

móvel um sistema de gradiente de hexano, DCM e MeOH. Foram fracionadas as

frações reunidas 1-4,6-12, 14-16, 17-21, 25-40, 45, 46-56 e 57.

Tabela 21: Eluentes utilizados para o fracionamento do extrato FDCM

Frações coletadas Eluentes

1-18 Hex/AcOEt 85:15

19-29 Hex/AcOEt 75:25

30-46 Hex/AcOEt 65:35

47-58 Hex/AcOEt 35:75

59-70 AcOEt 100%

71-80 AcOEt/MeOH 8:2

44

continuação da Tabela 21. 80-89 AcOEt/MeOH 1:1

90-99 MeOH 100%

A fração FDCM 1-4 (2 g) foi fracionada em CC aberta (85 x 1,8 cm) com sílica

gel (75 g) com gradiente de polaridade crescente de hexano, DCM e MeOH (Tabela 22).

O volume de cada eluente adicionado à CC foi de 400 mL, enquanto que os volumes

das 92 frações recolhidas variaram de 30 a 60 mL.

Tabela 22: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 1-4


1-13 Hex/DCM 9:1

14-24 Hex/DCM 8:2

25-35 Hex/DCM 7:3

36-44 Hex/DCM 1:1

45-53 DCM 100%

54-62 DCM/MeOH 9:1

63-71 DCM/MeOH 8:2

72-78 DCM/MeOH 7:3

79-85 DCM/MeOH 1:1

86-92 MeOH 100%

A fração FDCM 6-12 (1 g) foi fracionada em CC aberta (70 x 1,8 cm) com sílica

gel (70 g) com gradiente de DCM em hexano, MeOH em DCM até MeOH 100%

(Tabela 23). O volume de cada eluente adicionado à CC foi de 260 mL e o volume das

63 frações recolhidas foi de 30 a 50 mL. As frações foram reunidas por semelhança

química em CCDC.



1-9 Hex/DCM 7:3

10-15 Hex/DCM 6:4

16-23 Hex/DCM 1:1

45

continuação da Tabela 23. 24-31 DCM 100%

32-39 DCM/MeOH 9:1

40-44 DCM/MeOH 8:2

45-50 DCM/MeOH 7:3

51-56 DCM/MeOH 1:1

57-63 MeOH 100%

Destas frações reunidas, a fração 38-63 (60 mg) foi fracionada em CC aberta (18

x 1,0 cm) de sílica gel (6 g) e eluída em AcOEt e MeOH em diferentes proporções

(Tabela 24). As 26 frações obtidas foram reunidas após serem analisadas por CCDC.

Tabela 24: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 6-12.38-63


1-3 Hex/DCM 7:3

4-5 Hex/DCM 1:1

6-8 DCM 100%

9-11 DCM/MeOH 9:1

12-15 DCM/MeOH 8:2

16-18 DCM/MeOH 7:3

19-21 DCM/MeOH 6:4

22-24 DCM/MeOH 1:1

25-26 MeOH 100%

A fração FDCM 17-21 (150 mg) foi fracionada em cartuchos de Sep-pak

Florisil (10 g) e eluída com fase móvel em gradiente de polaridade crescente,

combinando hexano, AcOEt e MeOH 100% (Tabela 25). O volume de cada eluente foi

de 50 mL e o volume recolhido de cada fração foi de aproximadamente 25 mL.



1-2 Hex/AcOEt 8:2

3-5 Hex/AcOEt 7:3

46

continuação da Tabela 25. 6-7 Hex/AcOEt 6:4

8-10 Hex/AcOEt 1:1

11-12 AcOEt 100%






23-25 MeOH 100%

Após reunião das frações semelhantes, a fração 1-5 (85 mg) foi fracionada em

CC aberta (20 x 1,2 cm) de sílica gel (8 g) e eluída com gradiente de AcOEt em hexano,

MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 26). O volume de cada eluente foi de 50

mL, e recolhidos 25 mL de 33 frações. A fração 14 mostrou-se pura quando analisada

por CCDC e por RMN de 1H e 13C.

Tabela 26: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 17-21.1-5


1-3 Hex/AcOEt 9:1

4-6 Hex/AcOEt 8:2

7-10 Hex/AcOEt 7:3

11-14 Hex/AcOEt 6:4

15-17 Hex/AcOEt 1:1

18-20 AcOEt 100%






31-33 MeOH 100%

A fração FDCM 25-40 (900 mg) foi fracionada em CC aberta (81 x 1,6 cm)

com 90 g de sílica gel e gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH

47

100% (Tabela 27). O volume de cada eluente foi de 250 mL, e os volumes das 42

frações recolhidas de 20 a 50 mL.



1-3 Hex/AcOEt 9:1

4-5 Hex/AcOEt 8:2

6-7 Hex/AcOEt 7:3

8-10 Hex/AcOEt 6:4

11-12 Hex/AcOEt 1:1

13-18 AcOEt 100%





40-42 MeOH 100%

Destas, a fração 6 (130 mg) foi fracionada em coluna cromatográfica aberta (91

x 1,6 cm) com sílica gel (17 g), eluída com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em

AcOEt até MeOH 100% (Tabela 28). O volume de cada eluente foi de 20 mL, e o

volume das 19 frações recolhidas foi de 10 mL.

Tabela 28: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 25-40.6


1-2 Hex/AcOEt 8:2

3-4 Hex/AcOEt 7:3

5-6 Hex/AcOEt 6:4

7-8 Hex/AcOEt 1:1

9-10 AcOEt 100%




48


19 MeOH 100%

A fração FDCM 25-40.6.4 (4 mg) mostrou elevado grau de pureza quando

analisada por CCDC, então foi analisada por RMN de 1H e experimentos 2D (HSQC e

HMBC). Esta análise indicou que se tratava de uma mistura de dois triterpenos, a qual

foi purificada utilizando CLAE. A amostra foi dissolvida em acetonitrila (ACN) e

análisada em coluna analítica cianopropil (Phenomenex®; 250 x 4 mm, 4 µm) com

volume de injeção de 25 μL e fluxo de 1 mL/min. A purificação foi realizada em coluna

semi-preparativa cianopropil (Phenomenex®; 250 x 4 mm, 4 μm) com volume de

injeção de 35 μL e fluxo de 5 mL/min. A análise foi realizada no modo normal de

eluição, no sistema isocrático utilizando ACN/H2O (90:10). Foram observados dois

picos com tempo de retenção muito próximo, tR = 11.5 e 12 min. As frações obtidas

correspondentes a cada pico foram analisadas por RMN de 1H e bidimensionais (HSQC

e HMBC) e denominadas de substância I e substância II.

A fração FDCM 25-40.7 (100 mg) foi fracionada em CC aberta (81 x 1,6 cm) de

sílica gel (10 g) com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH

100% (Tabela 29). O volume de cada eluente adicionado à coluna cromatográfica foi de

20 mL, e o volume de cada uma das 42 frações recolhidas foi de 20 mL.

Tabela 29: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 25-40.7


1-5 Hex/AcOEt 8:2

6-10 Hex/AcOEt 7:3

11-13 Hex/AcOEt 6:4

14-16 Hex/AcOEt 1:1

17-21 AcOEt 100%





39-42 MeOH 100%

49

A fração FDCM 45 (700 mg) foi fracionada utilizando cartucho Sep-pak de

Florisil (10 g) e eluída AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela

30). O volume de cada sistema de eluição foi de 50 mL, e o volume das frações

recolhidas foi de aproximadamente 10 mL.

Tabela 30: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 45


1 Hex/AcOEt 9:1

2 Hex/AcOEt 8:2

3 Hex/AcOEt 7:3

4 Hex/AcOEt 6:4

5 Hex/AcOEt 1:1

6 AcOEt 100%

7 AcOEt/MeOH 9:1

8 AcOEt/MeOH 8:2

9 AcOEt/MeOH 7:3

10 AcOEt/MeOH 1:1

11 MeOH 100%

A fração FDCM 46-56 (320 mg) foi fracionada em coluna cromatográfica aberta

(22 x 1,8 cm) de sílica gel (26 g) e eluída com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH

em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 31). O volume de cada eluente adicionado à CC foi

de 80 mL, e o volume de cada uma das 27 frações recolhidas foram de 20 a 40 mL.



1-4 Hex/AcOEt 8:2

5-7 Hex/AcOEt 7:3

8-11 Hex/AcOEt 6:4

12-14 AcOEt 100%




50


26-27 MeOH 100%

A fração FDCM 57 (50 mg) foi fracionada em cartucho Sep-pak de Florisil e

eluída AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 32). Tanto o

volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica quanto os

volumes das 12 das frações recolhidas foi de 10 mL.

Tabela 32: Eluentes utilizados para o fracionamento da FDCM 57


1 Hex/AcOEt 8:2

2 Hex/AcOEt 7:3

3 Hex/AcOEt 6:4

4 Hex/AcOEt 1:1

5 AcOEt 100%

6 AcOEt/MeOH 9:1

7 AcOEt/MeOH 8:2

8 AcOEt/MeOH 7:3

9 AcOEt/MeOH 6:4

10 AcOEt/MeOH 1:1

11-12 MeOH 100%

O fracionamento do extrato FDCM da 1ª coleta está sumarizado na Figura 6.

51

Figura 6: Fracionamento do extrato DCM das folhas da 1ª coleta.

52

4.3.2. Fracionamento dos Extratos Metanólico de Folhas e Galhos

Através da análise em CCDC pode-se perceber que os extratos metanólicos

apresentaram substâncias com polaridade muito distinta, portanto foram submetidos à

extração líquido-líquido. Foi utilizada a mesma metodologia para os extratos das folhas

(10 g) e dos galhos (13 g). Cada extrato foi solubilizado em MeOH/H2O 1:9 e

particionado com DCM (500 mL; 3x) e depois com AcOEt (500 mL; 3x). A fase

hidrometanólica foi liofilizada (Figura 7).

Figura 7: Extração líquido-líquido de folhas e galhos dos extratos metanólico da 1ª coleta.

A fase DCM do extrato metanólico das folhas (FMeOH-DCM) (2 g) foi

fracionada em CC aberta (100 cm x 2,5 cm) de sílica (120 g), com gradiente de AcOEt

em DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 33).

Tabela 33: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase FMeOH-DCM


1-12 Hex/DCM 9:1

13-22 Hex/DCM 8:2

23-32 Hex/DCM 7:3

Extrato MeOH

Fase DCM Fase Hidrometanólica

Fase AcOEt

Extração em DCM

Extração em AcOEt

Fase Hidrometanólica

53

continuação da Tabela 33. 33-42 Hex/DCM 6:4

43-51 Hex/DCM 1:1

52-60 DCM 100%

61-70 DCM/MeOH 9:1

71-79 DCM/MeOH 8:2

80-89 DCM/MeOH 7:3

90-98 DCM/MeOH 6:4

98-107 DCM/MeOH 1:1

108-111 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de 400

mL, enquanto que o volume das frações recolhidas variou de 40 a 60 mL, foram obtidas

111 frações, as quais foram analisadas por CCDC e foram reunidas. Destas frações

reunidas obtidas do fracionamento do extrato FMeOH-DCM, foram fracionadas a

frações 7-10, 12-14 e 13-25 conforme demonstrado na Figura 8.

A fração 7-10 (130 mg) foi fracionada em CC aberta (29 x 0,9 cm) de sílica (9 g),

com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 34).

Tabela 34: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 7-10


1-3 Hexano 100%

4-6 Hex/AcOEt 9:1

7-9 Hex/AcOEt 8:2

10-12 Hex/AcOEt 7:3

13-15 Hex/AcOEt 6:4

16-18 Hex/AcOEt 1:1

19-20 AcOEt 100%






54

continuação da Tabela 34. 33-34 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de

30 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de aproximadamente 15 mL,

foram obtidas 34 frações, as quais foram analisadas por CCDC e foram reunidas.

A fração 12-14 (13 mg) foi submetida a CCDCP de sílica gel e eluída com o

sistema Hexano/AcOEt 6:4. Foram obtidas quatro frações.

A fração 13-25 (500 mg) foi fracionada em CC (1 m x 1,8 cm) de sílica (35 g)

com gradiente de AcOEt em DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 35).

Tabela 35: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 13-25


1-19 Hex/AcOEt 9:1

20-30 Hex/AcOEt 8:2

31-40 Hex/AcOEt 7:3

41-52 Hex/AcOEt 6:4

53-61 Hex/AcOEt 1:1

62-71 Hex/AcOEt 4:6

72-81 Hex/AcOEt 3:7

82-94 Hex/AcOEt 2:8

95-98 AcOEt 100%





159-187 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à CC foi de aproximadamente

200 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de 8 a 15 mL. Foram obtidas

187 frações, as quais foram analisadas por CCDC e foram reunidas. Desta reunião, a

fração 110-187 (80 mg) foi fracionada em CC (20 cm x 0,9 cm) de sílica gel (6 g), com

gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 36).

55

Tabela 36: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração FMeOH-DCM 13-25.110-187


1 Hex/AcOEt 7:3

2-3 Hex/AcOEt 6:4

4-6 Hex/AcOEt 1:1

7-8 AcOEt 100%

9-11 AcOEt/MeOH 9:1




19 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à CC foi de aproximadamente 40

mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de aproximadamente 20 mL.

Foram obtidas 19 frações, as quais foram analisadas por CCDC e foram reunidas.

Figura 8: Fracionamento da fase DCM do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta.

56

A fase AcOEt do extrato metanólico das folhas (FMeOH-AcOEt) com 1,3 g foi

fracionada em CC (70 cm x 1,3 cm) de sílica (70 g), com gradiente de AcOEt em

hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 37).

Tabela 37: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase FMeOH-AcOEt


1-3 Hex/AcOEt 8:2

4-6 Hex/AcOEt 7:3

7-10 Hex/AcOEt 6:4

11-12 Hex/AcOEt 1:1

13-15 AcOEt 100%






40-46 MeOH 100%


100 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de 30 a 60 mL, as 46 frações

foram analisadas por CCDC e foram reunidas. A fração 11-12 (2 mg) mostrou elevado

grau de pureza quando observada sob luz visível, UV 254 e 365 nm e reveladas com

anisaldeído sulfúrico. Após analisada por RMN de 1H e experimentos 2D (400 MHz)

esta fração foi identificada como sendo uma chalcona (substância III). O fluxograma

que descreve o fracionamento do extrato MeOH das folhas fase AcOEt da 1ª coleta está

ilustrado na Figura 9.

57

Figura 9: Fracionamento da fase AcOEt do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta

A fase AcOEt do extrato metanólico dos galhos (GMeOH-AcOEt) (600 mg) foi

fracionada em coluna aberta (70 cm x 1,3 cm) de sílica gel (30 g), com gradiente de

AcOEt em DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 38 e Figura 10).

Tabela 38: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-AcOEt


1 DCM/AcOEt 9:1

2-3 DCM/AcOEt 8:2

4-6 DCM/AcOEt 7:3

7-9 DCM/AcOEt 6:4

10-11 DCM/AcOEt 1:1

12-13 AcOEt 100%





25-28 MeOH 100%


60 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de 15 a 30 mL. Foram

coletadas 28 frações, destas a fração 7-8 (3 mg) apresentou alto grau de pureza quando

58

analisada nas cromatoplacas e através dos espectros de RMN de 1H e bidimensionais

foi possível a identificação de um ácido fenólico denominado ácido m-metoxi-p-

hidroxi-benzoico (substância IV).

Figura 10: Fracionamento da fase AcOEt do extrato MeOH dos galhos da 1ª coleta

4.4. Estudo Fitoquímico dos Extratos da 2ª Coleta

4.4.1. Fracionamento dos Extratos Diclorometânico dos Galhos

Foram fracionados 4 g do extrato diclorometânico dos galhos (GDCM) através

de CC aberta (95 x 2,2 cm), recheada com sílica gel (135 g), com gradiente AcOEt em

DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100%, sendo adicionado 0.01% de NH4OH na fase

móvel, obtendo-se pH 9 em cada sistema (Tabela 39). O fluxograma de todo o

fracionamento deste extrato encontra-se na Figura 11.

Tabela 39: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GDCM


1-9 DCM 100%

10-21 DCM/AcOEt 9:1

22-32 DM/AcOEt 8:2

33-42 DCM/AcOEt 7:3

43-49 DCM/AcOEt 6:4

50-56 DCM/AcOEt 1:1

57-63 DCM/AcOEt 4:6

64-72 DCM/AcOEt 3:7

59

continuação da Tabela 39. 73-81 DCM/AcOEt 2:8

82-94 DCM/AcOEt 1:9

95-103 AcOEt 100%






145-168 MeOH 100%

Foram obtidas 168 frações e o volume de cada sistema de eluição adicionado à

CC foi de aproximadamente 250 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi

de 20 mL. Ao analisar por CCDC, observou-se alto grau de pureza da fração 57 (47

mg), a qual apresentou coloração laranja ao ser revelada com Dragendorff, indicando a

presença de alcaloides, esta fração foi analisada por RMN de 1H, 13C e bidimensionais

(HSQC, HMBC e COSY), sendo identificada como 10-metoxi-ajmalicina (substância

V).

Após serem analisadas por CCDC, as frações semelhantes foram reunidas.

Destas, foram selecionadas as frações ricas em alcaloides para serem refracionadas: 54-

62, 133-136 e 137-143.

A fração 54-62 (350 mg) foi fracionada através de CC aberta (66 x 1 cm), com

20 g sílica gel, com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH

100%, sendo adicionado 0.01% de NH4OH na fase móvel, obtendo-se pH 9 em cada

sistema (Tabela 40). Foram obtidas 94 frações cada uma com 20 mL.

Tabela 40: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GDCM 54-62


1-3 Hex/AcOEt 95:05

4-7 Hex/AcOEt 9:1

8-10 Hex/AcOEt 85:15

11-16 Hex/AcOEt 8:2

17-20 Hex/AcOEt 75:25

60

continuação da Tabela 40. 21-23 Hex/AcOEt 7:3

24-26 Hex/AcOEt 6:4

27-31 Hex/AcOEt 1:1

32-35 Hex/AcOEt 4:6

36-38 Hex/AcOEt 3:7

39-41 Hex/AcOEt 2:8

42-45 Hex/AcOEt 1:9

46-48 AcOEt 100%










90-94 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à CC foi de aproximadamente 100

mL, enquanto que o volume das 94 frações recolhidas foi de 20 mL. Através da análise

de CCDC verificou-se que as frações 31 a 35 apresentavam alto grau de pureza,

portanto estas foram submetidas a analise de RMN de 1H, 13C e bidimensionais (HSQC,

HMBC e COSY). A fração 31 (2 mg) foi identificada como 11-metoxi-ajmalicina

(substância VI), a fração 32-33 (3 mg) corresponde ao alcaoide 11-metoxi-3-

isoajmalicina (substância VII), e a fração 34-35 (30 mg) foi caracterizada como 10-

metoxi-ajmalicina (substância V), a qual já havia sido isolada em fracionamentos

anteriores.

A fração 133-136 (200 mg) foi fracionada em CC aberta (35 x 1,8 cm), com 20 g

sílica gel, com gradiente de AcOEt em DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100%, a

cada sistema foi adicionado 0.01% de NH4OH, foi verificado o pH em 9 para cada

sistema (Tabela 41).

61



1-3 DCM/AcOEt 9:1

4-6 DM/AcOEt 8:2

7-9 DCM/AcOEt 7:3

10-12 DCM/AcOEt 6:4

13-18 DCM/AcOEt 1:1

19-21 DCM/AcOEt 4:6

22-24 DCM/AcOEt 3:7

25-27 DCM/AcOEt 2:8

28-31 DCM/AcOEt 1:9

32-35 AcOEt 100%






57 AcOEt/MeOH 4:3




66-71 MeOH 100%

Foram obtidas 71 frações e o volume de cada sistema de eluição adicionado à CC

foi de aproximadamente 100 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de

20 mL.

A fração 137-43 (244 mg) foi fracionada através de cromatografia em coluna

aberta (36 x 2 cm), com 45 g sílica gel, com gradiente de AcOEt em hexano, MeOH em

AcOEt até MeOH 100% com 0.01% de NH4OH à um pH 9 (Tabela 42).

62



1 Hex/AcOEt 1:1

2 Hex/ AcOEt 4:6

3-4 Hex/ AcOEt 3:7

5 Hex/ AcOEt 2:8

6 Hex/ AcOEt 1:9

7-8 AcOEt 100%



13 AcOEt/MeOH 85:15

14 AcOEt/MeOH 8:2

15 AcOEt/MeOH 75:25

16 AcOEt/MeOH 7:3

17 AcOEt/MeOH 6:4

18 AcOEt/MeOH 1:1

19 AcOEt/MeOH 4:6

20 AcOEt/MeOH 3:7

21 AcOEt/MeOH 2:8

22 AcOEt/MeOH 1:9

23-24 MeOH 100%

O volume coletado das 24 frações foi de 20 mL, sendo que em cada sistema de

eluição foram adicionados 90 mL. As frações 8, 9 e 11 mostraram alto grau de pureza

ao serem analisadas por CCDC, e após comparar os espectros de RMN de 1H e 13C

observou-se que os espectros das frações 8 e 9 eram idênticos, portanto estas foram

reunidas e identificadas como a mistura de dois isômeros: 9-metoxi-3-isoajmalicina e 9-

metoxi-19-epi-3-iso-ajmalicina (substância VIII e IX) e a fração 11 (2 mg) foi

identificada como 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância X).

63

Figura 11: Fracionamento do extrato DCM dos galhos da 2ª coleta.

64

4.4.2. Fracionamento dos Extratos Metanólico dos Galhos

O extrato metanólico dos galhos da segunda coleta foi submetido a uma extração

líquido-líquido, a massa inicial foi de 10 g solubilizados numa mistura de MeOH/H2O

1:9. A solução foi extraída com 500 mL de DCM em funil de separação (repetindo 3

vezes) e com 500 mL AcOEt (repetindo 3 vezes) e roto-evaporadas. Ao final as fases

foram concentradas em rota-evaporador. O fracionamento do extrato GMeOH da 2ª

coleta está sumarizado na Figura 12.

A fase DCM do extrato metanólico dos galhos (GMeOH-DCM) com 660 mg foi

fracionada em coluna aberta (33 x 1 cm) de sílica (60 g), com gradiente de AcOEt em

hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100%, obtendo um total de 26 frações (Tabela

43).

Tabela 43: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-DCM


1-2 Hex/AcOEt 95:05

3-4 Hex/AcOEt 9:1

5-6 Hex/AcOEt 8:2

6-7 Hex/AcOEt 7:3

8-9 Hex/AcOEt 1:1

10-11 AcOEt 100%





25-26 MeOH 100%


40 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de aproximadamente 20 mL.

Quando analisadas por CCDC e reveladas com Dragendorff, todas as frações

apresentaram a cor laranja, indicando a possível presença de alcaloides. Estas foram

submetidas à análise de RMN de 1H (60 MHz). As frações 8, 9-10 e 22-25 apresentaram

sinais característicos de alcaloides, portanto, estas foram refracionadas.

65

A fração 8 do extrato metanólico dos galhos fase DCM com 20 mg foi

fracionado em coluna aberta (24 x 1,5 cm) de sílica (2 g), com gradiente de DCM em

hexano, MeOH em DCM até MeOH 100%, obtendo um total de 32 frações (Tabela 44).

Tabela 44: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 8


1-2 Hex/DCM 6:4

3-4 Hex/DCM 55:45

5-6 Hex/DCM 1:1

6-7 DCM 100%

8-9 DCM/MeOH 95:05

10-11 DCM/MeOH 9:1

12-14 DCM/MeOH 85:15

15-18 DCM/MeOH 8:2

19-20 DCM/MeOH 75:25

21-24 DCM/MeOH 7:3

25-26 DCM/MeOH 65:35

27-28 DCM/MeOH 6:4

29-30 DCM/MeOH 1:1

31-32 MeOH 100%



A fração 9-10 (200 mg) da fase DCM do extrato metanólico dos galhos, rica em

alcaloides, foi fracionada em CC aberta (100 x 1,5 cm) em sílica (20g), utilizando como

fase móvel AcOEt em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100% (Tabela 45).

Tabela 45: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 9-10


1-5 Hex/AcOEt 8:2

6-9 Hex/AcOEt 7:3

10-15 Hex/AcOEt 6:4

16-18 Hex/AcOEt 1:1

66

continuação da Tabela 45 19-21 Hex/AcOEt 4:6

22-24 AcOEt 100%





47-48 MeOH 100%



Ao analisar as frações por CCDC pôde-se perceber um certo grau de pureza nas frações

24 (3 mg) e 28 (15 mg), após analisadas por RMN de 1H e bidimensionais, estas foram

identificadas como 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI) e 10-metoxi-rauniticina

(substância XII), respectivamente.

Das 48 frações obtidas, as frações 22 e 23 foram reunidas e analisadas por RMN

de 1H, o qual indicou a presença de alcaloides. A fim de purificar estes alcaloides, a

fração 22-23 (40 mg) foi refracionada em CC aberta (45 x 1,5 cm) de sílica (4 g), com

gradiente de AcOEt em DCM, MeOH em AcOEt até MeOH 100% sendo adicionados

0.01% de NH4OH (ph 9) a cada sistema de eluição (Tabela 46).

Tabela 46: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 9-10. 22-23


1 DCM/AcOEt 95:05

2-3 DM/AcOEt 9:1

4 DCM/AcOEt 85:15

5-6 DCM/AcOEt 8:2

7-8 DCM/AcOEt 75:25

9 DCM/AcOEt 7:3

10-11 DCM/AcOEt 6:4

12 DCM/AcOEt 1:1

13-14 DCM/AcOEt 4:6

15-16 DCM/AcOEt 3:7

67

continuação da Tabela 46. 17-18 DCM/AcOEt 2:8

19 DCM/AcOEt 1:9

20-21 AcOEt 100%

22 AcOEt/MeOH 9:1

23 AcOEt/MeOH 8:2

24 AcOEt/MeOH 7:3

25 AcOEt/MeOH 6:4


28 AcOEt/MeOH 4:3

29 AcOEt/MeOH 3:7

30 AcOEt/MeOH 2:8

31 AcOEt/MeOH 1:9

32 MeOH 100%



A reunião 22-25 (34 mg) da fase DCM do extrato metanólico dos galhos foi

fracionada em CC aberta (40 x 1,5 cm) de sílica (3 g), com gradiente de AcOEt em

hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100%, obtendo um total de 12 frações (Tabela

47).

Tabela 47: Eluentes utilizados para o fracionamento da fração GMeOH-DCM 22-25


1 Hexano 100%

2 Hex/AcOEt 9:1

3 Hex/AcOEt 8:2

4 Hex/AcOEt 7:3

5 Hex/AcOEt 1:1

6 AcOEt 100%

7 AcOEt/MeOH 9:1

8 AcOEt/MeOH 8:2

9 AcOEt/MeOH 7:3

68

continuação da Tabela 47. 10 AcOEt/MeOH 1:1

11-12 MeOH 100%

O volume de cada sistema de eluição adicionado à CC foi de 10 mL, recolhidas

em frascos também de 10 mL.

A fase AcOEt do extrato metanólico dos galhos (GMeOH-AcOEt) com 900 mg

foi fracionado em coluna aberta (39 x 2,5 cm) de sílica (50 g), com gradiente de AcOEt

em hexano, MeOH em AcOEt até MeOH 100%, obtendo um total de 28 frações (Tabela

48).

Tabela 48: Eluentes utilizados para o fracionamento da fase GMeOH-AcOEt


1-2 Hex/AcOEt 9:1

3-4 Hex/AcOEt 8:2

5-6 Hex/AcOEt 7:3

7-8 Hex/AcOEt 1:1

9-10 AcOEt 100%






24-28 MeOH 100%


70 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas foi de 15 a 35 mL.

69

Figura 12: Fracionamento do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta

4.5. Atividades Química e Biológica

4.5.1. Atividade Antioxidante

Na análise qualitativa da atividade antioxidante os extratos foram testados em

placas cromatográficas e revelados com solução de 0,2% de 2,2-difenil-1-picril-

hidrazila (DPPH) que revela a capacidade de sequestrar radicais livres. As regiões que

adquiriram cor branco-amarelada após 30 minutos da aplicação indicaram a presença de

substâncias com atividade antioxidante (CUENDET et al., 1997).

No teste quantitativo, os extratos foram testados quanto à capacidade de

descolorir o oxidante DPPH, visto que o mesmo apresenta coloração violeta, e os

resultados obtidos foram comparados em termos de equivalente com ácido ascórbico,

utilizado como antioxidante padrão. Na presença de um redutor, o DPPH de coloração

violeta (Δmax = 517 nm) é convertido a DPPH de coloração amarelo pálido. O ensaio

foi realizado em triplicata e as amostras foram solubilizadas em metanol grau P.A com

concentração de 30 mg/mL. A quantificação foi feita através da leitura da absorbância

em espectrofotômetro. A solução de DPPH foi preparada na concentração de 30 μg/mL

70

utilizando metanol grau P.A para a dissolução. A reação foi iniciada pela adição de 990

μL desta solução e 10 μL de amostra (1mg/mL), realizado em triplicata com leituras

após 30 minutos. O preparo do branco consistiu em adicionar 10 μL de MeOH com 990

μL da solução de DPPH (ΔABS branco).

A inibição da coloração é expressa em % de atividade sequestradora, através da

fórmula:

% AS = 100 × Δhx

Δhx= hc– hx

hc= absorbância controle (DPPH + MeOH)

hx= absorbância teste (DPPH + extrato)

Inicialmente, os extratos foram avaliados a uma concentração de 10 µg/mL, os

que apresentaram atividade nesta concentração foram avaliados em sua relação

dose/dependência em diferentes concentrações (5,0; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125 e 0,1562

µg/mL). A potência da atividade sequestradora foi obtida através de gráficos de

concentração x resposta inibitória (%). A concentração inibitória média (CI50), ou seja, a

concentração da amostra que causa 50% de redução da concentração inicial de DPPH

foi obtida por regressão linear (LEE et al., 2003).

4.5.2. Toxicidade frente a Artemia salina

Os testes frente ao microcrustáceo Artemia salina indicam o potencial de

toxicidade dos extratos, frações e substâncias. A técnica e sua utilização sistemática,

como meio de se obterem compostos ativos a partir de extratos vegetais é descrita por

Meyer e colaboradores (1982). Para o teste, utilizou-se como meio de crescimento uma

solução salina (3,8%). Foram adicionados 10 mg dos cistos de Artemia salina para a

eclosão dos mesmos. As condições de crescimento utilizadas foram: temperatura de 25

a 28 oC, e iluminação com lâmpada fluorescente, durante 48 horas. Após esse período,

as larvas foram repassadas para placas de 24 poços, sendo distribuídas 10 larvas de

Artemia salina em cada poço, realizado em triplicata. As placas com as larvas de A.

salina foram mantidas por 24 horas sob iluminação de lâmpada fluorescente. Após esse

período, avaliou-se o número de larvas sobreviventes, tanto nos poços de controles

71

quanto no teste. Inicialmente, os extratos foram testados na concentração de 1000

µg/mL e diluídos até encontrar a concentração letal média (CL50).

4.5.3. Atividade Antibacteriana

4.5.3.1. Cepas testadas

As análises foram realizadas frente às bactérias: Aeromonas hydrophila (ATCC

7966), Bacillus cereus (ATCC 14579), Bacillus subtilis (ATCC 6051),

Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032), Escherichia coli (ATCC 11775),

Edwardsiella tarda (ATCC 15947), Flavobacterium corumnare (ATCC 49512),

Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Salmonella enteritidis (ATCC 13076),

Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Providencia rettgeri (ATCC 29944),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525) e

Nocardia brasiliensis (ATCC 19296).

A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Mínima Bactericida (CMB) dos extratos/substâncias foram realizadas conforme

metodologia descrita por Eloff (1998a) e CLSI (2003).

4.5.3.2. Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Os extratos/substâncias foram primeiramente solubilizados em dimetilssulfóxido

(DMSO) a 5%, e em seguida foram realizadas diluições sucessivas para a obtenção das

concentrações de 1000 μg/mL a 15,6 μg/mL. Em seguida, cada concentração foi

adicionada em poços (microplaca de 96 poços). Foram adicionados 95 μL de cada

concentração do extrato e 5 μL do inóculo (McFarland 0,5 contendo aproximadamente

1,5 x 108) diluída 10 vezes. Para o controle negativo foram utilizados 95 μL de caldo

DMSO e o inóculo. Para o controle positivo foi utilizado o antibiótico oxitetraciclina

nas concentrações de 125 μg/mL a 0,97 μg/mL. Todos os testes foram realizados em

triplicata. Em seguida a placa foi agitada e incubada a 29 °C. A CIM foi detectada com

o auxílio do revelador cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (2 mg/mL), foi adicionada uma

quantidade de 40 μL deste revelador em cada poço. Micro-organismos metabolicamente

ativos coram-se de vermelho. A CIM foi definida como a menor concentração do

extrato que não houve mudança de coloração.

72

4.5.3.3. Concentração Bactericida Mínima (CBM)

Foi realizada também a análise para a determinação da CBM, que determina

onde não houve crescimento bacteriano a partir da CIM. Primeiramente, foram retirados

10 μL de cada concentração que não demonstrou crescimento microbiano na CIM e

posteriormente foi semeada em Ágar Mueller-Hinton. As placas foram incubadas a

temperatura de 29 °C por um período de 18 a 24 horas. Foi considerada a CBM a menor

concentração do extrato onde não houve crescimento celular sobre a superfície do ágar

inoculado.

4.5.4. Atividade Antimicobacteriana

4.5.4.1. Teste da Sensibilidade aos Extratos Vegetais

Os ensaios colorimétricos que empregam indicadores de oxidação-redução para

determinar o perfil de susceptibilidade foram anteriormente usados com micobactérias

(PALOMINO et al., 2002). O método REMA (Resazurin Microtitre Assay) é um deles,

rápido e simples, no qual se utiliza a resazurina como um indicador de oxi-redução para

avaliar a viabilidade e a contaminação bacteriana, além de testar a atividade

antimicrobiana (PALOMINO et al., 2002).

4.5.4.2. Preparação da Suspensão e do Inóculo Micobacteriano

A atividade dos extratos, frações e substâncias foram avaliadas frente a três

cepas de Mycobacterium tuberculosis: uma pan-sensível H37Rv (ATCC 27294), outra

monorresistente ao antibiótico isoniazida (INH, ATCC 35822) com mutação em katG,

códon S315T (AGC-ACC) e outra monorresistente a rifampicina (RMP, ATCC 35338),

com mutação em rpoB, códon H526T (CAC-TAC). Isoniazida e Rifampicina são

considerados os principais antibióticos para cepas M. tuberculosis sensíveis e possuem

padrões de CIM de 0,25 µg/mL e 0,5 µg/mL. As cepas foram cultivadas em meio

Ogawa-Kudoh por aproximadamente 14 dias a uma temperatura de 37 ºC. Uma

suspensão bacteriana de cada cepa foi preparada em um tubo estéril contendo pérolas de

vidro e homogeneizada com água destilada para o ajuste da turbidez segundo o tubo um

da Escala de McFarland. Em seguida a suspensão bacteriana foi adicionada ao caldo

Middlebrook 7H9 na proporção de 1:20 (FRANZBLAU et al., 1998).

73

4.5.4.3. Preparação das Placas de screening

As amostras foram testadas frente às cepas de M. tuberculosis, onde foi avaliada

a sensibilidade do micro-organismo utilizando uma concentração fixa de 200 µg/mL,

em uma microplaca de 96 cavidades. Nas cavidades periféricas foram adicionados 200

µL de água destilada estéril, para evitar a evaporação do meio líquido quando incubado

na estufa. Nos poços de teste, adicionaram-se 75 µL de meio - 7H9 enriquecido com

10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase) para M. tuberculosis, 75 µL

do extrato e 75 µL do inóculo. Assim, a concentração da amostra em cada poço foi de

200 µg/mL, devido a sua diluição no meio e no inóculo. Posteriormente, a placa foi

incubada na estufa a 37 ºC.

4.5.4.4. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Após a triagem, foram selecionados os extratos que apresentaram atividade

antimicobacteriana na concentração de 200 μg/mL, para avaliar a CIM (FRANZBLAU

et. al., 1998). Foram adicionados 200 µL de água destilada estéril nos poços da periferia

com o propósito de evitar a evaporação do meio líquido. Em seguida, em todos os poços

de CMI, foram adicionados 100 µL do meio, 100 µL do extrato partindo-se de uma

concentração de 200 μg/mL no primeiro poço (microdiluição 1:2) e 100 μL do inóculo

bacteriano em todos os poços. Após isso, a placa foi incubada na estufa a 37 ºC por sete

dias.

4.5.4.5. Análises pelo Método de Colorimetria

Após a incubação, foram adicionados 30 µL de resazurina a 0,02% em cada poço

dos ensaios, incubando-se por mais dois dias na estufa a 37 °C. O corante age como um

indicador da viabilidade celular. A leitura foi baseada na mudança de cor, do azul para o

rosa quando ocorre oxi-redução do corante devido ao crescimento bacteriano

(PALOMINO et al., 2002).

4.5.5. Avaliação da citotoxicidade in vitro

74

4.5.5.1. Linhagens Celulares

Foram utilizadas linhagens de células neoplásicas: HCT116 (carcinoma

colorretal humano), MCF-7 (carcinoma de mama), SK-Mel-19 (melanoma humano) e

uma linhagem não neoplásica: MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano). As quais

foram cultivadas em meio DMEM, suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1%

de antibióticos, mantidas em estufa a 37°C e atmosfera contendo 5% de CO2. As

amostras foram dissolvidas em DMSO na concentração estoque de 5 mg/mL para as

substâncias puras e de 50 mg/mL para os extratos brutos.

4.5.5.2. Teste do Alamar blue

O Alamar Blue é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades

redox e em células em proliferação o Alamar Blue é reduzido. A forma oxidada é azul e

não-fluorescente (indicando célula não viável) e a forma reduzida é rósea e fluorescente

(indicando célula viável).

O teste do Alamar Blue foi realizado conforme metodologia descrita por Ahmed

e colaboradores (1994) com o intuito de se analisar a viabilidade celular das células

testadas na presença de diferentes concentrações das substâncias e dos extratos testados.

As células cultivadas em garrafa de cultura com meio DMEM foram contadas em

câmara de Neubauer e plaqueadas em placas de 96 poços. A cada poço foram

adicionadas 1 x 104 células em 200 µL de meio de cultura. A placa foi incubada por 24h

em estufa a 37 oC com atmosfera de 5% de CO2. Após este tempo, as células foram

tratadas, por 72 h. Como controle positivo foi utilizada a Doxorrubicina a 5μg/mL. O

grupo controle recebeu no poço a mesma quantidade de DMSO da maior concentração

das substâncias e extratos. Após 24 h de tratamento, 10 µL da solução de uso de Alamar

Blue (solução estoque a 0,4% 1:5 em meio de cultura sem soro fetal bovino) foi

adicionada em cada poço da placa. Após 3 h de exposição ao Alamar Blue, retirou-se da

estufa meia hora antes do término e a fluorescência foi medida usando-se um leitor de

placas de Elisa (Beckman e Coulter®).

Os resultados foram analisados segundo suas médias e respectivos erros-padrão.

O cálculo da CI50 e seus respectivos desvios foram realizados a partir da regressão não-

linear no programa Graph Prism (versão 5).

75

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Prospecção Fitoquímica

Na triagem fitoquímica para detecção das classes de metabólitos secundários

presentes em cada extrato, através de análises por CCDC, foram observadas diferenças

significativas nas composições químicas dos extratos das duas coletas. Essas diferenças

podem estar relacionadas ao fato de que a 1ª coleta foi realizada em dezembro, época

chuvosa na região Norte e a 2ª coleta em maio, época de seca, ou pelas coletadas terem

sido feitas em locais diferentes. Os resultados são coerentes com as observações de

especialistas de que a variedade e complexidade de metabólitos secundários produzidos

pelas plantas sofrem influência dos estímulos ambientais, bastante variáveis, de natureza

química, física e biológica sobre sua composição química (ALVES, 2001; GOBBO-

NETO e LOPES, 2007). De fato, a quantidade e a natureza dos metabólitos variam

durante o ano, e até mesmo durante o dia. Assim, um estudo que visa encontrar

substâncias bioativas de vegetais, deve considerar todos os fatores que possam

influenciar a produção ou o acúmulo da(s) substância(s) de interesse, tendo cuidado

especial com relação à época e local da coleta, secagem, transporte etc (CALIXTO,

2001). Os dados de rendimento dos extratos estão descritos na Tabela 49.

Tabela 49: Quantidade de massa e rendimento dos extratos

Extrato Material seco e moído (g)

Massa do Extrato (g)

Rendimento %

1ª COLETA Folhas DCM 493,15 13,3453 2,70 Folhas MeOH 475,00 19,7568 4.15 Galhos DCM 488,76 1,5923 0.32 Galhos MeOH 467,00 13,3447 2.85

2ª COLETA Folhas Hexano 649,00 8,7421 1.34 Folhas MeOH 630,18 50,4682 8.00 Galhos DCM 1.086,00 7,4318 0.68 Galhos MeOH 890,00 49,9935 5.60

Nos ensaios fitoquimicos os extratos de baixa polaridade (hexânico e DCM) dos

galhos e das folhas da 1ª e 2ª coleta, observou-se a presença de substâncias terpênicas

em todos os extratos, por revelar com sulfato de cério (IV) (WAGNER e BLADT,

76

2001) e anisaldeído sulfúrico. A possível presença de alcaloides foi detectada apenas

nos extratos DCM dos galhos da 2ª coleta, enquanto que a presença de taninos só foi

observada nos extratos DCM das folhas (1ª coleta). Nos extratos metanólicos de folhas e

galhos (1ª coleta) verificou-se a presença de substâncias fenólicas, possivelmente

flavonoides, quando reveladas com cloreto de alumínio, pois ao analisar no UV 365 nm,

observou-se intensificação da fluorescência. Os extratos DCM dos galhos de ambas as

coletas, quando revelados com DPPH adquiriram uma coloração amarela sugerindo a

presença de substâncias antioxidantes.

Nos extratos MeOH dos galhos da 1ª coleta e das folhas da 2ª coleta mostraram

a presença de terpenos, ao serem reveladas com sulfato cérico e de taninos hidrolisáveis

pela cor azulada em cloereto férrico (SIMÕES et al., 2004). Apenas os extratos DCM e

MeOH dos galhos da 2ª coleta revelaram macnhas de cor laranja em Dragendorff,

indicando a presença de alcaloides. Segundo alguns autores os alcaloides podem ser

encontrados em todas as partes de um vegetal, porém pode haver um acúmulo

preferencial em determinados órgãos (PELLETIER, 1988). As cromatoplacas quando

reveladas com cloreto de alumínio, pode-se observar intensificação da fluorescência sob

luz UV 365 nm, caracterizando possivelmente compostos flavonoídicos. Ao reagirem

com DPPH, todos os extratos metanólicos apresentaram a coloração amarelada,

indicando a presença de substâncias com atividade antioxidante (CONFORTI et al.,

2002) As análises em CCDC além de confirmarem algumas classes de metabólitos,

indicaram a presença de substâncias fluorescentes sob luz UV, sugerindo a existência de

compostos aromáticos.

5.2. Identificação das Substâncias Isoladas dos Extratos da Primeira Coleta de

Duroia macrophylla

Dentre os extratos obtidos de D. macrophylla, iniciou-se o fracionamento com o

extrato FDCM da 1ª coleta, devido sua elevada atividade antimicobacteriana. Após o

fracionamento em coluna cromatográfica e análise das frações obtidas, constatou-se que

nenhuma das frações apresentou alto grau de pureza. Portanto, as frações com maior

quantidade de massa foram novamente analisadas em CCDC para a escolha de um novo

sistema de fracionamento. A fração 17-21.1-5.14 após ser analisada por RMN de 1H e 13C foi identificada como sendo a mistura do β-sitosterol e estigmasterol. A fração 25-

40.6.4 mostrou elevado grau de pureza quando analisada por RMN de 1H (60 MHz), no

77

entanto, mostrou ser constituída por uma mistura de dois ácidos triterpênicos, os quais

foram purificados por CLAE e identificados por RMN de 1H (500 MHz) como ácido

oleanólico (substância I) e ácido ursólico (substância II).

Após análise detalhada dos espectros de RMN (mono e bidimensionais) a fração

11-12 (2 mg) obtida através do fracionamento da fase AcOEt do extrato metanólico das

folhas foi identificada como 4,4’dihidroxi-3’- metoxi-chalcona (substância III).

Do fracionamento da fase AcOEt do extrato metanólico dos galhos foi obtida a

fração 7-8 (3 mg), a qual foi analisada por RMN de 1H, HSQC e HMBC. Através destas

análises e comparação com dados da literatura (TOMAZ et al., 2008) foi possível

identificar esta substância como ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico (substância IV).

5.2.1 Identificação dos triterpenos

Os dados de RMN de 1H da fração 25-40.6.4 (4 mg) mostraram a presença de

sinais entre δ 0,7 e 1,2 (singletos), característicos de hidrogênios metílicos de

triterpenos; dois sinais em δ 5,31 (t; J = 3,5 Hz) e 5,27 (t; J = 3,5 Hz) característicos de

hidrogênio olefínico e também dois sinais em δ 3,23 (d; J = 5,0 Hz) 3.21 (d, J = 5,3 Hz)

referentes a hidrogênios carbinólicos (H-3). Estes dados confirmavam que esta fração se

tratava da mistura de dois triterpenos com esqueleto oleanano.

Após a purificação dos dois triterpenos por CLAE-DAD, o espectro de RMN de 1H (Figura 14) da primeira fração (25-40.6.4.1) mostrou sinais em δH 5,31 (t; J = 3,5

Hz) e da segunda fração (25-40.6.4.2) em δ 5,27 (t; J = 3,5 Hz), sinalizando para a

presença dos hidrogênios olefinicos em C-12 deste tipo de triterpenos.

5.2.1.1 Identificação da substância I

No espectro de RMN de 1H (Figura 14) do primeiro triterpeno (25-40.6.4.1),

verificou além da presença do tripleto em δ 5,31 (J = 3,5 Hz; 1H); um dd em δ 3,23 (J =

10,7 e 4,7 Hz; 1H) e dois dubletos largos em δ 2,82 e 2,87 (J = 4,0 e 5,0 Hz),

caracterizando o esqueleto oleanano da substância I (Figura 13).

O mapa de contorno HSQC (Figura 15) mostra as correlações entre o hidrogênio

em δ 5,31 com o carbono em δ 122,8, característico de carbono vinilico C-12 do ácido

oleanólico (Figura 14). No mapa de contorno HMBC (Figura 16) foi possível observar a

78

correlação do hidrogênio em δ 0,94 com o carbono do grupo carboxílico em δ 180,0 (C-

28).

A análise dos dados de RMN de 1H e bidimensionais (Tabela 50) e o espectro de

massas, o qual mostrou um pico do íon molecular em m/z 456 e um padrão de

fragmentação comum de triterpenos (OGUNKOYA, 1981), confirmaram a identificação

desta substância como sendo o ácido oleanólico (substância I). (MAHATO & KUNDU

1994).

Tabela 50: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido oleanólico.

HSQC HMBC

Posição δC δH (m; J em Hz)

2-4J C,H

1 38,5 1,63 (m) 2 28,1 1,60 (m) 3 79,1 3,23 (dd; 10,7; 4,7) 4 38,8 - 5 55,3 0,74 (d; 11) 6 18,8 1,54 (m) 7 32,7 1,49 (m) 8 39,3 - 9 47,6 1,54 (m) 10 37,0 - 11 23,8 0,94 (m) 12 122,8 5,31 (t; 3,5) 13 143,5 - 14 41,5 - 15 17,3 1,60 (m) 16 23,7 0,94 (m) C-17 17 47,3 - 18 41,2 2,82 (dl; 4,0) 19 41,5 2,87 (dl; 5,0) 20 31,0 - 21 32,6 1,62 (m) 22 33,9 1,30 (m) 23 28,0 1,00 (s) C-3, C-24 24 16,8 0,79 (s) C-3, C-6 25 15,3 0,93 (s) C-1 C-5 26 15,5 0,79 (s) 27 26,0 1,16 (s) C-8, C-13 28 180,0 - 29 33,1 0,92 (s) C-20, C-30 30 23,7 0,94 (s) C-20, C-22

79

Figura 13: Estrutura do ácido oleanólico e suas correlações no HMBC.

HO

COOH

36

9

1213

15

19 21

23 24

25 26

27

28

29 30

80

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

0.03

00.

04

0.75

0.78

0.82

0.84

0.97

0.99

1.03

1.13

1.18

1.29

1.38

1.57

1.66

1.721.94

1.95

1.97

2.07

2.22

2.24

3.23

3.24

3.26

3.275.30

5.31

7

3 . 5

5 . 0

5

Figura 14: Espectro de RMN de 1H do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz).

81

5.31

122.8

3.23

79.1

Figura 15: Mapa de contorno HSQC do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz).

82

143.5

1.16

Figura 16: Mapa de contorno HMBC do ácido oleanólico em CDCl3 (400 MHz).

83

5.2.1.2 Identificação da Substância II

O espectro de RMN de 1H (Figura 18) do segundo triterpeno (25-40.6.4.2)

mostrou sinais na região entre δ 0,79 e 1,72 característicos de hidrogênios metílicos e δ

1.91 (2H; dd; J = 8,6 e 3,6 Hz), além dos sinais observados em δ 3,22 (dd; J = 10,8 e 4,9

Hz) e 5,31 (t; J = 3,6 Hz) estes sinais são característicos de esqueleto ursano da

substância II (Figura 17).

Através dos espectros bidimensionais HSQC e HMBC pôde-se definir que sete

sinais correspondem aos carbonos metílicos (CH3), nove sinais aos carbonos

metilênicos (CH2), sete aos carbonos metínicos (CH) e sete C quaternários (C),

resultando em 30 carbonos característicos de triterpenos pentacíclicos.

No mapa de contorno HMBC (Figura 20) foram observadas as correlações que

indicaram a presença dos carbonos do ácido carboxílico em δ 179,6 (C-28), olefínicos

em δ 125,9 e 137,9 (C-12 e C-13), respectivamente. Por estes dados, assim como pelos

deslocamentos químicos observados no mapa de contorno HSQC (Figura 19) e a

comparação com dados da literatura (MAHATO & KUNDU 1994) o triterpeno como

foi identificado como ácido ursólico (Tabela 51).

É comum isolar a mistura do ácido ursólico com ácido oleanólico, devido à

grande semelhança química entre estas moléculas. Apenas de algumas diferenças entre

elas permitem distingui-las por meio de RMN: os deslocamentos químicos dos H-18, C-

18, C-12, C-13 e C-29 (KONTOGIANNI et al., 2009) e, principalmente, a

multiplicidade dos H-29, um dubleto no ácido ursólico e um singleto no ácido

oleanólico. Este é o primeiro relato da ocorrência destes dois triterpenos no gênero

Duroia.

Tabela 51: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido ursólico.

HSQC HMBC Posição δC δH

(m, J em Hz)

2-4J C,H

1 36,8 1,72 (m) 2 27,7 1,60 (m) 3 78,7 3,22 (dd; 10,6; 5) 4 38,5 - 5 55,2 1,34 (m)

84

continuação da Tabela 51. 6 18,3 1,60 (m) 7 32,9 1,72 (m) 8 39,5 - 9 47,3 1,60 (m) 10 38,0 - 11 23,1 1,91 (dd; 8,6; 3,6) 12 125,9 5,28 (t; 3,6 ) 13 137,9 - 14 41,2 - 15 27,7 1,60 (m) 16 25,0 1,34 (m) 17 48,1 - 18 52,3 2,2 (d; 10,8) 19 38,5 1,00 (s) 20 38,5 0,95 (s) 21 30,3 1,27 (br s) 22 36,7 1,72 (m) 23 28,9 1,00 (s) C-5 24 15,6 0,79 (s) C-2, C-3, C-4 25 15,4 0,94 (s) C-4, C-5 26 16,8 0,82 (s) C-8, C-14 27 23,5 1,10 (s) C-8, C-13, C-14, C-15 28 179,6 - 29 17,0 0,87 (d; 6,4) C-18, C-20 30 21,4 0,97 (s) C-20, C-21

HO

COOH

36

9

1213

15

19 21

23 24

25 26

27

28

29

30

Figura 17: Estrutura do Ácido ursólico e suas correlações no HMBC..

85

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Norm

alize

d In

tens

ity

3.0 2.5

5 . 0

5

Figura 18: Espectro de RMN de 1H do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz).

86

125.9

78.7

3.225.28

Figura 19: Mapa de contorno HSQC do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz).

87

137.9

1.10

78.7

0.79

Figura 20: Mapa de contorno HMBC do ácido ursólico em CDCl3 (400 MHz).

88

5.2.2 Identificação da Sustância III

No espectro de RMN de 1H (Figuras 22 e 23) da substância III, foram

observados dois dubletos em δ 6,29 e 7,71, ambos com J = 15,9 Hz e integral para 1H,

enquanto que, um singleto em δ 3,96 com integral para 3H caracterizou o grupo

substituinte metoxila. Foram observados dois dubletos em δ 6,86 e 7,46, ambos com J =

8,6 Hz e com integral para 2H, caracterizando os hidrogênios homotópicos H-3 e H-5,

H-2 e H-6, respectivamente. Observou-se um duplo dubleto em δ 7,70, com constantes

de acoplamento de 8,4 e 1,9 Hz corresponte ao hidrogênio 6’, acoplando em meta com o

dubleto em δ 7,58 (H-2’) e em orto com o dubleto em δ 6,86 (H-5’), caracterizando um

derivado benzênico para-dissubstituído.

Com a análise detalhada do mapa de contorno de HSQC (Figura 24) observou-

se 10 acoplamentos entre 1H e 13C. Os deslocamentos químicos em δ 130,4

correspondem aos carbonos C-2 e C-6, em δ 115,7 aos C-3 e C-5, os carbonos

olefínicos α e β foram observados em δ 146,6 e 146,8, respectivamente; em δ 121,0

corresponde ao C-2’, em δ 114,3 ao C-5’, em δ 125,2 ao C-6’ e em δ 56,6 ao carbono da

metoxila.

No mapa de contorno de HMBC (Figura 25) foram observados os acoplamentos

de longa distância que permitiram localizar os substituintes na estrutura. Além dos

acoplametos 3J observado entre 1H e 13C de suma importância para definir a posição da

metoxila e das duas hidroxilas, levou a definir os carbonos quaternários em δ 171,4

(C=O), em δ 127,0 (C-1), em δ 158,0 (C-4), em δ 112,3 (C-1’), em δ 146,2 (C-3’) e em

δ 150,8 (C-4’). As correlações no HMBC, HSQC e os dados de 1H e estão descritas na

Tabela 52.

A análise minuciosa dos dados obtidos por RMN e comparação com os dados

existentes na literatura (KAWAI et al., 2012) foi possível identificar esta chalcona como

4,4’-dihidroxi-3’-metoxi-chalcona (Figura 21), sendo o 1º relato no gênero Duroia.

89

Tabela 52: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH

(m; J em Hz) 2-4J C,H

1 C 127,0 2 CH 130,4 7,46 (d, 8,6) C-6, C- β, C-4 3 CH 115,7 6,86 (d, 8,6) C-1 4 C 158,0 5 CH 115,7 6,86 (d, 8,6) C-1 6 CH 130,4 7,46 (d, 8,6) C-2, C- β, C-4 β CH 146,8 7,70 (d, 15,9) C-6 α CH 146,6 6,29 (d, 15,9) C-1 1’ C 112,3 2’ CH 121,0 7,58 (d, 1,9) C-4’, C-6’ 3’ C 146,2 4’ C 150,8 5’ CH 114,3 6,96 (d, 8,4) C-2’, C-4’ 6’ CH 125,2 7,73 (dd, 8,4; 1,9) C-1’, C=O

OMe CH3 56,2 3,96 (s) C-3’ C=O 171,4

OCH3

OH

O

OH

Figura 21: Estrutura da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona e suas correlações no HMBC.

90

249_F_MeOH_Fase_Acoet_11-12.011.esp

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5Chemical Shift (ppm)

0.05

0.10

0.15

Norm

alize

d In

tens

ity

3.97

6.296.336.856.

876.

966.98

7.27

7.46

7.48

7.587.59

7.70

7.727.73

7.748.02

Figura 22: Espectro de RMN de 1H da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz).

91

7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2Chemical Shift (ppm)

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

Nor

mal

ized

Inte

nsity

6.296.336.

856.

876.

90

6.966.

98

7

7.46

7.48

7.587.

59

7.70

7.70

7.73

7.74

Figura 23: Expansão do espectro de RMN de 1H da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz).

92

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5F2 Chemical Shift (ppm)

0

20

40

60

80

100

120

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

S

3.96

56.2

2'3'

6'

4'

5'

OCH3

OH

O

4

5

3

6

2OH

β

α

Figura 24: Mapa de contorno HSQC da 4,4’-dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz). S: solvente.

93

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

200

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

3.96

146.2

7.70

171.4

2'3'

6'

4'

5'

OCH3

OH

O

4

5

3

6

2OH

β

α

Figura 25: Mapa de contorno HMBC da 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona em CDCl3 (400 MHz).

94

5.2.3 Identificação da Sustância IV

Os dados de RMN de 1H (Figura 27) da substância IV mostraram a presença de

sinais característicos de anel aromático em δ 7,57 (d, J = 1,8 Hz, H-2), 6,97 (d, J=8,4

Hz, H-5) e 7,69 (dd, J=8,4 e 1,8 Hz, H-6). O acoplamento em orto (J = 8,4 Hz) de H-5

e H-6 e em meta (J=1,8 Hz) de H-2 e H-6 evidenciaram substituição em C-1, C-3 e C-4.

Foi observada também a presença de um grupamento metoxila através do singleto em δ

3,98 (Tabela 53).

O mapa de contorno HSQC (Figura 28) mostra as correlações dos carbonos

metínicos do anel aromático: δ 7,57 (H-2) x δ 112,5 (C-2); δ 6,97 (H-5) x δ 114,6 (C-

5); δ 7,69 (H-6) x δ 125,5 (C-6) e entre os hidrogênios em δ 3,98 com o carbono em δ

56,2. Através da análise do mapa de contorno HMBC (Figura 29) foi possível

determinar o padrão de substituição no anel aromático, assim como os carbonos

quaternários. O sinal em δ 168,4 foi atribuído ao grupo carboxílico (C-7) e em δ 154,0

(C-4) ao carbono com o grupo hidroxila (OH).

A análise dos dados espectrais de RMN aliado à comparação com dados da

literatura (TOMAZ et al., 2008) permitiu identificar a substância IV como sendo o

ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico (Figura 26), relatada pela 1ª vez para uma espécie

do gênero Duroia.

Tabela 53: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (400 MHz) e correlações heteronucleares do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico.

HSQC HMBC Posição δC δH


1 121,1 2 112,0 7,57 (d; 1,8) C-4, C-6, C-7 3 146,1 4 150,7 5 114,1 6,97 (d; 8,4) C-1, C-3 6 125,1 7,69 (dd; 1,8; 8,4) C-2, C-4, C-7 7 171,0 H3CO 56,1 3,98 (s) C-3

95

7

OH

OCH3

OH

O

Figura 26: Estrutura do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico e suas correlações no HMBC.

96

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Nor

mal

ized

Inte

nsity

0.83

0.84

0.840.88

1.23

1.25

1.30

2.043.

96

6.96

6.98

7.00

7.2

7.57

7.58

7.69

7.69

7.71

6 . 9 5

0 5

1 0

1 5

6.966.

98

Figura 27: Espectro de RMN de 1H do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico, em CDCl3 (400 MHz).

97

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

S

7.69 7.57 6.97 3.98

125.5

114.6112.5

56.2

Figura 28: Mapa de contorno HSQC do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico em CDCl3 (400 MHz). Legenda: S=solvente.

98

3.98

146.0

Figura 29: Mapa de contorno HMBC do ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico em CDCl3 (400 MHz).

99

5.3. Identificação das Substâncias Isoladas dos Extratos da Segunda Coleta de

Duroia macrophylla

Foram identificados oito alcaloides indólicos monoterpênicos dos extratos

diclorometânico e metanólico dos galhos de D. macrophylla, sendo o primeiro registro

destes alcaloides no gênero Duroia. Os espectros de massas (Anexo 2) mostraram o íon

molecular m/z 368 para todos os alcaloides. Com análise dos dados de espectrometria de

massas aliados aos espectros de RMN de 1H, DEPT, HSQC, HMBC e COSY (Anexo 3)

conclui-se que todos os alcaloides possuem a fórmula molecular C21H24N2O4.

Os alcaloides dessa classe apresentam quatro carbonos estereogênicos (C-3, C-

15, C-19 e C-20) e 16 estereoisômeros possíveis. Entretanto, como H-15 é

biogeneticamente α, o número de estereoisômeros é reduzido a oito, além de o

substituinte CH3-18 dessa classe de substâncias pode estar nas posições α ou β

(SHAMMA, 1963). Segundo a literatura, os dois grupos de estereoisômeros resultantes

foram classificados da seguinte forma:

normais (H-3α; H-20β; H-19β) (H-3α; H-20β; H-19α)

pseudos (H-3β; H-20β; H-19β) (H-3β; H-20β; H-19α)

allos (H-3α; H-20α; H-19β) (H-3α; H-20α; H-19α)

epiallos (H-3β; H-20α; H-19β) (H-3β; H-20α; H-19α)

Dependendo da estereoestereoquímica dos centros estereogênicos C-3, C-15 e

C-20, os alcaloides indólicos pentacíclicos podem apresentar configurações distintas nas

junções dos anéis C/D/E dando origem às conformações conhecidas como normal,

pseudo, allo e epiallo (WENKERT et al., 1976). A Figura 30 ilustra alguns exemplos de

alcaloides indólicos pentacíclicos das séries mencionadas. A definição das

conformações desses alcaloides é extremamente importante não apenas para a

determinação de suas estruturas moleculares, mas principalmente, para o estudo de seus

mecanismos de ação farmacológica.

100

Figura 30: Estereoquímica relativa dos centros estereogênicos C-3, C-15 e C-20, que caracteriza a estereoquímica do anel D dos alcaloides indólicos nas séries normal, pseudo, allo e epiallo.

De acordo com as sínteses orgânicas de ioimbinas, pode-se determinar entre os

isômeros C/D trans [normal/allo] e os isômeros C/D cis [pseudo/epiallo] dos derivados

da ioimbina pelo deslocamento químico no espectro de RMN de 13C dos carbonos C-3 e

C-6, no qual o primeiro grupo apresenta valores maiores que o segundo grupo,

conforme a Tabela 54 (WENKERT et al., 1961). No espectro de RMN de 1H os

isômeros que apresentam configurações H-3β (epiallo e pseudo) mostram deslocamento

químico em aproximadamente δ 4,4 indicando uma união de anéis na forma trans-

quinolizidina. Na configuração H-3α (allo e normal) o deslocamento químico é menor,

sendo observado em aproximadamente δ 3,4 (WENKERT et al., 1961; MANSKE,

1965).

Tabela 54: Deslocamentos químicos típicos para C-3 e C-6 para alcaloides de esqueleto ioimbina.

Normal/allo (δ) Pseudo/epiallo (δ) C-3 60 ±1 53,5± 1 C-6 21,5± 1 16,5 ±1

101

Para diferenciar entre normal e allo observam-se os deslocamentos do C-14 e C-

20, em normal (junção D/E trans), os deslocamentos químicos apresentam valores

maiores que em allo (junção D/E cis), como mostra na Tabela 55 (HONTY et al.,

1982).

Tabela 55: Deslocamentos químicos típicos para C-14 e C-20 para alcaloides de esqueleto ioimbina.

Normal (δ) Allo (δ) C-14 34±1 31±1 C-20 40±1 32 ±1

O valor de deslocamento químico do H-19 fornece uma indicação sobre a

posição relativa desse hidrogênio. Quando seu valor de δH se encontra em

aproximadamente δ 4,4, ele pertence à série H-19β, 20α, posição trans. Entretanto, se

esses átomos estiverem dispostos em posição cis, o valor de δH do H-19 estará em

aproximadamente δ 3,4 (BRUYN et al., 1989).

A maioria dos dados de RMN de 1H e 13C registrados na literatura para os

alcaloides indólicos pentacíclicos foram obtidos por técnicas unidimensionais. Com a

disponibilidade de técnicas de RMN bidimensionais (homo e heteronucleares), a

elucidação estrutural destas substâncias complexas pôde ser esclarecida, principalmente

no que concerne aos deslocamentos químicos e constantes de acoplamento dos

hidrogênios ligados aos carbonos sp3. Com base nas informações fornecidas dos

espectros de RMN de 1H e 13C, principalmente pelos experimentos de HMBC, HMQC e

COSY, foi realizado um estudo sobre a estrutura, configuração e conformação dos

alcaloides isolados de D. macrophylla.

102

5.3.1. Identificação da Substância V

O espectro de RMN de 1H (Figura 32) apresentou os sinais do NH em δ 9,86 e

dos hidrogênios aromáticos do núcleo indólico em δ 6,89 (d; J=2,3 Hz; H-9), δ 6,68

(dd; J=8,7 e 2,3 Hz; H-11) e δ 7,18 (d; J= 8,7 Hz; H-12), O acoplamento de H-11 em

orto (J = 8,7 Hz) com H-12 e em meta (J = 2,3 Hz) com H-9 evidenciou substituição no

carbono 10. Também foram observadaos: um dubleto em δ 1,37 (J=6,0 Hz) relacionado

ao grupo CH3-18; um duplo quarteto em δ 4,48 (J=10,2 e 6,0 Hz) relacionado ao H-19,

um singleto correspondente ao H-17 em δ 7,51; dois singletos das duas metoxilas em δ

3,68 e 3,77, com integral para 3 hidrogênios; o duplo duplo dubleto (ddd) em δ 1,40

(J=12,3;12,3;12,3) correspondente ao H-14β; os multipletos (m) relacionados ao H-6α e

H-6β em δ 2,61 e 2,83, respectivamente; um dubleto relativo ao H-3 em δ 3,30 (J=11,3

Hz); um dubleto em δ 3,17 (J=12,0) e um multipleto em δ 2,69 dos H-21α e H-21β,

respectivamente (Tabela 56).

No espectro de RMN de 13C-APT (Figura 33) foram oservados 22 sinais, oito

sinais relativos à CH, quatro correspondentes a CH2, três referentes a CH3 e sete de

carbonos quaternários, Os sinais de RMN de 13C em δ 136,9 (C-2), 108,7 (C-7), 128,6

(C-8), 101,0 (C-9), 154,9 (C-10), 111,4 (C-11), 112,4 (C-12) e 132,8 (C-13) foram

atribuídos ao núcleo indólico, Os sinais em δ 111,1 (C-16) e 156,0 (C-17)

correspondem à dupla ligação do sistema carbonílico α-β insaturado; o sinal em δ 168,0

corresponde a C=O de éster; os sinais em δ 18,8 (CH3-18) e em δ 51,3 relativo a

metoxila (MeO-23) com os demais sinais em δ 32,4 (C-15), 39,5 (C-20), 73,3 (C-19)

caracterizam a unidade secologanínica.

A posição da metoxila no grupamento indólico foi determinada com base nos

valores de constante de acoplamento (J) entre os hidrogênios do anel benzênico.

Através da análise das correlações observadas no mapa de contorno HMBC (Figura 35)

foi possível determinar as posições das metoxilas: a correlação entre a metoxila em δ

3,77 (H-24) e carbono quaternário (C-10) em δ 154,9, diferenciando-se da outra

metoxila em δ 3,68 (H-23), a qual acopla com o carbono do éster (C-22) em δ 168,0.

Com os dados de RMN de 13C-APT e HSQC (Figura 34) foi possível identificar

qual é a configuração dos esqueletos da porção secologanina da molécula, podendo

determinar se ela é normal, allo, pseudo ou epiallo. Conforme Wenkert e colabradores

(1961) a ausência de um singleto largo em aproximadamente δ 4,4 referente à H-3

103

indica uma uniãode anéis na forma trans-quinolizidina. De acordo com as sínteses

orgânicas de ioimbinas, pode-se diferenciar entre os isômeros C/D trans [normal/allo] e

os isômeros C/D cis [pseudo/epiallo] dos derivados da ioimbina pelos sinais no espectro

de RMN-13C dos carbonos C-3 e C-6, no qual o primeiro grupo apresenta os sinais de

C-3 e C-6 com valores maiores que o segundo grupo (WENKERT et al., 1976).

Como os valores encontrados de deslocamentos químicos de C-3 e C-6 foram δ

61,3 e 22,8, respectivamente, indica que a junção do anel C/D é do tipo trans. Para

diferenciar os isômeros entre normal e allo observam-se os deslocamentos do C-14 e C-

20. Em normal (junção D/E trans) os deslocamentos químicos estão em

aproximadamente δ 34 e 40, respectivamente, e para a configuração allo (a junção D/E

cis), os deslocamentos químicos do C-14 está em torno de δ 31 e do C-20 em δ 32

(HONTY et al., 1982).

Os dados de RMN (1H, 13C, HSQC, HMBC e COSY), aliados a espectrometria

de massas, o qual apresentou o pico do íon molecular em m/z 382 (Anexo 2) e a

comparação com dados da literatura (GRETHE et al., 1971; NUNEZ et al., 2012)

confirmaram a identificação desta substância como sendo o alcaloide 10-metoxi-

ajmalicina, o qual pertence a série normal (Figura 31).

Tabela 56: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-ajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 136,9 3 CH 61,3 3,30 (d; 11,3) C-2 5 CH2 54,4 2,49 (m)α

3,01 (m) β C-3, C-6, C-21

6 CH2 22,8 2,61 (m) 2,83 (m)

C-5, C-7

7 C 108,3 8 C 128,6 9 CH 101,0 6,89 (d; 2,3) C-7, C-10, C-11, C-13 10 C 154,9 11 CH 111,4 6,68 (dd; 8,7; 2,3) C-9, C-10, C-11 12 CH 112,4 7,18 (d; 8,7) C-8, C-9, C-10 13 C 132,8 14 CH2 34,4 2,58 (m) α

1,40 (ddd; 12,3) β

C-3, C-15, C-20 15 CH 32,4 2,70 (m) C-14, C-15, C-16, C-19 16 C 111,1

104

continuação da Tabela 56. 17 CH 156,0 7,51 (s) C-19, C-22 18 CH3 18,8 1,37 (d; 6,0) C-19, C-20 19 CH 73,3 4,46 (dq; 10,2; 6,0) C-15, C-18, C-20 20 CH 39,5 1,69 21 CH2 57,1 3,17 (d; 12,0) α

2,69 (m) β C-20

C-3, C-5, C-15, C-19 22 C 168,0 23 CH3 51,3 3,68 (s) C-22 24 CH3 56,1 3,77 (s) C-10 NH 9,86 (s)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HOCH3

Figura 31: Estrutura da 10-metoxi-ajmalicina e suas correlações no HMBC.

O mapa de contorno COSY (Figura 36) apresentou correlações homonucleares

confirmando a estrutura proposta. A análise dos dados obtidos revelou correlações entre

os hidrogênios aromáticos do núcleo indólico em δ 6,68 (H-11) com δ 6,89 (H-9) e com

δ 7,18 (H-12); entre os hidrogênios da unidade de secologanínica em δ 4,46 (H-19) e

1,37 (CH3-18); em δ 4,46 (H-19) e 1,69 (H-20); e entre os hidrogênios quinolizidínicos

em δ 2,61 e 2,83 (H-6) com δ 2,49 e 3,01 (H-5); em δ 1,40 e 2,58 (H-14) com δ 2,70 (H-

15); em δ 3,17 e 2,69 (H-21) com 1,69 (H-20) conforme a Tabela 57.

105

Tabela 57: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x 1H COSY de 10-metoxi-ajmalicina.

Posição δH (m, J em Hz)

Correlações COSY

3 3,30 (d; 11,3) 5 2,49 (m) α

3,01 (m) β H-5β, H-6α, H-6β

H-5α, H-6β 6 2,61 (m) α

2,83 (m) β H-5α, H-6β

H-5α, H-5β, H-6α 9 6,89 (d; 2,3) H-11 11 6,68 (dd; 8,7; 2,3) H-9, H-12 12 7,18 (d; 8,7) H-11 14 2,58 (m) α

1,40 (ddd; 12,3) β H-14β, H-15 H-14α, H-15

15 2,70 (m) H-14α, H-14β, H-20 17 7,51 (s) H-18, H-21β 18 1,37 (d; 6,0) H-19 19 4,46 (dq; 10,2; 6,0) H-18, H-20 20 1,69 H-15, H-19,H-21α, H-21β 21 3,17 (d; 12,0) α

2,69 (m) β H-20, H-21α H-20, H-21β

23 3,68 (s) 24 3,77 (s) NH 9,86 (s)

106

DAIANE_2013-03-13_COL2_57.001.ESP

9 8 7 6 5 4 3 2 1Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Norm

alize

d In

tens

ity

0.86

0.88

0.89

0.90

1.29

1.33

1.36

1.38

1.48

1.96

2.042.05

2.062.

252.

272.

302.

642.70

2.722.732.74

3.15

3.15

3.68

3.77

3.93

4.44

4.46

4.47

4.495.335.34

5.34

5.35

5.35

5.37

5.376.

666.67

6.696.706.89

6.907.

177.

207.

50

9.86

7.18, d, J = 8.7

6.68,dd, J = 8.7, 2.2

6.89,d, J = 2.2

Figura 32: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

107

61.3

22.8C/CH2

CH/CH3

Figura 33: Espectro de RMN de 13C-APT da 10-metoxi-ajmalicina, com destaque para deslocamentos que definem a estereoquímica (125 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

OCH3 24

CH318

HH

H

108

Figura 34: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

OCH3 24

CH318

HH

H

109

Figura 35: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

OCH3 24

CH318

HH

H

110

Figura 36: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

OCH3 24

CH318

HH

H

111

5.3.2. Identificação da Substância VI

O espectro de RMN de 1H (Figura 38) apresentou sinais do anel aromático

(parcialmente encoberto) em δ 6,89 (d; J=5,5 Hz; H-9), δ 6,42 (dd; J=5,5; 2,3 Hz, H-

10) e δ 6,90 (d; J= 2,3 Hz; H-12). A constante de acoplamento orto (J = 5,5 Hz) de H-9

e H-10 e a constante de acoplamento meta (J=2,3 Hz) para H-11 e H-10 evidenciam um

padrão de substituição em H-11. Além destes, também mostrou um dubleto em δ 1,36

(J=6,0 Hz) relacionado ao grupo CH3-18; um duplo quarteto em δ 4,47 (J=10,2, 6,3 Hz)

relacionado a H-19, um singleto correspondente a H-17 em δ 7,51, e dois singletos

relacionados a duas metoxilas em δ 3,67 e 3,84. Os dubletos largo (dl) em δ 2,46

(J=4,2) e em δ 2,95 (J=6,0) correspondente ao H-5α e H-5β, respectivamente; os

multipletos (m) relacionados ao H-6 em δ 2,98 e 1,24; um dubleto largo relativo a H-3

em δ 3,31 (J=12,0 Hz); um duplo dubleto em δ 3,16 (J=12,0, 2,0) e dubleto em δ 2,72

correspondente a H-21α e H-21β. O sinal do H-19, um duplo quarteto em δ 4,47 e

valores de J = 10,2 e 6,3 Hz, indica que esse átomo de hidrogênio acopla com os

hidrogênios da metila, na posição 18, com 3J19,18 = 6,2 Hz e, portanto a outra constante de

acoplamento se refere ao acoplamento entre esse hidrogênio e o da posição 20. O valor de

deslocamento químico do H-19 fornece uma indicação sobre a posição relativa desse

hidrogênio. Quando seu valor de δH se encontra entre 4,2 e 4,5 ppm, ele pertence à série

H-19β, 20α (BRUYN et al., 1989). O valor encontrado de δ 4,47 (dq; 10,2; 6,3 Hz) para

esta substância corrobora para esse resultado.

A análise do espectro de RMN de 13C (Figura 39) mostrou 22 sinais, oito sinais

relativos a CH, quatro correspondentes a CH2, três referentes a CH3 e sete de carbonos

quaternários. Os valores dos deslocamentos químicos relativos ao anel aromático em δ

122,2 (C-9), em δ 99,9 (C-10) e δ 105,0 (C-12) confirmaram o padrão de substituição

em H-11. Os dados de RMN de 13C-APT e HSQC (Figura 40) permitiram a

determinação da configuração da molécula. Como os valores encontrados de

deslocamentos químicos de C-3 e C-6 foram δ 61,0 e 24,8, respectivamente, portanto a

junção do anel C/D é do tipo trans (a), e os deslocamentos do C-14 em δ 34,7 e de C-20

em δ 39,3, conclui-se que a substância VI apresenta configuração normal. As

correlações no HMBC (Figura 41) juntamente com a análise dos dados de RMN (Tabela

58) e dados da literatura (ADIBATTI et al., 1991, SRIVASTAVA et al., 2010,

112

MAURYA et al., 2013) confirmam que a Substância VI trata-se do alcaloide 11-

metoxi-ajmalicina (Figura 37).

Tabela 58: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 11-metoxi-ajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH

(m, J em Hz) 2-4J C,H

2 C 139,5 3 CH 61,0 3,31 (dl; 12,0) C-2 5 CH2 54,4 2,46 (d; 4,2) α

2,95 (dl; 6,0) β C-3, C-6

C-2, C-3, C-6, C-7, C-21 6 CH2 24,8 2,98 (m) α

1,24 (m) β C-2, C-7

7 C 108,6 8 C 134,4 9 CH 122,2 6,89 (d; 5,5) C-8, C-11, C-13 10 CH 99,9 6,42 (dd; 5,5, 2,3) C-8, C-11, C-13 11 C 155,7 12 CH 105,0 6,90 (d; 2,3) C-10 13 C 139,5 14 CH2 34,7 2,55 (dt; 12,0) α

1,39 (d; 6,3) β C-15, C-20

C-2, C-3, C-15, C-16 15 CH 32,5 2,70 (sept.) C-16, C-17, C-22 16 C 111,2 C-15, C-20

C-2, C-3, C-15, C-16 17 CH 156,0 7,51 (s) C-15, C-16, C-22 18 CH3 18,2 1,36 (d; 6,0) C-19, C-20 19 CH 73,6 4,47 (dq; 10,2; 6,3) C-15, C-20 20 CH 39,3 1,67 (m) - 21 CH2 57,0 3,16 (dd; 12,0; 2,0) α

2,72 (d; 3,5) β C-5, C-20

C-3, C-19, C-20 22 C 168,4 C-22 23 CH3 51,1 3,67 (s) C-11 24 CH3 55,2 3,84 (s) C-22 NH 9,99 (s)

113

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

H

OCH3

Figura 37: Estrutura da 11-metoxi-ajmalicina e suas correlações no HMBC.

O mapa de contorno COSY (Figura 42) da substância VI apresentou

correlações homonucleares entre os hidrogênios aromáticos do núcleo indólico (H-9, H-

10 e H-12); entre os hidrogênios da unidade secologanínica (H-19 e CH3-18) e (H-19 e

H-20); assim como entre os hidrogênios quinolizidínicos (H-6 e H-5), (H-14 e H-15) e

(H-20 e H-21), as demais correlações estão descritas na Tabela 59.

Todos os sinais foram atribuídos às posições correspondentes na molécula com

base nas correlações observadas nos espectros em 1D/2D, os quais foram fundamentais

para a determinação da estereoquímica dos hidrogênios da porção terpênica. A diferença

entre essa substância V (10-metoxi-ajmalicina) e a substância VI (11-metoxi

ajmalicina) está somente na substituição do átomo de hidrogênio da posição 11 por um

grupamento metoxila.

Tabela 59: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 11-metoxi ajmalicina.


Correlações COSY

3 3,31 (dl; 12,0) H-14β 5 2,46 (d; 4,2) α

2,95 (dl; 6,0) β H-5β, H-6α

H-5α 6 2,98 (m) α

1,24 (m)β H-5β

9 6,89 (d; 5,5) 10 6,42 (dd; 5,5; 2,3) H-12 12 6,90 (d; 2,3) H-10 14 2,55 (dt; 12,1) α

1,39 (d; 6,3) β H-3, H-14β

H-3,14α, H-15

114

continuação da Tabela 59. 15 2,70 (sept.) H-14β, H-20 17 7,51 (s) H-18, H-19 18 1,36 (d; 6,0) H-17,H-19 19 4,47 (dq; 10,2, 6,3) H-18, H-20 20 1,67 H-19, H-21α, H-21β 21 3,16 (dd; 12,0, 2,0) α

2,72 (d; 3,5) β H-20, H-21β H-20, H-21α

23 3,67 (s) 24 3,84 (s) NH 9,99 (sl)

115

Figura 38: Espectro de RMN de 1H da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40Chemical Shift (ppm)

6.42

6.426.4

36.44

6.89

66.9

06.9

16.9

2

6,42,dd, J = 5.5, 2.3

6,90; d; J = 2,3

6,89;d; J = 5,5

116

Figura 39: Espectro de RMN de 13C -APT da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (125 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

117

Figura 40: Mapa de contorno HSQC da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

118

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

3,67

155,7

168,4

3,84

Figura 41: Mapa de contorno HMBC da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

119

Figura 42: Mapa de contorno COSY da 11-metoxi-ajmalicina em C3D6O (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

120

5.3.3. Identificação da Substância VII

O espectro de RMN de 1H (Figura 44) apresentou sinais característicos de anel

aromático: δ 6,89 (d; J=5,5 Hz; H-9), δ 6,42 (dd; J=5,5; 2,3 Hz, H-10) e δ 6,90 (d; J=

2,3 Hz; H-12). A constante de acoplamento orto (J = 5,5 Hz) de H-9 e H10 e a

constante de acoplamento meta (J=2,3 Hz) para H-11 e H-10 evidenciam um padrão de

substituição em H-11 (Tabela 60).

A comparação dos dados de RMN do mapa de contorno HSQC (Figura 45)

destas substâncias sugeriu a estereoquímica de um isômero pseudo (H-3β; H-20β). Esta

estereoquímica é confirmada pelo deslocamento químico do carbono na posição 3, em δ

55,4 e do carbono na posição 20, em δ 38,1, diferenciando-se do isômero normal

(substância VI) em que o deslocamento do C-3 está em δ 61,0. O carbono em δ 55,4 e

o hidrogênio em δ 3,31, correspondentes ao C-3 e H-3, apesar de apresentarem sinais

semelhantes com os sinais das metoxilas (δ 51,1 - δ 3,66 e δ 55,1 – 3,79) pôde-se

determinar com exatidão, devido à multiplicidade dos sinais e integrais no espectro de 1H e confirmada pelas correlações no HMBC (Figura 46). A presença de dois singletos

bem intenso e integral para 3 hidrogênios, indica a existência de dois grupos metoxila,

entretanto o sinal correspondente ao H-3 apresenta-se como um dubleto largo (12,0 Hz)

e integral para 1 hidrogênio. A comparação dos dados apresentados pelos espectros de

RMN de 1H, HSQC, HMBC e COSY com os descritos na literatura para a akuamigina

(JORGE, 2005) confirmaram a estrutura da substância VII como sendo 11-metoxi-3-

isoajmalicina (Figura 43).

Tabela 60: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 11-metoxi-3-isoajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 134,5 3 CH 55,4 3,31 (dl 12,0) 5 CH2 50,0 2,67 (m)

3,11 (m)

6 CH2 22,9 2,95 (m) 1,30 (m)

7 C 108,6 8 C 134,4 9 CH 122,2 6,89 (d; 5,5) C-11, C-13

121

continuação da Tabela 60. 10 CH 99,5 6,42 (dd; 5,5; 2,3) C-7, C-13 11 C 154,9 12 CH 105,0 6,90 (d; 2,3) 13 C 137,5 14 CH2 33,5 2,46 (m)

1,45 (m)

15 CH 32,5 2,65 (sept.) 16 C 111,2 17 CH 156,0 7,50 (s) 18 CH3 18,2 1,33 (d; 6,0) C-19, C-20 19 CH 73,6 4,45 (dq; 10,2; 6,3) 20 CH 38,1 1,67 21 CH2 57,0 2,98 (dd; 12,0; 2,0) α

2,50 (m) β

22 C 168,4 23 CH3 51,1 3,66 (s) C-16, C-22 24 CH3 55,2 3,79 (s) C-11 NH 9,99 (s)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

H

OCH3

Figura 43: Estrutura da 11-metoxi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC.

As correlações observadas no mapa de contorno COSY (Figura 47) entre os

hidrogênios aromáticos do núcleo indólico H-10 com H-9 e H-12; entre os hidrogênios

da unidade secologanínica (H-19 e CH3-18) e (H-19 e H-20) e as demais correlações

estão descritas na Tabela 61.

122

Tabela 61: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 11-metoxi-3-isoajmalicina.

Posição δH (m, Hz)

Correlações COSY

3 3,31 (dl; 12,0) 5 2,67 (m) α

3,11 (m)β H-5β H-5α

6 2,95 (m) α 1,30 (m) β

9 6,89 (d;5,5) H-10 10 6,42 (dd; 5,5, 2,3) H-9, H-12 12 6,90 (d; 2,3) H-10, H-24 14 2,46 (m)

1,45 (m)

15 2,65 (sept) 17 7,50 (s) 18 1,33 (d; 6,0) H-19 19 4,45 (dq; 10,2; 6,3) H-18, H-20 20 1,67 (m) H,18, H-21β 21 2,98 (dd; 12,0; 2,0) α

2,50 (m) β H-21α

H-20, H-21β 23 3,66 (s) 24 3,79 (s) H-12 NH 9,99 (s)

123

6,42;dd; J = 5,5; 2,3

6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40Chemical Shift (ppm)

6.42

6.426.4

36.44

6.89

66.9

06.9

16.9

2

6,90; d; J = 2,3

6,89; d; J = 5,5

Figura 44: Espectro de RMN de 1H da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz).

124

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

Figura 45: Mapa de contorno HSQC da 11-metoxi-3-isoajmalicina, com destaque para alguns deslocamentos que definem a estereoquímica em C3D6O (500 MHz).

125

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

Figura 46: Mapa de contorno HMBC da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz).

126

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3 24

Figura 47: Mapa de contorno COSY da 11-metoxi-3-isoajmalicina em C3D6O (500 MHz).

127

5.3.4. Identificação das Substâncias VIII e IX

A análise detalhada dos espectros de RMN de 1H,13C, HSQC, HMBC e COSY

evidenciaram a mistura de dois alcaloides: 9-metoxi-3-isoajmalicina (substância VIII)

e 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância IX).

No espectro de RMN de 1H (Figura 50) foram observados sinais comuns para

ambas às substâncias: um singleto em δ 7,52 (H-17), seguido dos sinais dos

hidrogênios aromáticos em δ 6,66 (H-10), δ 7,15 (H-11) e δ 7,20 (H-12); dois singletos

em δ 3,59 e 3,91 referentes a duas metoxilas; um dubleto em δ 1,23 (J=6,0 Hz)

relacionado ao grupo CH3-18. Os sinais dos hidrogênios metilênicos indicam a presença

de duas substâncias, sendo confirmadas pela ocorrência dos sinais atribuídos aos

hidrogênios na posição 19 (H-19): para 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em δ 3,66,

indicando que esta pertence à série H-19β, 20α, posição trans e para 9-metoxi-3-

isoajmalicina em δ 4,40, o que corresponde à posição α em relação ao plano.

Conforme o deslocamento químico do C-19 foi possível definir a configuração do grupo

metílico para cada uma das substâncias, o qual se encontra em δ 76 para 9-metoxi-19-

epi-3-isoajmalicina, indicando que o grupo metílico em C-19 está β-orientado e em 9-

metoxi-3-isoajmalicina este é observado em δ 74,0, correspondendo à posição α. Essas

diferenças exercem um grande efeito na estrutura tridimensional da molécula, sem

alterar seu espectro de UV e massa molecular.

O espectro de RMN de 13C-APT (Figura 51) mostrou sinais referentes à mistura

de duas substâncias: δ 54,6 e δ 55,1 (C-3), δ 47,4 e δ 48,6 (C-5), δ 20,0 e δ 24,9 (C-6),

δ 33,5 e δ 38,8 (C-14), δ 31,7 e δ 32,4 (C-15), δ 74,0 e δ 76,0 (C-19), δ 39,1 e δ 43,8

(C-20), estes sinais sugerem a mistura dos dois alcaloides. Os demais sinais em δ 106,2

(C-16) e 156,2 (C-17) correspondem à dupla ligação do sistema carbonílico; o sinal em

δ 167,5 corresponde a C=O de éster; os sinais em δ 18,3 (CH3-18) e em δ 50,9 (MeO-

23) e em δ 55,4 (MeO-24) são idênticos nas duas substâncias.

Através da observação dos deslocamentos químicos referentes a C-3 e C-14 no

espectro HSQC (Figura 52) foi possível definir a configuração do esqueleto da porção

secologanina nas duas moléculas, onde ambas as substâncias pertences à série pseudo.

Com o espectro de HMBC (Figura 53) foi possível confirmar quais hidrogênios

estavam sobrepostos na região mais protegida e atribuir hidrogênios e carbonos para

cada uma das substâncias. Através dos acoplamentos: C-3 com H-6, H-20 e H-21; C-15

com H-17, H-20 e H-21; C-18 com H-19 e H-20; C-21 com H-14 foi identificado o

128

alcaloide 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (Tabela 62, Figura 48 ). E os acoplamentos

do C-3 com H-5, H-6 e H-15; C-19 com H-17 e H-21; C-15 com H-17; C-21 com H-3

permitiram a identificação da 9-metoxi-3-isoajmalicina (Tabela 63, Figura 49). A

identificação das substâncias foi confirmada através da espectrometria de massas e

comparação com dados da literatura (SHELLARD et al., 1966; SHELLARD e

SARPONG, 1969; XIN et al., 2008).

Tabela 62: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 9-metoxi-3-isoajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 138,9 3 CH 54,6 4,60 (d; 12,0) C-21 5 CH2 47,4 2,80 (dd; 10,9; 3,6) α

2,60 (t) β C-3 C-3

6 CH2 20,0 3,05 (m) α 3,36 (m) β

C-3, C-7

7 C 107,5 8 C 118,8 9 C 155,1 10 CH 99,9 6,66 (d; 8,0) C-8, C-9, C-12 11 CH 122,2 7,15 (d; 8,0) C-9, C-13 12 CH 105,8 7,20 (d; 8,0) C-9, C-10, C-13 13 C 132,5 14 CH2 33,5 1,35 (d; 8,0) α

1,65 (m) β

15 CH 32,4 1,73 (m) C-2, C-3 16 C 109,2 17 CH 156,2 7,69 (s) C-15, C-16, C-19, C-22 18 CH3 18,3 1,23 (d; 6,5) C-19, C-20 19 CH 74,0 4,40 (d; 3,8) 20 CH 39,1 1,58 (m) 21 CH2 63,4 3,98 (d; 12,0) α

4,66 (d; 12,0) β C-19

22 C 167,5 C-3, C-15 23 CH3 50,9 3,59 (s) C-22 24 CH3 55,4 3,91 (s) C-9 NH 11,57 (s) C-2, C-7, C-8, C-13

129

Tabela 63: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 138,9 3 CH 55,1 3,78 (d; 11,0) 5 CH2 48,6 1,80 (m)

2,01 (m) C-3

6 CH2 24,9 1,75 (m)

2,05 (m) C-2, C-3

7 C 107,5 8 C 118,8 9 C 155,1 10 CH 99,9 6,66 (d; 8,0) C-8, C-9, C-12 11 CH 122,2 7,15 (d; 8,0) C-9, C-13 12 CH 105,8 7,20 (d; 8,0) C-9, C-10, C-13 13 C 132,5 14 CH2 38,8 1,58 (m) α

1,06 (m) β

C-21 15 CH 31,7 2,23 (m) 16 C 109,2 17 CH 156,2 7,69 (s) C-15, C-16, C-19, C-22 18 CH3 18,3 1,23 (d; 6,5) C-19, C-20 19 CH 76,0 3,66 (d; 3,8) 20 CH 43,8 1,70 (m) 21 CH2 63,4 4,24 (d; 11,0) α

4,87 (d; 11,0) β C-19

22 C 167,5 C-3, C-15 23 CH3 50,9 3,59 (s) C-22 24 CH3 55,4 3,91 (s) C-9 NH 11,57 (s) C-2, C-7, C-8, C-13

130

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

Figura 48: Estrutura da 9-metoxi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC.

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

Figura 49: Estrutura da 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina e suas correlações no HMBC.

A análise dos dados obtidos do mapa de contorno COSY (Figura) foi essencial

na determinação dos sinais de cada alcaloide. As correlações observadas no mapa de

contorno COSY entre os hidrogênios em δ 4,60 (H-3) e δ 1,73 (H-15), δ 2,80 (H-5 α) e

2,60 (H-5 β), δ 3,05 (H-6 α) e 3,36 (H-6 β), δ 1,35 (H-14 α) e 1,65 (H-14 β), δ 7,69 e

1,73, δ 1,58 (H-20) e 1,73 (H-15), δ 3,98 (H-21 α) e 4,66 (H-21 β), foram atribuídas a 9-

metoxi-3-isoajmalicina (substância IX) (Tabela 64).

131



Correlações COSY

3 4,60 H-15 5 2,80 (dd; 10,9, 3,6) α

2,60 (t) β H-5β H-5α

6 3,05 (m) α 3,36 (m) β

H-6β H-6α

10 6,66 (d; 8,0) H-12 11 7,15 (d; 8,0) 12 7,20 (d; 8,0) H-10 14 1,35 (d; 8,0) α

1,65 (m) β H-14β H-14α

15 1,73 (m) H-3, H-17, H-20 17 7,69 (s) H-15 18 1,23 (d; 6,5) 19 4,40 (d; 3,8) H-20 20 1,58 (m) H-15 21 3,98 (d; 11,0) α

4,66 (d; 11,0) β H-21β H-21α

23 3,59 (s) 24 3,91 (s) NH 11,57(s)

As correlações entre os hidrogênios em δ 4,24 e 4,87 (H-5α e H-5β), entre δ 1,58

e 1,06 (H-14α e H-14β), δ 2,23 (H-15) com δ 7,69 (H-17) e 1,70 (H-20), entre δ 1,23

(H-18) e 3,66 (H-19); entre os hidrogênios aromáticos do núcleo indólico em δ 7,20 (H-

12) com δ 6,66 (H-10); conforme Figura 54 e Tabela 65.



Correlações COSY

3 3,78 (d; 11,0) 5 1,80 (m) α

2,01 (m) β

6 1,75 (m) 2,05 (m)

10 6,66 (d; 8,0) H-12 11 7,15 (d; 8,0) 12 7,20 (d; 8,0) H-10 14 1,58 (m) α

1,06 (m) β H-14β H-14α

15 2,23 (m) H-17, H-20

132

continuação da Tabela 65. 17 7,69 (s) H-15 18 1,23 (d; 6,5) H-19 19 3,66 (d; 3,8) H-18, H-20 20 1,70 (m) H-15, H-19 21 4,24 (d; 10,5) α

4,87 (d; 10,5) β H-21 β H-21 α

23 3,59 (s) 24 3,91 (s) NH 11,57 (s)

133

Figura 50: Espectro de RMN de 1H da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz).

134

C/CH2

CH/CH3

74,076,4 39,143,8

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

Figura 51: Espectro de RMN de 13C- APT da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (125 MHz).

135

76,074,0

4,40 3,66

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

Figura 52: Mapa de contorno HSQC da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-akuamigina, com destaque para alguns dos deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N (500 MHz).

136

1,23

74,0

76,0

43,8

39,1

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

Figura 53: Mapa de contorno HMBC da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina, com destaque para alguns dos deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N (500 MHz).

137

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

H

OCH3

Figura 54: Mapa de contorno COSY da mistura de 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz).

138

5.3.5. Identificação da Substância X

Foi possível oservar no espectro de RMN de 1H (Figura 56) da substância X os

sinais referentes aos hidrogênios aromáticos em δ 7,35 (d; J=2,5 Hz; H-9), δ 7,09 (dd;

J=8,8; 2,5 Hz; H-11) e δ 7,49 (d; J= 8,8 Hz; H-12), com um padrão de substituição em

H-10, além de sinais de hidrogênios metínicos e metilênicos e o hidrogênio referente ao

NH em δ 11,4 (Tabela 66).

O mapa de contorno HSQC (Figura 57) desta substância mostra o deslocamento

em δ 55,8 referente ao C-3, que corresponde a posição β, ou seja, posicionado em

relação ao plano, juntamente com a observação dos deslocamentos em δ 17,6 (C-6), δ

31,7 (C-14) e δ 44,2 (C-20) pôde-se confirmar a estereoquímica desta substância

pertencente à série pseudo.

No mapa de contorno HMBC (Figura 58), além das correlações heteronucleares 13C x 1H entre os carbonos aromáticos do núcleo indólico (C-8, C-9 e C-10) e o

hidrogênio (H-11), apresentou também correlações correspondentes à unidade

secologanínica de C-20 com os hidrogênios metílicos (CH3-18); de C-16 com o

hidrogênio olefínico (H-17) e da carbonila do grupo éster (C-22) com os respectivos

hidrogênios da metoxila.

Os dados de RMN (1H, 13C, HSQC, HMBC e COSY), o dado obtido com a

espectrometria de massas (íon molecular em m/z = 382) interpretados juntamente com

as informações obtidas nas referências bibliográficas (SALKIN et al., 1961; ARBAIN

et al., 1993; JORGE et al., 2006) confirmaram a identificação desta substância como

sendo 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (Figura 55).

Tabela 66: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 135,9 3 CH 55,8 3,70 (s) 5 CH2 50,6 3,62 (d; 2,0) α

3,30 (d; 6,0) β

C-3, C-7 6 CH2 17,6 2,61 (m)

2,55 (m) C-5, C-7

7 C 108,0 8 C 129,1

139

continuação da Tabela 66. 9 CH 100,7 7,35 (d; 2,5) C-13 10 C 155,0 11 CH 111,3 7,09 (dd; 8,8; 2,5) C-8, C-9, C-10 12 CH 112,8 7,49 (d; 8,8) 13 C 132,4 14 CH2 31,7 2,20 (m)

2,27 (m)

15 CH 32,5 2,40 (m) 16 C 109,0 17 CH 156,3 7,68 (d; 2,0) C-14, C-16, C-19 18 CH3 18,2 1,22 (d; 6,0) C-19, C-20 19 CH 76,0 3,58 (m) 20 CH 44,2 1,63 (m) C-3 21 CH2 47,7 2,78 (dd; 10,0; 3,5) α

2,52 (m) β C-20 C-20

22 C 167,4 23 CH3 50,7 3,59 (s) C-22 24 CH3 54,0 3,87 (s) C-10 NH 11,43 (s)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

Figura 55: Estrutura da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina e suas correlações no

HMBC.


confirmando a estrutura proposta. A análise dos dados obtidos revelou correlações entre

os hidrogênios aromáticos do núcleo indólico em δ 7,09 (H-11) com δ 7,35 (H-9) e com

δ 6,49 (H-12); entre os hidrogênios da unidade secologanínica em δ 3,58 (H-19) e 1,22

(CH3-18); entre os hidrogênios quinolizidínicos H-6α e H-6β; entre H-14α e H-5, entre

H-14β e H-21β, os demais acoplamentos estão descritos na Tabela 67.

140

Tabela 67: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina.


Correlações COSY

3 3,70 (s) 5 3,62 (d; 2,0) α

3,30 (d; 6,0) β H-14α, H-18, H-20

6 2,61 (m) α 2,55 (m) β

H-6β H-6α

9 7,35 (d; 2,5) H-11 11 7,09 (dd; 8,8; 2,5) H-9, H-12 12 7,49 (d; 8,8) H-11 14 2,20 (m) α

2,27 (m) β H-5

H-21β 15 2,40 (m) H-20 17 7,68 (d; 2,0) 18 1,22 (d; 6,0) H-5, H-19 19 3,58 (m) H-18 20 1,63 (m) H-5, H-15, H-21β, H-21α 21 2,78 (dd; 10,0; 3,5) α

2,52 (m) β H-20, H-21β

23 3,59 (s) 24 3,87 (s) NH 11,43 (s)

141

Figura 56: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz).

142

3,70

55,8

76,0

3,58

Figura 57: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina, com destaque para os deslocamentos que definem a estereoquímica, em C5D5N.

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

143

1,22

76,0

44,2

Figura 58: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

144

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

Figura 59: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina em C5D5N (500 MHz).

145

5.3.6. Identificação da Substância XI

A análise dos deslocamentos químicos no espectro de RMN de 1H (Figura 61),

bem como a constante de acoplamento dos hidrogênios do anel aromático sugere um

padrão de substituição em H-11. O valor de deslocamento químico do H-19 em δ 4,15

(duplo quarteto) indica que esta substância pertence à série H-19β, 20α.

No mapa de contorno HSQC (Figura 62) observou-se o deslocamento químico

dos carbonos no anel A (C-8 e C-13) em δ 126,5 e 130,7, respectivamente; sinal de

carbono de carbonila em região mais desprotegida (δ 167,3) característico de grupo

éster; cinco átomos de carbono quaternários sp2, C-2 (δ 140,0), C-13 (δ 130,7), C-7 (δ

109,9) e C-8 (δ 126,5) estes adjacentes a NH e em δ 154,2 (C-10); contém também

outros quatro sinais de carbono sp2, C-9 (δ 100,0), C-11 (δ 111,0) e C-12 (δ 111,3), em

região mais protegida em relação aos carbonos aromáticos não-hidrogenados.

Observaram-se sinais em δ 50,9 e em δ 55,6 característicos do grupo metoxila, em δ

17,1 (C-18) referente ao grupo metila e em δ 75,8 (C-19). Para definir a estereoquímica

foram observados os centros estereogênicos: C-3 (junção do anel C e D) que para esta

substância encontra-se em δ 55,1 e C-14 em δ 31,2, além dos carbonos que encontram-

se na junção do anel D e E, C-15 em δ 25,1 e C-20 em δ 36,6, indicanro que esta

substãncia pertence à série epiallo.

No mapa de contorno HMBC (Figura 63) foram verificadas as correlações entre 1H e 13C (Tabela 68) confirmando a estrutura proposta como sendo o alcaloide 10-

metoxi-3-isorauniticina (Figura 60) segundo dados da literatura (PHILLIPSON e

SUPAVITA; 1983; ADIBATTI et al., 1991)

Tabela 68: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-3-isorauniticina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 140,0 3 CH 55,1 3,18 (bd) 5 CH2 49,5 2,39 (d; 12,0)

3,06 (m)

6 CH2 21,2 2,69 (m) 3,02 (m)

7 C 109,9

146

continuação da Tabela 68. 8 C 126,5 9 CH 100,0 6,89 (d; 2,3) C-11, C-13 10 C 154,3 11 CH 111,0 6,68 (dd; 8,7, 2,3) C-9, C-13 12 CH 111,3 7,19 (d; 8,7) C-8, C-10 13 C 130,7 14 CH2 31,2 1,75 (m)

3,04 (m)

15 CH 25,1 1,55 (d; 6,5) C-2 16 C 105,4 17 CH 157,2 7,63 (s) C-14, C-16, C-19 18 CH3 17,1 1,39 (d; 6,6) C-19, C-20 19 CH 75,8 4,15 (dq) 20 CH 36,6 2,36 (m) 21 CH2 53,2 2,61 (m)

3,11 (m)

22 C 167,3 23 CH3 51,0 3,75 (s) C-22 24 CH3 55,6 3,87 (s) C-10 NH 9,11 (s)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

Figura 60: Estrutura da 10-metoxi-3-isorauniticina e suas correlações no HMBC.


entre os hidrogênios: H-3 e H-14β, H-5α e H-5β, H-6α e H-6β; e entre os hidrogênios

aromáticos do núcleo indólico (H-11 e H-12); entre os hidrogênios da unidade

147

secologanínica (H-19 e CH3-18); entre os hidrogênios quinolizidínicos (H-14 e H-21) e

(H-21α e H-21 β) (Tabela 69).

Tabela 69: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) com as correlações 1H x1H COSY da 10-metoxi-3-isorauniticina.


Correlações COSY

3 3,18 (dl; 10,0) H-14β 5 2,39 (d; 12,0) α

3,06 (m) β H-5β H-5α

6 2,69 (m) α 3,02 (m) β

H-6β H-6α

9 6,89 (d; 2,3) 11 6,68 (dd; 8,7, 2,3) H-12 12 7,19 (d; 8,7) H-11 14 1,75 (m) β

3,04 (m) α H-3, H-14α

H-14β, H-21 α 15 1,55 (d; 6,5) 17 7,63 (s) 14α, H-19 18 1,39 (d; 6,6) H-19 19 4,15 (dq.) H-18 20 2,36 (m) 21 3,11 (m) α

2,61 (m) β H-14β, H-21β

H-21α 23 3,75 (s) 24 3,87 (s) NH 9,11 (s)

148

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5Chemical Shift (ppm)

0.05

0.10

0.15

0.20

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.28

1.29

1.31

1.33

1.361.

451.

801.

942.00

22.

162.

23

2.71

3.07

3.083.11

3.13

3.18

3.30

3.31

3.31

33.

603.

623.77

3.80

3.96

4.07

4.09

4.11

4.14

4.60

4.81

44.

965.49

6.69

6.72

6.72

6.88

6.89

6.937.18

7.21

7.63

7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6Chemical Shift (ppm)

6.666.

676.696.70

6.89

6.90

7.17

7.20

7,19; d; J = 8,7

6,68;dd; J = 8,7; 2,26,89; d; J = 2,2

Figura 61: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz).

149

4,14

75,8

3,18

55,1

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

Figura 62: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz).

150

1,39

75,8

36,6

Figura 63: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

151

Figura 64: Mapa de contorno COSY da 10-metoxi-3-isorauniticina em CDO3D (500 MHz).

8

13

9

12

10

11

7

2NH1

6 5

3N4

14

15

21

20

16 17

19O

22O

O CH323

CH318

HH

HOCH3

152

5.3.7. Identificação da Substância XII

Após análise de RMN (1D e 2D) verificou-se que os sinais de deslocamento

assemelhavam-se com os da substância XI (10-metoxi-3-isorauniticina), diferindo no

deslocamento químico de C-3. Devido a esta diferença, esta substância foi identificada

como 10-metoxi-rauniticina (Figura 65).

Segundo Bruyn e colaboradores (1989) o valor de deslocamento químico do H-

19 fornece uma indicação sobre a posição relativa desse hidrogênio. Quando seu valor

encontra-se entre δ 4,2 e 4,5, ele pertence à série H-19β, 20α, entretanto, se esses

átomos estiverem dispostos em posição cis, o valor de δH do H-19 estará em

aproximadamente δ 3,7. Com a análise do espectro de RMN de 1H (Figura 66), pôde-se

distinguir a substância XI da substância XII, pela diferença do deslocamento químico

do hidrogênio na posição 19, em 10-metoxi-rauniticina (substância XII) encontra-se

em δ 3,67 e em 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI) em δ 4,46.

A análise das correlações heteronucleares 13C x 1H no mapa de contorno HSQC

(Figura 67) confirmaram a estrutura proposta como sendo 10-metoxi-rauniticina, cujo

deslocamento químico do C-3 está em δ 64,0 (posição α) enquanto para 10-metoxi-3-

isorauniticina, este se encontra em 55,1 (posição β). No mapa de contorno HMBC

(Figura 68) pôde-se verificar as correlações da MeO-23 em δ 3,74 com C-22 (δ 167,4) e

entre a MeO em δ 3,85 e C-10 (154,0), e as correlações entre hidrogênios e carbonos do

anel aromático: em δ 6,94 (H-11) com δ 131,1 (C-13); em δ 6,98 (H-12) com δ 124,3

(C-8) e com 154,0 (C-10), as quais foram imprecindíveis para determinar a posição dos

mesmos (Tabela 70).

Através da análise conjunta dos espectros de RMN foi possível determinar a

configuração da molécula em allo e ao comparar estes dados com a literatura foi

possível identificá-la como sendo 10-metoxi-rauniticina (ARBAIN et al., 1998b;

SALIM et al., 2011).

153

Tabela 70: Deslocamentos químicos de RMN de 1H (500 MHz) e correlações heteronucleares da 10-metoxi-rauniticina.

Posição

C

HSQC HMBC δC δH


2 C 137,0 3 CH 64,0 4,07 (m) 5 CH2 55,0 2,50 (ddd; 4,0; 4,0; 4,0) 6 CH2 22,6 1,27 (m)

0,87 (m)

7 C 109,0 8 C 124,3 9 CH 111,6 7,27 (s) 10 C 154,0 11 CH 111,4 6,94 (d; 2,0) C-13 12 CH 100,2 6,98 (s) C-10, C-8 13 C 131,1 14 CH2 34,0 1,54 (m)

2,07 (m)

15 CH 21,8 2,92 (m) 16 C 111,0 17 CH 157,2 7,56 (s) 18 CH3 18,4 1,42 (d; 6,0) 19 CH 75,7 3,67 (m) 20 CH 36,5 2,9 (m) 21 CH2 57,0 2,69 (m) 22 C 167,4 23 CH3 51,0 3,74 (s) C-22 24 CH3 55,7 3,85 (s) C-10 NH 8,03 (s)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

H

OCH3

Figura 65: Estrutura da 10-metoxi-rauniticina e suas correlações no HMBC.

154

Figura 66: Espectro de RMN de 1H da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz).

155

4,07 3,67

64,0

70,5

Figura 67: Mapa de contorno HSQC da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz).

156

8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

200

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

6,98 6,93

124,3131,1

154,0

Figura 68: Mapa de contorno HMBC da 10-metoxi-rauniticina em CDCl3 (500 MHz).

157

5.4. Atividades Química e Biológica

5.4.1. Atividade Antioxidante

Para avaliação da atividade antioxidante, todos os extratos foram testados quanto

a sua capacidade de inibir o radical de livre DPPH na concentração inicial de 10,0

µg/mL (Tabela 71), os resultados foram expressos como equivalente em ácido

ascórbico, ou seja, quanto mais próximo de 1 significa que é mais ativo.

Analisando os resultados em termos de inibição da atividade radicalar, os

extratos que apresentaram maior atividade antioxidante foram os extratos metanólicos

das folhas e dos galhos, com inibição de 79±0,6% (galhos, 1ª coleta), 59±0,01% (folhas,

2ª coleta) e 68±0,01% (galhos, 2ª coleta). Devido a esta pronunciada inibição em 10,0

µg/mL, estes extratos foram testados em outras concentrações a fim de encontrar a CI50,

ou seja, a concentração do extrato capaz de provocar a diminuição de 50% da atividade

do DPPH em um período de tempo determinado. Portanto, quanto menor a CI50, maior é

a atividade antioxidante. Como os extratos de baixa polaridade,

(diclorometânico/hexânico das folhas e galhos da 1ª e 2ª coleta) demonstaram baixa

inibição em 10,0 µg/mL, não foi realizado o ensaio com as menores concentrações.

Tabela 71: Resultado das reações dos extratos de Duroia macrophylla com o oxidante DPPH.

EXTRATOS

Valores médios

|ΔABS517| [AA]eq

Equiv.

(mg extrato/mg

ácido ascórbico)

1ª COLETA

Folhas DCM 0,027+ 0,01 0,303 16,8

Folhas MeOH 0,230+ 0,01 1,926 2,6

Galhos DCM 0,010+0,02 0,173 40,6

Galhos MeOH 0,794+ 0,06 6,435 0,8

2ª COLETA

Folhas Hexano 0,010+ 0,02 0,173 39,4

Folhas MeOH 0,684+ 0,01 5,559 0,9

Galhos DCM 0,084+ 0,00 0,759 6,6

Galhos MeOH 0,587+ 0,01 4,780 1,0

158

Estes resultados corroboram com a análise qualitativa realizada em CCDC frente

ao reagente de DPPH. O aparecimento de manchas branco-amareladas que indica a

possível presença de substâncias antioxidantes foi observada com maior intensidade nos

extratos mais polares (MeOH), a qual pode estar relacionada com a presença de

compostos fenólicos, os quais podem interferir nas reações de propagação e formação

de radicais livres.

A capacidade sequestradora de radicais livres dos extratos metanólicos foi

verificada através da construção de uma curva para determinar a concentração inibitória

(CI50). Os extratos que tiveram atividade significativa no teste preliminar foram

avaliados em dose/dependência, em diferentes concentrações 10,0; 5,0; 2,5; 1,25; 0,625;

0,3125 e 0,1562 μg/mL. Os extratos testados nas diferentes concentrações apresentaram

uma relação de dose/dependência de 5,0 a 1,562 μg/mL. Os resultados estão expressos

considerando o erro padrão médio (±EPM).

O extrato metanólico dos galhos (1ª coleta) mostrou inibição de 22%, 14%, 13%

e 4%, nas concentrações de 5; 2,5; 1,25 e 0,625 μg/mL, respectivamente (Figura 69).

Uma vez que foram isoladas substâncias fenólicas, tais como o ácido m-metoxi-p-

hidroxi-benzoico (substância IV) identificado no extrato dos galhos, é possível que estas

sejam as responsáveis pela atividade antioxidante destes extratos pois possuem

hidroxilas fenólicas que atuam na captura dos radicais livres.

Figura 69: Atividade antioxidante do extrato dos galhos da 1ª coleta.

159

O extrato metanólico das folhas (2ª coleta) possui elevada capacidade

antioxidante, apresentando uma inibição de 15%, 9%, 4%, 3%, 2% e 1%, nas

concetrações testadas: 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125 e 0,1562 μg/mL, respectivamente

(Figura 70). O extrato metanólico dos galhos (2ª coleta) manteve a mesma inibição de

1% em diferentes concentrações (0,625; 0,3125 e 0,1562 μg/mL) e de 12%, 5% e 3%

nas concentrações de 5,0; 2,5 e 1,25 μg/mL, respectivamente (Figura 71).

Figura 70: Atividade antioxidante do extrato metanólico das folhas da 2ª coleta.

Figura 71: Atividade antioxidante do extrato metanólico dos galhos da 2ª coleta.

160

5.4.2. Toxicidade sobre Artemia salina

O extrato metanólico das folhas da 2ª coleta apresentou toxidade na

concentração letal (CL50) de 120 μg/mL, enquanto os demais extratos não foram

citotóxicos (Tabela 72). No amplo espectro de atividades biológicas apresentadadas

pelos alcaloides indólicos monoterpênicos está a atividade citotóxica e antitumoral

frente a diferentes linhagens de células tumorais (SAKAMOTO-HOJO et al., 1988).

Para os extratos que apresentam citotoxicidade, pode-se obter uma correlação utilizando

sistematicamente este bioensaio na avaliação prévia de substâncias antitumorais, que

são testadas em diferentes culturas de células tumorais (MCLAUGHLIN et al., 1998).

A falta de citotoxicidade dos extratos sobre o microcrustáceo A. salina pode

sugerir que estes não serão tóxicos às células de mamíferos, um resultado que seria

promissor, em função de vários extratos possuírem atividade antimicobacteriana. No

entanto, vale ressaltar que este ensaio é preliminar, sendo necessárias outras

metodologias para complementar o estudo citotóxico.

Tabela 72: Resultados da análise de toxicidade sobre Artemia salina dos extratos de Duroia macrophylla.

EXTRATOS (μg/mL)

Valores médios 1000 500 250 120 60 30

1ª COLETA

Folhas DCM 10 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Folhas MeOH 33,33 ± 0,57 6,67±0,57 6,67±0,57 3,33 ± 0,57 0 ± 0 0 ± 0 Galhos DCM 20 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Galhos MeOH 30 ± 0 13,33±0,57 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0

2ª COLETA

Folhas Hexano 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Folhas MeOH 83,33 ±1,15 73,33 ±1,15 53,33 ±0,57 50 ± 0 46,67 ±0,57 43,33 ±0,57 Galhos DCM 100 ± 0 40 ± 0 20 ± 0 10 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Galhos MeOH 100 ± 0 76,67 ±0,57 66,67 ±0,57 20 ± 0 3,33 ±0,57 0 ± 0

161

5.4.3. Atividade Antibacteriana

Todos os extratos foram testados contra 12 espécies de bactérias patogênicas:

Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium corumnare, Aeromonas hydrophila, Bacillus

cereus, Escherichia coli, Edwardsella tarda, Salmonella enteridis, Staphylococus

aureus, Providencia rettgeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa e

Nocardia brasiliensis.

Os extratos que apresentaram atividade antibacteriana foram: MeOH das folhas

e dos galhos da 1ª coleta, DCM dos galhos da 1ª e 2ª coleta, a uma concentração de 250

μg/mL sobre Klebsiella pneumoniae e Flavobacterium corumnare. Frente a bactéria

Nocardia brasiliensis apenas o extrato DCM das folhas (1ª coleta) foi ativo com CIM

de 125 μg/mL. O extrato MeOH dos galhos (2ª coleta) apresentou CIM de 125 μg/mL

frente à bactéria Salmonella enteridis; a CIM do extrato MeOH das folhas (2ª coleta)

foi de 500 μg/mL frente a Pseudomonas aeroginosa. Estes extratos que apresentaram

atividade inibitória foram testados para determinar onde não houve crescimento

bacteriano a partir da CIM, porém nenhum extrato apresentou atividade bactericida. Os

demais extratos não apresentaram atividade inibitória sobre as cepas testadas (Tabela

73).

Segundo alguns autores, os extratos metanólicos apresentam maior atividade

antimicrobiana por conter compostos químicos como alcaloides, aminoácidos,

flavonoides, glicosídeos, fitoesteróis, saponinas, esteróides, taninos e triterpenoides

(ELOFF, 1998a; LIN et al., 1999; PAREKH et al., 2005).

A atividade antibacteriana foi encontrada em outras espécies da família Rubiaceae:

Psychotria microlabrasta, Palicourea longiflora (RAJAKARUNA et al, 2002),

Richardia brasiliensis (SOUZA et al., 2004), Gonzalagunia rosea (NIÑO et al., 2006).

A extensa revisão de literatura sobre atividade antibacteriana de rubiáceas realizado por

Katyayani et al, (2012), mostra que os melhores resultados foram frente as bacterias

Bacillus sp, Staphylococcus sp e Pseudomonas aeruginosa.

Foram testados os dois triterpenos (ácido oleanólico e ursólico), uma chalcona

(4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona) e um derivado fenólico (ácido m-metoxi-p-hidroxi-

benzoico) isolados de D. macrophylla frente às cepas Klebsiella pneumoniae,

Flavobacterium corumnare, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas aeruginosa, Nocardia brasiliensis e Serratia marcescens. Apenas o ácido

162

oleanólico apresentou atividade antibacteriana frente à Nocardia brasiliensis e Serratia

marcescens, com uma CIM de 500 μg/mL (Tabela 74).

Muitos autores relacionam a atividade antimicrobiana de extratos brutos com a

presença de derivados fenólicos, terpenos e alcaloides em sua composição química.

Estes, podem estar atuando em sinergia, uma vez que quando isolados, podem diminuir

ou até mesmo perder sua atividade (GUTKIND et al., 1984; PERRUCHON, 2002;

SINGH e SINGH, 2003; SIMÕES et al., 2004; WENIGER et al., 2005).

A produção de metabólitos secundários está relacionada à adaptação da planta ao

ambiente. Estudos mostram que estes metabólitos podem apresentar múltiplas funções,

como proteção contra herbívoros, microrganismos e outras defesas inter-espécies,

aumentando a capacidade adaptativa do indivíduo ao ambiente (PEREIRA et al., 2003).

A mediação destes metabólitos em interações entre organismos pode indicar que estas

moléculas também atuem em outros sistemas biológicos. De modo mais específico,

muitas plantas desenvolveram substâncias que são verdadeiros inseticidas e

antimicrobianos naturais. Como por exemplos os compostos fenólicos sintetizados pela

sálvia, alecrim, tomilho, lúpulo, coentro, chá, cravo e manjericão, os quais são

conhecidos por possuírem efeitos antimicrobianos contra patógenos alimentares e

quando analisados in vitro apresentou atividade antibacteriana (AHN et al., 2007). Esta

correlação incentiva a busca por substâncias mais potentes, com poucos efeitos

colaterais, baixa toxicidade e aos quais as bactérias patogênicas não apresentem

resistência.

163

Tabela 73: CIM dos extratos de Duroia macrophylla frente às bactérias testadas.

CEPAS EXTRATOS (μg/mL)

Kle

bsie

lla

pneu

mon

iae

Flav

obac

teri

um

coru

mna

re

Aero

mon

as

hydr

ophi

la

Baci

llus

cere

us

Esch

eric

hia

coli

Edw

ards

ella

ta

rda

Salm

onel

la

ente

ridi

s

Stap

hylo

cocu

s au

reus

Prov

iden

cia

rettg

eri

Pseu

dom

onas

flu

ores

cens

Pseu

dom

onas

ae

rogi

nosa

Noc

ardi

a br

asili

ensi

s

1ª COLETA Folhas DCM 500 500 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 250 Folhas MeOH 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Galhos DCM 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Galhos MeOH 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

2ª COLETA Folhas HEX 500 500 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Folhas MeOH 500 500 N/A 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 500 Galhos DCM 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Galhos MeOH 500 500 N/A 500 N/A N/A 125 N/A N/A N/A N/A N/A

Legenda: N/A= não ativo

164

Tabela 74: CIM das substâncias isoladas de Duroia macrophylla frente às bactérias testadas.

EXTRATOS/SUBSTÂNCIAS (μg/mL)

CEPAS

Klebsiella pneumoniae

Flavobacterium corumnare

Aeromonas hydrophila

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas aeruginosa

Nocardia brasiliensis

Serratia marcescens

Substâncias isoladas do extrato DCM das folhas

Extrato DCM das folhas 500 500 N/A N/A N/A 250 N/A Ácido oleanólico (substância I) N/A N/A N/A N/A N/A 500 500 Ácido ursólico (substância II) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Substâncias isoladas do extrato MeOH das folhas

Extrato MeOH das folhas 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A 4,4’dihidroxi-3’-metoxi-chalcona (substância III)

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Substâncias isoladas do extrato MeOH dos galhos

Extrato MeOH dos galhos 250 250 N/A N/A N/A N/A N/A Ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico (substância IV)

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Legenda: N/A= não ativo

165

5.4.4. Atividade Antimicobacteriana

Na avaliação da atividade antimicobacteriana dos extratos de D. macrophylla

frente ao M. tuberculosis, apenas o extrato MeOH dos galhos (1ª coleta) não foi ativo

para nenhuma das cepas testadas, os demais extratos foram ativos contra pelo menos

uma cepa. O extrato DCM das folhas (1ª coleta) apresentou melhor resultado, com CIM

de 6,25 µg/mL para a cepa INHr, de 25 µg/mL para a cepa RMPr e ≤ 6,25 µg/mL para a

cepa H37Rv, vale destacar que foi a partir do fracionamento deste extrato que

obtiveram-se os dois triterpenos, ácido oleanólico e ursólico (substâncias I e II), e a

mistura dos dois esteroides, β-sitosterol e estigmasterol. O extrato MeOH das folhas da

2ª coleta apresentou CIM de 12,5 µg/mL para a cepa INHr (Tabela 75), para este extrato

foi encontrada a CL50 frente a A. salina de 120 µg/mL.

O extrato DCM dos galhos (2ª coleta) apresentou CIM de 100 µg/mL para as

três cepas testadas e a CIM do extrato MeOH dos galhos (2ª coleta) foi de 25 µg/mL

para a cepa H37Rv e 50 µg/mL para a cepa INHr. De ambos os extratos foram isolados

alcaloides monoterpênicos indólicos.

A elevada atividade do extrato DCM das folhas (1ª coleta) pode ser atribuída à

presença de terpenos, pois estudos realizados por Newton et al, (2000), Cantrell et al,

(2001); Copp (2003); Seidel e Taylor (2004), Aguiar et al, (2005) e Higuchi et al,

(2008), mostraram que os terpenos são os responsáveis pela atividade

antimicobacteriana das espécies vegetais estudadas. Há relatos na literatura da atividade

antimicobacteriana do ácido oleanólico frente à cepa H37Rv com CIM de 50 a 69

µg/mL e 200 µg/mL para a cepa RMPr (COPP, 2003; CANTRELL et al., 2001;

CALDWELL et al., 2000).

Outras substâncias que têm sido alvo de testes antimicobacterianos são os

esteroides como o sistosterol e estigmasterol, apresentando elevada atividade

(SALUDES et al., 2002; OKUNADE et al., 2004). Em outros ensaios, o sitosterol

proveniente de diferentes espécies vegetais apresentou atividade contra M. tuberculosis

(CALDWELL et al., 2000; JIMÉNEZ et al., 2005). Testes clínicos mostraram a eficácia

do β-sitosterol como co-adjuvante no tratamento da tuberculose (DONALD et al.,

1997).

Outras espécies de Rubiaceae foram testadas em micobactérias, como a espécie

Duroia hirsuta que foi ativa frente ao Mycobacterium phlei (LOPEZ et al., 2001) e

Psychotria vellosiana que apresentou atividade frente ao M. tuberculosis e ao M.

166

Kansasii (RAMOS et al., 2008). Segundo alguns autores, a atividade

antimicobacteriana também pode estar ligada a presença de alcaloides, comumente

encontrados em espécies de Rubiaceae (SCHRIPSEMA et al.,1999; KHAN et al.,,

2003) principalmente alcaloides indólicos derivados da ioimbina (MEDEIROS et al.,

2001; PEREIRA et al., 2006; NUNES et al., 2006).

Tabela 75: Determinação da CIM dos extratos de D. macrophylla frente ao M. tuberculosis.

EXTRATOS (μg/mL)

M. tuberculosis H37Rv (µg/mL) INHr (µg/mL) RMPr (µg/mL)

1ª COLETA Folhas DCM S ≤ 6,25 S 25 S ≤ 6,25 Folhas MeOH R >200 R >200 S 200 Galhos DCM S 100 S 100 S 100 Galhos MeOH R >200 R >200 R >200

2ª COLETA Folhas Hexano S 200 S 50 R >200 Folhas MeOH S 100 S 12,5 S 100 Galhos DCM S 25 S 50 R >200 Galhos MeOH S 100 S 100 S 100 Legenda: S=sensível R=resistente

Das 55 frações testadas, 33 foram ativas frente à cepa de M. tuberculosis H37Rv

com CIM entre 25 a 200 µg/mL, Frente a cepa INHr, 29 frações foram ativas, com CIM

entre 12,5 a 200 µg/mL, enquanto que para a cepa RMPr 27 frações apresentaram

atividade com CIM entre 25 a 200 µg/mL, conforme tabelas 76 a 80.

A fração 25-40.6.4 obtida do fracionamento do extrato DCM das folhas (1ª

coleta), corresponde a mistura do ácido oleanólico e ursólico (substâncias I e II) foi

ativa frente as três cepas, com a CIM de 100 µg/mL. A mistura do β-sitosterol e

estigmasterol (fração 17-21.1-5.1-4.14) não apresentou atividade frente as cepas

testadas, contrastando com os resultados obtidos por Saludes et al., (2002), o qual testou

estes esteroides isolados de Morinda citrifolia (Rubiaceae) frente ao M. tuberculosis,

obtendo como resultado uma CIM de 128 µg/mL para o sitosterol e 32 µg/mL para o

estigmasterol (Tabela 76).

A fração 13-18 obtida do fracionamento da fase AcOEt do extrato MeOH das

folhas (1ª coleta) apresentou a CIM de 50, 12,5 e 50 µg/mL para as cepas H37Rv, INHr

167

e RMPr, respectivamente (Tabela 77). A partir da desta fração foi isolada e identificada

a substância 4,4’-dihidroxi-3’-metoxi-chalcona (substância IV). Esta alta atividade

antimicobacteriana pode estar associada a presença de compostos fenólicos como

descrevem outros autores (SIVAKUMAR et al., 2007; TRIVEDI et al., 2008), estes

compostos estão relacionados na adaptação da planta à condições de estresse ambiental,

como defesa contra microrganismos e outros patógenos (FARAH e DONANGELO,

2006).

Os resultados obtidos neste estudo mostram que algumas frações testadas

apresentaram atividade reduzida em relação a seu extrato bruto e algumas vezes foram

inativas, enquanto outras apresentaram uma melhor atividade. Segundo Pauli e

colaboradores (2005), extratos vegetais podem apresentar substâncias ativas que sejam

antagonizadas ou potencializadas na presença de outras.

Este biomonitoramento demonstra a importância de um fracionamento

preliminar dos extratos para a detecção da atividade antimicobacteriana, uma vez que a

baixa concentração das substâncias ativas pode mascarar a detecção nos extratos brutos,

apresentando uma ação minimizada pela interação com outras moléculas presentes no

extrato.

Tabela 76: Determinação da CIM das frações do extrato DCM dos galhos da 1ª coleta.

EXTRATO/FRAÇÕES (μg/mL)

M,tuberculosis

H37Rv (µg/mL) INHr (µg/mL) RMPr (µg/mL)

Folhas DCM S 6,25 S 25 S ≤ 6,25 Folhas DCM FR1-4 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR1-4.17-20 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 5 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 6-12 S 50 S 100 S 100 Folhas DCM FR 6-12.30 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 6-12.33-35 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 6-12.38-63 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR14-16 S 100 S 50 S 100 Folhas DCM FR 17-21 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM 17-21.1-5.1-4.14 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 25-40 S 200 S 200 S 200 Folhas DCM FR 25-40.6 R >200 S 200 S 200 Folhas DCM FR 25-40.6.4 S 100 S 100 S 100 Folhas DCM FR 41-44 S 100 S 50 S 100 Folhas DCM FR 46-56 S 200 S 200 S 100

168

continuação da Tabela 76 Folhas DCM FR 46-56.5 S 200 S 200 S 200 Folhas DCM FR 46-56. 8-10 S 50 S 50 S 50 Folhas DCM FR 46-56.13-17 R >200 R >200 R >200 Folhas DCM FR 57.6-12 S 100 R >200 R >200 Folhas DCM FR 63-65 S 100 S 25 S 100 Folhas DCM FR 66-68 S 200 S 100 S 200 Folhas DCM FR 70-74 R >200 S 200 R >200 Folhas DCM FR 76-86 R >200 S 200 S 200 Folhas DCM FR 87-92 S 200 S 50 S 100 Folhas DCM FR 94-99 S 200 S 200 S 100

Legenda: S=sensível R=resistente

Tabela 77: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH das folhas da 1ª coleta


M. tuberculosis H37Rv

(µg/mL) INHr

(µg/mL) RMPr

(µg/mL) Folhas MeOH R >200 R >200 S 200 Folhas MeOH AcOEt R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH AcOEt 13-18 S 50 S 12,5 S 50 Folhas MeOH AcOEt 20-21 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH FASE AcOEt 27 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH FASE AcOEt 30 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH FAcOEt 34 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH FASE AcOEt 39 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH DCM S >200 S >200 S >200 Folhas MeOH DCM 110-187,12-19 R >200 R >200 R >200 Folhas MeOH BuOH R >200 R >200 R >200


Tabela 78: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH dos galhos da 1ª coleta.


M. tuberculosis H37Rv

(µg/mL) INHr

(µg/mL) RMPr

(µg/mL) Galhos MeOH R >200 R >200 R >200 Galhos MeOH AcOEt 17 R >200 R >200 R >200 Galhos MeOH AcOEt 21-23 R >200 R >200 R >200 Galhos MeOH DCM S 200 S 100 S 200


169

Tabela 79: Determinação da CIM das frações do extrato DCM dos galhos da 2ª coleta.


M.tuberculosis H37Rv

(µg/mL) INHr

(µg/mL) RMPr

(µg/mL) Galhos DCM S 100 S 50 S 100 Galhos DCM 1-4 R >200 R >200 R >200 Galhos DCM 18-27 S 200 S 50 S 200 Galhos DCM 28-36.17-18 S 100 S 50 S 100 Galhos DCM 28-36.27-29 S 25 S 50 S 50 Galhos DCM 42-45 S 50 S 25 S 50 Galhos DCM 46-54. 1-9 S 100 S 200 S 100 Galhos DCM 55-60 S 50 S 100 S 50 Galhos DCM 82-85 S 200 S 200 S 200 Galhos DCM 86-92 S 200 S 200 S 200


Tabela 80: Determinação da CIM das frações do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta,


M.tuberculosis H37Rv

(µg/mL) INHr

(µg/mL) RMPr

(µg/mL) Galhos MeOH S 200 S 50 S 50 Galhos MeOH FR 6 S 200 S 200 R >200 Galhos MeOH FR 7 R >200 R >200 R >200 Galhos MeOH AcOEt 14-22 S 200 S 200 R >200 Galhos MeOH AcOEt 23-28 R >200 R >200 R >200 Galhos MeOH DCM 06-07 S 25 S 50 S 25


Os alcaloides isolados dos extratos DCM e MeOH dos galhos (2ª coleta) de D.

macrophylla foram testados frente ao M. tuberculosis cepa pan-sensível H37Rv e para a

cepa resistente a isoniazida (INHr), que é o principal e mais potente antimicobacteriano

no tratamento da tuberculose (Figura 72). Devido a característica estrutural dos

alcaloides, estes não foram testados frente à cepa resistente a rifampicina (RMPr), que é

um complexo macrocíclico (Figura 73).

170

Figura 72: Estrutura molecular da Isoniazida (INH).

Figura 73: Estrutura molecular da Rifampicina (RMPr).

A comparação entre os resultados obtidos do extrato DCM dos galhos e dos

alcaloides isolados a partir deste extrato, mostra que apenas o alcaloide identificado

como 10-metoxi-ajmalicina (substância V) e a mistura dos alcaloides 9-metoxi-3-

isoajmalicina (substância VIII) com 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância IX)

apresentaram menor CIM frente a cepa INHr (25 μg/mL) que o extrato bruto (Tabela

80).

Os alcaloides 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI) e 10-metoxi-rauniticina

(substância XII), isolados do extrato MeOH dos galhos, mostraram resultados mais

satisfatórios frente a cepa INHr (CIM - 50 μg/mL) do que o obtido com com extrato

bruto (Tabela 80).

A determinação da CIM de um extrato pode ou não ser um indicador confiável

de sucesso em isolar um agente antimicobacteriano ativo. Pois, há possibilidade de

existir um extrato com alta atividade (CIM relativamente baixa) que contém substâncias

majoritárias com atividade moderada, enquanto outro extrato pode conter componentes

minoritários com alta atividade. Entretanto, o extrato quando purificado, pode ter

171

atividade reduzida, apresentar uma CIM maior, ou até mesmo ser inativo. Este fato,

pode ocorrer devido ao sinergismo dos componentes presentes nos extratos e frações

que é a ação combinada de duas ou mais substâncias resultando em um efeito biológico

superior ao efeito individual destas mesmas substâncias.

Tabela 81: Determinação da CIM das substâncias isoladas de D. macrophylla.

EXTRATOS/SUBSTÂNCIAS (μg/mL)

M. tuberculosis (μg/mL)

H37Rv INHr

Alcaloides isolados do extrato DCM dos galhos Extrato DCM de galhos 25 50 10-metoxi-ajmalicina (substância V) 50 25 11-metoxi-ajmalicina (substância VI) 100 50 11-metoxi-3-isoajmalicina (substância VII) 100 50 Mistura da 9-metoxi-3-isoajmalicina (substância VIII) e 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância IX)

100 25

10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância X) 100 100 Alcaloides isolados do extrato MeOH dos galhos Extrato MeOH de galhos 100 100 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI) 100 50 10-metoxi-rauniticina (substância XII) 100 50

5.4.5. Atividade citotóxica in vitro

O potencial citotóxico dos extratos e alcaloides foi avaliado em linhagens de células

neoplásicas: HCT116 (carcinoma colorretal humano), MCF-7 (carcinoma de mama),

SK-Mel-19 (melanoma humano) e uma linhagem não neoplásica: MRC-5 (fibroblasto

de pulmão humano). Tanto os extratos quanto as substâncias apresentaram baixa

atividade antitumoral, apenas o alcaloide 11-metoxi-3-isoajmalicina (substância VII)

apresentou resultados mais promissores como agente citotóxico sobre as linhagens de

células MRC-5 e SK-Mel 19 quando comparado com os resultados obtidos dos extratos

brutos (Tabela 82). Ao comparar a toxicidade dos alcaloides testados com a toxicidade

da Doxorrubicina (controle positivo), pode-se afirmar que estes não apresentaram

atividade antitumoral significativa. A baixa toxicidade dos alcaloides sobre a linhagem

de células não neoplásica (MRC-5-fibroblasto de pulmão humano) demonstra que estes

não são citotóxicos para as células normais, sugerindo um resultado promissor para

serem avaliados em outras atividades biológicas.

172

A correlação da atividade sobre o microcrustáceo A. salina e a atividade

antitumoral foi confirmada pelos resultados obtidos dos extratos testados, os quais

apresentaram baixa atividade inibitória do crescimento das linhagens de células

tumorais.

Muitos alcaloides são reconhecidos por sua toxicidade, alguns possuem

aplicação clínica no tratamento de tumores como o topotecano (camptotecina),

vimblastina e vincristina, outros como a como a elipticina e olivacina, possuem

atividade antitumoral, porém devido à alta toxicidade estas substâncias não são

utilizadas na terapêutica (SCHRIPSEMA et al., 2004).

Segundo Shoemaker (2006) uma triagem realizada pelo National Cancer

Institute (NCI) em busca de drogas antitumorais, relatou uma coleção de mais de 75.000

extratos vegetais, cujo mais promissores foram selecionados para testes in vivo. Porém,

outros estudos são necessários para estabelecer a utilidade destes extratos na terapia,

devido à variação de conteúdo de seus componentes ativos. Dessa maneira, o princípio

ativo deve vir na sua forma purificada, o qual possibilita a sua dosagem precisa. Uma

boa correlação é com os 34 alcaloides registrados no Dicionário de Especialidades

Farmacêuticas, os quais são comercializados no Brasil, puros, em associações, em

forma de derivados e outros são utilizados como matéria-prima para a síntese de

fármacos.

Embora os alcaloides constituam um dos grupos de metabólitos secundários com

grande potencial terapêutico, no presente estudo os alcaloides testados apresentaram

baixa atividade inibitória no crescimento das linhagens de células tumorais. Porém,

mesmo as substâncias que revelam baixa citotoxicidade podem subsidiar estudos de

modificação estrutural e/ou protótipos de fármacos. Para esclarecer melhor efeitos

benéficos deste grupo de substâncias no tratamento do câncer, é necessário estabelecer a

correlação entre um ou mais bioensaios, bem como as particularidades de cada sistema

biológico testado, interações e características moleculares. Desta forma, a atividade

antitumoral e o bioensaio com A. salina funcionam como uma pré-avaliação de extratos

e substâncias com potencial farmacológico sendo um forte indicativo para serem

avaliados por outros bieonsaios específicos tanto in vitro como in vivo.

173

Tabela 82: Determinação da viabilidade celular das substâncias isoladas de D. macrophylla em linhagens de células tumorais.

EXTRATOS/SUBSTÂNCIAS

VIABILIDADE CELULAR (%) LINHAGENS DE CÉLULAS

HCT116 MCF-7 MRC-5 SK-MEL-19 Doxorrubicina (controle positivo) 10,45 21,42 10,19 16,66 DMSO (controle negativo) 100 100 100 100 Alcaloides isolados do extrato DCM dos galhos Extrato DCM de galhos 79,50 72,96 85,38 93,04 10-metoxi-ajmalicina (substância V) 85,10 78,62 92,36 100 11-metoxi-ajmalicina (substância VI) 81,49 76,18 86,04 100 11-metoxi-3-isoajmalicina (substância VII) 85,75 89,02 80,16 85,08 Mistura da 9-metoxi-3-isoajmalicina (substância VIII) e 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância IX)

83,67 87,07 92,55 92,25

10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância X) 87,78 84,06 93,21 96,55 Alcaloides isolados do extrato MeOH dos galhos Extrato MeOH de galhos 76,02 69,89 86,80 91,69 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI) 91,16 86,36 95,33 100 10-metoxi-rauniticina (substância XII) 86,64 91,09 100 100

174

5. CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico dos extratos diclorometânico e metanólicos de folhas e galhos

da 1ª coleta de D. macrophylla possibilitou isolar e identificar quatro substâncias, sendo

dois triterpenos, uma chalcona e um ácido fenólico.

Os extratos diclorometânico e metanólicos dos galhos da 2ª coleta mostraram-se ser

uma fonte promissora de alcaloides, dos quais foram identificados oito alcaloides

indólicos monoterpênicos.

Todas as substâncias isoladas neste estudo estão sendo descritas pela primeira vez no

gênero Duroia.

Os extratos metanólicos de folhas e galhos de ambas as coletas apresentaram intensa

capacidade antioxidante.

O extrato metanólico das folhas da 2ª coleta apresentou toxicidade frente ao

microcrustáceo Artemia salina na concentração letal (CL50) de 120 μg/mL.

A atividade bacteriostática foi observada nos extratos MeOH das folhas e dos galhos

(1ª coleta) e DCM dos galhos (ambas as coletas) sobre Klebsiella pneumoniae e

Flavobacterium corumnare; e no extrato MeOH dos galhos (2ª coleta) sobre Salmonella

enteridis e no extrato MeOH folhas (2ª coleta) sobre Pseudomonas aeroginosa.

Das substâncias testadas apenos o ácido oleanólico apresentou atividade

antibacteriana frente à Nocardia brasiliensis e Serratia marcescens, com uma CIM de

500 μg/mL.

Os extratos testados frente ao M. tuberculosis apresentaram resultados bastante

promissores, com destaque para o extrato DCM das folhas da 1ª coleta, com uma CMI

de 6,25 µg/mL para a cepa INHr, de 25 µg/mL para a cepa RMPr e ≤ 6,25 µg/mL para a

cepa H37Rv e o extrato MeOH das folhas da 2ª coleta com CMI de 12,5 µg/mL contra a

cepa INHr.

Das 54 frações testadas, 33 foram ativas frente à cepa de M. tuberculosis H37Rv com

CMI entre 25 a 200 µg/mL. Frente a cepa INHr, 29 frações foram ativas, com CMI

entre 12,5 a 200 µg/mL, enquanto que para a cepa RMPr 27 frações apresentaram

atividade com CMI entre 25 a 200 µg/mL.

Os alcaloides 10-metoxi-ajmalicina, 10-metoxi-3-isorauniticina e a mistura de 9-

metoxi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina apresentaram uma CIM

de 25 μg/mL frente ao M. tuberculosis cepa INHr e o alcaloide 10-metoxi-rauniticina a

CIM foi de 50 μg/mL.

175

Os extratos e os alcaloides apresentaram baixo potencial citotóxico sobre as células

neoplásicas (carcinoma colorretal humano, carcinoma de mama e melanoma humano) e

não neoplásica (fibroblasto de pulmão humano).

Este trabalho descreveu o primeiro estudo químico e de atividade biológica realizado

com a espécie D. macrophylla, contribuindo para o conhecimento químico e biológico

do gênero Duroia.

176

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDULLAH, M. A.; ALI, A. M.; MARZIAH, M.; LAJIS, N. H.; ARIFF, A. B. Establishment of cell suspension cultures of Morinda elliptica for the production of anthraquinones. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 54(3):173-182, 1998.

ACHENBACH, H.; LOTTES, M.; WAIBEL, R.; KARIKAS, G. A.; CORREA, M. D.; GUPTA, M. P. Alkaloids and other compounds from Psychotria correae. Phytochemistry, 38(6):1537-1545, 1995.

ADIBATTI, N. A.; THIRUGNANASAMBANTHAM, P.; KULOTHUNGAN, C.; VISWANATHAN, S.; AMESWARAN, L.; BALAKRISHNA, K.; SUKUMAR, E. A pyridine alkaloid from Ceropegia juncea. Phytochemistry, 30(7):2449–2450, 1991.

AGOMUOH, A. A.; ATHAR, A.; UDENIGWE, C. C.; ALUKO, R. E.; IRENUS, I. Novel Indole Alkaloids from Nauclea latifolia and their Renin‐Inhibitory Activities. Chemistry & Biodiversity, 10(3):401-410, 2013.

AGRAWAL, P. K.; BANSAL, M. C. The Carbon-13 NMR of Flavonoids, Amsterdam: Elsevier, 1989, 564p.

AGUIAR, R. M.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Unusual naphthoquinones, catechin and triterpene from Byrsonima microphylla. Phytochemistry, 66(19):2388-2392, 2005.

AGUSTA, A. Steroids from stem bark of Anthocepalus cadamba Miq. (Rubiaceae). Majalah Farmasi Indonesia, 9( 1):24-34, 1998.

AHMAD, V. U. Handbook of natural products data. Volume 2: pentacyclic triterpenoids, New York: Elsevier Science, 1994, 1556p.

AHMAD, R.; SHAARI, K.; LAJIS, N. H.; HAMZAH, A. S.; ISMAIL, N. H.; KITAJIMA, M. Anthraquinones from Hedyotis capitellata. Phytochemistry, 66(10):1141-1147, 2005.

AHMED, B.; AL-HOWIRINY, T. A.; MOSSA, J. S. Crotalic and emarginellic acids: Two triterpenes from Crotalaria emarginella and anti-inflammatory and anti-hepatotoxic activity of crotalic acid. Phytochemistry, 67(10):956-964, 2006.

AKIHISA, T.; WATANABE, K.; YAMAMOTO, A.; ZHANG, J.; MATSUMOTO, M.; FUKATSU, M. Monoterpene glycosides from Gardeniae fructus. Chemistry & Biodiversity, 9(8):1490-1499, 2012.

ALVES, H. D. M. A diversidade química das plantas como fonte de fitofármacos. Cadernos Temáticos de Química Nova na Escola, 3:10-15, 2001.

177

ANAM, E. M. Novel Nauclequiniine from the Root Extract of Nauclea pobequinii (Pob, & Pellegr, ) Petit (Rubiaceae). Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry, 36b(1):54-56, 1997.

ANDREASEN, K.; BREMER, B. Phylogeny of the subfamily Ixoroideae (Rubiaceae). Opera Botanica Belgica, 7:119–138, 1996.

ANDRIOLLI, A. C.; SANTOS, D. S.; TEIXEIRA, S. C. G.; TEIXEIRA, L. R.; BERALDO, H.; ZIOLLI, R. L. Avaliação do potencial citotóxico de 2-piridiniformamida tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe (III) utilizando Artemia salina. Revista Saúde e Ambiente, 8(2):19-23, 2009.

ANERO, R.; DÍAZ-LANZA, A.; OLLIVIER, E.; BAGHDIKIAN, B.; BALANSARD, G.; BERNABÉ, M. Monoterpene glycosides isolated from Fadogia agrestis. Phytochemistry, 69(3):805-811, 2008.

AQUINO, R.; DE SIMONE, F.; PIZZA, C.; CERRI, R.; DE MELLO, J. F. Quinovic acid glycosides from Guettarda platypoda. Phytochemistry, 27(9):2927-2930, 1988.

AQUINO, R.; GAROFALO, L.; TOMMASI, N.; UGAZ, O. L.; PIZZA, C. Glucoindole alkaloids from bark of two Sickingia species. Phytochemistry, 37(5):1471-1475, 1994.

AQUINO, R.; DE TOMMASI, N.; DE SIMONA, F.; PIZZA, C. Triterpenes and Quinovic Acid Glycosides from Uncaria tomentosa. Phytochemistry, 45(5):1035-1040, 1997

AQUINO, R.; DE TOMMASI, N.; TAPIA, M.; LAURO, M. R.; RASTRELLI, L. New 3-methyoxyflavones, an iridoid lactone and a flavonol from Duroia hirsuta. Journal of natural products, 62(4):560-562, 1999.

ARBAIN, D.; LAJIS, N. H.; PUTRA, D. P.; SARGENT, M. V.; SKELTON, B. W.; WHITE, A. H. ChemInform Abstract: A New Quaternary Corynanthe Alkaloid from Lerchea bracteata. ChemInform, 24(12):no-no, 1993.

ARBAIN, D.; BYRNE, L. T.; EVRAYOZA, N.; SARGENT, M. V. Bracteatine, a quaternary glucoalkaloid from Ophiorrhiza bracteata. Australian Journal of Chemistry, 50(11):1111-1112, 1997a.

ARBAIN, D.; BYRNE, L. T.; SARGENT, M. Isomalindine-16-carboxylate, a zwitterionic alkaloid from Ophiorrhiza cf, communis. Australian Journal of Chemistry, 50(11):1109-1110, 1997b.

ARBAIN, D.; DACHRIYANUS, F.; SARGENT, M. V.; SKELTON, B. W.; WHITE, A. H. Unusual indole alkaloids from Ophiorrhiza blumeana Korth. Journal of the Chemical Society, Perkin, 1(16):2537-2540, 1998a.

178

ARBAIN, D.; IBRAHIM, S.; SARGENT, M. V.; SKELTON, B. W.; WHITE, A. H. The alkaloids of Uncaria cf, glabrata. Australian Journal of Chemistry, 51(11):961-964, 1998b.

ARBAIN, D.; PUTRA, D. P.; SARGENT, M. V.; SUSILA, R.; WAHYUNI, F. S. Indole alkaloids from two species of Ophiorrhiza. Australian Journal of Chemistry, 53(3):221-224, 2000.

ARGÁEZ, R. B.; MEDINA, L. B.; PAT, F. M.; RODRIGUES, L. M. P. Merilactone, an Unusual C19 Metabolite From the Root Extract of Chiocacca alba. Journal of Natural Products, 64:228-231, 2001.

ASHIHARA, H.; SANO, H.; CROZIER, A. Caffeine and related purine alkaloids: biosynthesis, catabolism, function and genetic engineering. Phytochemistry, 69(4):841-856, 2008.

BAILLEUL, F.; DELAVEAU, P.; KOCH, M. Apodantheroside, an iridoid glucoside from Feretia apodanthera. Phytochemistry, 19(12):2763-2764, 1980.

BALDE, A.; PIETERS, L.; GERGELY, A.; KOLODZIEJ, H.; CLAEYS, M.; VLIETINCK, A. A-type proanthocyanidins from stem-bark of Pavetta owariensis. Phytochemistry, 30(1):337-342, 1991.

BANTHORPE, D. V.; WHITE, J. J, Novel anthraquinones from undifferentiated cell cultures of Galium verum. Phytochemistry, 38(1):107-111, 1995.

BARBOSA, M. B. A. Ações de enfermagem para o controle do câncer: uma proposta de integração ensino-serviço. Ministério da Saúde/Instituto Nacional do Câncer. Rio de Janeiro: INCA, 3ª ed., 488pp., 2008.

BARREIRO, E. J. Produtos naturais bioativos de origem vegetal eo desenvolvimento de fármacos. Química Nova, 13(1):29-39, 1990.

BARROSO, G. M.; PEIXOTO, A. L.; ICHASO, C. L. F.; COSTA, C. G.; GUIMARÃES, E. F.; LIMA, H. C. Sistemática de angiospermas do Brasil. Viçosa: UFV-Imprensa Universitária, 1991.

BASSETTI, L.; HAGENDOORN, M.; TRAMPER, J. Surfactant-induced non-lethal release of anthraquinones from suspension cultures of Morinda citrifolia. Journal of Biotechnology, 39(2):149-155, 1995.

BASTOS, A. B. F. D. O.; CARVALHO, M. G.; VELANDIA, J. R.; BRAZ-FILHO, R. Chemical constituents from Simira glaziovii (K, schum) steyerm, and ¹H and 13C NMR assignments of ophiorine and its derivatives. Química Nova, 25(2):241-245, 2002.

BAZE, A.; CORDEIRO, A. C.; BUENO, C. R.; PALÁCIO, C. A. S.; FERREIRA, C. A. C.; CRUZ, F. Reserva Ambiental da Cachoeira da Onça. Manaus: Fundação Rede Amazônica / Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 2003.

179

BEGUM, B.; HASAN, C. M.; RASHID, M. A. Caffeine from the Mature Leaves of Coffea bengalensis. Biochemical Systematics and Ecology, 31(10):1219-1220, 2003.

BERGER, A.; FASSHUBER, H.; SCHINNERL, J.; ROBIEN, W.; BRECKER, L.; VALANT-VETSCHERA, K. Iridoids as chemical markers of false ipecac (Ronabea emetica), a previously confused medicinal plant. Journal of ethnopharmacology, 138(3):756-761, 2011.

BERGER, A.; FASSHUBER, H.; SCHINNERL, J.; BRECKER, L.; GREGER, H. Various types of tryptamine-iridoid alkaloids from Palicourea acuminata (=Psychotria acuminata, Rubiaceae). Phytochemistry Letters, 5(3):558-562, 2012.

BERNHARD, M.; FASSHUBER, H.; ROBIEN, W.; BRECKER, L.; GREGER, H. Dopamine-iridoid alkaloids in Carapichea affinis (¼Psychotria borucana) confirm close relationship to the vomiting root Ipecac. Biochemical Systematics and Ecology, 39:232-235, 2011.

BETHLEM, N.; SOUZA, G. R. M.; BETHLEM, E. P.; SILVA, W. A. E. SIDA/AIDS e tuberculose no Brasil; AIDS and tuberculosis in Brazil. Arquivo Brasileiro de Medicina, 64(1):28-32, 1990.

BHATTACHARYYA, J.; CUNHA, E. V. L. A triterpenoid from the root-bark of Chiococca alba. Phytochemistry, 31(7):2546-2547, 1992.

BLACKLEDGE, R. D.; TAYLOR, C. M. Psychotria Viridis-A Botanical Source of Dimethyltryptamine (DMT). Microgram Journal, 1(1-2):18-22, 2003.

BOLZANI, D. S.; IZUMISAWA, C. M.; YOUNG, M. C. M.; TREVISAN, L.; KINGSTON, D. G. I.; GUNATILAKA, A. L. Iridoids from Tocoyena formosa. Phytochemistry, 46(2):305-308, 1997.

BOLZANI, V. D. S.; YOUNG, M. C. M.; FURLAN, M.; CAVALHEIRO, A. J.; ARAÚJO, A. R.; SILVA, D. H. S.; LOPED, M. N. Secondary metabolites from Brazilian Rubiaceae plant species: Chemotaxonomical and biological significance. In: Recent Research Development in Phytochemistry, 5:10-31, 2001.

BORGES, R. M.; VALENCA, S. S.; LOPES, A. A.; BARBI, N. S.; SILVA, A. J. R. Saponins from the roots of Chiococca alba and their in vitro anti-inflammatory activity. Phytochemistry Letters, 6(1):96-100, 2013

BRAND, G.; HENRIQUES, A. T.; PASSOS, C. S.; BALDOQUI, D. C.; SANTIN, SILVANA M. O.; COSTA, W. F.; SARRAGIOTTO, M. H. Pyrrolidinoindoline alkaloids from Margaritopsis cymuligera (Muell. Arg.) C.M. Taylor (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 45:155-157, 2012.

BREMER, B. Combined and separate analyses of morphological and molecular data in the plant family Rubiaceae. Cladistics, 12(1):21-40, 1996.

180

BREMER, B. A Review of Molecular Phylogenetic Studies of Rubiaceae. Annals of the Missouri Botanical Garden, 96(1):4-26, 2009.

BRINGMANN, G.; OCHSE, M.; WOLF, K.; KRAUS, J.; PETERS, K.; PETERS, E. M.; HERDERICH, M.; AKÉ ASSI, L.; TAYMAN, F. S. K. 4-Oxonicotinamide-1-(1'-[beta]--ribofuranoside) from Rothmannia longiflora Salisb, (Rubiaceae). Phytochemistry, 51(2):271-276, 1999.

BRINGMANN, G.; HAMM, A.; KRAUS, J.; OCHSE, M.; NOURELDEEN, A.; JUMBAM, D. N. Gardenamide A from Rothmannia urcelliformis (Rubiaceae)− Isolation, Absolute Stereostructure, and Biomimetic Synthesis from Genipine. European Journal of Organic Chemistry, 2001(10):1983-1987, 2001.

BROINIZI, P. R. B.; ANDRADE-WARTHA, E. R. S.; SILVA, A. M. O.; NOVOA, A. J. V.; TORRES, R. P.; AZEREDO, H. M. C.; ALVES, R.E.; MANCINI-FILHO, J. Avaliação da atividade antioxidante dos compostos fenólicos naturalmente presentes em subprodutos do pseudofruto de caju (Anacardium occidentale L.). Ciência e Tecnologia Alimentar, 27(4):902-908, 2007.

BRUIX, M.; RUMBERO, A.; VÁZQUEZ, P. Apodihydrocinchonamine, an indole alkaloid from Isertia haenkeana. Phytochemistry, 33(5):1257-1261, 1993.

BRUNETON, J.; BARTON, D. H. R. Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia, Acribia, 1991.

BRUYN, A.; ZHANG, W.; BUDESINSKY, M. NMR study of three heteroyohimbine derivatives from Rauwolfia serpentina stereochemical aspects of the two isomers of reserpiline hydrochloride. Magnetic Resonance in Chemistry, 27:935-940, 1989.

BUCHBAUER, G.; JIROVETZ, L.; NIKIFOROV, A.; KAUL, V.K.; WINKER, N. Volatiles of the absolute of Gardenia jasminoides Ellis (Rubiaceae). Journal of Essential Oil Research, 8(3):241-245, 1996.

BUKURU, J.; NGUYEN VAN, T.; VAN PUYVELDE, L.; HE, W.; DE KIMPE, N. New pentacyclic cyclol-type naphthohydroquinone from the roots of Pentas bussei. Tetrahedron, 59(31):5905-5908, 2003.

CAI, Y. F.; HUANG, Q. S. Determination of oleanolic acid and ursolic acid in Damnacanthus indicus from different places by RP-hPLC]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 35(5):694-696, 2012.

CALDWELL, C. G.; FRANZBLAU, S. G.; SUAREZ, E.; TIMMERMANN, B. N. Oleanane triterpenes from Junellia tridens. Journal of Natural Products, 63(12):1611-1614, 2000.

CALIXTO, J. B. Estudo farmacológico pré-clínico de plantas medicinais. In: CALIXTO, J. B.; YUNES, R. A. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, p.77-99, 2001.

181

CALIXTO, J. B.; YUNES, R. A. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna, Florianópolis, SC: Argos 2001.

CALLAWAY, J. C.; RAYMON, L. P.; HEARN, W. L.; MCKENNA, D. J.; GROB, C. S.; BRITO, G. S.; MASH, D. C. Quantitation of N. N-dimethyltryptamine and harmala alkaloids in human plasma after oral dosing with ayahuasca. Journal of Analytical Toxicology, 20(6):492-497, 1996.

CAMPOS, M. T. V.; BRITO, J. M. Rubiaceae. In: RIBEIRO, J. E. L. S.;HOPKINS, M. J. G, , et al (Ed, ), Flora da Reserva Ducke: guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central, Manaus, AM: Inpa, p.626-633, 1999.

CANTRELL, C. L.; FRANZBLAU, S. G.; FISCHER, N. H. Antimycobacterial plant terpenoids. Planta Médica, 67(8):685-694, 2001.

CARBONEZI, C. A.; MARTINS, D.; YOUNG, M. C. M.; LOPES, M. N.; FURLAN, M.; BOLZANI, V. S. Iridoid and seco-iridoid glucosides from Chiococca alba (Rubiaceae), Phytochemistry, 51:781-785, 1999.

CARBONEZI, C. A.; HAMERSKI, L.; FLAUSINO JR, O. A.; FURLAN, M.; BOLZANI, V. S.; YOUNG, M. C. M. Determinação por RMN das configurações relativas e conformações de alcaloides oxindólicos isolados de Uncaria guianensis. Química Nova, 27(6):878-881, 2004.

CAVALCANTE, P. B. Frutas comestíveis da Amazônia. 6ª Ed., Belem, PA: Museu Paraense Emilio Goeldi, 1996.

CAVALCANTE, M. F.; OLIVEIRA, M. C. C.; VELANDIA, J. R.; ECHEVARRIA, A. Síntese de 1, 3, 5-triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente a Artemia salina Leach. Química Nova, 23(1):20-22, 2000.

CHAN, H. H.; LI, C. Y.; DAMU, A. G.; WU, T. S. Anthraquinones from Ophiorrhiza hayatana OHWI. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 53(10):1232-1235, 2005.

CHANDRA, U.; Ghosh, R.; Chowdhury, S.; Dinda, B. New iridoid from aerial parts of Mussaenda roxburghii. Natural Product Communications, 7(1):1, 2012.

CHANG, P.; CHEN, C. Isolation and Characterization of Antitumor Anthraquinones from Morinda umbellata. Chinese Pharmaceutical Journal, 47(4):347-53, 1995.

CHENG, Z. H.; YU, B. Y.; YANG, X. W. 27-Nor-triterpenoid glycosides from Mitragyna inermis. Phytochemistry, 61(4):379-382, 2002.

CHEN, Q. C.; ZHANG, W. Y.; YOUN, U. J.; KIM, H. J.; LEE, I. S.; JUNG, H. J.; NA, M. K.; MIN, B. S.; BAE, K. H. Iridoid glycosides from Gardeniae Fructus for treatment of ankle sprain. Phytochemistry, 70(6):779-784, 2009.

182

CHIANG, L.; ABDULLAH, M. A. Enhanced anthraquinones production from adsorbent-treated Morinda elliptica cell suspension cultures in production medium strategy. Process Biochemistry, 42(5):757-763, 2007.

CHIQUIERI, A.; DI MAIO, F. R.; PEIXOTO, A. L. A distribuição geográfica da família Rubiaceae Juss, na Flora Brasiliensis de Martius. Rodriguésia, 55(84):47-57, 2004.

CIMANGA, K.; DE BRUYNE, T.; LASURE, A.; LI, Q.; PIETERS, L.; CLAEYS, M.; BERGHE, D. V.; KAMBU, K.; TONA, L.; VLIETINCK, A. Flavonoid O-glycosides from the leaves of Morinda morindoides. Phytochemistry, 38(5):1301-1303, 1995.

CIMANGA, R. K.; KAMBU, K.; TONA, L.; HERMANS, N.; APERS, S.; TOTTÉ, J.; PIETERS, L.; VLIETINCK, A. J. Cytotoxicity and in vitro susceptibility of Entamoeba histolyticato Morinda morindoides leaf extracts and its isolated constituents. Journal of Ethnopharmacology, 107(1):83-90, 2006.

CIMANGA, R. K.; MUKENYI, P. N. K.; KAMBU, O. K.; TONA, G. L.; APERS, S.; TOTTÉ, J.; PIETERS, L.; VLIETINCK, A. J. The spasmolytic activity of extracts and some isolated compounds from the leaves of Morinda morindoides (Baker) Milne-Redh, (Rubiaceae). Journal of Ethnopharmacology, 127(2):215-220, 2010.

CLARDY, J.; WALSH, C. 2004. Lessons from natural molecules. Nature, 432:829-837, 2004.

CLSI, W. P. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard, Pennsylvania 19087-1898 USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003,

CONFORTI, F.; STATTI, G. A.; TUNDIS, R.; MENICHINI, F.; HOUGHTON, P. Antioxidant activity of methanolic extract of Hypericum triquetrifolium Turra aerial part. Fitoterapia, 73(6):479-483, 2002.

COPP, B. R. Antimycobacterial natural products. Natural Product Reports, 20(6):535-557, 2003.

CORDELL, G. A.; QUINN-BEATTIE, M. L.; FARNSWORTH, N. R. The potential of alkaloids in drug discovery. Phytotherapy Research, 15(3):183-205, 2001.

CORTINAS, M. N.; FERNÁNDEZ, M.; VALETA, M. I.; URIARTE, M. R.; MOGDASY, M. C. Caracterización genotípica de 80 cepas del género Mycobacterium en Uruguay. Revista Médica del Uruguay, 18(3):230-238, 2002.

COSTA, A. B. Caracterização de bactérias do complexo Aeromonas isoladas de peixes de água doce e sua atividade patogênica, Universidade de São Paulo. Piracicaba, SP, 2003.

183

COSTA-LOTUFO, L. V., CUNHA, G. M. A. FARIAS, P. A. M., VIANA, G. S. B.CUNHA, K. M. A., PESSOA, C., MORAES, M. O., SILVEIRA, E. R., GRAMOSA, N. V., RAO, V. S. N. The Cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated from Copaifera langsdorffi oleo-resin. Toxicon, 40: 1231-1234, 2002.

COUTINHO, H. D. M.; COSTA, J. G. M.; SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P.; LIMA, E. O. In vitro anti-staphylococcal activity of Hyptis martiusii Benth against methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA strains. Revista Brasileira de Farmacognosia, 18:670-675, 2008.

CUENDET, M.; HOSTETTMANN, K.; POTTERAT, O.; DYATMIKO, W. Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei, Helvetica Chimica Acta, 80(4):1144-1152, 1997.

DA CUNHA, A. P.; DA GRAÇA, J. A. B. Farmacognosia e fitoquímica.Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005.

DAI, Y.; HARINANTENAINA, L.; BRODIE, P. J.; BIRKINSHAW, C.; RANDRIANAIVO, R.; APPLEQUIST, W.; RATSIMBASON, M.; RASAMISON, V. E.; SHEN, Y.; DYKE, K. T.; KINGSTON, D. G. Two Antiproliferative Triterpene Saponins from Nematostylis anthophylla from the Highlands of Central Madagascar. Chemistry & Biodiversity, 10(2):233-240, 2013.

DAL PIAZ, F.; MALAFRONTE, N.; ROMANO, A.; GALLOTTA, D.; BELISARIO, M. A.; BIFULCO, G.; GUALTIERI, M. J.; SANOGO, R.; TOMMASI, N.; PISANO, C. Structural characterization of tetranortriterpenes from Pseudrocedrela kotschyi and Trichilia emetica and study of their activity towards the chaperone Hsp90. Phytochemistry, 75:78-89, 2012.

DALLAVALLE, S.; JAYASINGHE, L.; KUMARIHAMY, B. M. M.; MERLINI, L.; MUSSO, L.; SCAGLIONI, L. A new 3, 4-seco-lupane derivative from Lasianthus gardneri. Journal of Natural Products, 67(5):911-913, 2004.

DAMTOFT, S.; ROSENDAL, S.; NIELSEN, B. J. 13C and 1H NMR spectroscopy as a tool in the configurational analysis of iridoid glucosides. Phytochemistry, 20(12):2717-2732, 1981.

DE-MORAES-MOREAU, R. L.; HARAGUCHI, M.; MORITA, H.; PALERMO-NETO, J. Chemical and biological demonstration of the presence of monofluoroacetate in the leaves of Palicourea marcgravii St, Hil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 28(6):685-692, 1995.

DEULOFEU, V. Chemical compounds isolated from Banisteriopsis and related species. Ethnopharmacological Search for Psychoactive Drugs, US Public Health Service Publication. 18, 1967.

DI STASI, L. C.; HIRUMA-LIMA, C. A. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. 1ª, Editora Unesp, 2003.

184

DINDA, B.; DEBNATH, S.; MAJUMDER. S.; ARIMA, S.; SATO, N.; HARIGAYA, Y. Chemical constituents of Mussaenda incana. Indian Journal of Chemistry, 44b(11):2362-2366, 2005.

DINDA, B.; DEBNATH, S.; BANIK, R.; SATO, N.; HARIGAYA, Y. Iridoid glucosides from Wendlandia tinctoria roots. Natural Product Communications, 6(6):747, 2011a.

DINDA, B.; DEBNATH, S.; MAJUMDER. S.; SATO, N.; HARIGAYA, Y. New iridoid glucoside from Wendlandia tinctoria roots. Chinese Chemical Letters, 22(10):1233-1236, 2011b.

DIYABALANAGE, T. K. K.; KUMARIHAMY, B. M. M.; WANNIGAMA, G. P.; JAYASINGHE, L.; MERLINI, L.; SCAGLIONI, L. Alkaloids of Uncaria elliptica. Phytochemistry, 45(8):1731-1732, 1997.

DJOUDI, R.; BERTRAND, C.; FIASSON, K.; FIASSON, J. L.; COMTE, G.; FENET, B.; ANTOINE RABESA, Z. Polyphenolics and iridoid glycosides from Tarenna madagascariensis. Biochemical Systematics and Ecology, 35:314-316, 2007.

DONALD, P.; LAMPRECHT, J.; FREESTONE, M.; ALBRECHT, C.; BOUIC, P.; KOTZE, D.; VAN JAARSVELD, P. A randomised placebo-controlled trial of the efficacy of beta-sitosterol and its glucoside as adjuvants in the treatment of Pulmonary tuberculosis. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 1(6):518-522, 1997.

DONFACK, E. V.; LENTA, B. N.; KONGUE, M. D.; FONGANG, Y. F.; NGOUELA, S.; TSAMO, E.; DITTRICH, B.; LAATSCH, H. Naucleactonin D. an Indole Alkaloid and other Chemical Constituents from Roots and Fruits of Mitragyna inermis. Zeitschrift fur Naturforschung, B67(11):1159, 2012.

DREWES, S. E.; HORN, M. M.; CONNOLLY, J. D.; BREDENKAMP, B. Enolic iridolactone and other iridoids from Alberta magna. Phytochemistry, 47(6):991-996, 1998.

DREWES, S. E.; HORN, M. M.; MUNRO, O. Q.; RAMESAR, N.; OCHSE, M.; BRINGMANN, G.; PETERS, K.; PETERS, E. M. Stereostructure, conformation and reactivity of P-and a-gardiol from Burchellia bubalina. Phytochemistry, 50(3):387-394, 1999.

EKPENDU, T. O. E.; ADESOMOJU, A. A.; EKUNDAYO, O.; OKOGUN, J. I.; LAAKSO, I. Constituents of the volatile oil of Mitracarpus scaber Zucc. Flavour and fragrance journal, 8(5):269-271, 1993.

EKPENDU, T. O. E.; ADESOMOJU, A. A.; OKOGUN, J. I. Chemical Studies of Mitracarpusvillosus (Sw, ) Dc - A Medicinal Rubiaceous Weed. Journal of Chemical Society of Nigeria, 26(1):69-71, 2001,

EL ABBADI, N.; WENIGER, B.; LOBSTEIN, A.; QUIRION, J.; ANTON, R. New alkaloids of Chiococca alba. Phytochemistry, 31(7):603-604, 1989.

185

EL-EMARY, N. A.; BACKHEET, E. Y. Three hydroxymethylanthraquinone glycosides from Rubia tinctorum. Phytochemistry, 49(1):277-279, 1998;

EL-GAMAL, A. A.; TAKEYA, K.; ITOKAWA, H.; HALIM, A. F.; AMER, M. M.; SAAD, H. E. A.; AWAD, S. A. Anthraquinones from the polar fractions of Galium sinaicum. Phytochemistry, 42(4):1149-1155, 1996.

EL-HAFIZ, A.; WENIGER, B.; QUIRON, J. C.; ANTON, N. Ketoalcohols, Lignans and Coumarins From Chiococca alba. Phytochemistry, 30(6):2029-2031, 1991.

EL-LAKANY, A. M.; KADER. M. S. A.; SABRI, N. N, Anthraquinones with Antibacterial Activities from Crucianella maritima L. Growing in Egypt. Natural Product Sciences, 10(2):63-68, 2004.

ELOFF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Médica, 64:711-713, 1998a.

ENDALE, M.; ALAO, J. P.; AKALA, H. M.; RONO, N. K.; EYASE, F. L.; DERESE, S.; NDAKALA, A., MBUGUA, A.; WALSH, D. S.; SUNNERHAGEN, P.;YENESEW, A. Antiplasmodial Quinones from Pentas longiflora and Pentas lanceolata. Planta medica, 78(1):31-35, 2012a.

ENDALE, M.; EKBERG, A.; ALAO, J. P.; AKALA, H. M.; NDAKALA, A.; SUNNERHAGEN, P.; YENESEW, A. Anthraquinones of the Roots of Pentas micrantha. Molecules, 18(1):311-321, 2012b

ENDO, T.; TAGUCHI, H. The constituents of Gardenia jasminoides geniposide and genipin-gentiobioside. Chemical & pharmaceutical bulletin, 21(12):2684-2688, 1973.

ENRÍQUEZ, G. Amazônia–Rede de inovação de dermocosméticos Sub-rede de dermocosméticos na Amazônia a partir do uso sustentável de sua biodiversidade com enfoques para as cadeias produtivas da castanha-do-pará e dos óleos de andiroba e copaíba. Parcerias Estratégicas, 14:28, 2010.

FABRI, R. L.; GRAZUL, R. M.; CARVALHO, L. O. D.; COIMBRA, E. S.; CARDOSO, G. M.; SOUZA-FAGUNDES, E. M. D.; SILVA, A. D.; SCIO, E. Antitumor, antibiotic and antileishmanial properties of the Pyranonaphthoquinone Psychorubrin from Mitracarpus frigidus. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 84(4):1081-1090, 2012.

FAN, G. J., & HE, Z. S. Triterpenoid glycosides from Adina rubella. Phytochemistry, (44, 6):1139-1143, 1997.

FAN, J. T.; CHEN, Y. S.; XU, W. Y.; DU, L.; ZENG, G. Z.; ZHANG, Y. M.; SU, J.; LI, Y.; TAN, N. H. Rubiyunnanins A and B. two novel cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensis. Tetrahedron Letters, 51(52):6810-6813, 2010.

186

FARIAS, M. F. Psychotria myriantha Mull Arg, (Rubiaceae): caracterização dos alcalóides e avaliação das atividades antiquiotáxica e sobre o sistema nervoso central. Tese de doutorado: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre: Rio Grande do Sul, 191pp., 2006

FARIAS, F. M.; PASSOS, C. S.; ARBO, M. D.; ZUANAZZI, J. A. S.; STEFFEN, V. M.; HENRIQUES, A. T. Monoamine levels in rat striatum after acute intraperitoneal injection of strictosidinic acid isolated from Psychotria myriantha Mull, Arg, (Rubiaceae). Phytomedicine, 17(3):289-291, 2010.

FARIAS, F. M.; PASSOS, C. S.; ARBO, M. D.; BARROS, D. M.; GOTTFRIED, C.; STEFFEN, V. M.; HENRIQUES, A. T. Strictosidinic acid, isolated from Psychotria myriantha Mull. Arg.(Rubiaceae), decreases serotonin levels in rat hippocampus. Fitoterapia, 83(6):1138-1143, 2012.

FARID, H. A. R.; KUNERT, O.; HASLINGER, E.; SEGER, C. Isolation and Structure Elucidation of Iridoide and Coumarin Derivatives from Xeromphis nilotica (Rubiaceae). Monatshefte für Chemie/Chemical Monthly, 133(11):1453-1458, 2002.

FERNANDES, L. M.; GARCEZ, W. S.; MANTOVANI, M. S.; FIGUEIREDO, P. O.; FERNANDES, C. A.; GARCEZ, F. R.; GUTERRES, Z. R. Assessment of the in vitro and in vivo genotoxicity of extracts and indole monoterpene alkaloid from the roots of Galianthe thalictroides (Rubiaceae). Food and Chemical Toxicology, 59:405-411, 2013.

FERREIRA, J. C.; LEMOS, R. P. L.; CONSERVA, L. M. Chemical constituents from Spermacoce verticillata (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 44:208-211, 2012.

FOGUE, K. S.; WEMBE, N. A.; ANKE, B.; MARC, L.; MERLIN, K. G.; MICHAEL, S. Monoterpenes with antibacterial activities from a Cameroonian medicinal plant Canthium multiflorum (Rubiaceae). Fitoterapia, 91:199-204, 2013.

FRAGOSO, V.; NASCIMENTO, N. C.; MOURA, D. J.; RICHTER, M. F.; SAFFI, J.; FETT-NETO, A. G. Antioxidant and antimutagenic properties of the monoterpene indole alkaloid psychollatine and the crude foliar extract of Psychotria umbellata Vell. Toxicology in Vitro, 22(3):559-566, 2008.

FRANZBLAU, S. G.; WITZIG, R. S.; MCLAUGHLIN, J. C.; TORRES, P.; MADICO, G.; HERNANDEZ, A.; DEGNAN, M. T.; COOK, M. B.; QUENZER, V. K.; FERGUSON, R. M. Rapid, low-technology MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the microplate Alamar Blue assay. Journal of Clinical Microbiology, 36(2):362-366, 1998.

FREDERICKSON, M. E. Ant species confer different partner benefits on two neotropical Myrmecophytes. Oecologia, 143(3):387-395, 2005.

187

FREDERICKSON, M. E.; GREENE, M. J.; GORDON, D. M. Ecology:‘Devil's gardens’ bedevilled by ants. Nature, 437(7058):495-496, 2005.

FREEDLAND, C. S.; MANSBACH, R. S. Behavioral profile of constituents in ayahuasca, an Amazonian psychoactive plant mixture. Drug and alcohol dependence, 54(3):183-194, 1999.

GAO, G.; LU, Z.; TAO, S.; ZHANG, S.; WANG, F. Triterpenoid saponins with antifeedant activities from stem bark of Catunaregam spinosa (Rubiaceae) against Plutella xylostella (Plutellidae). Carbohydrate Research, 346(14):2200-2205, 2011.

GARCIA, R. M. A.; OLIVEIRA, L. O.; MOREIRA, M. A.; BARROS, W. S. Variation in emetine and cephaeline contents in roots of wild Ipecac (Psychotria ipecacuanha). Biochemical Systematics and Ecology, 33(3):233-243, 2005.

GARCÍA-PRADO, E.; GIMENEZ, G.; DE LA PUERTA VÁZQUEZ, R.; ESPARTERO SÁNCHEZ, J. L.; SÁENZ RODRÍGUEZ, M. T. Antiproliferative effects of mitraphylline, a pentacyclic oxindole alkaloid of Uncaria tomentosa on human glioma and neuroblastoma cell lines. Phytomedicine, 14(4):280-284, 2007.

GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, 30(2):374-381, 2007.

GOMES-CARNEIRO, M. R.; RIBEIRO-PINTO, L. F.; PAUMGARTTEN, F. J. R. Fatores de risco ambientais para o câncer gástrico: a visão do toxicologista. Cadernos da Saúde Pública, 13( Supl 1): 27-38, 1997.

GRETHE, G.; LEE, H. L.; MITT, T.; USKOKOVIC, M. R. Synthesis of cinchona alkaloids via quinuclidine precursors. Journal of American Chemical Society, 93(22):5904–5907, 1971.

GROB, C. S.; MCKENNA, D. J.; CALLAWAY, J. C.; BRITO, G. S.; NEVES, E. S.; OBERLAENDER. G.; SAIDE, O. L.; LABIGALINI, E.; TACLA, C.; MIRANDA, C. T. Human psychopharmacology of hoasca, a plant hallucinogen used in ritual context in Brazil. Journal of Nervous and Mental Disease, 184(2):86-94, 1996.

GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Biodiversidade, Fitoterápicos e Fitofármacos, In: SIMÕES, C. M. O. Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5ª Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS/UFSC, p.489-516, 2004.

GUTKIND, G.; NORBEDO, C.; MOLLERACH, M.; FERRADO, G.; TORRES, R. Antibacterial activity of Achyrocline flaccida. Journal of Ethnopharmacology, 10:319-321, 1984.

GUVENALP, Z.; KILIC, N.; KAZAZ, C.; KAYA, Y.; DEMIREZER, L. O. Chemical constituents of Galium tortumense. Turkish Journal of Chemistry, 30(4):515-523, 2006.

188

HAMERSKI, L.; FURLAN, M.; SIQUEIRA SILVA, D. H.; CAVALHEIRO, A. J.; EBERLIN, M. N.; TOMAZELA, D. M.; DA SILVA BOLZANI, V. Iridoid glucosides from Randia spinosa (Rubiaceae). Phytochemistry, 63(4):397-400, 2003.

HAMERSKI, L.; BOMM, M. D.; SILVA, D. H. S.; YOUNG, M. C. M.; FURLAN, M.; EBERLIN, M. N.; CASTRO-GAMBOA, I.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. S. Phenylpropanoid glucosides from leaves of Coussarea hydrangeifolia (Rubiaceae). Phytochemistry, 66(16):1927-1932, 2005a.

HAMERSKI, L.; CARBONEZI, C. A.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. S.; YOUNG, M. C. M. Triterpenoid saponins from Tocoyena brasiliensis Mart, (Rubiaceae). Química Nova, 28(4):601-604, 2005b.

HAMZAH, A. S.; AIMI, N.; LAJIS, N. H. J. Constituents of Hedyotis herbacea (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 24, 1996.

HANDJIEVA, N.; MITOVA, M.; ANCEV, M.; POPOV, S. Iridoid glucosides from Galium album and G. lovcense. Phytochemistry, 43(3):625-628, 1996.

HAO, J.; FENG, S. X.; QIU, S. X. S.; CHEN, T. (2011). Anthraquinone Glycosides from the Roots of Prismatomeris connata. Chinese Journal of Natural Medicines, 9(1):42-45, 2011.

HARI, L.; DE BUYCK, L. F.; DE POOTERT, H. L. Naphthoquinoid pigments from Pentas longiflora. Phytochemistry, 30(5):1726-1727, 1991.

HAROUNA, H.; FAURE, R.; ELIAS, R.; DEBRAUWER, L.; SAADOU, M.; BALANSARD, G.; BOUDON, G. Harounoside a pentalongin hydroquinone diglycoside from Mitracarpus scaber. Phytochemistry, 39(6):1483-1484, 1995.

HE, Z.; FANG, S. Y.; WANG, P.; GAO, J. H. 27-nor-triterpenoid glycosides from Adina rubella. Phytochemistry, 42(5):1391-1393, 1996.

HE, Z. D.; MA, C. Y.; ZHANG, H. J.; TAN, G. T.; TAMEZ, P.; SYDARA, K.; BOUAMANIVONG, S.; SOUTHAVONG, B.; SOEJARTO, D. D.; PEZZUTO, J. M. Antimalarial constituents from Nauclea orientalis (L, ) L. Chemistry & biodiversity, 2(10):1378-1386, 2005.

HEITZMAN, M. E.; NETO, C. C.; WINIARZ, E.; VAISBERG, A. J.; HAMMOND, G. B. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaria (Rubiaceae). Phytochemistry, 66(1):5-29, 2005.

HEMWIMON, S.; PAVASANT, P.; SHOTIPRUK, A. Microwave-assisted extraction of antioxidative anthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Separation and Purification Technology, 54(1):44-50, 2007.

HIGUCHI, C. T.; PAVAN, F. R.; LEITE, C. Q. F.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; LEITE, S. R. A.; SACRAMENTO, L. V. S.; SATO, D. N. Triterpenes and

189

antitubercular activity of Byrsonima crassa. Química Nova, 31(7):1719-1721, 2008.

HOEHNE, F. C. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais, São Paulo:1939.

HONTY, K.; BAITZGACS, E.; BLASKO, G.; SZANTAY, C.Synthesis of yohimbines. 4. Synthesis of (.+-.)-3-epi-.alpha.-yohimbine and (.+-.)-3, 17-epi-.alpha.-yohimbine. Carbon-13 NMR investigation of yohimbine stereoisomers. Journal of Organic Chemistry, 47( 26): 5111-5114, 1982.

HOSHINA, T. Studies on red-fin disease of eel. Special Research Report of Tokyo University of Fisheries, (6):61-105, 1962.

HOU, W. C.; LIN, R. D.; CHEN, C. T.; LEE, M. H. Monoamine oxidase B (MAO-B) inhibition by active principles from Uncaria rhynchophylla. Journal of ethnopharmacology, 100(1):216-220, 2005.

IDOWU, T. O.; OGUNDAINI, A. O.; SALAU, A. O.; OBUOTOR, E. M.; BEZABIH, M.; ABEGAZ, B. M. Doubly linked, A-type proanthocyanidin trimer and other constituents of Ixora coccinea leaves and their antioxidant and antibacterial properties. Phytochemistry, 71(17):2092-2098, 2010.

IKRAM, A.; VERSIANI, M. A.; SHAMSHAD, S.; AHMED, S. K.; ALI, S. T.; FAIZI, S. (2013). Ixorene, a New Dammarane Triterpene from the Leaves of Ixora coccinea Linn. Records of Natural Products, 7:4, 2013.

INOUYE, H.; TAKEDA, Y.; NISHIMURA, H.; KANOMI, A.; OKUDA, T.; PUFF, C. Chemotaxonomic studies of rubiaceous plants containing iridoid glycosides. Phytochemistry, 27(8):2591-2598, 1988.

IQBAL, P. F.; BHAT, A. R.; AZAM, A. Antiamoebic coumarins from the root bark of Adina cordifolia and their new thiosemicarbazone derivatives. European journal of medicinal chemistry, 44(5):2252-2259, 2009.

ISMAIL, N. H.; ALI, A. M.; AIMI, N.; KITAJIMA, M.; TAKAYAMA, H.; LAJIS, N. H. Anthraquinones from Morinda elliptica. Phytochemistry, 45(8):1723-1725, 1997.

ITO, A.; CHAI, H. B.; SHIN, Y. G.; GARCÍA, R.; MEJÍA, M.; GAO, Q.; FAIRCHILD, C. R.; LANE, K. E.; MENENDEZ, A. T.; FARNSWORTH, N. R. Cytotoxic Constituents of the Roots of Exostema acuminatum. Tetrahedron, 56(35):6401-6405, 2000.

ITOH, A.; TANAHASHI, T.; NAGAKURA, N.; NAYESHIRO, H. Tetrahydroisoquinoline-monoterpene glucosides from Alangium lamarckii and Cephaelis ipecacuanha, Phytochemistry, 36(2):383-387, 1994.

ITOH, A.; IKUTA, Y.; BABA, Y.; TANAHASHI, T.; NAGAKURA, N. Ipecac alkaloids from Cephaelis acuminata. Phytochemistry, 52(6):1169-1176, 1999a.

190

ITOH, A.; IKUTA, Y.; TANAHASHI, T.; NAGAKURA, N. Structures of New Alkaloids from Cephaelis acuminata and Alangium lamarckii, Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu, Hiroshima, Hiroshima University, p, 367-372, 1999b.

ITOH, A.; BABA, Y.; TANAHASHI, T.; NAGAKURA, N. Tetrahydroisoquinoline-monoterpene glycosides from Cephaelis acuminata. Phytochemistry, 59(1):91-97, 2002.

ITOH, A.; TANAHASHI, T.; NAGAKURA, N.; NISHI, T. Two triterpenoid saponins from Neonauclea sessilifolia. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 51(11):1335-1337, 2003b

JACOBS, J.; CLAESSENS, S.; DE KIMPE, N. First straightforward synthesis of 1-hydroxy-3, 4-dihydro-1H-benz [g] isochromene-5, 10-dione and structure revision of a bioactive benz [g] isochromene-5, 10-dione from Psychotria camponutans. Tetrahedron, 64(2):412-418, 2008.

JANGWAN, J. S.; AQUINO, R. P.; MENCHERINI, T.; SINGH, R. Isolation and in vitro cytotoxic activity of 11-methylixoside isolated from bark of Randia dumetorum Lamk. Herba Polonica, 59(1):44-52, 2013.

JANNIC, V.; GUÉRITTE, F.; LAPRÉVOTE, O.; SERANI, L.; MARTIN, M. T.; SÉVENET, T.; POTIER, P. Pyrrolidinoindoline Alkaloids from Psychotria oleoides and Psychotria lyciiflora. Journal of natural products, 62(6):838-843, 1999.

JANSAKUL, C.; INTARIT, K.; ITHARAT, A.; PHADUNGCHAROEN, T.; RUANGRUNGSI, N.; MERICA, A.; LANGE, G. L. Biological activity of crude extract and saponin pseudoginsenoside-RT1 derived from the fruit of Randia siamensis. Pharmaceutical biology, 37(1):42-45, 1999.

JANUÁRIO, A.; PIETRO, R.; KASHIMA, S.; SATO, D.; FRANÇA, S. Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L, (Solanaceae). Phytotherapy Research, 16(5):445-448, 2002.

JENSEN, S. R. Iridoids in Rothmannia globosa. Phytochemistry, 22(8):1761-1765, 1983.

JIMÉNEZ, A.; MECKES, M.; ALVAREZ, V.; TORRES, J.; PARRA, R. Secondary metabolites from Chamaedora tepejilote (Palmae) are active against Mycobacterium tuberculosis. Phytotherapy Research, 19(4):320-322, 2005.

JOLY, A. B. Botânica - Introdução à Taxonomia Vegetal, 6ª, São Paulo: Editora Nacional, 777pp, 1983.

JORGE, T. C. M.; OZIMA, A. P.; DÜSMAN, L. T.; SOUZA, M. C.; PEREIRA, G. F.; VIDOTTI, G. J.; SARRAGIOTTO, M. H. Alkaloids from Cephalanthus glabratus (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 34(5):436-437, 2006.

191

JUNQUEIRA JUNIOR, G.; BRAGA, L. M. G. D. M.; MOTTA, M. D. S.; PILLA, H. S. Modelo experimental de melanoma em camundongos. Anais Brasileiros de Dermatologia. Dermatol, 72( 5): 487-489, 1997.

KAM, T. S.; LEE, K. H.; GOH, S. H. Dimeric indole alkaloids from Uncaria callophylla. Phytochemistry, 30(10):3441-3444, 1991.

KAMIYA, K.; HAMABE, W.; TOKUYAMA, S.; SATAKE, T. New anthraquinone glycosides from the roots of Morinda citrifolia. Fitoterapia, 80(3):196-199, 2009.

KANCHANAPOOM, T.; KASAI, R.; YAMASAKI, K. Iridoid and phenolic diglycosides from Canthium berberidifolium. Phytochemistry, 61(4):461-464, 2002a

KANCHANAPOOM, T.; KASAI, R.; YAMASAKI, K. Iridoid and phenolic glycosides from Morinda coreia. Phytochemistry, 59(5):551-556, 2002b.

KAN-FAN, C.; ZUANAZZI, J. A.; QUIRION, J. C.; HUSSON, H. P.; HENRIQUES, A. Deppeaninol, A New β-Carboline Alkaloid from Deppea blumenaviensis (Rubiaceae). Natural Product Letters, 7(4):317-321, 1995.

KANG, W. Y.; LI, G. H.; HAO, X. J. Two New Triterpenes from Neonauclea sessilifolia. Acta Botanica Sinica - Chinese Edition, 45(8):1003-1007, 2003.

KARAKET, N.; SUPAIBULWATANA, K.; OUNSUK, S.; BULTEL-PONCE, V.; PHAM, V. C.; BODO, B. Chemical and bioactivity evaluation of the bark of Neonauclea purpurea. Natural Product Communications, 7(2):169, 2012.

KARIKAS, G. A.; EUERBY, M. R.; WAIGH, R. D. Constituents of the stems of Arbutus unedo. Planta Médica, 53(2):223-224, 1987.

KATO, L. O.; CECILIA, M. A.; MELO, M. P.; FREITAS, C. S.; SCHUQUEL, I. T. A.; DELPRETE, P. G. Glucosidic iridoids from Molopanthera paniculata Turcz. (Rubiaceae, Posoquerieae). Phytochemistry Letters, 5(1):155-157, 2012.

KATYAYANI, D. C.; MANABENDRA, D. C.; M. B. Anti Bacterial Activity of some Plants Belonging to the Family Rubiaceae: A Review. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 1(3):1179-1194, 2012.

KAWAI, K.; OSHIMI, K.; SUNAGA, T.; INOUE, K. Phenolic Compound, Epoxy Resin, Epoxy Resin Composition, Prepreg, and Cured Product Thereof." WIPO Patent No. 2011093474. 5 Aug. 2011.

KHAN, M. R.; OMOLOSO, A. D.; KIHARA, M. Antibacterial activity of Alstonia scholaris and Leea tetramera. Fitoterapia, 74(7-8):736-740, 2003.

KHAN, I. A.; STICHER, O.; RALI, T. New triterpenes from the leaves of Timonius timon. Journal of Natural Products, 56(12):2163-2165, 1993.

192

KHAN, M. R.; RUTAIHWA, D. S. D.; MHEHE, G. L. 1-(3-Hydroxy-4-methoxy-5-methylphenyl) ethanone, a new compound from the stem bark of Lamprothamnus zanguebaricus. Fitoterapia, 74(7-8):741-742, 2003.

KHAN, M. T. H.; ATHER, A.; THOMPSON, K. D.; GAMBARI, R. Extracts and molecules from medicinal plants against herpes simplex viruses. Antiviral research, 67(2):107-119, 2005.

KHAN, K.; KARODI, R.; SIDDIQUI, A.; THUBE, S.; RUB, R. A. Development of anti-acne gel formulation of anthraquinones rich fraction from Rubia cordifolia (Rubiaceae). International Journal of Applied Research in Natural Products, 4(4):28-36, 2012.

KIM, S. H.; AHN, B. Z.; RYU, S. Y. Antitumour effects of ursolic acid isolated from Oldenlandia diffusa. Phytotherapy Research, 12(8):553-556, 1998.

KIM, H. K.; KWON, M. K.; KIM, J. N.; KIM, C. K.; LEE, Y. J.; SHIN, H. J.; LEE, J.; LEE, H. S. Identification of novel fatty acid glucosides from the tropical fruit Morinda citrifolia L. Phytochemistry Letters, 3(4):238-241, 2010,

KITAGAWA, I.; WEI, H.; NAGAO, S.; MAHMUD, T.; HORI, K.; KOBAYASHI, M.; SHIBUYA, H. Indonesian Medicinal Plants. XIV. Characterization of 3'-O-Caffeoylsweroside, a new secoiridoid glucoside, and kelampayosides A and B. two new phenolic apioglucosides, from the bark of Anthocephalus chinensis (Rubiaceae). Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 44(6):1162-1167, 1996.

KITAJIMA, M.; FISCHER, U.; NAKAMURA, M.; OHSAWA, M.; UENO, M.; TAKAYAMA, H.; UNGER, M.; STÖCKIGT, J.; AIMI, N. Anthraquinones from Ophiorrhiza pumila tissue and cell cultures. Phytochemistry, 48(1):107-111, 1998.

KITAJIMA, M.; YOKOYA, M.; HASHIMOTO, K.; TAKAYAMA, H.; AIMI, N. Studies on New Alkaloid and Triterpenoids from Peruvian Una de Gato. Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu, p, 437-442, 2001.

KITAJIMA, M.; FUJII, N.; YOSHINO, F.; SUDO, H.; SAITO, K.; AIMI, N.; TAKAYAMA, H. Camptothecins and two new monoterpene glucosides from Ophiorrhiza liukiuensis. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 53(10):1355-1358, 2005.

KITAJIMA, M.; OHARA, S.; KOGURE, N.; SANTIARWORN, D.; TAKAYAMA, H. β-Carboline-type indole alkaloid glycosides from Ophiorrhiza trichocarpon. Tetrahedron, 69(45):9451-9456, 2013.

KONIGHEIM, B. S.; COMINI, L. R.; GRASSO, S.; AGUILAR, J. J.; MARIONI, J.; CONTIGIANI, M. S.; MONTOYA, S. C. N. Determination of non-toxic and subtoxic concentrations of potential antiviral natural anthraquinones. Latin American Journal of Pharmacy, 31(1):51-56, 2012.

193

KONISHI, M.; HANO, Y.; TAKAYAMA, M.; NOMURA, T.; HAMZAH, A. S.; JASMANI, H. Triterpenoid saponins from Hedyotis nudicaulis. Phytochemistry, 48(3):525-528, 1998.

KONTOGIANNI, V. G.; EXARCHOU, V.; TROGANIS, A.; GEROTHANASSIS, I. P. Rapid and novel discrimination and quantification of oleanolic and ursolic acids in complex plant extracts using two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy -Comparison with HPLC methods. Analytica Chimica Acta, 635:188-195 , 2009.

KOYAMA, J.; OKATANI, T.; TAGAHARA, K.; KOUNO, I.; IRIS, H. Anthraquinones of Damnacanthus indicus. Phytochemistry, 31(2):709-710, 1992a

LAI, Q. L.; PHAM, T. K.; VU, V. D.; CHU, P. K. Chemical components of roots of Hedyotis capitellata Wall, ex G. Don var, mollis Pierre ex Pit. Tap Chi Duoc Hoc, (9):9-11, 2001.

LAMIDI, M.; OLLIVIER, E.; FAURE, R.; DEBRAUWER, L.; NZE-EKEKANG, L.; BALANSARD, G. Quinovic acid glycosides from Nauclea diderrichii. Phytochemistry, 38(1):209-212, 1995.

LAMIDI, M.; OLLIVIER, E.; MAHIOU, V.; FAURE, R.; DEBRAUWER, L.; NZE EKEKANG, L.; BALANSARD, G. Gluco-indole alkaloids from the bark of Nauclea diderrichii, 1H and 13C NMR assignments of 3-5tetrahydrodeoxycordifoline lactam and cadambine acid. Magnetic Resonance in Chemistry, 43(5):427-429, 2005.

LATHA, P. G.; NAYAR, M. N. S.; SING, O. V.; GEORGE, K. R.; PANIKKAR, K. R.; PUSHPANGADAN, P. Isolation of antigenotoxic ursolic acid from Ixora coccinea flowers. Actual Biol, 23:21-24, 2001.

LAUS, G.; KEPLINGER, K. Alkaloids of peruvian Uncaria guianensis (Rubiaceae). Phyton, 43(1):1-8, 2003.

LAUS, G.; TEPPNER, H. The alkaloids of an Uncaria rhynchophylla (Rubiaceae-Coptosapelteae). Phyton, 36(2):185-196, 1996.

LAUS, G. e KEPLINGER, D. Separation of stereoisomeric oxindole alkaloids from Uncaria tomentosa by high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 662(2):243-249, 1994.

LAXMINARAYAN, R.; KLEIN, E.; DYE, C.; FLOYD, K.; DARLEY, S.; ADEYI, O. Economic benefit of tuberculosis control. Policy research working paper, 4295, 2007.

LEE, D.; CUENDET, M.; AXELROD, F.; CHAVEZ, P. I.; FONG, H. H, S.; PEZZUTO, J. M.; DOUGLAS KINGHORN, A. Novel 29-nor-3, 4-seco-cycloartane triterpene methyl esters from the aerial parts of Antirhea acutata, Tetrahedron, 57(33):7107-7112, 2001.

194

LEE, D.U.; PARK, C.H.; KANG, S.I.; MIN, E.G.; HAN, Y.H.; LEE, C.K. Isolation of the Component Transformed Into Blue Pigments by Aerobic Bacteria in the Fruits of Gardenia jasminoides. Saengyak Hakhoechi, 29(3):204-208, 1998.

LEE, S. E. HWANG H J. HA J S. JEONG H S. JEONG H K. Screening medicinal plant extracts for antioxidant activity. Life Sciences, 73: 167-179, 2003.

LEITÃO, S. G.; CASTRO, O.; FONSECA, E. N.; JULIÃO, L. S.; TAVARES, E. S.; LEO, R. R, T.; VIEIRA, R. C.; OLIVEIRA, D. R.; LEITÃO, G. G.; MARTINO, V. Screening of Central and South American plant extracts for antimycobacterial activity by the Alamar Blue test. Revista Brasileira de Farmacognosia, 16(1):6-11, 2006.

LEMEN, J.; TAYLOR, W. I. A Uniform numbering system for indole alkaloids. Experientia, 21(9):508, 1965.

LEMMICH, E.; CORNETT, C.; FURU, P.; JORSTIAN, C. L.; KNUDSEN, A. D.; OLSEN, C. E.; SALIH, A.; THILBORG, S. T. Molluscicidal saponins from Catunaregam nilotica. Phytochemistry, 39(1):63-68, 1995.

LENDL, A.; WERNER, I.; GLASL, S.; KLETTER, C.; MUCAJI, P.; PRESSER, A.; REZNICEK, G.; JURENITSCH, J.; TAYLOR, D. W. Phenolic and terpenoid compounds from Chione venosa (sw, ) urban var, venosa (Bois Bandé). Phytochemistry, 66(19):2381-2387, 2005.

LIEW, S. Y., MUKHTAR, M. R., HADI, A. H. A., AWANG, K., MUSTAFA, M. R., ZAIMA, K., HIROSHI, M.; LITAUDON, M. Naucline, a new indole alkaloid from the bark of Nauclea officinalis. Molecules, 17(4):4028-4036, 2012.

LIN, J.; OPOKU, A. R.; GEHEEB-KELLER, M.; HUTCHINGS, A. D.; TERBLANCHE, S. E.; K JÄGER, A.; VAN STADEN, J. Preliminary screening of some traditional Zulu medicinal plants for anti-inflammatory and anti-microbial activities. Journal of Ethnopharmacology, 68(1):267-274, 1999.

LIU, Q.; KIM, S. B.; AHN, J. H.; HWANG, B. Y.; KIM, S. Y.; LEE, M. K. Anthraquinones from Morinda officinalis roots enhance adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells. Natural Product Research, 26(18):1750-1754, 2012a.

LIU, M.; ZHOU, L.; CHEN, Z.; HU, C. Analgesic effect of iridoid glycosides from Paederia scandens (LOUR.) MERRILL (Rubiaceae) on spared nerve injury rat model of neuropathic pain. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 102(3):465-470, 2012b.

LIU, Y.; CHEN, B.; BAI, Y.; DUDDECK, H.; HIEGEMANN, M. Digiferriginol glycoside from Rubia schumanniana. Phytochemistry, 30(3):947-949, 1991.

LONGO, L.; SCARDINO, A.; VASAPOLLO, G. Identification and quantification of anthocyanins in the berries of Pistacia lentiscus L, , Phillyrea latifolia L. and Rubia peregrina L. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 8(3):360-364, 2007.

195

LOPES, S.; VON POSER, G. L.; KERBER, V. A.; FARIAS, F. M.; KONRATH, E. L.; MORENO, P.; SOBRAL, M. E.; ZUANAZZI, J. A. S.; HENRIQUES, A. T. Taxonomic significance of alkaloids and iridoid glucosides in the tribe Psychotrieae (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 32(12):1187-1195, 2004.

LOPEZ, A.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N. Antiviral and antimicrobial activities of Colombian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, 77(2-3):189-196, 2001.

LORENCE, A.; MEDINA-BOLIVAR, F.; NESSLER, C. L. Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin from Camptotheca acuminata hairy roots. Plant Cell Reports, 22(6):437-441, 2004.

LU, H. C.; HE, J. A study on chemical constituents of Oldenlandia diffusa (Willd) Roxb. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa, 8(1):34-37, 1996.

LUCIANO, J. H. S.; LIMA, M. A. S.; SOUZA, E. B.; SILVEIRA, E. R. Chemical constituents of Alibertia myrciifolia Spruce ex K. Schum. Biochemical Systematics and Ecology, 32(12):1227-1229, 2004.

MABBERLEY, D. J. The plant book. A portable dictionary of the vascular plants. 2.ed. Cambridge: Cambridge University Press, 858pp., 1997.

MACBAE, W. D.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N. Studies on the pharmacological activity of Amazonian Euphorbiaceae. Journal of ethnopharmacology, 22(2):143-172, 1988.

MACHIDA, K.; TAKEHARA, E.; KOBAYASHI, H.; KIKUCHI, M. Studies on the constituents of Gardenia species, III, New iridoid glycosides from the leaves of Gardenia jasminoides cv, fortuneana Hara. Chemical and pharmaceutical bulletin, 51(12):1417-1419, 2003.

MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA, V.; GRYNBERG, N. F.; ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, 25( 3): 429-438, 2002.

MAEHARA, S.; SIMANJUNTAK, P.; KITAMURA, C.; OHASHI, K.; SHIBUYA, H. Bioproduction of Cinchona Alkaloids by the Endophytic Fungus Diaporthe sp. Associated with Cinchona ledgeriana. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 60(10):1301-1304, 2012.

MAHATO, S. B.; KUNDU, A. P. 13C NMR Spectra of pentacyclic triterpenoids-a compilation and some salient features. Phytochemistry, 37(6):1517-1575, 1994.

MANSKE, R. H. F. Alkaloids of Pseudocinchona and Yohimbe. In: MANSKE, R. H. F The Alkaloids, chemistry and physiology. New York, London: Academic Press, VIII (The indole alkaloids), 1965.

196

MAREC, F.; KOLLAROVA, I.; JEGOROV, A. Mutagenicity of natural anthraquinones from Rubia tinctorum in the Drosophila wing spot test. Planta Médica, 67(2):127-131, 2001.

MATA, R.; DEL RAYO CAMACHO, M.; MENDOZA, S.; DEL CARMEN CRUZ, M. A phenylstyrene from Hintonia latiflora. Phytochemistry, 31(9):3199-3201, 1992.

MATSUO, H.; OKAMOTO, R.; ZAIMA, K.; HIRASAWA, Y.; ISMAIL, I. S.; LAJIS, N. H.; MORITA, H. New Vasorelaxant Indole Alkaloids, Villocarines A-D from Uncaria villosa. Bioorganic & medicinal chemistry, 19(13):4075-4079 2011.

MAURICIO, A. Q. Estudo da atividade antioxidante do ácido caféico e da PIH: um polifenol natural e um quelante sintético. Instituto de Química da Universidade de Brasília, Universidade de Brasília, Brasília, 2006.

MAURYA, A.; GUPTA, S.; SRIVASTAVA, S. K. Large-scale separation of antipsychotic alkaloids from Rauwolfia tetraphylla L. by pH-zone-refining fast centrifugal partition chromatography. Journal of Separation Science, 36(2):407–413, 2013.

MCLAUGHLIN, J. L.; ROGERS, L. L.; ANDERSON, J. E. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information Journal, 32(2):513-524, 1998.

MEDEIROS, W. L. B.; VIEIRA, I. J. C.; MATHIAS, L.; BRAZ-FILHO, SCHRIPSEMA, R. A new quaternary indole alkaloid isolated from Tabernaemontana laeta Mart. (Apocynaceae). Journal of Brazilian Chemical Society, (12):368-372, 2001.

MELO, E. A.; GUERRA, N. B. Ação antioxidante de compostos fenólicos naturalmente presentes em alimentos. Boletim da SBCTA, 36(1):1-11, 2002.

MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R.; PUTNAM, J. E.; JACOBSEN, L. B.; NICHOLS, D. E.; MCLAUGHLIN, J. L. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Médica, 45(1):31-34, 1982.

MITAINE-OFFER, A. C.; TAPONDJOU, L.; DJOUKENG, J.; BOUDA, H.; LACAILLE-DUBOIS, M. A. Glycoside derivatives of scopoletin and β-sitosterol from Hymenodictyon floribundum. Biochemical Systematics and Ecology, 31(2):227-228, 2003.

MITOVA, M. I.; ANCHEV, M. E.; PANEV, S. G.; HANDJIEVA, N. V.; POPOV, S. S, Coumarins and Iridoids from Crucianella graeca, Cruciata glabra, Cruciata laevipes and Cruciata pedemontana (Rubiaceae). Zeitschrift für Naturforschung, C. Biosciences, 51(9-10):631-634, 1996a.

MITOVA, M. I.; HANDJIEVA, N. V.; ANCHEV, M. E.; POPOV, S. S. Iridoid glucosides from four Balkan endemics of the Galium incurvum group (Rubiaceae). Zeitschrift fuer Naturforschung, C. Bioscience, 51(9-10): 286-290, 1996b

197

MITOVA, M.; HANDJIEVA, N.; SPASSOV, S.; POPOV, S. (1996). Macedonine, a non-glycosidic iridoid from Galium macedonicum. Phytochemistry, 42(4): 1227-1229, 1996c.

MIYAZAWA, M.; KAWATA, J. Identification of the key aroma compounds in dried roots of Rubia cordifolia. Journal of Oleo Science, 55(1):37-39, 2006.

MOBOT <http://www, tropicos, org/Name/42000210?tab=maps>, acessado em 03/01/2011.

MOHAMMED, A. M. A.; COOMBES, P. H.; CROUCH, N. R.; MULHOLLAND, D. A. Chemical constituents from Fadogia homblei De Wild (Rubiaceae). International Letters of Chemistry, Physics and Astronomy, 9(2):116-124, 2013.

MONGRAND, S.; BADOC, A.; PATOUILLE, B.; LACOMBLEZ, C.; CHAVENT, M.; BESSOULE, J. Chemotaxonimy of the Rubiaceae family based on leaf fatty acid composition. Phytochemistry, 66): 549-559, 2005.

MONTAGNAC, A.; LITAUDON, M.; PAÍS, M. Quinine-and quinicine-derived alkaloids from Guettarda noumeana, Phytochemistry, 46(5):973-975, 1997.

MONTORO, P.; CARBONE, V.; DE DIOZ ZUNIGA QUIROZ, J.; DE SIMONE, F.; PIZZA, C. Identification and quantification of components in extracts of Uncaria tomentosa by HPLC-ES/MS. Phytochemical analysis, 15(1):55-64, 2004.

MOON, H.I.; OH, J.S.; KIM, J.S.; CHEN, P.C.; ZEE, O.P. Phytochemical Compounds from the Underground Parts of Gardenia jasminoides Var. Radicans Makino. Saengyak Hakhoechi, 33(1):1-4, 2002.

MORIMOTO, M.; TANIMOTO, K.; SAKATANI, A.; KOMAI, K. Antifeedant activity of an anthraquinone aldehyde in Galium aparine L. against Spodoptera litura F. Phytochemistry, 60(2):163-166, 2002.

MOURA, V. M.; SANTOS, A. R.; NURNBERG, V.; DE SOUZA, M. C.; SANTIN, S. M. O. Iridoid glycosides from Galianthe brasiliensis. Biochemical Systematics and Ecology, 33(4):451-453, 2005.

MUHAMMAD, I.; DUNBAR, D. C.; KHAN, R. A.; GANZERA, M.; KHAN, I. A. Investigation of Una De Gato I. 7-Deoxyloganic acid and 15N NMR spectroscopic studies on pentacyclic oxindole alkaloids from Uncaria tomentosa. Phytochemistry, 57(5):781-785, 2001.

MUKHTAR, M. R.; OSMAN, N.; AWANG, K.; HAZNI, H.; QURESHI, A. K.; HADI, A.; HAMID A.; ZAIMA, K.; MORITA, H.; LITAUDON, M. Neonaucline, a new indole alkaloid from the leaves of Ochreinauclea maingayii (Hook. f.) Ridsd. (Rubiaceae). Molecules, 17:267-274, 2012.

198

NAHRSTEDT, A.; ROCKENBACH, J.; WRAY, V. Phenylpropanoid glycosides, a furanone glucoside and geniposidic acid from members of the rubiaceae. Phytochemistry, 39(2):375-378, 1995.

NASCIMENTO, C. A.; LIÃO, L. M.; OLIVEIRA, C.M.A.; KATO, L. Alcalóides Indólicos Monoterpênicos Glicosilados de Palicourea coriacea (Rubiaceae). In: Congresso de Pesquisa, Ensino e Extensão Da UFG - CONPEEX, 2., 2005, Goiânia. Anais eletrônicos do II Seminário de Pesquisa e Pós-Graduação da UFG [CD-ROM], Goiânia: UFG, 2005.

NASCIMENTO, N. C.; MENGUER, P. K.; SPEROTTO, R. A.; ALMEIDA, M. R.; FETT-NETO, A. G. Early Changes in Gene Expression Induced by Acute UV Exposure in Leaves of Psychotria brachyceras, a Bioactive Alkaloid Accumulating Plant. Molecular biotechnology, 54(1):79-91, 2013.

NEERGHEENA, V. S.; SOOBRATTEE, M. A.; BAHORUN, T.; ARUOMA, O. I. Characterization of the phenolic constituents in Mauritian endemic plants as determinants of their antioxidant activities in vitro. Journal of plant physiology, 163(8):787-799, 2006.

NEWTON, S. M.; LAU, C.; WRIGHT, C. W. A review of antimycobacterial natural products. Phytotherapy Research, 14(5):303-322, 2000.

NGALAMULUME, T.; KILONDA, A.; TOPPET, S.; COMPERNOLLE, F.; HOORNAERT, G. An ursadienedioic acid glycoside from Crossopteryx febrifuga. Phytochemistry, 30(9):3069-3072, 1991.

NIÑO, J.; NARVÁEZ, D. M.; MOSQUERA, O. M.; CORREA, Y. M. Atividades antibactariana, antifúngica e citotóxica de oito plantas Asteraceae e duas Rubiaceae da biodiversidade colombiana. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4):566-70, 2006.

NISHIMURA, K.; HITOTSUYANAGI, Y.; SUGETA, N.; SAKAKURA, K.; FUJITA, K.; FUKAYA, H.; AOYAGI, Y.; HASUDA, T.; KINOSHITA, T.; HE, D. H. Tricalysiolides AF, new rearranged ent-kaurane diterpenes from Tricalysia dubia. Tetrahedron, 62(7):1512-1519, 2006.

NUANYAI, T.; SAPPAPAN, R.; VILAIVAN, T.; PUDHOM, K. Dammarane triterpenes from the apical buds of Gardenia collinsae. Phytochemistry Letters, 4:183-186, 2011.

NÚÑEZ MONTOYA, S. C.; COMINI, L. R.; SARMIENTO, M.; BECERRA, C.; ALBESA, I.; ARGÜELLO, G. A.; CABRERA, J. L. Natural anthraquinones probed as Type I and Type II photosensitizers: singlet oxygen and superoxide anion production. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 78(1):77-83, 2005.

NUNEZ, C. V.; SANTOS, P. A.; ROUMY, V.; HENNEBELLE, T.; MESQUITA, A. S. S.; BAILLEUL, F. Raunitidine isolated from Duroia macrophylla (Rubiaceae). Planta Medica, 75: 1037-1037, 2009.

199

NUNEZ, C. V.; VASCONCELOS, M. C. Novo Alcaloide Antitumoral de Duroia macrophylla. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI10201203380, data de depósito: 31/12/2012, título: "Novo Alcaloide Antitumoral de Duroia macrophylla.", Instituição de registro: INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial. 2012.

NUNEZ, C. V.;ROUMY, V.; MESQUITA, D. W. O.; MESQUITA, A. S. S.; SAHPAZ, S.; BAILLEUL, F.; HENNEBELLE, T. Indole alkaloids from Duroia macrophylla (Rubiaceae). Planta Médica, (78):287, 2012.

O'BRIEN, R. J.; NUNN, P. P, The need for new drugs against tuberculosis. American journal of respiratory and critical care medicine, 163(5):1055-1058, 2001.

OGUNKOYA, L. Application of mass spectrometry in strutural problems in triterpenes. Phytochemistry, 20: 121-126, 1981.

OKUNADE, A. L.; ELVIN-LEWIS, M. P. F.; LEWIS, W. H. Natural antimycobacterial metabolites: current status. Phytochemistry, 65(8):1017-1032, 2004.

OLIVEIRA, A. M.; LEMOS, R. P. L.; CONSERVA, L. M. β-Carboline alkaloids from Psychotria barbiflora DC.(Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 50:339-341, 2013.

OLIVEIRA, P. L. Contribuição ao estudo de espécies da família Rubiaceae: Fitoquímica da espécie Amaioua guianensis Aulb. Dissertação de Mestrado, Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2009.

ONO, M.; UENO, M.; MASUOKA, C.; IKEDA, T.; NOHARA, T. Iridoid glucosides from the fruit of Genipa americana, ChemInform, 37(12):no-no, 2006.

ONO, M.; ISHIMATSU, N.; MASUOKA, C.; YOSHIMITSU, H.; TSUCHIHASHI, R.; OKAWA, M.; KINJO, J.; IKEDA, T.; NOHARA, T. Three new monoterpenoids from the fruit of Genipa americana. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 55(4):632-634, 2007.

ORBÁN, N.; BOLDIZSÁR, I.; SZUCS, Z.; DÁNOS, B. Influence of different elicitors on the synthesis of anthraquinone derivatives in Rubia tinctorum L. cell suspension cultures. Dyes and Pigments, 77(1):249-257, 2008.

OTSUKA, H.; YOSHIMURA, K.; YAMASAKI, K.; CANTORIA, M. C. Isolation of 10-O-acyl iridoid glucosides from a Philippine medicinal plant, Oldenlandia corymbosa L, (Rubiaceae). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 39(8):2049-2052, 1991.

PAGE, J. E.; MADRINAN, S.; TOWERS, G. H. N. Identification of a plant growth inhibiting iridoid lactone from Duroia hirsuta, the allelopathic tree of the ‘Devil's Garden’. Cellular and Molecular Life Sciences, 50(9):840-842, 1994.

PALOMINO, J. C.; MARTIN, A.; CAMACHO, M.; GUERRA, H.; SWINGS, J.; PORTAELS, F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive

200

method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46(8):2720-2722, 2002.

PANDEY, R.; SINGH, S. C.; GUPTA, M. M, Heteroyohimbinoid type oxindole alkaloids from Mitragyna parvifolia. Phytochemistry, 67(19):2164-2169, 2006.

PANIAGUA-VEGA, D.; GARCIA-ROJAS, C. M. C.; PONCE-NOYOLA, T.; RAMOS-VALDIVIA, A. C. A new monoterpenoid oxindole alkaloid from Hamelia patens micropropagated plantlets. Natural Product Communications, 7(11):1441-1444, 2012.

PAREKH, J.; JADEJA, D.; CHANDA, S. Efficacy of aqueous and methanol extracts of some medicinal plants for potential antibacterial activity. Turkish Journal of Biology, 29:203-210, 2005.

PAULI, G. F.; CASE, R. J.; INUI, T.; WANG, Y.; CHO, S.; FISCHER, N. H.; FRANZBLAU, S. G. New perspectives on natural products in TB drug research. Life Sciences, 78(5):485-494, 2005.

PEDERSEN, J. M.; BOWMAN, W. R.; ELSEGOOD, M. R. J.; FLETCHER, A. J.; LOVELL, P. J.; J. Synthesis of ellipticine: a radical cascade protocol to aryl- and heteroaryl-annulated[b]carbazoles. The Journal of Organic Chemistry, 70:10615, 2005.

PELLETIER, P. J.; CAVENTOU, J. B.; Annales de Chimie et de Physique, XV, 289, 1820.

PENG, J. N.; FENG, X. Z.; ZHENG, Q. T.; LIANG, X. T. A [beta]-carboline alkaloid from Hedyotis chrysotricha. Phytochemistry, 46(6):1119-1121, 1997.

PENG, J. N.; FENG, X. Z.; LIANG, X. T. Iridoids from Hedyotis hedyotidea. Phytochemistry, 47(8):1657-1659, 1998.

PERASSOLO, M.; QUEVEDO, C.; BUSTO, V.; IANONE, F.; GIULIETTI, A. M.; TALOU, J. R. Enhance of anthraquinone production by effect of proline and aminoindan-2-phosphonic acid in Rubia tinctorum suspension cultures. Enzyme and Microbial Technology, 41(1):181-185, 2007.

PEREIRA, CG; ROSA, PTV e MEIRELES, MAA. Extraction and isolation of indole alkaloids from Tabernaemontana catharinensis A.DC: Technical and economical analysis. The Journal of Supercritical Fluids, 40(2):232–238, 2006.

PERRUCHON, S. Estudo das propriedades dos flavonóides para cosméticos através do relacionamento função-estrutura. Cosmetics & Toiletries, 14(6):74, 2002.

PFISTER, S.; MEYER, P.; STECK, A.; PFANDER. H. Isolation and structure elucidation of carotenoid-glycosyl esters in Gardenia fruits (Gardenia jasminoides Ellis) and saffron (Crocus sativus Linne). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(9):2612-2615, 1996.

201

PHAM, M. H.; NGUYEN, D. T.; DO, T. D. Isolation and Identification of Scopoletin From Roots of Nho Dong (Morinda longissima Y. Z. Ruan, Rubiaceae). Tap Chi Duoc Hoc, 45(2):12-13, 2005.

PHILLIPSON, J.; SUPAVITA, N. Alkaloids of Uncaria elliptica. Phytochemistry, 22(8): 1809-1813, 1983.

PHUONG, N. M.; VAN SUNG, T.; SCHMIDT, J.; PORZEL, A.; ADAM, G. Capitelline-A New Indole Alkaloid from Hedyotis capitellata. Natural Product Letters, 11(2):93-100, 1998.

PHUONG, N. M.; VAN SUNG, T.; PORZEL, A.; SCHMIDT, J.; MERZWEILER, K.; ADAM, G. [beta]-Carboline alkaloids from Hedyotis capitellata. Phytochemistry, 52(8):1725-1729, 1999.

PIETRO, R. C. L. R.; KASHIMA, S.; SATO, D. N.; JANUÁRIO, A. H.; FRANCA, S. C. In vitro antimycobacterial activities of Physalis angulata L. Phytomedicine, 7(4):335-338, 2000.

PINTO, A. C. O Brasil dos viajantes e dos exploradores e a química de produtos naturais brasileira. Química Nova, 18(6):608-615, 1995.

PIOVANO, M.; CHAMY, M. C.; GARBARINO, J. A.; NICOLETTI, M. Iridoids from Cruckshanksia pumila (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 31(10):1201-1203, 2003.

POWELL, D. B.; PALM, R. C.; MACKENZIE, A. P.; WINTON, J. R. Extremophile extracts and enhancement techniques show promise for the development of a live vaccine against Flavobacterium columnare. Cryobiology, 59(2):158-163, 2009.

POZNIAK, A. L.; UTTLEY, A. H. C.; KENT, R. J. Mycobacterium avium complex in AIDS: who, when, where, why and how? Journal of Applied Microbiology, 81:40S-46S, 1996.

QUANG, D. N.; HASHIMOTO, T.; TANAKA, M.; DUNG, N. X.; ASAKAWA, Y. Iridoid glucosides from roots of Vietnamese Paederia scandens. Phytochemistry, 60(5):505-514, 2002.

RAHARIVELOMANANA, P.; BIANCHINI, J. P.; RAMANOELINA, A. R. P.; RASOHARAHONA, J. R. E.; CHATEL, F.; FAURE, R. Structures of Cadinane- and Guaiane-type Sesquiterpenoids from Enterospermum madagascariensis (Baill, ) Homolle. Magnetic Resonance in Chemistry, 43(12):1049-1052, 2005.

RAJAKARUNA, N.; HARRIS, C. S.; TOWERS, G. H. N. Antimicrobial Activity of Plants Collected from Serpentine Outcrops in Sri Lanka. Pharmaceutical Biology, 40(3):235-44, 2002.

http://journals.ohiolink.edu/ejc/search.cgi?q=authorExact:%22Phillipson%2C%20J.%22

http://journals.ohiolink.edu/ejc/search.cgi?q=authorExact:%22Supavita%2C%20N.%22

202

RAMAN, V.; AVULA, B.; GALAL, A. M.; WANG, Y. H.; KHAN, I. A. (2013). Microscopic and UPLC–UV–MS analyses of authentic and commercial yohimbe (Pausinystalia johimbe) bark samples. Journal of natural medicines, 67(1(42-50, 2013.

RAMOS, D. F.; LEITÃO, G. G.; COSTA, F. N.; ABREU, L.; VILLARREAL, J. V.; LEITÃO, S. G.; SAID Y FERNÁNDEZ, S. L.; SILVA, P. E. A. Investigation of the antimycobacterial activity of 36 plant extracts from the brazilian Atlantic Forest. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 44(4):669-674, 2008.

RASMUSSEN, L. S.; RANK, C.; JENSEN, S. R. Transfer of iridoid glucosides from host plant Galium verum to hemiparasitic Euphrasia stricta. Biochemical Systematics and Ecology, 34(10):763-765, 2006.

RASOANAIVO, P.; MULTARI, G.; FEDERICI, E.; GALEFFI, C. Triterpenoid diglucoside of Enterospermum pruinosum. Phytochemistry, 39(1):251-253, 1995.

RATH, G.; NDONZAO, M.; HOSTETTMANN, K. Antifungal anthraquinones from Morinda lucida Benth, (Rubiaceae), Colloques - Institut National De La Recherche Agronomique. Polyphenols, 69:413-414, 1995.

RAVEENDRAN, V. V.; VIJAYAN, F. P.; PADIKKALA, J. Antitumor activities of an anthraquinone fraction isolated from in vitro cultures of Ophiorrhiza rugosa var decumbens. Integrative Cancer Therapies, 11(2):120-128, 2012.

RAYNAUD, C.; ETIENNE, G.; PEYRON, P.; LANÉELLE, M. A.; DAFFÉ, M. Extracellular enzyme activities potentially involved in the pathogenicity of Mycobacterium tuberculosis. Microbiology, 144(2):577-587, 1998.

RIBEIRO, J. E. L. S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C.; COSTA, M. A. S.; BRITO, J. M.; SOUZA, M. A. D.; MARTINS, L.; LOHMANN, L.; ASSUNÇÃO, P.; PEREIRA, E. C.; SILVA, C. F.; MESQUITA, M. R.; PROCÓPIO, L. C. Flora da Reserva Ducke, Guia de identificação das plantas em uma floresta de terra firme na Amazônia central, Manaus: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazonia (INPA) e Department for International Development (DFID), 1999.

RIZZINI, C. T.; MORS, W. B. Botânica econômica brasileira, Rio de Janeiro: Editora Âmbito Cultural, 1995.

ROBBRECHT, E. Tropical woody Rubiaceae, Opera Botanica Belgica, 1(272):599-602, 1988.

ROCKENBACH, J.; NAHRSTEDT, A.; WRAY, V. Cyanogenic glycosides from Psydrax and Oxyanthus species. Phytochemistry, 31(2):567-570, 1992.

ROFI, R. D.; POMILIO, A. B. 5, 7, 3-Trihydroxy 4, 5-dimethoxyflavone and other phenolics from Poahueca. Phytochemistry, 24:2131-2132, 1985.

203

ROJAS-DURAN, R.; GONZALEZ-ASPAJO, G.; RUIZ-MARTEL, C.; BOURDY, G.; DOROTEO-ORTEGA, V. H.; ALBAN-CASTILLO, J.; ROBERT, G.; AUBERGER, P.; DEHARO, E. Anti-inflammatory activity of Mitraphylline isolated from Uncaria tomentosa bark. Journal of Ethnopharmacology, 143(3):801-804, 2012.

ROSSETTI, M. L. R.; VALIM, A. R. M.; SILVA, M. S. N.; RODRIGUES, V. S. Tuberculose resistente: revisão molecular. Revista Saúde Pública, 36(4):525-32, 2002.

RUIZ-MESIA, L.; RUIZ-MESÍA, W.; REINA, M.; MARTÍNEZ-DIAZ, R.; DE INÉS, C.; GUADAÑO, A.; GONZÁLEZ-COLOMA, A. Bioactive cinchona alkaloids from Remijia peruviana. Journal of agricultural and Food Chemistry, 53(6):1921-1926, 2005.

RUKACHAISIRIKUL, V.; NAOVANIT, S.; TAYLOR, W. C.; BUBB, W. A.; DAMPAWAN, P. A.Sesquiterpene From Gardenia sootepensis. Phytochemistry, 48(1):197-200, 1998.

RUKACHAISIRIKUL, T.; PRABPAI, S.; CHAMPUNG, P.; SUKSAMRARN, A. Chabamide, a novel piperine dimer from stems of Piper chaba. Planta Medica-Natural Products and Medicinal Plant Research, 68(9):853-855, 2002.

RUKSILP, T.; SICHAEM, J.; KHUMKRATOK, S.; SIRIPONG, P.; TIP-PYANG, S. Anthraquinones and an iridoid glycoside from the roots of Morinda pandurifolia. Biochemical Systematics and Ecology, 39:888-892, 2011.

RUMBERO, A.; VÁSQUEZ, P. Structure and stereochemistry of magniflorine, a new indole alkaloid from Hamelia magniflora Wernha, Tetrahedron Letters, 32(38):5153-5154, 1991.

SAGRILLO, M. R.; CARDOSO, S. H.; SILVA, L. R.; GRAÇA, C. H.; FERREIRA, E.; HAMERSCHLAK, N.; GUERRA, J. C.; BACAL, N. S.; ANDRADE, J. A.; BOROVIK, C. L. Leucemia promielocítica aguda: caracterização de alterações cromossômicas por citogenética tradicional e molecular (FISH). Revista Brasileira de Hematologial.Hemoter, 27( 2): 94-101, 2005.

SAHPAZ, S.; GUPTA, M. P.; HOSTETTMANN, K. Triterpene saponins from Randia formosa. Phytochemistry, 54(1):77-84, 2000.

SAITO, K.; SUDO, H.; YAMAZAKI, M.; KOSEKI-NAKAMURA, M.; KITAJIMA, M.; TAKAYAMA, H.; AIMI, N. Feasible production of camptothecin by hairy root culture of Ophiorrhiza pumila. Plant Cell Reports, 20(3):267-271, 2001.

SAKAKIBARA, I.; TAKAHASHI, H.; TERABAYASHI, S.; YUZURIHARA, M.; KUBO, M.; ISHIGE, A.; HIGUCHI, M.; KOMATSU, Y.; OKADA, M.; MARUNO, M. Effect of oxindole alkaloids from the hooks of Uncaria macrophylla on thiopental-induced hypnosis. Phytomedicine, 5(2):83-86, 1998.

204

SAKAMOTO-HOJO, E. T.; TAKAHASHI, C. S.; FERRARI, I.;. MOTIDOME, M. Clastogenic effect of the plant alkaloid ellipticine on bone marrow cells of Wistar rats and on human peripheral blood lymphocytes. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 199(1): 11–19, 1988.

SALIM, F.; AHMAD, R. Alkaloids from Malaysian Uncaria longiflora var, pteropoda. Biochemical Systematics and Ecology, 39:151-152, 2011.

SALIM, F.; AHMAD, R.; ISMAIL, H.N.; HAZRINA, H.; NG, S.W. Rauniticine-allo-oxindole B methanol monosolvate. Acta Crystallographica Section E. 1345, 2001.

SALKIN, R.; HOSANSKY, N.; JARET, R. Leaf alkaloids of Rauwolfia nitida. Journal of Pharmaceutical Sciences, 50(12):1038–1041, 1961.

SALUDES, J. P.; GARSON, M. J.; FRANZBLAU, S. G.; AGUINALDO, A. M. Antitubercular constituents from the hexane fraction of Morinda citrifolia Linn, (Rubiaceae). Phytotherapy Research, 16(7):683-685, 2002.

SAMOYLENKO, V.; ZHAO, J.; DUNBAR, D. C.; KHAN, I. A.; RUSHING, J. W.; MUHAMMAD, I. New constituents from noni (Morinda citrifolia) fruit juice. Journal of agricultural and Food Chemistry, 54(17):6398-6402, 2006.

SANG, S.; WANG, M.; HE, K.; LIU, G.; DONG, Z.; BADMAEV, V.; ZHENG, Q. Y.; GHAI, G.; ROSEN, R. T.; HO, C. Chemical components in noni fruits and leaves (Morinda citrifolia L, ) Acs Symposium Series 803 (Quality Management of Nutraceuticals), pp134-150, 2003.

SARGENT, M. V.; WAHYUNI, F. S. (+)-Isochimonanthine, a Pyrrolidinoindole Alkaloid from Argostemma yappii King. Australian Journal of Chemistry, 53(2):159-160, 2000.

SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PETROVICK, P. R.; SIMÕES, C. M. O. Produtos de origem vegetal eo desenvolvimento de medicamentos, In: SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G. Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5 ed., Porto Alegre/Florianópolis: Editora UFRGS/Editora da UFSC. 15:371-400, 2003.

SCHINNERL, J.; ORLOWSKA, E. A.; LORBEER, E.; BERGER, A.; BRECKER, L. Alstrostines in Rubiaceae: Alstrostine A from Chassalia curviflora var. ophioxyloides and a novel derivative, rudgeifoline from Rudgea cornifolia. Phytochemistry Letters, 5(3):586-590, 2012.

SCHRIPSEMA, J.; RAMOS-VALDIVIA, A.; VERPOORTE, R. Robustaquinones, novel anthraquinones from an elicited Cinchona robusta suspension culture. Phytochemistry, 51(1):55-60, 1999.

SCHRIPSEMA, J.; DAGNINO, D.; GOSMANN, G. Alcalóides indólicos. In: SIMÕES, C.M.O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFSC. p.819-46, 2004.

205

SCHWARZ, B.; WRAY, V.; PROKSCH, P. A cyanogenic glycoside from Canthium schimperianum. Phytochemistry, 42(3):633-636, 1996.

SEIDEL, V.; TAYLOR, P. W. In vitro activity of extracts and constituents of Pelagonium against rapidly growing mycobacteria. International Journal of Antimicrobial Agents, 23(6):613-619, 2004.

SHAMMA, M.; RICHEY, J. M. The stereochemistry of the heteroyohimbine alkaloids. Journal of American Chemical Society, 85: 2507-2512, 1963.

SHELLARD, E. J.; BECKETT, A. H.; TANTIVATANA, P.; PHILLIPSON, J. D.; LE, C. M. Alkaloids from Mitragyna javanica, Koord. and Valeton and Mitragyna hirsuta, Havil. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 18(8):553–555, 1966.

SHELLARD, E. J.; SARPONG, K. The alkaloids of the leaves of Mitragyna inermis (Willd.) O. Kuntze. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 21(S1):113S–117S, 1969

SHENG-DIAN, H.; YU, Z.; MING-MING, C.; YING-TONG, D.; GUI-HUA, T.; ZONG-GEN, P.; JIAN-DONG, J.; HONG-PING, H.; XIAO-JIANG, H. Myriberine A. a new alkaloid with an unprecedented heteropentacyclic skeleton fromMyrioneuron faberi. Organic letters, 15(3):590-593, 2013.

SHIN, J. S.; YUN, K. J.; CHUNG, K. S.; SEO, K. H.; PARK, H. J.; CHO, Y. W.; BAEK, N. I.; JANG, D. S.; LEE, K. T.Monotropein isolated from the roots of Morinda officinalis ameliorates proinflammatory mediators in RAW 264.7 macrophages and dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis via NF-κB inactivation. Food and Chemical Toxicology, 53:263-271, 2013.

SHIXIU, F.; JIJIANG, B.; SHENGXIANG, Q.; YONG, L.; TAO, C. Iridoid and phenolic glycosides from the roots of Prismatomeris connata. Natural Product Communications, 7(5):561-562, 2012.

SHOJI, M.; PARTOMUAN, S.; YOSHIHIDE, M.; CHINAMI, K.; KAZUYOSHI, O.; HIROTAKA, S. Ability of endophytic filamentous fungi associated with Cinchona ledgeriana to produce Cinchona alkaloids. Journal of Natural Medicines, 67(2):421-423, 2013.

SICHAEM, J.; SURAPINIT, S.; SIRIPONG, P.; KHUMKRATOK, S.; JONG-ARAMRUANG, J.; TIP-PYANG, S. Two new cytotoxic isomeric indole alkaloids from the roots of Nauclea orientalis. Fitoterapia, 81(7):830-833, 2010.

SILVA, F. A. M.; BORGES, M. F. M.; FERREIRA, M. A. Métodos para avaliação do grau de oxidação lipídica e da capacidade antioxidante. Química Nova, 22(1):94-103, 1999.

206

SILVA, J. H. S.; LIMA, M. A. S.; SOUZA, E. B.; SILVEIRA, E. R. Chemical constituents of Alibertia myrciifolia Spruce ex K. Schum. Biochemical Systematics and Ecology, 32(12):1227-1229, 2004.

SILVA, V. C.; SILVA, G.; BOLZANI, V. S.; LOPES, M. N. Isolation of lignans glycosides from Alibertia sessilis (Vell.) K. Schum, (Rubiaceae) by preparative high-performance liquid chromatography. Eclética Química, 31(4):55-58, 2006.

SILVA, J. G.; SOUZA, I. A.; HIGINO, J. S.; SIQUEIRA-JUNIOR, J. P.; PEREIRA, J. V.; PEREIRA, M. S. V. Atividade antimicrobiana do extrato de Anacardium occidentale Linn, em amostras multiresistentes de Staphylococcus aureus. Revista Brasileira de Farmacognosia, 17(4):572-577, 2007.

SILVA, M. A. R.; HIGINO, J. S.; PEREIRA, J. V.; SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P.; PEREIRA, M. S. V. Antibiotic activity of the extract of Punica granatum Linn, over bovine strains of Staphylococcus aureus. Revista Brasileira de Farmacognosia, 18(2):209-212, 2008.

SIMÃO, A. M. Aditivos para alimentos sob o aspecto toxicológico, Nobel, 1985.

SIMKIN, A. J.; KUNTZ, M.; MOREAU, H.; MCCARTHY, J. Carotenoid profiling and the expression of carotenoid biosynthetic genes in developing coffee grain. Plant Physiology and Biochemistry, 48(6):434-442, 2010

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento, Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004.

SINGH, B.; SINGH, S. Anticrobial activity of terpenoids from Trichodesma amplexicaule Roth. Phytotherapy Research, 17(7):814-816, 2003.

SIVA, R.; MAYES, S.; BEHERA, S. K.; RAJASEKARAN, C. Anthraquinones dye production using root cultures of Oldenlandia umbellata L. Industrial Crops and Products, 37(1):415-419, 2012.

SMITH, I. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Clinical Microbiology Reviews, 16(3):463-496, 2003.

SOARES, P. R. O.; OLIVEIRA, P. L.; OLIVEIRA, C. M. A.; KATO, L.; GUILLO, L. A. In vitro antiproliferative effects of the indole alkaloid vallesiachotamine on human melanoma cells. Archives of Pharmacal Research, 35(3):565-571, 2012.

SOLÍS, P. N.; RAVELO, A. G.; ANTONIO PALENZUELA, J.; GUPTA, M. P.; GONZÁLEZ, A.; DAVID PHILLIPSON, J. Quinoline alkaloids from Psychotria glomerulata. Phytochemistry, 44(5):963-969, 1997.

SOLIS, P. N.; WRIGHT, C. W.; GUPTA, M. P.; PHILLIPSON, J. D. Alkaloids from Cephaelis dichroa. Phytochemistry, 33(5):1117-1119, 1993.

207

SOUSA, M. P.; MATOS, M. E. O.; MACHADO, M. I. L.; VENCATO, I.; MASCARENHAS, Y. P. Triterpenoids from Guettarda angelica. Phytochemistry, 23(11):2589-2592, 1984.

SOUZA, A. Q. L.; SOUZA, A. D. L.; ASTOLFI-FILHO, S.; BELÉM-PINHEIRO, M. L.; SARQUIS, M. I. M.; PEREIRA, J. O. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da Amazônia: Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazônica, 34(2):185-95, 2004.

SOUZA, V. C.; LORENZI, H. Botânica sistemática: Guia ilustrado para identificação de Fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II, Nova Odessa: Instituto Plantarum, 704pp. 2008.

SPERANZA, G.; DADA, G.; MANITTO, P.; MONTI, D.; GRAMATICA, P. 13-cis-crocin: a new crocinoid of saffron. Gazzetta Chimica Italiana, 114:189-192, 1984.

SRIVASTAVA, S. K.; AGRAWAL, A. K.; SINGH, S. C.; KHANNA, V. K.; SINGH, J.; NATH, C.; GUPTA, M. M.; GUPTA S.; VERMA, R. K.; PAL, A.; BAWANKULE, D. U.; SAIKIA, D.; GUPTA, A. K.; MAURYA, A.; KHANUJA, S. P. S. Antipsychotic Agents and Standardized Antipsychotic Fractions from Rauwolfia tetraphylla and Process of Their Isolation. U.S. Patent Application 13/262, 040, 31 mar. 2010.

STAERK, D.; LEMMICH, E.; CHRISTENSEN, J.; KHARAZMI, A.; OLSEN, C. E.; JAROSZEWSKI, J. W. Leishmanicidal, antiplasmodial and cytotoxic activity of indole alkaloids from Corynanthe pachyceras. Planta Médica, 66(6):531-536, 2000.

SU, B. N.; KANG, Y. H.; PINOS, R. E.; SANTARSIERO, B. D.; MESECAR, A. D.; SOEJARTO, D. D.; FONG, H. H, S.; PEZZUTO, J. M.; KINGHORN, A. D. Isolation and absolute stereochemistry of coussaric acid, a new bioactive triterpenoid from the stems of Coussarea brevicaulis. Phytochemistry, 64(1):293-302, 2003.

SUDARSONO, Asperuloside, an Iridoid Substance in Hedyotis corymbosa (L, ) Lamk, (Oldenlandia Corymbosa Linn, ), Family Rubiaceae. Majalah Farmasi Indonesia, 10(3):163-174, 1999.

SUDARSONO, Distribution of Asperuloside, Scandoside Methyl Ester in Plant Organs of Hedyotis corymbosa (L, ) Lamk (Oldenlandia Corymbosa Linn) of Rubiaceae Family. Majalah Farmasi Indonesia, 15(2):62-67, 2004.

SUKSAMRARN, A.; TANACHATCHAIRATANA, T.; KANOKMEDHAKUL, S. Antiplasmodial triterpenes from twigs of Gardenia saxatilis. Journal of ethnopharmacology, 88(2):275-277, 2003.

SUN, J.; LOU, H.; DAI, S.; XU, H.; ZHAO, F.; LIU, K. Indole alkoloids from Nauclea officinalis with weak antimalarial activity. Phytochemistry, 69(6):1405-1410, 2008.

208

SUZUKI, S.; ENDO, Y. Studies on the Constituents of the Fruits of Paederia scandens, Structure of A New Iridoid, Paederia lactone. Journal of Tohoku Pharmaceutical University, 51:17-21, 2004,

SWENSON, J. M.; WALLACE JR, R.; SILCOX, V. A.; THORNSBERRY, C. Antimicrobial susceptibility of five subgroups of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 28(6):807-811, 1985.

TAKAYAMA, H. Chemistry and pharmacology of analgesic indole alkaloids from the rubiaceous plant, Mitragyna speciosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 52(8):916-928, 2004.

TAKEDA, Y.; SHIMIZU, H.; MASUDA, T.; HIRATA, E.; SHINZATO, T.; BANDO, M.; OTSUKA, H. Lasianthionosides AC, megastigmane glucosides from leaves of Lasianthus fordii. Phytochemistry, 65(4):485-489, 2004.

TALLENT, W. H. Two new antibiotic cyclopentanoid monoterpenes of plant origin. Tetrahedron, 20(7):1781-1787, 1964.

TAO, J. Y.; DAI, S. J.; ZHAO, F.; LIU, J. F.; FANG, W. S.; LIU, K. New ursane-type triterpene with NO production suppressing activity from Nauclea officinalis. Journal of Asian Natural Products Research, 14(2):97-104, 2012.

TAYLOR, C. M. J. A.; STEYERMARK, P. G.; DELPRETE, A.; VINCENTINI, R.; CORTÊS, D.; ZAPPI, C.; PERSSON, C. B.; COSTA, E. J. A.; STEYERMARK, J. S.; STEYERMARK, P. E.; BERRY, B. K. Rubiaceae, Flora of the Venezuelan Guayana. Annals of the Missouri Botanical Garden, 8:497-848, 2004.

TAYLOR, C. M.; CAMPOS, M. T. V. A. Flora da Reserva Ducke, Amazonas, Brasil: Rubiaceae. Zappi Rodriguésia, 58(3):549-616, 2007.

TEIXEIRA, J. B. A.; NOGUEIRA, M. S. Câncer gástrico: fatores de risco em clientes atendidos nos serviços de atenção terciária em um município do interior paulista. Revista Latino-Americana de Enfermagem, 11( 1): 43-8, 2003.

TESTA, G.; OLIVEIRA, P. R. N.; SILVA, CLEUZA, C.; SCHUQUEL, I. T. A.; SANTIN, S. M. O.; KATO, L.; OLIVEIRA, C. M., A.; ARRUDA, L. L. M.; BERSANI-AMADO, C. A.Chemical constituents of the leaves and anti-inflammatory activity evaluation of extracts of roots and leaves of Guettarda pohliana Mull. Arg. (Rubiaceae). Química Nova, 35(3):527-529, 2012.

TIGOUFACK, I. B. N.; NGNOKAM, D.; TAPONDJOU, L. A.; HARAKAT, D.; VOUTQUENNE, L. Cycloartane glycosides from leaves of Oxyanthus pallidus. Phytochemistry, 71(17):2182-2186, 2010.

TOMAZ, A. C. A.; NOGUEIRA, R. B. S. S.; PINTO, D. S. M.; AGRA, M. F.; SOUZA, M. F. V. S.; CUNHA, E. V. L. Chemical constiuents from Richardia grandifl ora (Cham. & Schltdl.) Steud. (Rubiaceae). Brazilian Journal of Pharmacognosy, 18( 1): 47-52, 2008.

209

TUCHINDA, P.; SAIAI, A.; POHMAKOTR, M.; YOOSOOK, C.; KASISIT, J.; NAPASWAT, C.; SANTISUK, T.; REUTRAKUL, V. Anti-HIV-1 cycloartanes from leaves and twigs of Gardenia thailandica. Planta Medica-Natural Products and Medicinal Plant Research, 70(4):366-369, 2004.

UDDIN, N.; HOSSAIN, M. K.; HAQUE, M. R.; HASAN, C. M. Chemical investigation of Paederia foetidae (Rubiaceae). Asian Journal of Chemistry, 25(2):1163-1164, 2013.

VALVERDE, J.; TAMAYO, G.; HESSE, M. [beta]-Carboline monoterpenoid glucosides from Palicourea adusta. Phytochemistry, 52(8):1485-1489, 1999.

VAN DE SANTOS, L.; FETT NETO, A. G.; KERBER, V. A.; ELISABETSKY, E.; QUIRION, J. C.; HENRIQUES, A. T. Indole monoterpene alkaloids from leaves of Psychotria suterella Mull, Arg, (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 29(11):1185-1187, 2001.

VEROTTA, L.; PILATI, T.; TATÒ, M.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. Pyrrolidinoindoline Alkaloids from Psychotria colorata. Journal of Natural Products, 61(3):392-396, 1998.

VERPOORTE, R.; PUIGROK, C. L. M.; BERARHEIM, S. A. Medicinal plants of Surinam. II- Antimicrobial active alkaloids from Aspidosperma marcgravianum. Planta Medica, 46:149-52, 1982.

VERPOORTE, R.; PUIGROK, C. L. M.; BERARHEIM, S. A. Medicinal plants of Surinam. Planta Medica, 48:283-9, 1983.

VERSIANI, M. A., IKRAM, A., KHALID, S., FAIZI, S., & TAHIRI, I. A. Ixoroid: a new triterpenoid from the flowers of Ixora coccinea. Natural Product Communications, 7(7):831, 2012.

VIEGAS, C.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova, 29(2):326-337, 2006.

VON POSER, G. L.; TERRA SEIBT, L. Gardenoside from Tocoyena bullata. Biochemical Systematics and Ecology, 26(6):669-670, 1998.

WAGNER, H.; BLADT, S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. 2, Springer Verlag, 2001.

WEI, X.; XIE, H.; GE, X.; ZHANG, F. Iridoids from Dunnia sinensis. Phytochemistry, 53(8):837-840, 2000.

WEI-MIN, Z.; JUN-PING, X.; GUO-WEI, Q.; REN-SHENG, X. Two monoterpenes from fruits of Gardenia jasminoides. Phytochemistry, 37(4):1079-1081, 1994.

WENIGER, B.; ANTON, R.; VAREA, T.; QUIRION, J. C.; BASTIDA, J.; GARCIA, R. Indole alkaloids from Antirhea portoricensis. Journal of natural products, 57(2):287-290, 1994.

210

WENIGER, B.; JIANG, Y.; ANTON, R.; BASTIDA, J.; VAREA, T.; QUIRION, J. C. Oxindole alkaloids from Neolaugeria resinosa. Phytochemistry, 32(6):1587-1590, 1993.

WENIGER, B.; RAFIK, W.; BASTIDA, J.; QUIRION, J. C.; ANTON, R. Indole alkaloids from Antirhea lucida. Planta Medica-Natural Products and Medicinal Plant Research, 61(6):569-569, 1995.

WENIGER, B.; LOBSTEIN, A.; UM, B.; VONTHORON-SÉNÉCHAU, C.; ANTON, R.; USUGA, N. J.; BARAM, H.; LUGNIER, C. Bioactive triterpenoids from Vochysia pacifica interact with cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme PDE4. Phytotherapy Research, 19:75-77, 2005.

WENKERT, E.; CHANG, C. J.; CHAWLA, H. P. S.; COCHRAN, D. W.; HAGAMAN, E. W.; KING, J. C.; ORITO, K. General methods of synthesis of indole alkaloids. Short routes of construction of yohimboid and ajmalicinoid alkaloid systems and their C-13 Nuclear Magnetic-Resonance spectral analysis. Journal of the American Chemical Society, 98(12):3645-3655, 1976.

WENKERT, E.; LEICHT, C. L.; WICKBERG, B., Stereochemistry of ajmalicine and tetrahydroalstonine. Journal of the American Chemical Society, 83(24): 5037, 1961.

WHITE, R. J.; MARGOLIS, P. S.; TRIAS, J.; YUAN, Z. Targeting metalloenzymes: a strategy that works. Current Opinion in Pharmacology, 3(5):502-507, 2003.

WORLD HEALT ORGANIZATION, W. H. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing, WHO report: 303 P. 2009.

WU, L. J.; WANG, S. X.; HUA, H. M.; LI, X.; ZHU, T. R.; MIYASE, T.; UENO, A. 6-Methoxygeniposidic acid, an iridoid glycoside from Rubia cordifolia. Phytochemistry, 30(5):1710-1711, 1991.

WYNANTS, C.; TOPPET, S.; KILONDA, A.; HOORNAERT, G. Two triterpenoid saponins from Heinsia crinata. Phytochemistry, 36(6):1489-1492, 1994.

XIE, S.; SHI, Y.; WU, C.; WANG, Y.; LIU, W.; FENG, F.; XIE, N. Systematic identification and quantification of tetracyclic monoterpenoid oxindole alkaloids in Uncaria rhynchophylla and their fragmentations in Q-TOF-MS spectra. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 81-82:56-64, 2013.

XIN, W. B.; CHOU, G. X.; WANG, Z. T. Bis (monoterpenoid) indole alkaloid glucosides from Uncaria hirsuta, Phytochemistry Letters, 4:380-382, 2011.

XIN W.B., GU P., CHOU G.X., WANG Z. T. Studies on alkalodial constituents in leaves of Uncaria hirsuta. China Journal of Chinese Materia Medica, 33(17):2124-2128, 2008.

XU, Y. J.; FOUBERT, K.; DHOOGHE, L.; LEMIÈRE, F.; CIMANGA, K.; MESIA, K.; APERS, A.; PIETERS, L. Chromatographic profiling and identification of

http://europepmc.org/search?page=1&query=AUTH:%22Xin+WB%22

http://europepmc.org/search?page=1&query=AUTH:%22Gu+P%22

http://europepmc.org/search?page=1&query=AUTH:%22Chou+GX%22

http://europepmc.org/search?page=1&query=AUTH:%22Wang+ZT%22

http://europepmc.org/search?page=1&query=ISSN:%221001-5302%22

211

two new iridoid-indole alkaloids by UPLC–MS and HPLC-SPE-NMR analysis of an antimalarial extract from Nauclea pobeguinii. Phytochemistry Letters, 5(2):316-319, 2012.

YA-FANG, H.; CHEN, C.;KE-YI, D.; LIU, J. Research on color-forming property of three sulfur-containing iridoid-glucoside from Paederia scandens (Lour) Merrill (Rubiaceae) with amine-containing compounds I. preparation of iridoids, color-formation condition and property. Pige Kexue Yu Gongcheng, 23(1):5-10, 2013.

YAMAZAKI, M.; MOCHIDA, K.; ASANO, T.; NAKABAYASHI, R.; CHIBA, M.; UDOMSON, N.; YAMAZAKI, Y.; GOODENOWE, D. B.; SANKAWA, U.; YOSHIDA, T.; TOYODA, A.; TOTOKI, Y.; SAKAKI, Y.; GÓNGORA-CASTILLO, E.; BUELL, C. R.; SAKURAI, T.; SAITO, K. Coupling Deep Transcriptome Analysis with Untargeted Metabolic Profiling in Ophiorrhiza pumila to Further the Understanding of the Biosynthesis of the Anti-Cancer Alkaloid Camptothecin and Anthraquinones. Plant Cell Physiology, 54(5):686-696, 2013

YANG, L.; PENG, K.; ZHAO, S.; CHEN, L.; QIU, F. Monoterpenoids from the fruit of Gardenia jasminoides Ellis (Rubiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 50:435-437, 2013a.

YANG, L.; PENG, K.; ZHAO, S.; ZHAO, F.; CHEN, L.; QIU, F. 2-Methyl-l-erythritol glycosides from Gardenia jasminoides. Fitoterapia, 89:126-130, 2013b.

YÉPEZ, A. M. P.; DE UGAZ, O. L.; ALVAREZ, C. M. P.; DE FEO, V.; AQUINO, R.; DE SIMONE, F.; PIZZA, C. Quinovic acid glycosides from Uncaria guianensis. Phytochemistry, 30(5):1635-1637, 1991.

YILDIRIM, A.; MAVI, A.; KARA, A. A, Determination of antioxidant and antimicrobial activities of Rumex crispus L. extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(8):4083-4089, 2001.

YOKOSUKA, A.; SATO, K.; MIMAKI, Y. Cycloartane glycosides from the rhizomes of Curculigo orchioides. Phytochemistry, 71(17):2174-2181, 2010.

YOSHIMATSU, K.; SHIMOMURA, K. Emetic alkaloid formation in root culture of Cephaelis ipecacuanha. Phytochemistry, 30(2):505-507, 1991.

ZANI, C. L.; CHAVES, P. P, G.; QUEIROZ, R.; DE OLIVEIRA, A. B.; CARDOSO, J. E.; ANJOS, A. M. G.; GRANDI, T. S. M. Brine shrimp lethality assay as a prescreening system for anti-Trypanosoma cruzi activity. Phytomedicine, 2(1):47-50, 1995.

ZENG, D.; CHEN, L.; XU, H.; YANG, K. Antifeedant activity of Catunaregam spinosa fruit extracts against Plutella xylostella. Journal of South China Agricultural University, 28, 2005.

212

ZHAO, W.; XU, J.; QIN, G.; XU, R. Saponins from Mussaenda pubescens. Phytochemistry, 39(1):191-193, 1995.

ZHAO, W.; YANG, G.; XU, R.; QIN, G. Three monoterpenes from Mussaenda pubescens. Phytochemistry, 41(6):1553-1555, 1996.

ZHENG, W.; WANG, S. Y. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of agricultural and Food Chemistry, 49(11):5165-5170, 2001.

ZHI-JUN, W.; JIAN-HUA, W.; DONG-MEI, F.; GUO-LIN, Z. Analysis of iridoid glucosides from Paederia scandens using HPLC-ESI-MS/MS. Journal of chromatography. B., 923-924:54-64, 2013.

ZHOU, Z.; JIANG, S. H.; ZHU, D. Y.; LIN, L. Z.; A CORDELL, G. Anthraquinones from Knoxia valerianoides. Phytochemistry, 36(3):765-768, 1994.

ZULETA, L. M. C. Estudos Químicos e Biológicos das Cascas de Calycophyllum Spruceanum Benth, Dissertação de Mestrado. Química de Produtos Naturais, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 68pp.,1997.

ZULETA, L. M. C.; CAVALHEIRO, A. J.; SILVA, D. H. S.; FURLAN, M.; YOUNG, M. C. M.; ALBUQUERQUE, S.; CASTRO-GAMBOA, I.; BOLZANI, V. S. seco-Iridoids from Calycophyllum spruceanum (Rubiaceae). Phytochemistry, 64(2):549-553, 2003.

213

7. ANEXOS

Anexo 1 - Relação das classes de substâncias caracterizadas em espécies da família Rubiaceae (de 1990 a 2013)*.

Espécie Composto (s) Referência (s) Adina cordifolia Cumarinas IQBAL et al., 2009

Adina rubella Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólicos FAN e HE., 1997

Triterpenos pentacíclicos glicosilados HE et al., 1996

Alberta magna Iridoides: iridolactonas Ciclopentenos dialdeídicos DREWES et al., 1998

Alangium lamarckii Alcaloides de Ipeca ITOH et al., 1999b

Alibertia myrciifolia Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico Flavonoides: flavonas Cumarinas metoxiladas

LUCIANO et al., 2004

Anthocepalus cadamba Esteroides AUGUSTA et al., 1998

Anthocephalus chinensis Iridoides e seco-iridoide glicosilado Apiglicosídeos fenólicos Alcaloides indólicos

KITAGAWA et al., 1996

Antirhea acutata Triterpeno-metilesteres: nor-seco-cicloartano LEE et al., 2001 Antirhea lucida Alcaloides indólicos WENIGER et al.,1995 Antirhea portoricensis Alcaloides indólicos WENIGER et al., 1994 Argostemma yappii Alcaloides pirrolidinoindolicos SARGENT e WAHYUNI, 2000 Borreria verticillata Alcaloides bis-indólicos BALDE et al., 1991b Burchellia bubalina Iridoides DREWES et al., 1998 Calycophyllum spruceanum seco-Iridoides glicosilados ZULETA et al., 2003 Camptotheca acuminata Alcaloides: der. da camptotecina e camptotecina LORENCE et al., 2004

214

Canthium berberidifolium Iridoides glicosilados Fenólicos diglicosilados KANCHANAPOOM et al., 2002a

Canthium multiflorum Monoterpenos FOGUE et al, 2013

Canthium schimperianum Glicosídeo cianogênico esterificados com iridoides glicosilados SCHWARZ et al., 1996

Carapichea affinis Alcaloides e Iridoides BERNHARD et al., 2011

Catunaregam nilótica Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólicos LEMMICH et al., 1995

Catunaregam spinosa Saponinas triterpênicas GAO et al., 2011

Cephaelis acuminata Monoterpenos tetraidroisoquinolínico glicosilado ITOH et al., 2002 Alcaloides eméticos ITOH et al., 1999a

Cephaelis acuminata Alcaloides de Ipeca ITOH et al., 1999b Cephaelis alba Iridoides seco-Iridoide CARBONEZI et al., 1999

Cephaelis dichroa Alcaloides indólicos Alcaloides indólicos glicosilados SOLIS et al., 1993

Cephaelis ipecacuanha

Monoterpenos tetraisoquinolinicos glicosilados ITOH et al., 1994 Alcaloides eméticos YOSHIMATSU et al., 1991 Nor-seco-pimarano ARGAEZ et al., 2001 Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos BHATTACHARYYA et al.,1992 Alcaloides quinolínicos EL ABBADI et al., 1989

Cephalanthus glabratus Alcaloides oxindólico JORGE et al., 2006 Chassalia curviflora var, ophioxyloides Alcaloides indólicos monoterpênicos SCHINNERL et al., 2012

Chiococca alba

Saponinas BORGES et al., 2013 Cetoalcoois Fenilcumarinas Lignanas

EL-HAFIZ et al., 1991

Chiococca braquiata Flavonoides Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico BOLZANI et al., 2001

215

Chione venosa Acetofenonas Iridoides glicosilados Triterpenos tetraciclicos

LENDL et al., 2005

Cinchona ledgeriana Alcaloides cinchona SHOJI et al., 2013 Alcaloides cinchona MAEHARA et al., 2012

Cinchona robusta Antraquinonas Der. de fenilpropanoides SCHRIPSEMA et al., 1999

Coffea sp Alcaloides púricos ASHIHARA et al., 2008

Coffea bengalensis Alcaloide: cafeína Diterpeno (16-epicafestol) BEGUM et al., 2003

Coffea canephora e Coffea arabica Carotenoides SIMKIN et al., 2010 Corynanthe pachyceras Alcaloides indólicos STAERK et al., 2000 Coussarea brevicaulis Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico SU et al., 2003 Coussarea hydrangeifolia Der. glicosilados de fenilpropanoides HAMERSKI et al., 2005ª

Crossopteryx febrífuga Triterpenos pentacíclicos glicosilados: derivado ursólico NGALAMULUME et al., 1991

Crotalaria emarginella Triterpenos AHMED et al., 2006 Crucianella graeca Cruciata glabra Cruciata laevipes Cruciata pedemontana

Cumarinas e Iridoides MITOVA et al., 1996a

Crucianella marítima Antraquinonas EL-LAKANY et al., 2004

Cruckshanksia pumila Iridoides Secologanina PIOVANO et al., 2003

Curculigo orchioides Glicosideos cicloartano YOKOSUKA et al., 2010

Damnacanthus indicus Antraquinonas KOYAMA et al., 1992a triterpenos CAI e HUANG, 2012

216

Deppea blumenaviensis Alcaloide β-carbolínico KAN-FAN et al., 1995 Dunnia sinensis Iridoides glicosilados WEI et al., 2000 Duroia hirsuta Iridoide lactona PAGE et al., 1994 Enterospermum madagascariensis Sesquiterpenos: der. cadinano e guaiano RAHARIVELOMANANA et al., 2005

Enterospermum pruinosum Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólicos RASOANAIVO et al., 1995

Exostema acuminatum nor-Diterpenos 4-Fenilcumarinas ITO et al., 2000

Fadogia agrestis Monoterpenos glicosilados ANERO et al., 2008

Fadogia homblei

Cumarinas Flavonas Triterpenos Lignanas

MOHAMMED et al., 2013

Fernelia buxifolia Fenóis NEERGHEENA et al., 2006 Galianthe brasiliensis Iridoides glicosídeos MOURA et al., 2005 Galianthe thalictroides Alcaloides indólicos monoterpênicos FERNANDES et al., 2013 Galium álbum Iridoides glicosilados: der. Acetoxiloganina HANDJIEVA et al., 1996 Galium lovcense Iridoides glicosilados: der. Acetoxiloganina HANDJIEVA et al., 1996 Galium incurvum Iridoides glicosilados MITOVA et al., 1996b Galium macedonicum Iridoides: macedonina não glicosilada MITOVA et al., 1996c Galium sinaicum Antraquinonas, Antraquinonas glicosiladas EL-GAMAL et al., 1996

Galium verum Antraquinonas BANTHORPE et al., 1995 Iridoides glicosilados RASMUSSEN et al., 2006

Gardenia collinsae Triterpenos NUANYAI et al., 2011

Gardenia jasminoides

Iridoides glicosilados CHEN et al., 2009 Ácido ferrulíco MOON et al., 2002 Iridoides glicosilados LEE et al., 1998 Monoterpenos WEI-MIN et al., 1994

217

Substâncias voláteis BUCHBAUER et al., 1996 Monoterpenos YANG et al., 2013a Iridoides glicosilados YANG et al., 2013b

Gardenia saxatilis Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico SUKSAMRARN et al., 2003

Gardenia sootepensis Sesquiterpeno Flavonoides: flavonas Der. do ácido benzoico

RUKACHAISIRIKUL et al., 1998

Gardenia thailandica Cicloartano TUCHINDA et al., 2004 Gardenia fructus Monoterpenos glicosilados AKIHISA et al., 2012 Genipa americana Iridoides glicosilados ONO et al., 2006 Guettarda noumeana Alcaloides quinolínicos MONTAGNAC et al., 1997 Guettarda pohliana Monoterpenos e triterpenos TESTA et al., 2012 Hamelia magniflora Alcaloides indólicos RUMBERO et al., 1991 Hamelia patens Alcaloide oxindólico monoterpênico PANIAGUA-VEGA et al., 2012 Hedyotis Alcaloides bis- indólico LAJIS E AHMAD, 2006

Hedyotis capitellata

Furanoantraquinonas AHMAD et al., 2005 Alcaloides, saponinas,taninos e antranoides LAI et al., 2001 Alcaloides s-carbolinicos PHUONG et al., 1999 Alcaloides indolicos monoterpenicos PHUONG et al., 1998

Hedyotis chrysotricha Alcaloides s-carbolinico PENG et al., 1997

Hedyotis corymbosa Der. asperulosideos e scandosideos SUDARSONO, et al., 2004 Iridoides SUDARSONO, et al., 1999

Hedyotis difusa Iridoides glicosilados XU et al., 2010 Hedyotis hedyotidea Iridoides PENG et al., 1998 Hedyotis herbácea Flavonoides HAMZAH et al., 1996 Hedyotis nudicaulis Saponinas triterpenicas: der. oleanólicos KONISHI et al., 1998 Heinsia crinata Triterpenos pentacíclicos glicosilados WYNANTS, et al., 1994

218

Heterophyllaea pustulata Antraquinonas NÚNEZ-MONTOYA et al., 2005 Antraquinonas KONIGHEIM et al., 2012

Hintonia latiflora Fenilcumarinas Fenilestireno MATA et al., 1992

Hymenodictyon floribundum Glicosídeos: der. da scopoletina e ƒÀ-sitosterol MITAINE-OFFER et al., 2003 Isertia haenkeana Alcaloides indólicos BRUIX et al., 1993

Ixora coccínea

Triterpeno pentacíclico: der. ursólico LATHA et al., 2001 Protocianinas IDOWU et al., 2010

Iridoides VERSIANI et al., 2012 IKRAM et al., 2013

Knoxia valerianoides Antraquinonas ZHOU et al., 1994

Lasianthus fordii

Megastigmane glucosídeos Iridoides glicosilados Megastigmane glucosídeos Iridoides glicosilados

TAKEDA et al., 2004

Lasianthus gardneri Triterpenos tetracíclicos: der. seco-lupanos DALLAVALLE et al., 2004 Lerchea bracteata Alcaloide corinantano quaternário ARBAIN et al., 1993 Margaritopsis cymuligera Alcaloides pirrolidinoindoline BRAND et al., 2012 Mitracarpus frigidus Compostos naftoquinônicos FABRI et al., 2012

Mitracarpus scaber Hidroquinona diglicosídeo HAROUNA et al., 1995 Substâncias voláteis: ácidos EKPENDU et al., 1993

Mitracarpus villosus Fitoesterois Triterpeno pentacíclico: der. ursólico EKPENDU et al., 2001

Mitragyna inermis 27-Nor-triterpenos glicosilados: der. oleanólico CHENG et al., 2002 Alcaloides indólicos DONFACK et al., 2012

Mitragyna parvifolia Alcaloides oxindólicos PANDEY et al., 2006 Mitragyna rotundifolia Saponinas triterpênicas KANG e HAO, 2006 Mitragyna speciosa Alcaloides indólicos TAKAYAMA et al., 2004

219

Molopanthera paniculata Iridoides glicosilados KATO et al., 2012

Morinda citrifolia

Antraquinonas glicosiladas KAMIYA et al., 2009 Antraquinonas HEMWIMON et al., 2007 Ácidos graxos glicosilados KIM et al., 2010 Constituintes apolares: E-phitol, der. cicloartano, stigmasterol e sitosterol, cetoesteroides SALUDES et al., 2002

Iridoides glicosilados SANG et al., 2003 Antraquinonas BASSETTI et al., 1995

Morinda coreia

Iridoides glicosilados Fenolicos diglicosilados Seco-iridoides Antraquinonas glicosiladas

KANCHANAPOOM et al., 2002b

Morinda elliptica Antraquinonas ABDULLAH et al., 1998 ISMAIL et al., 1997 CHIANG e ABDULLAH, 2007

Morinda longíssima Scopoletina PHAM et al., 2005 Morinda lucida Antraquinonas RATH et al., 1995

Morinda morindoides Flavonoides O-glicosilados CIMANGA et al., 1995 Flavonoides e iridoides CIMANGA et al., 2006 Flavonoides e saponinas CIMANGAA et al., 2010

Morinda officinalis Monoterpenos SHIN et al., 2013 Antraquinonas LIU et al., 2012a

Morinda pandurifolia Antraquinonas e iridoide glicosilado RUKSILP et al., 2011

Morinda pubescens Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos e der. oleanólicos glicosilados SAMOYLENKO et al., 2006

Morinda umbellata Antraquinonas CHANG e CHENG, 1995 Mussaenda incana Iridolactona e Iridoide glicosilado DINDA et al., 2005

220

Mussaenda roxburghii Iridoides CHANDRA et al., 2012

Mussaenda pubescens Lactonas monoterpênicas ZHAO et al., 1996 Saponinas triterpênicas: der. oleanólicos ZHAO et al., 1995

Myonima obovata Fenois NEERGHEENA et al., 2006 Myonima nitens Fenois NEERGHEENA et al., 2006 Myrioneuron faberi Alcaloides carbolínicos indólicos SHENG-DIAN et al., 2013

Nauclea diderrichii Saponinas triterpênicas: der. oleanólicos LAMIDI et al., 1995 Alcaloides gluco-indólicos LAMIDI et al., 2005

Nauclea latifólia Alcaloides indólicos AGOMUOH et al., 2013

Nauclea officinalis Alcaloides indólicos SUN et al., 2008 Alcaloides indólicos LIEW et al., 2012 Triterpenos TAO et al., 2012

Nauclea orientalis Alcaloides monoterpênico tetraidro-ƒÀ-carbolinicos glicosilados triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos HE et al., 2005

Alcaloides indólicos SICHAEM et al., 2010

Nauclea pobeguinii Alcaloides indólicos Iridoides XU et al., 2012

Nauclequiniina Alcaloides indólico ANAM et al., 1997 Nematostylis anthophylla Saponinas DAI et al., 2013 Neolaugeria resinosa Alcaloides oxindólicos WENIGER et al., 1993

Neonauclea purpurea Alcaloides quinolínicos KARAKET et al., 2012 Alcaloides indólicos KARAKET et al., 2012

Neonauclea sessilifolia

Seco-iridoides glicosilados e alcaloides indólicos glicosilados ITOH et al., 2003b

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos KANG et al., 2003 Saponinas triterpênicas: der. oleanólicos ITOH et al., 2003b

Ochreinauclea maingayii Alcaloides indólicos MUKHTAR et al., 2012

221

Oldenlandia corymbosa Iridoides glicosilados OTSUKA et al., 1991

Oldenlandia difusa Triterpenos pentacíclicos: der. ursólicos KIM et al., 1998 Triterpenos pentacíclicos: der. ursólicos e oleanólicos LU et al., 1996

Oldenlandia filistipula Alcaloides normalindina ARBAIN et al., 1993 Oldenlandia umbellata Antraquinonas SIVA et al., 2012 Ophiorrhiza blumeana Alcaloides indólicos ARBAIN et al., 1998a Ophiorrhiza bracteata Alcaloide glucoindólico quaternário ARBAIN et al., 1997a Ophiorrhiza communis Alcaloides indólicos ARBAIN et al., 1997b Ophiorrhiza hayatana Antraquinonas CHAN et al., 2005 Ophiorrhiza kunstleri Alcaloides indólicos ARBAIN et al., 2000 Ophiorrhiza liukiuensis Monoterpenos glicosilados KITAJIMA et al., 2005

Ophiorrhiza pumila

Alcaloides: der. camptotecinas SAITO et al., 2001 Antraquinonas KITAJIMA et al., 1998 Antraquinona Alcaloides YAMAZAKI et al., 2013

Ophiorrhiza rosácea Alcaloides indólicos ARBAIN et al., 2000 Ophiorrhiza rugosa var decumbens Antraquinonas RAVEENDRAN et al., 2012 Ophiorrhiza trichocarpon Alcaloides indólicos KITAJIMA et al., 2013 Oxyanthus pallidus Glicosídeos cicloartano TIGOUFACK et al., 2010 Paederia foetidae Ácido fenólico UDDIN et al., 2013

Paederia scandens

Iridoides SUZUKI e ENDO, 2004 Iridoides glicosilados QUANG et al.,2002 Iridoides glicosilados ZHI-JUN et al., 2013 Iridoides glicosilados YA-FANG et al., 2013 Iridoides glicosilados LIU et al., 2012b

Palicourea acuminata Alcaloide Iridoide BERGER et al., 2012

222

Palicourea adusta Monoterpenos s-carbolinicos glicosilados Der. do ácido hidroxicinamico VALVERDE et al., 1999

Palicourea coriácea Alcaloide indólico monoterpênico glicosilado NASCIMENTO et al., 2005 Palicourea rígida Alcaloide indolico SOARES et al., 2012 Pausinystalia johimbe Alcaloides indólicos monoterpênicos RAMAN et al., 2013

Pavetta owariensis

Proantocianidina Flavonoides Proantocianidina Ésteres der. do ácido ferrulíco

BALDE et al., 1991

Pentas bussei Naftoiidroquinonas pentacíclicas BUKURU et al., 2003 Pentas lanceolata Quinonas ENDALE et al., 2012a

Pentas longiflora Der. naftoquinoides HARI et al., 1991 Quinonas ENDALE et al., 2012a

Pentas micranta Antraquinonas ENDALE et al., 2012

Prismatomeris connata Antraquinonas glicosiladas HAO et al., 2011 Fenolico glicosilados e iridoides SHIXIU et al., 2012

Pseudrocedrela kotschyi tetranortriterpenes DAL-PIAZ et al., 2012 Psychotria barbiflora b-Carboline alkaloids OLIVEIRA et al., 2013 Psychotria brachyceras Alcaloides indólicos monoterpênicos NASCIMENTO et al., 2013 Psychotria camponutans Naftoquinonas, Psychorubrina e quinonas JACOBS et al., 2008 Psychotria colorata Alcaloides pirrolidinoindólicos VEROTTA et al., 1998

Psychotria correae Alcaloides indólicos Der. C13-nor-isoprenoides Carotenoides

ACHENBACH et al., 1995

Psychotria glomerulata Alcaloides quinolínicos SOLIS et al., 1997 Psychotria ipecacuanha Alcaloides emeticos GARCIA et al., 2005 Psychotria leiocarpa Alcaloide indólico monoterpênico LOPES et al., 2004

223

Psychotria myriantha Alcaloide ácido estrictosidínico FARIAS et al., 2010 Alcaloides indólicos monoterpênicos FARIAS et al., 2012

Psychotria oleoides P, lyciiflora Alcaloides pirrolidinoindolicos JANNIC et al., 1999

Psychotria suterella Alcaloide indolico monoterpênico VAN DE SANTOS et al., 2001 Psychotria umbellata Monoterpenos e alcaloide indólico FRAGOSO et al., 2008 Psychotria viridis Alcaloide: dimetiltriptamina BLACKLEDGE et al., 2003 Randia dumetorum Iridoides glicosilados JANGWAN et al., 2013 Randia formosa Saponinas triterpenicas der. ursólicos e oleanólicos SAHPAZ et al., 2000 Randia nilótica Saponinas DANJUMA et al., 2013

Randia siamensis Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólicos e ursólicos JANSAKUL et al., 1999

Randia spinosa Iridoides glicosilados HAMERSKI et al., 2003 Remijia peruviana Alcaloides da chinchona RUIZ-MESIA et al., 2005 Ronabea emética Iridoides BERGER et al., 2011 Rothmannia longiflora 4 oxonicotinamide 1-(1'- beta-dextro ribofuranosideo) BRINGMANN et al., 1999 Rothmannia urcelliformis Iridoide alcaloidal BRINGMANN et al., 2001 Rubia akane Antraquinona aldeído MORIMOTO et al., 2002

Rubia cordifolia

Componentes do óleo essencial: mollugina, furomollugina, e (E)-anetol MIYAZAWA e KAWATA, 2006

Naftoquinonas Antraquinonas MIYAZAWA e KAWATA, 2006

Iridoides glicosilados: der. geniposídeos WU et al., 1991 Antraquinonas KHAN et al., 2012

Rubia peregrina Antocianidinas LONGO et al., 2007

Rubia schumanniana Digiferruginol glicosilado Antraquinonas glicosiladas LIU et al., 1991

224

Rubia tinctorum

Antraquinonas MAREC et al., 2001 Antraquinonas: Hidroximetilantraquinonas Antraquinonas glicosiladas Iridoide: asperulosideo

EL-EMARY et al., 1998

Antraquinonas PERASSOLO et al., 2007 ORBÁN et al., 2008

Rubia yunnanensis Hexapeptídeos cíclicos FAN et al., 2010 Schumanniophyton problematicum Alcaloide quinolínico KUMARA et al., 2013 Sickingia species Alcaloides glicoindolicos AQUINO et al., 1994

Simira glaziovii Esteróides, alcaloides: der. harmanos e opiorinicos Monoterpenos β-carbolinicos tetraacetilglucosideos BASTOS et al., 2002

Spermacoce verticillata Ácidos graxos Monoterpenos EKPENDU et al., 2001

Triterpenos, flavonoides e antraquinonas FERREIRA et al., 2012 Tarenna madagascariensis Iridoides glicosilados e polifenóis DJOUDI et al., 2007 Timonius timon Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos KHAN et al., 1993

Tocoyena brasiliensis Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanolicos Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos HAMERSKI et al., 2005

Tocoyena bullata Iridoides glicosilados VON POSER et al., 1998 Tocoyena formosa Iridoides BOLZANI et al., 1997 Tricalysia dúbia Diterpenos NISHIMURA et al., 2006 Trichilia emética Tetra-nor-triterpenos DAL-PIAZ et al., 2012

Uncaria

Alcaloides Terpenes Flavonoides Cumarinas

HEITZMAN et al., 2005

Uncaria callophylla Alcaloides indólicos dimericos KAM et al., 1991

225

Uncaria elliptica Alcaloides pentacíclicos oxindólicos DIYABALANAGE et al., 1997 Uncaria glabrata Glucoalcaloide indólico monotêrpenico ARBAIN et al., 1998b

Uncaria guianensis Alcaloides LAUS e KEPLINGER, 2003 Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. ursólicos YÉPEZ et al., 1991

Uncaria hirsuta Alcaloide bis-indólico monoterpênico glicosilado XIN et al., 2011 Uncaria longiflora var, pteropoda Alcaloides oxindólico pentacíclico SALIM e AHMAD 1978 Uncaria macrophylla Alcaloides oxindólicos SAKAKIBARA et al., 1998

Uncaria rhynchophylla Flavonoides HOU et al., 2005 Alcaloides oxindólicos e indólicos LAUS e TEPPNER, 1996 Alcaloides oxindólicos XIE et al., 2013

Uncaria tomentosa

Alcaloides indólicos Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólico MONTORO et al., 2004

Alcaloides indólicos glicosilados e β-carbolinicos Triterpenos pentacíclicos: der. ursólico KITAJIMA et al., 2001

Alcaloides oxindólicos Iridoides glicosilados MUHAMMAD et al., 2001

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. ursólicos AQUINO et al., 1997 Alcaloides indólicos LAUS e KEPLINGER, 1994 Alcaloides oxindólicos LAUS e KEPLINGER, 1994 Alcaloides oxindólicos pentacíclico GARCÍA-PRADO et al., 2007 Alcaloide oxindólico monoterpênico ROJAS-DURAN et al., 2012

Uncaria villosa Alcaloides indólicos MATSUO et al., 2011

Wendlandia tinctoria Iridoides glicosilados DINDA et al., 2011a Iridoides glicosilados DINDA et al., 2011b

* Essa busca foi realizada utilizando os portais www.sciencedirect.com e CAS-Scifinder.

226

Anexo 2: Espectros de massas dos alcaloides isolados de D. macrophylla.

Alcaloide 10-metoxi-ajmalicina (substância V)

Mistura dos alcaloides 9-metoxi-3-isoajmalicina com 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância VIII e IX)

227

Alcaloide 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina (substância X)

Alcaloide 10-metoxi-3-isorauniticina (substância XI)

228

Alcaloide 10-metoxi-rauniticina (substância XII)

229 Anexo 3: Dados de RMN de 13C dos alcaloides isolados de D. macrophylla.

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HOCH3

10-metoxi-ajmalicina

(substância V)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

H

OCH3

11-metoxi-ajmalicina

(substância VI)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

H

OCH3

11-metoxi-3-isoajmalicina

(substância VII)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

9-metoxi-3-isoajmalicina

(substância VIII)

Posição δC δC δC δC 2 136,9 139,5 134,5 138,9 3 61,3 61,0 55,4 54,6 5 54,4 54,4 50,0 47,4 6 22,8 24,8 22,9 20,0 7 108,3 108,6 108,6 107,5 8 128,6 134,4 134,4 118,8 9 101,0 122,2 122,2 155,1 10 154,9 99,9 99,5 99,9 11 111,4 155,7 154,9 122,2 12 112,4 105,0 105,0 105,8 13 132,8 139,5 137,5 132,5 14 34,4 34,7 33,5 33,5 15 32,4 32,5 32,5 32,4 16 111,1 111,2 111,2 109,2 17 156,0 156,0 156,0 156,2 18 18,8 18,2 18,2 18,3 19 73,3 73,6 73,6 74,0 20 39,5 39,3 38,1 39,1 21 57,1 57,0 57,0 63,4 22 168,0 168,4 168,4 167,5 23 51,3 51,1 51,1 50,9 24 56,1 55,2 55,2 55,4

230 Anexo 3: Dados de RMN de 13C dos alcaloides isolados de D. macrophylla.

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HO

CH3

9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina

(substância IX)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HOCH3

10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina

(substância X)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HOCH3

10-metoxi-3-isorauniticina

(substância XI)

NH

N

O

OO CH3

CH3

HH

HOCH3

10-metoxi-rauniticina

(substância XII)

Posição δC δC δC δC 2 138,9 135,9 140,0 137,0 3 55,1 55,8 55,1 64,0 5 48,6 50,6 49,5 55,0 6 24,9 17,6 21,2 22,6 7 107,5 108,0 109,9 109,0 8 118,8 129,1 126,5 124,3 9 155,1 100,7 100,0 111,6 10 99,9 155,0 154,3 154,0 11 122,2 111,3 111,0 111,4 12 105,8 112,8 111,3 100,2 13 132,5 132,4 130,7 131,1 14 38,8 31,7 31,2 34,0 15 31,7 32,5 25,1 21,8 16 109,2 109,0 105,4 111,0 17 156,2 156,3 157,2 157,2 18 18,3 18,2 17,1 18,4 19 76,0 76,0 75,8 75,7 20 43,8 44,2 36,6 36,5 21 63,4 47,7 53,2 57,0 22 167,5 167,4 167,3 167,4 23 50,9 50,7 51,0 51,0 24 55,4 54,0 55,6 55,7

estudo quÍmico e biolÓgico de - ppbio.inpa.gov.br · resumo . as espécies pertencentes à...

Documents