etude de la résistance des cellules souches de la peau...
TRANSCRIPT
Etude de la résistance des cellules souches de la peau
humaine au rayonnement par les puces à haute densité
Walid Rachidi
Laboratoire Lésions des acides Nucléiques (LAN)
INAC / SCIB / Laboratoire Lésions des Acides Nucléiques W.Rachidi, 11 septembre 2008
Peau humaine
épiderme
derme
hypoderme
10 follicules pileux, 100 glandes sudoripares, 2500 cellules sensorielles,
3 m des capillaires, 12 m de fibres nerveuses1 cm2 X 3 mm de profondeur
Structure de l’épiderme
Couche basale
Couche épineuse
Couche granuleuse
Couche cornée
prolifération
Différenciation+
Différenciation++
Différenciation terminale+++
Cellules souches et AT
Kératinocyte épineux
Kératinocyte granuleux
Cornéocyte
COUCHE BASALE
Kératinocyte souche
Cellule-fille souche Cellules AT (d’amplification transitoire) Proliférantes renouvellement du tissu.
Division asymétrique
Modèle de l'épiderme humain interfolliculaire
En culture : test des colonies
méroclones
AT
holoclones
= souches
paraclones
Peau
Lésions immédiates
(brûlure, inflammation …)
Effets tardifs
Séquelles (nécrose, kératose)
Tumeurs cutanées
Peau et irradiations
Hypothèse: les cellules basales sont à l'origine des lésions
basal cellcarcinoma
Mutations dans les cellules AT/souches ?
Objectifs
Deux objectifs principaux :
1- Isoler et caractériser les cellules de la couche basale
(cellules à risque)
2- Etudier leur radiosensibilité différentielle
Souches AT
LGRK : Isolement des 3 populations
Intégrine α6
CD
71
0.1%
8-10%
Kératinocytes AT
Kératinocytes souches
Toxicité à court (24, 48 et 72h
et long terme (14 jours) :
XTT et survie clonale
Radiosensibilité différentielle
Dégâts de l’ADN
δ-H2AX (cassure double brin)
Génomique Fonctionnelle :
Transcriptomeα6+CD71-
α6+CD71+
Kératinocytes souches
Kératinocytes AT
2 Gy
2 Gy
Toxicité à long terme: survie clonale à 15 j (2Gy)
*
*
nb de coloniesnb cellules
ensemencées
CFE = n = 3p < 0.05
Colony Forming Efficiency
0
2
4
6
8
10
12
TA KSC
controlirradiated
Stem cells
Colony Forming Efficiency
0
2
4
6
8
10
12
TA KSC
controlirradiated
0
2
4
6
8
10
12
KSC
controlirradiated
Colony Forming Efficiency
AT Cellules souches
0Gy 2Gy2Gy 0Gy 2Gy2Gy
Résultats
kératinocytes AT: radio-sensibleskératinocytes souches:
radio-résistants
mécanismes ?
Signalisation, réparation de l’ADN??
AT
Souches
et 24 h…
05
1015202530354045
0 5 15 30
Temps (min)
Foci
per
cel
l
Proliférants
Souche
Comptage des foyers d’γ-H2AXMarquage des foyers d’γ-H2AX (cassure d’ADN double brin)
Réparation de l’ADN
Les kératinocytes souches ont une efficacité de réparation de l’ADN très rapide par rapport aux kératinocytes proliférants ou AT.
Décroissance très rapide du nombre des cassures d’ADN double brin dans les kératinocytes souches par rapport aux kératinocytes proliférants
Questions reposées
• Quels sont les mécanismes responsables d’une telle réparation chez les kératinocytes souches?
• Quels sont les gènes pouvant être impliqués dans ces mécanismes?
Puces: générateur d'hypothèseNombre de cellules : 10 000 à 50 000Amplification de l’ARNm Marquage fluorescent indirect (Cy5 ou Cy3)Puces à oligonucléotides longs (~60 mers) spottées avec 26496 dépôts (espèce Homme)4 réplicats techniques (2 dye swap)Liste des gènes modulés : Test de Student, p = 0,005Gènes sur-exprimés : rapport > 1,5Gènes sous-exprimés : rapport <0,66
Réponse spécifique des cellules souches à l’irradiation
4700 genes166
gènes227
SoucheAT
other specific pathways
DNA repairXRCC5, RAD52,
RAD23B, XAB1, BCCIP
cell signallingCHK1
Réseaux d’interaction géniques
Most significant networkin irradiated stem cells: cytokines
Ingenuity
up- regulated
genes
Upregulated FGF2 pathway in stem cells
FGF2
H-Ras
CREB
FGF-R1
SHP2
MEK1
ERK1/2
Radioresistance ?
extracellular
cytoplasm
nucleus
GRB2
Summary:
progenitors and stem cells can be purified
progenitors radiosensitive, both shortand long-term
stem cells radioresistant
mechanisms : apoptosis inhibition, faster DNA repair and activated signalling
FGF2 and DNA repair?Radioresistance of stem cells and high cancer
frequency?
FGF2 signalling is critical for FGF2 signalling is critical for DNA repair in human DNA repair in human epidermal stem cellsepidermal stem cells
•• Blocking FGF2 signalling inhibited the Blocking FGF2 signalling inhibited the rapid decrease of gH2AX foci in stem cells, rapid decrease of gH2AX foci in stem cells, suggesting a direct role of FGF2 in DNA suggesting a direct role of FGF2 in DNA repairrepair
Very freshly result!!!Very freshly result!!!
Merci pour votre attention