etude de l'activité enzymatique pour la détection des...
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
1 - ETUDE DE LACTIVITE ENZYMATIQUE
POUR LA DETECTION DES ENTEROBACTERIES
EN EAU DE MER
H MELlKECHI - M POMMEPUY - MP CAPRAIS
SOMMAIRE
INTRODUCTION 1
A - MATERIEL ET METHODES 3
1- MATERIEL 3
2 - METHODES 4
3 - EXPERIMENTATIONS 5
31 - Etude de la souche dE coli DI0407 induite 5
J11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer 5 J12 Etude de la persistance de lactiviteacute 13 -galactosidase en fonction
de la viabiliteacute des bacteacuteries 6
3121 Effet du chlorampheacutenicol 6 J122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation 6 3123 Effet du chlore 6 3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature 6
J1J Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enymatique enfonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli 7
32 Etude demuents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer 7
B RESULTATS ET DISCUSSION 8
1 ETUDE DE LA SOUCHE DE cOLID 10407 INDUITE 8
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer 8
12 - Etude de la persistance de lactiviteacute (l-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries 9
121 - Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement 9
1211 - Effet du chlorampheacutenicol 9 1212 - Effet de la lyse bacteacuterienne 9 1213 - Effet des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature 10 1214 - Conclusion 10
122 - Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement 11
1221 - Effet du chlorampheacutenicoL 11 1222 - Effet de la lyse bacteacuterienne 11 1223 - Conclusion 12
13 - Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique 12
2 - CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER 13
C - ETUDE DES CORRELATIONS 15
1 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES ENZYMATIQUES ET LES NUMERATIONS BACTERIENNES 15
11- Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO 15
12 - Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer 16
2 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES (l-GALACTOSIDASE ET I3-GLUCURONIDASE 17
CONCLUSION 18
REFERENCES BffiLIOGRAPIDQUES 19
INTRODUCTION
Leacutetat physiologique des bacteacuteries peut ecirctre appreacutecieacute par la mesure de leur activiteacute enzymatIque
La mesure des activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase permet deacutevaluer la contamination bacteacuterienne en utilisant le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-galactosidase (NfUGal) et le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronidase (MUGLu) comme substrats respectifs (Berg et Fiksdal 1988)
Le principe de cette mesure est baseacute sur lhydrolyse enzymatique du substrat aboutissant agrave un produit fluorescent le methylumbelliferone (MUF)
Cette meacutethode alternative permettant de deacutetecter des indicateurs de contamination feacutecale savegravere inteacuteressante pour sa sensibiliteacute et sa rapiditeacute par rapport aux meacutethodes classiques de numeacuteration des coliformes feacutecaux (Feng et Hartman 1982) ce qui est important quand il sagit de prendre des deacutecisions rapides lors de pollutions cocirctiegraveres
Toutes les meacutethodes de numeacuteration des coliformes thermotoleacuterants sont baseacutees sur lacidification et la fermentation du lactose Or les travaux de Munro (1988) mettent en eacuteltidence une perte de cette activiteacute lors dun seacutejour en mer dE coli au bout de 9 agrave 10 jours Dautres auteurs (Guthrie et Scovill 1984) notent lapparition de colonies lactose neacutegatives atypiques dE coli
Enfin diverses eacutetudes se sont baseacutees sur ces techniques pour la deacutetection des coliformes feacutecaux aussi bien dans des eaux destuaires des aliments ou des eacutechantillons cliniques (Frampton et Restaino 1993)
Ces techniques donnent une ideacutee correcte de la contamination feacutecale une bonne correacutelation entre la preacutesence de coliformes feacutecaux et lactiviteacute enzymatique est observeacutee par Pommepuy et al en 1993
La limite de deacutetection de cette technique est estimeacutee agrave 102-103 coliformes feacutecauxl00 nugrave ce qui correspond aux normes europeacuteennes pour les eaux de baignades Limportance des nutriments contenus dans leau de mer a eacuteteacute prouveacutee quant agrave lexpression enzymatique (Apte et Batley 1994) La ~-galactosidase ainsi que la ~-glucuronidase sont des enzymes inductibles et leur expression deacutepend de certains facteurs physiologiques et geacuteneacutetiques des bacteacuteries (Martins et al 1993) Le lactose est un facteur inducteur de la ~-galactosidase En effet lorsque le lactose est ajouteacute agrave une culture bacteacuterienne dans un milieu sans lactose la ~-galactosidase et la permeacutease sont syntheacutetiseacutees presque simultaneacutement La preacutesence du lactose augmente le nombre de ces proteacuteines dun facteur de 105 (Freifelder 1990)
Cependant Apte et al (1994) constatent contrairement agrave dautres auteurs (Warren et al 1978 Berg et Fiksdal 1988) que laddition de lactose dans le milieu naugmente pas la sensibiliteacute ils observent plutocirct leffet inverse
1
En fait le lactose est rarement utiliseacute dans les expeacuteriences dinduction car la ~shygalactosidase syntheacutetiseacutee clive le lactose entrainant une diminution de la concentration en lactose Pour palier agrave ce problegraveme lutilisation dun analogue contenant un atome de soufre lisopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) est recommandeacutee par Diehl (1991) afin daugmenter la reacuteponse enzymatique
Dans lenvironnement marin certains facteurs tels que le manque de nutriments la saliniteacute ou la tempeacuterature creacuteent des conditions non optimales pour la croissance des bacteacuteries et affectent leur eacutetat physiologique Des enzymes telles que les hydrolases sont souvent mises en jeu pour lassimilation de certains eacuteleacutements nutritifs ~ les substrats eacutetant alors plus facilement accessibles par les cellules bacteacuteriennes Lenzyme 4-meacutethylumbelliferyl-heptanoate-hydrolase (MUHase) produite par une souche diE coli en eau de mer a eacuteteacute eacutetudieacutee par Fiksdal et al en 1989 Une augmentation de lactiviteacute enzymatique semble ecirctre en relation avec ladaptation des bacteacuteries aux conditions nutritives du milieu marin
La saliniteacute est aussi un des facteurs influenccedilant lactiviteacute enzymatique En effet Apte et Batley en 1994 constatent sur des eftluents dilueacutes en eau de mer une diminution de la reacuteponse enzymatique en fonction de la saliniteacute
Dans cette eacutetude les activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase sont mesureacutees pour deacutetecter la preacutesence de coliformes feacutecaux et diE coli dans leau de mer Des eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie de stations deacutepuration et dilueacutes en eau de mer sont aussi testeacutes par ces techniques et suivis pendant environ 2 semaines
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A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
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B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
SOMMAIRE
INTRODUCTION 1
A - MATERIEL ET METHODES 3
1- MATERIEL 3
2 - METHODES 4
3 - EXPERIMENTATIONS 5
31 - Etude de la souche dE coli DI0407 induite 5
J11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer 5 J12 Etude de la persistance de lactiviteacute 13 -galactosidase en fonction
de la viabiliteacute des bacteacuteries 6
3121 Effet du chlorampheacutenicol 6 J122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation 6 3123 Effet du chlore 6 3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature 6
J1J Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enymatique enfonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli 7
32 Etude demuents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer 7
B RESULTATS ET DISCUSSION 8
1 ETUDE DE LA SOUCHE DE cOLID 10407 INDUITE 8
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer 8
12 - Etude de la persistance de lactiviteacute (l-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries 9
121 - Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement 9
1211 - Effet du chlorampheacutenicol 9 1212 - Effet de la lyse bacteacuterienne 9 1213 - Effet des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature 10 1214 - Conclusion 10
122 - Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement 11
1221 - Effet du chlorampheacutenicoL 11 1222 - Effet de la lyse bacteacuterienne 11 1223 - Conclusion 12
13 - Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique 12
2 - CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER 13
C - ETUDE DES CORRELATIONS 15
1 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES ENZYMATIQUES ET LES NUMERATIONS BACTERIENNES 15
11- Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO 15
12 - Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer 16
2 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES (l-GALACTOSIDASE ET I3-GLUCURONIDASE 17
CONCLUSION 18
REFERENCES BffiLIOGRAPIDQUES 19
INTRODUCTION
Leacutetat physiologique des bacteacuteries peut ecirctre appreacutecieacute par la mesure de leur activiteacute enzymatIque
La mesure des activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase permet deacutevaluer la contamination bacteacuterienne en utilisant le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-galactosidase (NfUGal) et le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronidase (MUGLu) comme substrats respectifs (Berg et Fiksdal 1988)
Le principe de cette mesure est baseacute sur lhydrolyse enzymatique du substrat aboutissant agrave un produit fluorescent le methylumbelliferone (MUF)
Cette meacutethode alternative permettant de deacutetecter des indicateurs de contamination feacutecale savegravere inteacuteressante pour sa sensibiliteacute et sa rapiditeacute par rapport aux meacutethodes classiques de numeacuteration des coliformes feacutecaux (Feng et Hartman 1982) ce qui est important quand il sagit de prendre des deacutecisions rapides lors de pollutions cocirctiegraveres
Toutes les meacutethodes de numeacuteration des coliformes thermotoleacuterants sont baseacutees sur lacidification et la fermentation du lactose Or les travaux de Munro (1988) mettent en eacuteltidence une perte de cette activiteacute lors dun seacutejour en mer dE coli au bout de 9 agrave 10 jours Dautres auteurs (Guthrie et Scovill 1984) notent lapparition de colonies lactose neacutegatives atypiques dE coli
Enfin diverses eacutetudes se sont baseacutees sur ces techniques pour la deacutetection des coliformes feacutecaux aussi bien dans des eaux destuaires des aliments ou des eacutechantillons cliniques (Frampton et Restaino 1993)
Ces techniques donnent une ideacutee correcte de la contamination feacutecale une bonne correacutelation entre la preacutesence de coliformes feacutecaux et lactiviteacute enzymatique est observeacutee par Pommepuy et al en 1993
La limite de deacutetection de cette technique est estimeacutee agrave 102-103 coliformes feacutecauxl00 nugrave ce qui correspond aux normes europeacuteennes pour les eaux de baignades Limportance des nutriments contenus dans leau de mer a eacuteteacute prouveacutee quant agrave lexpression enzymatique (Apte et Batley 1994) La ~-galactosidase ainsi que la ~-glucuronidase sont des enzymes inductibles et leur expression deacutepend de certains facteurs physiologiques et geacuteneacutetiques des bacteacuteries (Martins et al 1993) Le lactose est un facteur inducteur de la ~-galactosidase En effet lorsque le lactose est ajouteacute agrave une culture bacteacuterienne dans un milieu sans lactose la ~-galactosidase et la permeacutease sont syntheacutetiseacutees presque simultaneacutement La preacutesence du lactose augmente le nombre de ces proteacuteines dun facteur de 105 (Freifelder 1990)
Cependant Apte et al (1994) constatent contrairement agrave dautres auteurs (Warren et al 1978 Berg et Fiksdal 1988) que laddition de lactose dans le milieu naugmente pas la sensibiliteacute ils observent plutocirct leffet inverse
1
En fait le lactose est rarement utiliseacute dans les expeacuteriences dinduction car la ~shygalactosidase syntheacutetiseacutee clive le lactose entrainant une diminution de la concentration en lactose Pour palier agrave ce problegraveme lutilisation dun analogue contenant un atome de soufre lisopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) est recommandeacutee par Diehl (1991) afin daugmenter la reacuteponse enzymatique
Dans lenvironnement marin certains facteurs tels que le manque de nutriments la saliniteacute ou la tempeacuterature creacuteent des conditions non optimales pour la croissance des bacteacuteries et affectent leur eacutetat physiologique Des enzymes telles que les hydrolases sont souvent mises en jeu pour lassimilation de certains eacuteleacutements nutritifs ~ les substrats eacutetant alors plus facilement accessibles par les cellules bacteacuteriennes Lenzyme 4-meacutethylumbelliferyl-heptanoate-hydrolase (MUHase) produite par une souche diE coli en eau de mer a eacuteteacute eacutetudieacutee par Fiksdal et al en 1989 Une augmentation de lactiviteacute enzymatique semble ecirctre en relation avec ladaptation des bacteacuteries aux conditions nutritives du milieu marin
La saliniteacute est aussi un des facteurs influenccedilant lactiviteacute enzymatique En effet Apte et Batley en 1994 constatent sur des eftluents dilueacutes en eau de mer une diminution de la reacuteponse enzymatique en fonction de la saliniteacute
Dans cette eacutetude les activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase sont mesureacutees pour deacutetecter la preacutesence de coliformes feacutecaux et diE coli dans leau de mer Des eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie de stations deacutepuration et dilueacutes en eau de mer sont aussi testeacutes par ces techniques et suivis pendant environ 2 semaines
2
A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
12 - Etude de la persistance de lactiviteacute (l-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries 9
121 - Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement 9
1211 - Effet du chlorampheacutenicol 9 1212 - Effet de la lyse bacteacuterienne 9 1213 - Effet des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature 10 1214 - Conclusion 10
122 - Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement 11
1221 - Effet du chlorampheacutenicoL 11 1222 - Effet de la lyse bacteacuterienne 11 1223 - Conclusion 12
13 - Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique 12
2 - CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER 13
C - ETUDE DES CORRELATIONS 15
1 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES ENZYMATIQUES ET LES NUMERATIONS BACTERIENNES 15
11- Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO 15
12 - Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer 16
2 - CORRELATION ENTRE LES ACTIVITES (l-GALACTOSIDASE ET I3-GLUCURONIDASE 17
CONCLUSION 18
REFERENCES BffiLIOGRAPIDQUES 19
INTRODUCTION
Leacutetat physiologique des bacteacuteries peut ecirctre appreacutecieacute par la mesure de leur activiteacute enzymatIque
La mesure des activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase permet deacutevaluer la contamination bacteacuterienne en utilisant le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-galactosidase (NfUGal) et le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronidase (MUGLu) comme substrats respectifs (Berg et Fiksdal 1988)
Le principe de cette mesure est baseacute sur lhydrolyse enzymatique du substrat aboutissant agrave un produit fluorescent le methylumbelliferone (MUF)
Cette meacutethode alternative permettant de deacutetecter des indicateurs de contamination feacutecale savegravere inteacuteressante pour sa sensibiliteacute et sa rapiditeacute par rapport aux meacutethodes classiques de numeacuteration des coliformes feacutecaux (Feng et Hartman 1982) ce qui est important quand il sagit de prendre des deacutecisions rapides lors de pollutions cocirctiegraveres
Toutes les meacutethodes de numeacuteration des coliformes thermotoleacuterants sont baseacutees sur lacidification et la fermentation du lactose Or les travaux de Munro (1988) mettent en eacuteltidence une perte de cette activiteacute lors dun seacutejour en mer dE coli au bout de 9 agrave 10 jours Dautres auteurs (Guthrie et Scovill 1984) notent lapparition de colonies lactose neacutegatives atypiques dE coli
Enfin diverses eacutetudes se sont baseacutees sur ces techniques pour la deacutetection des coliformes feacutecaux aussi bien dans des eaux destuaires des aliments ou des eacutechantillons cliniques (Frampton et Restaino 1993)
Ces techniques donnent une ideacutee correcte de la contamination feacutecale une bonne correacutelation entre la preacutesence de coliformes feacutecaux et lactiviteacute enzymatique est observeacutee par Pommepuy et al en 1993
La limite de deacutetection de cette technique est estimeacutee agrave 102-103 coliformes feacutecauxl00 nugrave ce qui correspond aux normes europeacuteennes pour les eaux de baignades Limportance des nutriments contenus dans leau de mer a eacuteteacute prouveacutee quant agrave lexpression enzymatique (Apte et Batley 1994) La ~-galactosidase ainsi que la ~-glucuronidase sont des enzymes inductibles et leur expression deacutepend de certains facteurs physiologiques et geacuteneacutetiques des bacteacuteries (Martins et al 1993) Le lactose est un facteur inducteur de la ~-galactosidase En effet lorsque le lactose est ajouteacute agrave une culture bacteacuterienne dans un milieu sans lactose la ~-galactosidase et la permeacutease sont syntheacutetiseacutees presque simultaneacutement La preacutesence du lactose augmente le nombre de ces proteacuteines dun facteur de 105 (Freifelder 1990)
Cependant Apte et al (1994) constatent contrairement agrave dautres auteurs (Warren et al 1978 Berg et Fiksdal 1988) que laddition de lactose dans le milieu naugmente pas la sensibiliteacute ils observent plutocirct leffet inverse
1
En fait le lactose est rarement utiliseacute dans les expeacuteriences dinduction car la ~shygalactosidase syntheacutetiseacutee clive le lactose entrainant une diminution de la concentration en lactose Pour palier agrave ce problegraveme lutilisation dun analogue contenant un atome de soufre lisopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) est recommandeacutee par Diehl (1991) afin daugmenter la reacuteponse enzymatique
Dans lenvironnement marin certains facteurs tels que le manque de nutriments la saliniteacute ou la tempeacuterature creacuteent des conditions non optimales pour la croissance des bacteacuteries et affectent leur eacutetat physiologique Des enzymes telles que les hydrolases sont souvent mises en jeu pour lassimilation de certains eacuteleacutements nutritifs ~ les substrats eacutetant alors plus facilement accessibles par les cellules bacteacuteriennes Lenzyme 4-meacutethylumbelliferyl-heptanoate-hydrolase (MUHase) produite par une souche diE coli en eau de mer a eacuteteacute eacutetudieacutee par Fiksdal et al en 1989 Une augmentation de lactiviteacute enzymatique semble ecirctre en relation avec ladaptation des bacteacuteries aux conditions nutritives du milieu marin
La saliniteacute est aussi un des facteurs influenccedilant lactiviteacute enzymatique En effet Apte et Batley en 1994 constatent sur des eftluents dilueacutes en eau de mer une diminution de la reacuteponse enzymatique en fonction de la saliniteacute
Dans cette eacutetude les activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase sont mesureacutees pour deacutetecter la preacutesence de coliformes feacutecaux et diE coli dans leau de mer Des eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie de stations deacutepuration et dilueacutes en eau de mer sont aussi testeacutes par ces techniques et suivis pendant environ 2 semaines
2
A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
INTRODUCTION
Leacutetat physiologique des bacteacuteries peut ecirctre appreacutecieacute par la mesure de leur activiteacute enzymatIque
La mesure des activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase permet deacutevaluer la contamination bacteacuterienne en utilisant le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-galactosidase (NfUGal) et le 4-meacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronidase (MUGLu) comme substrats respectifs (Berg et Fiksdal 1988)
Le principe de cette mesure est baseacute sur lhydrolyse enzymatique du substrat aboutissant agrave un produit fluorescent le methylumbelliferone (MUF)
Cette meacutethode alternative permettant de deacutetecter des indicateurs de contamination feacutecale savegravere inteacuteressante pour sa sensibiliteacute et sa rapiditeacute par rapport aux meacutethodes classiques de numeacuteration des coliformes feacutecaux (Feng et Hartman 1982) ce qui est important quand il sagit de prendre des deacutecisions rapides lors de pollutions cocirctiegraveres
Toutes les meacutethodes de numeacuteration des coliformes thermotoleacuterants sont baseacutees sur lacidification et la fermentation du lactose Or les travaux de Munro (1988) mettent en eacuteltidence une perte de cette activiteacute lors dun seacutejour en mer dE coli au bout de 9 agrave 10 jours Dautres auteurs (Guthrie et Scovill 1984) notent lapparition de colonies lactose neacutegatives atypiques dE coli
Enfin diverses eacutetudes se sont baseacutees sur ces techniques pour la deacutetection des coliformes feacutecaux aussi bien dans des eaux destuaires des aliments ou des eacutechantillons cliniques (Frampton et Restaino 1993)
Ces techniques donnent une ideacutee correcte de la contamination feacutecale une bonne correacutelation entre la preacutesence de coliformes feacutecaux et lactiviteacute enzymatique est observeacutee par Pommepuy et al en 1993
La limite de deacutetection de cette technique est estimeacutee agrave 102-103 coliformes feacutecauxl00 nugrave ce qui correspond aux normes europeacuteennes pour les eaux de baignades Limportance des nutriments contenus dans leau de mer a eacuteteacute prouveacutee quant agrave lexpression enzymatique (Apte et Batley 1994) La ~-galactosidase ainsi que la ~-glucuronidase sont des enzymes inductibles et leur expression deacutepend de certains facteurs physiologiques et geacuteneacutetiques des bacteacuteries (Martins et al 1993) Le lactose est un facteur inducteur de la ~-galactosidase En effet lorsque le lactose est ajouteacute agrave une culture bacteacuterienne dans un milieu sans lactose la ~-galactosidase et la permeacutease sont syntheacutetiseacutees presque simultaneacutement La preacutesence du lactose augmente le nombre de ces proteacuteines dun facteur de 105 (Freifelder 1990)
Cependant Apte et al (1994) constatent contrairement agrave dautres auteurs (Warren et al 1978 Berg et Fiksdal 1988) que laddition de lactose dans le milieu naugmente pas la sensibiliteacute ils observent plutocirct leffet inverse
1
En fait le lactose est rarement utiliseacute dans les expeacuteriences dinduction car la ~shygalactosidase syntheacutetiseacutee clive le lactose entrainant une diminution de la concentration en lactose Pour palier agrave ce problegraveme lutilisation dun analogue contenant un atome de soufre lisopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) est recommandeacutee par Diehl (1991) afin daugmenter la reacuteponse enzymatique
Dans lenvironnement marin certains facteurs tels que le manque de nutriments la saliniteacute ou la tempeacuterature creacuteent des conditions non optimales pour la croissance des bacteacuteries et affectent leur eacutetat physiologique Des enzymes telles que les hydrolases sont souvent mises en jeu pour lassimilation de certains eacuteleacutements nutritifs ~ les substrats eacutetant alors plus facilement accessibles par les cellules bacteacuteriennes Lenzyme 4-meacutethylumbelliferyl-heptanoate-hydrolase (MUHase) produite par une souche diE coli en eau de mer a eacuteteacute eacutetudieacutee par Fiksdal et al en 1989 Une augmentation de lactiviteacute enzymatique semble ecirctre en relation avec ladaptation des bacteacuteries aux conditions nutritives du milieu marin
La saliniteacute est aussi un des facteurs influenccedilant lactiviteacute enzymatique En effet Apte et Batley en 1994 constatent sur des eftluents dilueacutes en eau de mer une diminution de la reacuteponse enzymatique en fonction de la saliniteacute
Dans cette eacutetude les activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase sont mesureacutees pour deacutetecter la preacutesence de coliformes feacutecaux et diE coli dans leau de mer Des eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie de stations deacutepuration et dilueacutes en eau de mer sont aussi testeacutes par ces techniques et suivis pendant environ 2 semaines
2
A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
En fait le lactose est rarement utiliseacute dans les expeacuteriences dinduction car la ~shygalactosidase syntheacutetiseacutee clive le lactose entrainant une diminution de la concentration en lactose Pour palier agrave ce problegraveme lutilisation dun analogue contenant un atome de soufre lisopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) est recommandeacutee par Diehl (1991) afin daugmenter la reacuteponse enzymatique
Dans lenvironnement marin certains facteurs tels que le manque de nutriments la saliniteacute ou la tempeacuterature creacuteent des conditions non optimales pour la croissance des bacteacuteries et affectent leur eacutetat physiologique Des enzymes telles que les hydrolases sont souvent mises en jeu pour lassimilation de certains eacuteleacutements nutritifs ~ les substrats eacutetant alors plus facilement accessibles par les cellules bacteacuteriennes Lenzyme 4-meacutethylumbelliferyl-heptanoate-hydrolase (MUHase) produite par une souche diE coli en eau de mer a eacuteteacute eacutetudieacutee par Fiksdal et al en 1989 Une augmentation de lactiviteacute enzymatique semble ecirctre en relation avec ladaptation des bacteacuteries aux conditions nutritives du milieu marin
La saliniteacute est aussi un des facteurs influenccedilant lactiviteacute enzymatique En effet Apte et Batley en 1994 constatent sur des eftluents dilueacutes en eau de mer une diminution de la reacuteponse enzymatique en fonction de la saliniteacute
Dans cette eacutetude les activiteacutes enzymatiques ~-galactosidase et ~-glucuronidase sont mesureacutees pour deacutetecter la preacutesence de coliformes feacutecaux et diE coli dans leau de mer Des eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie de stations deacutepuration et dilueacutes en eau de mer sont aussi testeacutes par ces techniques et suivis pendant environ 2 semaines
2
A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
A - MATERIEL ET METHODES
1) MATERIEL
- Souche dIE coli H10407
- Eftluents eacutepureacutes preacuteleveacutes agrave la sortie des stations biologiques de Maison Blanche et de Brest
Tableau 1 caracteacuteristiques des emuents
Emuent Maison Blanche Brest Date du preacutelegravevement 220793 120893 310893 120893 310893
Matiegraveres en suspension (MES)
Matiegraveres volatiles agrave 550 oC Carbone organique total (COT) Carbone organique dissous (COD) Ammonium (NH4) Phosphates (P04)
980
860 1293
1071
3410 190
480
-920
864
--
1440
1340 1930
1580
450 3010
1720
-1265
965
--
3420
320 2490
1545
5070 2270
Les valeurs sont exprimeacutees en mgl
- Eau de mer artificielle (Instant Ocean) filtreacutee agrave 02 J1m et autoclaveacutee pendant 20 min agrave 120 oC
- Milieu de base pour linduction hydrolisat de caseacuteine (25 g) KH2P04 (2 g) K2HP04 (7 g) (NH4hS04 (lg) MgCI2 6H20 (01 g) eau distilleacutee (1 1)
- Milieux de culture pour les numeacuterations bacteacuteriennes
geacutelose Trypticase incubation 18 h agrave 37degC geacutelose lactoseacutee de Drigalski incubation 18 h agrave 42 oC geacutelose lactoseacutee de Mac Conkey incubation 18 h agrave 44 oC
- Reacuteactifs utiliseacutes Inducteur Isopropyl-~-D-thiogalactoside (IPTG) -SIGMA chimie-Tampon phosphate 005 M pH 80 (KH2P04 01 M NaOH 01 M SLS 05 mgml) Tampon phosphate 005 M pH64 (KH2P0401 MNaOH 01 M)
Substrat (MUGal) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4-meacutethylumbelliferylshy~-D-galactoside agrave une concentration de 074 mMIl dans du tampon phosphate 005 M pH 8 Apregraves dissolution totale agrave une tempeacuterature voisine de 80 oC la solution est filtreacutee sur 02 J1m
Substrat (MUGlu) preacutepareacute extemporaneacutement en ajoutant du 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide agrave une concentration de 1 mgml dans de leau tritoneacutee
3
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Leau tritoneacutee est obtenue en introduisant 2 gouttes de triton X dans 100 ml deau distilleacutee puis autoclaveacutee pendant 15 min agrave 120 oC Le substrat MUGlu est dissout en chauffant leacutegegraverement puis filtreacute sur 02 Ilm
Un spectrofluorimegravetre type SEQUOIA-TURNER modegravele 450 est utiliseacute pour la mesure de la fluorescence du produit de la reacuteaction enzymatique (MUF) Des tubes en quartz permettant le passage des UV sont utiliseacutes la lecture se fait agrave 360 nm pour lexcitation et agrave 450 nm pour leacutemission
2) METHODES
Mesure de lactiviteacute enzymatique
Activiteacute ~-D-galactosidase dans un erlen placeacute dans un bain marie agiteacute agrave 44 oC sont introduits 135 ml de tampon phosphate 005 M pH 8 additionneacute de SLS agrave 05 mgml et 9 ml de substrat MUGal
Un volume adeacutequat selon lactiviteacute de leacutechantillon agrave analyser est filtreacute sur un filtre Nucleacutepore 02 J1m Le filtre est introduit dans le meacutelange tampon phosphate-substrat agrave TO
La cineacutetique de fluorescence est alors suivie agrave intervalles de 5 mn pendant 30 minutes Pour chaque mesure 25 ml deacutechantillon sont preacuteleveacutes additionneacutes de 100 III de NaOH 10 N puis introduits dans la cuve de mesure
Pour chaque seacuterie un blanc est reacutealiseacute et chaque eacutechantillon est mesureacute 2 fois
Activiteacute ~-D-glucuronidase la meacutethode de mesure est identique agrave celle de la ~shyD-galactosidase en introduisant 17 ml de tampon phosphate 005 M pH 64 dans un erlen et 3 ml de substrat MUGlu
Calcul de lactiviteacute enzymatique
Les cineacutetiques de fluorescence sont calculeacutees par lintermeacutediaire des pentes des droites ajusteacutees par la meacutethode des moindres carreacutes
Lactiviteacute enzymatique par litre sexprime par J1mole de MUF produite par litre et par minute et est donneacutee par lexpression
Act enzyml1itre = (Mm - Mt)Mc V v
ougrave Mm =pente moyenne des 2 reacuteplicats Mt = pente du teacutemoin Mc = pente de la courbe de calibration V = volume de la solution tampon dans lerlen en ml v =volume de leacutechantillon filtreacute en ml
4
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Pour la deacutetermination du Mc la fluorescence de solutions de 01 agrave 1 IlMll de 4shymeacutethylumbellifeacuterone d~s du tampon phosphate est mesureacutee par le spectrofluorimegravetre
Lactiviteacute enzymatique par cellule exprimeacutee par Ilmole de MUF produite par cellule et par minute est donneacutee par lexpression
ActlitreAct enzym ce u e =Il 1
nb de bacteacuteries litre
3) EXPERIMENTATIONS
Dans le cadre de cette eacutetude diffeacuterents types dexpeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutes
31 Etude de la souche dE coli Hl0407 induite
Suite aux reacutesultats obtenus preacuteceacutedemment (rapport GPQE janvier 1993) ougrave lactiviteacute f3-galactosidase eacutetait tregraves faible des essais dinduction de la souche diE coli H10407 ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave laide de lIPTG
- Preacuteparation de la souche
Une anse de culture de la souche diE coli H10407 est introduite dans 9 ml de milieu de base et 1 ml dIPTG 25 mM La culture bacteacuterienne est incubeacutee pendant 18 heures agrave 37degC sous agitation
La culture bacteacuterienne est centrifugeacutee et laveacutee agrave leau physiologique et le culot est reacutecupeacutereacute dans 100 ml deau (eau douce ou eau de mer selon lexpeacuterience)
Sur la souche ainsi induite les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees pour mettre en eacutevidence le rocircle de la matiegravere organique sur la survie en eau de mer et eacutetudier les variations de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie
311 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Des expeacuteriences reacutealiseacutees entre avril et juillet 1993 ont eacuteteacute faites sous diffeacuterentes conditions
- La survie diE coli (induit) est suivie en eau douce et en eau de mer agrave 30 o - Trois tempeacuteratures ont eacuteteacute testeacutees (8 oC 15 oC et 22 OC) - Lapport de la matiegravere organique a aussi eacuteteacute consideacutereacute (le mecircme eftluent a eacuteteacute
utiliseacute pour les trois tempeacuteratures)
Cet eftluent filtreacute sur 022 Ilm (apregraves passage sur 3 Ilm et 045 Ilm) est dilueacute dans leau agrave diffeacuterentes concentrations (0 25 et 50 ) puis steacuteriliseacute pendant 20 minutes agrave 120 oC
Sous ces diverses conditions les numeacuterations diE coli sur geacutelose Trypticase ainsi que lactiviteacute f3-galactosidase ont eacuteteacute suivies pendant une semaine
5
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
312 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-galactosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
Lors des premiegraveres expeacuterimentations (rapport GPQE janvier 1993) on avait constateacute que lactiviteacute enzymatique se maintenait plus longtemps que le caractegravere cultivable dE coli Il nous a donc paru inteacuteressant de correacuteler lactiviteacute enzymatique en fonction du nombre de bacteacuteries cultivables Des expeacuteriences ont alors eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 15 oC sur des souches dE coli stresseacutees (en preacutesence dantibiotique inhibant la synthegravese des proteacuteines) lyseacutees par congeacutelation-deacutecongeacutelation chloreacutees ou deacutetruites agrave haute tempeacuterature Ceci afin de voir si lactiviteacute enzymatique peut persister lorsque les bacteacuteries sont mortes ou viables non cultivables
3121 Effet du chlorampheacutenicol
Le chlorampheacutenicol est un antibiotique qui inhibe la synthegravese des proteacuteines Au cours de cette expeacuterience la souche est induite suivant le mecircme protocole que
celui deacutecrit preacuteceacutedemment et lon introduit dans les cultures au bout de 9 h dincubation des concentrations de 0 10 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol dans diffeacuterents eacutechantillons Les cultures sont incubeacutees agrave 37 oC sous agitation pendant environ 12 h Les culots bacteacuteriens reacutecupeacutereacutes apregraves lavage sont remis en suspension dans 100 ml dInstant Ocean agrave 34 0 (sans apport de matiegravere organique)
3122 Lyse bacteacuterienne par congeacutelation-deacutecongeacutelation
Une fraction de la culture bacteacuterienne induite dilueacutee dans leau de mer est soumise agrave 6 cycles de congeacutelation agrave - 80 oC suivie de deacutecongeacutelation agrave 44 oC Apregraves addition de lysozyme agrave 02 Jlglml de culture leacutechantillon est incubeacute agrave 37 oC pendant 30 minutes
Au cours de la seconde expeacuterience (0908) deux eacutechantillons ont eacuteteacute traiteacutes lun en eau de mer agrave 34 0 lautre en eau douce
Afin de se rendre compte de lefficaciteacute de la lyse bacteacuterienne les eacutechantillons sont observeacutes en eacutepifluorescence
3123 Effet du chlore
Dans un flacon une autre fraction de 10 ml de culture est mise en contact pendant une heure avec 1 ml deau de Javel concentreacutee La solution est filtreacutee sur 022 Jlm et le filtre laveacute agrave leau physiologique est introduit dans 10 ml dInstant Ocean agrave 34 O
3124 Destruction des bacteacuteries par la tempeacuterature
Un flacon de 10 ml de la culture induite dilueacutee dans leau de mer est autoclaveacute pendant 10 minutes agrave 115 oC afin danalyser le cas de bacteacuteries mortes
Apregraves tous ces traitements des numeacuterations ainsi que des mesures de lactiviteacute ~shygalactosidase sont reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents eacutechantillons
6
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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20
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
301030Etude de la variation de lintensiteacute de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique (phase de croissance) dE coli
Afin de comparer lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries agrave diffeacuterentes phases de croissance (phases exponentielle et stationnaire) deux cultures dE coli induit de 12 h et 38 h dincubation agrave 37 oC sont reacutealiseacutees Apregraves lavage des bacteacuteries agrave leau physiologique les culots sont repris dans 10 ml deau de mer Les densiteacutes optiques des deux eacutechantillons sont mesureacutees leacutechantillon en phase stationnaire de croissance est dilueacute de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique proche de celle de leacutechantillon en phase exponentielle
Des numeacuterations et des mesures de lactiviteacute j3-galactosidase sont suivies sur ces eacutechantillons maintenus agrave 15 oC et agrave lobscuriteacute pendant environ 15 jours
3020 Etude deffluents eacutepureacutes de stations deacutepuration dilueacutes en eau de mer
Des effluents eacutepureacutes sont preacuteleveacutes agrave la sortie de la station biologique de Maison Blanche etou de Brest les 21 juillet 13 aoucirct et 30 aoucirct 1993
Les effluents sont dilueacutes au 11 Oe et au 150e dans leau de mer artificielle agrave 34 O Les flacons sont maintenus environ 2 semaines agrave 15 oC agrave lobscuriteacute sous agitation magneacutetique (150 tmin)
Des preacutelegravevements sont reacutealiseacutes reacuteguliegraverement de faccedilon agrave suivre les numeacuterations bacteacuteriennes ainsi que les activiteacutes enzymatiques f3-D-galactosidase et f3-D-glucuronidase
7
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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20
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
B - RESULTATS ET DISCUSSION
1) ETUDE DE LA SOUCHE DIE COLIH 10407 INDUITE
11 Effet de la preacutesence de matiegravere organique en eau douce et en eau de mer
Trois expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees (13-19 avril (fig 1) 20-26 avril (fig 2) et 6-13 juillet (fig 3raquo avec la mecircme qualiteacute de matiegravere organique et agrave des tempeacuteratures de 8 oC 15 oC et 22 oC Dune maniegravere geacuteneacuterale une bonne survie dIE coli est observeacutee en eau douce pendant les 6 agrave 7 jours dexpeacuterience avec un leacuteger effet de protection agrave 25 et 50 deffluent par rapport au teacutemoin
En eau de mer agrave 30 0 leffet de la saliniteacute sur la survie dE coli est visible Une chute dau moins une uniteacute Log est observeacutee au bout du 6e jour dexpeacuterience sur tous les eacutechantillons allant jusquagrave 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 50 deffluent (fig 2 et 3) Dans tous les cas lapport de matiegravere organique de leffluent en eau de mer ne semble pas proteacuteger la survie des bacteacuteries Ces reacutesultats ont eacuteteacute observeacutes lors de leacutetude meneacutee entre septembre et deacutecembre 1992 sur la souche diE coli Hl 0407 non induite
Fiksdal et Midttun (1993) notent que la capaciteacute de protection de leffluent augmente lorsque le nombre de bacteacuteries atteint des valeurs faibles de lordre de 103 agrave 104 UFCml Dans notre eacutetude les numeacuterations de deacutepart eacutetaient de lordre de 106 UFCml et nous observons en eau de mer lorsque les numeacuterations atteignent cet ordre de grandeur (103 agrave 104 UFCml) une chute moins prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 25 et 50 deffluent agrave 22 oC et agrave 50 deffluent agrave 15 oC (fig 1 et 3)
Les valeurs des T90 (temps correspondant agrave la perte de cultivabiliteacute de 90 de la population bacteacuterienne) ont eacuteteacute calculeacutees pour ces diffeacuterentes expeacuteriences
En eau douce lapport de leffluent augmente la valeur du T90 de 4 jours agrave plus de 20 jours (13-1904 et 20-2604) Ceci na pas eacuteteacute le cas lors de lexpeacuterience du 6 au 13 juillet
En eau de mer le T90 naugmente pas en preacutesence de leffluent mais on observe plutocirct leffet inverse Ceci traduit le fait que dans un milieu hostile tel que leau de mer la matiegravere organique nest pas toujours utiliseacutee et de ce fait na pas toujours un effet protecteur pour la survie des bacteacuteries Les conditions de mise en oeuvre dun meacutecanisme dhalotoleacuterance par les bacteacuteries ne seraient pas reacuteunies dans notre eacutetude
Lors de ces expeacuteriences une baisse de lactiviteacute enzymatique par litre est observeacutee pendant les deux premiers jours A une saliniteacute de 30 000 et agrave 22 oC (13-1904) cette baisse de lactiviteacute nest observeacutee quentre les 2e et 4e jours A TO les valeurs des activiteacutes par litre varient de 01 agrave 4 JlMl-lmin-1 selon lexpeacuterience
Les valeurs des activiteacutes par cellule varient peu agrave saliniteacute 0 0 tout au long de lexpeacuterience on observe une augmentation progressive de lactiviteacute par cellule en fonction du temps agrave 30 O
8
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Survie Ecoli saliniteacute 0 0
800
700
600
E 500 gtU 400
sraquo 300
200
100
000 0
bull bull
2 3 4 5 6
Temps (jours)
800
700
600
~ 500
U 400
9 300
200
100
Survie Ecoli saliniteacute 300
bull
000 4-----+----+----+------------+-----I
o 2 3 4 5 6
Temps (jours)
bull OEffluent --0-- 25Effluent -- 5OEffluent
Fig 1 Survie de E couuml H10407 agrave lloC (13-190493)
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
T
Survie E coli saliniteacute 00
gt
E 400
o 300
~ 200
100
bull
Ooo+--------r------~--------~-------+------~
o 2 3 4 6
Temps (Jours)
Survie E coli saliniteacute 300
600
100
Ooo+--------r------~--------~------~------~
o 1 2 3 4 6
Temps (Jours)
bull Oeffluent --0-- 25effluent ---+- SOeffluent 1
Fig l Survie de E coli HI0407 agrave 8degC (20-260493)
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
bull bull
Survie Ecoli saliniteacute 00
600
[il ~ -----------=ll= Q
500
E - 400 0 ggt 300 -
200
loo
000 0 2 3 4 6 7
Temps (jours)
Survie Ecoli saliniteacute 300
700
~~==~~~600
500 Euml - 400 o ~--+ggt 300 -
200
100
OOO+-----~------~------+-----~~-----+----~
o 2 3 4 6 7
Temps (Jours)
-1-- 0 effluent --0-- 25effluent --lt-- 5Oeffluent 1
Fig 3 Survie de E coli HI0407 agrave lSoC (06-130493)
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
12 Etude de la persistance de lactiviteacute ~-D-ga1actosidase en fonction de la viabiliteacute des bacteacuteries
La souche dIE coli a eacuteteacute soumise agrave diffeacuterents traitements afin de tester la persistance de lactiviteacute enzymatique en fonction de leacutetat physiologique de la bacteacuterie puis la possibiliteacute de reviviscence en mer
121 Etude de lactiviteacute enzymatique apregraves traitement
J2 1 J Effet du chlorampheacutenicol
La souche a eacuteteacute soumise agrave 3 concentrations de chlorampheacutenicol les reacutesultats sont preacutesenteacutes sur le tableau 2
Tableau 2 Effet du chlorampheacutenicol- TO shy
Date de
lexpeacuterience
Paramegravetres
mesureacutes
1 2 3
15071993 Nom (CFUml) 250107 150107 280106
ActIl (J1Ml-1min-1) 1259 701 299
Actll (t1Ml-1min-1) 5041010 4671010 106109
1 Teacutemoin 2 Echantillon avec 100 Jlglml de chlorampheacutenicol 3 Echantillon avec 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
Dune maniegravere geacuteneacuterale on constate que pour des valeurs de chlorampheacutenicol infeacuterieures ou eacutegales agrave 100 Jlglml aucun effet nest visible sur le reacutesultat des cultures il y a cependant une leacutegegravere diminution de lactiviteacute enzymatique une concentration en antibiotique de 250 Jlglml entraicircne simultaneacutement une perte de cultivabiliteacute et la baisse de lactiviteacute enzymatique (cette derniegravere est cependant dans des proportions moindres que la perte de cultivabiliteacute)
J2 J2 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis de diminuer le nombre de bacteacuteries de 2 agrave 4 uniteacutes Log
Au niveau de lactiviteacute par litre une chute importante est observeacutee apregraves la lyse Selon lefficaciteacute de la rse on observe des diminutions de lactiviteacute par litre juste apregraves la lyse de 422 agrave 310-2 JlMl- min-1 (1507 - tableau 3)
9
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
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ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Tableau 3 Effet de la lyse par congeacutelation-deacutecongeacutelation TO - (150711993)
Echantillon Teacutemoin 11 Teacutemoin 12
CFUml 370106 70103 19106 1410-4
ActIl (pMI-lmin-l ) 1341 624 941 106
Actccli (pMI-lmin-l ) 3610-9 8910-7 49510-9 75710-7
Teacute~ 16 43 lt 10
422 310-2
49510-9 31010-6
Teacutemoin avant traitement 11 3 cycles de congeacutelation-deacutecongeacutelation 12 6 Il
16 6 Il + lysozyme
1213 Effet des traitements des bacteacuteries par le chlore et la tempeacuterature
Sur ces deux types de traitement la chute de la numeacuteration bacteacuterienne est radicale (tab 4) On passe de lordre de 106 CFUml agrave moins de 10 bacteacuteries cultivables par ml
Lactiviteacute enzymatique subit aussi une chute importante les valeurs de lactiviteacute par litre passent de 941 IlMl-Imin-1 pour leacutechantillon teacutemoin agrave des valeurs infeacuterieures agrave 10-3
pour les eacutechantillons chloreacutes et autoclaveacutes
Ces traitements drastiques ont vraisemblablement un effet direct (mort de la cellule) mais eacutegalement indirect (hydrolyse des proteacuteines) A TO apregraves autoclavage la chute de lactiviteacute pourrait ecirctre due agrave la destruction totale de lenzyme et de la cellule
Tableau 4 Effet de la destruction des bacteacuteries (chlore autoclavage) - TO
Echantillon 1 14 15
CFUml 19106 lt10 lt 10
Agrave _LlI ~ HJ-lmin-1) 941 lt 10-3 lt 10-3
IlMl-lmin-1) 4910-9 - -
1 Teacutemoin 14 Echantillon autoclaveacute 15 Echantillon chloreacute
1214 Conclusion
Ces expeacuterimentations avaient pour but deacutetudier la persistance de lactiviteacute enzymatique lorsque les bacteacuteries ne sont plus cultivables
10
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Lors de traitements drastiques (chlore - tempeacuterature eacuteleveacutee) lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries disparaicirct simultaneacutement avec leur possibiliteacute de cultiver la disparition dactiviteacute bacteacuterienne est attribueacutee agrave la mort de la bacteacuterie et agrave la destruction de lenzyme par le traitement
Lors de traitements plus doux (chlorampheacutenicol congeacutelation-deacutecongeacutelation) on observe simultaneacutement la perte du pouvoir de cultiver et la baisse de lactiviteacute enzymatique mais cependant pas dans les mecircmes proportions la perte de cultivabiliteacute eacutetant souvent plus importante que la baisse de lactiviteacute enzymatique il semble donc que les bacteacuteries viables non cultivables puissent garder quelque temps une activiteacute enzymatique quoique reacuteduite
122 Evolution de la souche dans leau de mer apregraves traitement
Ces expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en eau de mer agrave 34 0 et agrave 15 oC Les reacutesultats obtenus sont regroupeacutes sur les figures 4 et 5
1221 Effet du chlorampheacutenicol
Lors de ces expeacuteriences on observe agrave TO une diminution du nombre de bacteacuteries de 1 uniteacute Log pour les eacutechantillons agrave 250 Ilglml de chlorampheacutenicol Il ny a pas de diffeacuterence significative entre le teacutemoin et leacutechantillon agrave 10 Jlglml de chlorampheacutenicol
La chute des numeacuterations bacteacuteriennes dans le temps est plus prononceacutee pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml de chlorampheacutenicol que pour le teacutemoin Une perte de 1 uniteacute Log est observeacutee en 4 jours pour le teacutemoin alors quelle est denviron 3 uniteacutes Log pour les eacutechantillons agrave 100 et 250 Jlglml entre les troisiegraveme et quatriegraveme jours (fig 4)
On constate aussi que les valeurs du T90 diminuent en fonction de la concentration en chlorampheacutenicol elles passent de 78 jours pour le teacutemoin agrave 3 jours pour leacutechantillon agrave 250 Jlglml de chlorampheacutenicol
J222 Effet de la lyse bacteacuterienne
La lyse des bacteacuteries par la technique de congeacutelation-deacutecongeacutelation a permis dabaisser le nombre de bacteacuteries de 4 uniteacutes Log pendant les 3 agrave 4 premiers jours Au bout dune semaine environ un redressement du nombre de bacteacuteries est observeacute atteignant une numeacuteration voisine de leacutechantillon teacutemoin apregraves 17 jours (fig 5)
Ceci peut sexpliquer par le fait que la lyse bacteacuterienne neacutetant pas totale les bacteacuteries ayant eacutechappeacute agrave cette lyse se reproduisent de nouveau la preacutesence de la matiegravere organique des bacteacuteries lyseacutees contribue agrave ce redressement Lors de lexamen en eacutepi fluorescence juste apregraves le traitement on constate en effet que parmi les bacteacuteries eacuteclateacutees il reste quelques bacteacuteries intactes
Sur un essai de lyse (par congeacutelation-deacutecongeacutelation) une meilleure efficaciteacute a eacuteteacute observeacutee en eacutepifluorescence sur les bacteacuteries immergeacutees dans leau douce que sur celles immergeacutees dans leau de mer le nombre de bacteacuteries resteacutees intactes est beaucoup plus faible que dans leacutechantillon deau de mer
Ceci peut sexpliquer par le fait que la paroi des bacteacuteries en eau de mer subit des modifications qui rendraient les cellules plus reacutesistantes aux chocs thermiques
11
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
---
ECOU INDUIT (lSC) 150793
SURVIE DE ECOLI Hl0407
800 T
700 Euml 600 Ocirc 500 ~ 400
~ 300 j9 200 ------------------- 100 000 ----------------------lt
a 2 4 6 8 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTIVITELITRE
150 T 100 ==----=---~
050 - li-~-~=======jc CJ 000 zr -shy --=0 ---~-r( -0508 -100 ~ -150
-200 -250 +------+--------------
a 2 468 la 12 14
TEMPS (jours)
ACTlVITE 1CELLULE
a 3 4 5 000
~ -200 ~ 1amp1 0
-400 Uuml r(
-600 ~ 0
-800~
-1000
7 12 14
TEMPS (Jours)
Fig 4 Effet du clorampheacutenicol 1 Teacutemoin 2 10 pglml de chlorampheacutenicol 3 100 pglml de chlorampheacutenicol 4 250 pglml de chlorampheacutenicol
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
ECOU HI04071NDUIT USCl 0908193
SURVIE DE ECOII 0908
Sr 7
Euml 6 (5 ~ 4 () 3 9 2
1 a a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
1 ---ci- 511---shyACTIVITELITRE
14 l 12 10
- sf ~ uuml lt
~I a 2 4 6 S la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
ACTIVITECELLULE
a 2 4 6 S la 12 14 16 18 000
-200- LU
~ -400 U lt -600() 0 - -soo~
-1000 l
TEMPS (jours)
Fig 5 Etude des bacteacuteries lyseacutees 1 Teacutemoin 5 1 Echantillon lyseacute par congeacutelation-deacutecongeacutelation
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
1223 Conclusion
Dune maniegravere geacuteneacuterale le traitement desmiddot bacteacuteries entraicircne une deacutecroissance bacteacuterienne immeacutediate et au bout de quelques jours en eau de mer un maintien ou un redeacutemarrage de la croissance vraisemblablement due agrave une utilisation de la matiegravere organique (bacteacuteries deacutetruites) par les bacteacuteries qui ont reacutesisteacute au traitement ~ ceci saccompagne dun maintien ou dune augmentation de lactiviteacute enzymatique de la suspension De tels reacutesultats ont eacuteteacute preacuteceacutedemment trouveacutes par Shuval et al (1973) apregraves chloration Singh et al (1986) constatent que cette reviviscence saccompagne dun maintien du pouvoir pathogegravene
13 Etude de linfluence de leacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Lors de cette eacutetude en eau de mer deux eacutechantillons ont eacuteteacute testeacutes lun en phase exponentielle de croissance lautre en phase stationnaire Ce dernier a eacuteteacute dilueacute aux 23 afin de rapprocher la valeur de sa densiteacute optique agrave celle de leacutechantillon en phase exponentielle
A TO le nombre de bacteacuteries dans le premier eacutechantillon est de lordre de 107 UFCml le second (en phase stationnaire dilueacute) est agrave 4106 UFCml
Pendant la premiegravere semaine de lexpeacuterience une variation similaire du nombre de bacteacuteries est observeacutee pour les deux eacutechantillons avec cependant des valeurs leacutegegraverement plus eacuteleveacutees pour leacutechantillon en phase stationnaire (environ une uniteacute Log deacutecart) Cette variation saccentue au cours de la deuxiegraveme semaine pour atteindre au bout de 17 jours un eacutecart denviron 25 uniteacutes Log en faveur de leacutechantillon en phase stationnaire (fig 6)
Le T90 est de 8 jours pour cet eacutechantillon alors quil est reacuteduit de moitieacute ( 4 jours) pour leacutechantillon en phase exponentielle Les bacteacuteries en phase stationnaire de croissance survivent plus facilement en eau de mer que celles en phase exponentielle Cette constatation a eacuteteacute faite par Kolter en 1992 lors dune eacutetude sur la survie des bacteacuteries en phase stationnaire Ces auteurs notent quen ajoutant agrave une culture de bacteacuteries jeunes une minoriteacute de bacteacuteries plus vieilles ces derniegraveres se multiplient alors que les bacteacuteries jeunes narrivent pas agrave survivre et vont jusquagrave disparaicirctre de la culture
Au cours de notre eacutetude les valeurs des activiteacutes ~-galactosidase par litre bien que tregraves voisines pour les deux eacutechantillons sont en chaque point leacutegegraverement plus eacuteleveacutees dans le cas de leacutechantillon en phase stationnaire
Lactiviteacute par cellule nest pas significativement diffeacuterente que les cellules soient en phase exponentielle ou en phase stationnaire (fig 6)
Tableau 5 Influence de (eacutetat physiologique dE coli sur lactiviteacute enzymatique
Echantillon 1 TO 1 Tl7 2TO 2 Tl7 CFUml 12107 24105 44106 11105
Actll (uMl-lmin-1) 1139 524 145 631 Actlcell (IJMl-1min- 1) 94010-10 21810-8 33010-9 57310-8
1 Phase exponentielle 2 Phase stationnaire
12
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Leou Hl0407INDUIf (lSC) 090893
SURVIE DE ECOLI 0908
8T 7
Euml 6 0 5 ~ 4 () 3 9 2
1 a
0 2 4 6 8 la 12 14 16 18
TEMPS (jours)
bull -0- 8 1
ACTIVITELITRE
150
130
110 090 u oc( 070 () 0 050
030
010
-
-010 0 2 4 6 8 la TEMPS (Jours)
12 14 16 18
a 2 4
ACTIVITECELLULE
6 8 10 12 14 16 18 000
-100 -200
-300w g -4000 -500oc(
-600() 0 -700 -800
-900 -1000 1
TEMPS (jours)
Fig 6 Etude de leacutetat physiologique dE couuml H10407 1 Echantillon en phase exponentielle 8 Echantillon en phase statinnaire
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
2) CAS DES EFFLUENTS EPURES DILUES EN EAU DE MER
~ Au cours de la premiegravere expeacuterience (22071993) IIeffluent preacuteleveacute agrave la sortie de la station de Maison Blanche est dilueacute au 1l0e en eau de mer A TO (fig 7 et 8) le nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) est de 35 (Log CFUml) une chute denviron 05 uniteacutes Log est observeacutee agrave Tl puis une stabilisation pendant les 5 jours suivants Une diminution plus importante du nombre de bacteacuteries a lieu au cours de la deuxiegraveme semaine et entre les 20e et 34e jours le nombre de bacteacuteries se maintient entre 1 et 05 uniteacutes Log Le T90 deacutetermineacute pour cette expeacuterience est de 105 jours
~ Au cours de la deuxiegraveme expeacuterience (13081993) - fig 9 - deux effluents (Stations Maison Blanche et Brest) sont analyseacutes agrave deux dilutions diffeacuterentes en eau de mer (1l0e et 150e)
Sur la courbe de survie des bacteacuteries (1308) on observe des allures de deacutecroissance similaires entre les diffeacuterents eacutechantillons A TO le nombre de bacteacuteries cultivables est de 3102 CFUml pour les dilutions au 1lOe et de 5101 CFUml pour les dilutions au 150e Au bout de 10 jours ces valeurs deacutecroissent aux environs de 15 CFUml et de 3 CFUml respectivement
Entre les deux effluents (Maison Blanche et Brest) il nly a pas de diffeacuterence significative des charges bacteacuteriennes agrave TO (3102 CFUml) et la chute bacteacuterienne suit la mecircme allure au cours du temps
La valeur du T90 varie alors de 107 jours agrave 13 jours selon leacutechantillon consideacutereacute Sur leacutechantillon de Maison Blanche dilueacute au 1l0e on retrouve une valeur de T90 (107jours) du mecircme ordre que celle deacutetermineacutee au cours de lexpeacuterience preacuteceacutedente (105 jours)
Sur les eacutechantillons dilueacutes au 150e la valeur du T90 est un peu plus eacuteleveacutee (12 jours pour Maison Blanche et 13 jours pour la station de Brest)
Lanalyse physico-chimique sur les effluents preacuteleveacutes a eacuteteacute reacutealiseacutee Leffluent preacuteleveacute agrave la station de Brest est plus chargeacute en matiegraveres en suspension (172 mg1 contre 48 mg1 pour leffluent de Maison Blanche)
Le carbone organique total est de 1265 mg1 agrave Brest et 920 mg agrave Maison Blanche mais les valeurs mesureacutees pour le carbone organique dissous sont voisines (965 mg1 et 864 mg1 respectivement)
~ Lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct 1993 (effluents de Maison Blanche et de Brest dilueacutes au 110e et 150e) les eaux sont plus chargeacutees En effet le nombre de bacteacuteries cultivables agrave TO est de 13104 CFUml agrave Maison Blanche et de 15103 CFUml agrave Brest pour les dilutions au 110e Cette augmentation de la charge peut sexpliquer par des variations journaliegraveres
On constate au cours de cette expeacuterience une chute du nombre de bacteacuteries plus rapide par rapport agrave lexpeacuterience preacuteceacutedente Les valeurs deacutecroissent denviron 3 uniteacutes Log en 2 semaines pour les diffeacuterents eacutechantillons
13
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
SURVIE CES BACTERIES 2207
4
35
Œ~~_~_ 15 ~ l gt-~
-_~---====--yw
O~--------------______________~__________ o 5 la 15 35
TEMPS (Jours)
1 1 __ -r--Z lt
1 lt 1 lt
SURVIE DES BACiERIES 1308
3
05 ~ 1
a ~ 1
-05 T -1 ~I------------------------------------------
a 15 255 la
i
Temps (jours)
SURVIE DES BACTERIES 3008
4so i 400 iuml 350
~o-~
euro 300 t ~25J ~200
bull~ so l 100 1 osot oooLI--________________~========L
o 5 la 15 25
TEMPS (jours)
1--11 --0-- 12 - 21 ---0-- 22 1 1
Fig 7 Survie des bacteacuteries en eau de mer 15degC 12 Emuents de la station de Maison Blanche (reacuteplieau2207) dilueacutes au 110 11 Emuent eacutepureacute de la station de Maison Blanche (1308) dilueacute au 110 12 f If If 150 21 ft Brest (3008) dilueacute au 110 22 150
1 1 bull l j li
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
EFFLUENTS EPURES du 220793
ACTIVITE BGALliTRE 2207
o 10 20 30 40 000 ri-----------------lt
~ -100
~ -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1~1 ~21
ACTIVITE BGALCELLULE 2207
0 10 20 30 40 -500
-600w
Q -700t laquo -800 () 0 -900t
TEMPS (jours)
1---1 -0shy 2 1
ACTIVITE BGLUliTRE 2207
o 5 10 15 20000 t-I---_______------4-------1
-100t- o -lt -200 ()
9 -300
-400
TEMPS (jours)
1=~=1~21
ACTIVITE BGLUCELLULE 2207
o 5 10 15 20 -500 t-I-----4----------+__------
uumli -600 o
-700t3 laquo -800
~ -900
-1000
TEMPS (jours)
1=---1 ~I
Fig 8 Acthmiddotiteacutes enzymatiques ltp-galactosidase ct P-glucuronidase) des ernuents du 220793 12 Emnents de la station de Maison Blanche (reacutellicals) dilueacutes an 1110
-1000
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
EFFLENTS EPURES DILUES (l5C) du 130893
ACTIVITE BGALLITRE 1308
o 5 10 15 20 25 30
000 l = -100 U -200lt +-+-
g-300~~ 1 -400 ~
-500
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlULiTRE 1308
024 6810 000 j------I-----t-----+-----+-------t
-050 = -100 o -150 lt -200 ltgt -2SOt ~9 -300~~ ~___ --==-===
-350 ---=o -400 -c ~
TEMPS (jours)
ACTIVITE BGlUCEllUlE 1308
o 2 4 6 8 10 -500 ri------+---_--__-----i -o -600
~-700b ~~ ltgt-800 ~~9 ~
-900 l
TEMPS (jours)
1-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- 221
ACTIVITE BGAlCEllUlE 1308
0 5 10 15 20 25 30 -500 -~ ~OOW ~ - U -700
__Il
lt1( 8 -800 ~
-900
TEMPS (jours)
r-shy 11 -0-- 12 -+shy 21 --ltgt-- ~
Fig 9 Activiteacutes enzym1tilues (~-galllctosidase et ~-gltlculOllidnsc) dcs cfl1ucnts du 130893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de l1lisoll B1llnche dilueacute au IIJO 12 150 21 Emuent eacutellUreacute de la station dc Brcst dilueacute au 110 22 150
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
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-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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20
SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
SINGH A YEAGER R et GA Mc FETERS 1986 Asessment of in vivo revivaI growth and pathogenicity ofE coli strains after copper and chlorine injury Appl Env Mie 52 832-837
WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
EFFLUENTS EPURES DILUES (15C) du 300893
ACTIVITE BGALLITRE 3008 ACTIVITE BGLULITRE 3008
o 5 10 15 20 25o 5 10 15 20 25
QOOi 000 1-050 1 1
-050 -100
~ -100 -1 50t-U -150 ~ -200 ~~shy
()-250~_Smiddot200 9 -3oo~====shyJmiddot250 ~ -350 -=+bull-300 ~a
-400r-350 -450
TEMPS ltjours) TEMPS (Jours)
ACTIVITE BGLUCELLULE 3008ACTIVITE BGALCELLULE 3008
5o 5 10 15 20 25 o 10 15 20 25 -500 ri---__--------1----_+_---__------lt 1 -500 r------~~--~--~~- 2 o -600
n -700 laquo -800~
-900 1~ -1000
TEMPS (jours) TEMPS (jours)
I-~-- 11 -0- 12 =-2~ll] [-=~-=11~ 12 -+- 21 ~ 221
-900
Fig 10 Activiteacutes enzymatiflues ltp-galactosidase et P-glucuronidase) dcs CmUClts du 300893 11 Emuent eacutellUreacute de la station de Maison Blanche dilueacute au 110 12 150 21 Emuent eacutellureacute de la station de Brest dilueacute au 1110 ~2 1~0
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
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INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Ces diffeacuterences de survie observeacutees par rapport aux expenences preacuteceacutedentes peuvent ecirctre dues agrave la variation de la qualiteacute des effluents En effet les caracteacuteristiques physico-chimiques ont eacuteteacute mesureacutees et pour tous les paramegravetres analyseacutes (MES matiegraveres volatiles agrave 550 oC COT COD NH4 et P04) les valeurs sont plus eacuteleveacutees que celles des effluents preacuteleveacutes les 22 juillet et 12 aoucirct 1993 (tableau 1)
Les valeurs du T90 de cette derniegravere expeacuterience sont de lordre de 6 jours avec une valeur de COD de 155 mgll alors que le T90 est de 10-11 jours pour des valeurs de COD voisines de 9 mgll au cours des deux premiegraveres expeacuteriences
Ceci rejoint les reacutesultats obtenus lors de leacutetude dE coli H10407 en preacutesence deffluents ougrave lon observe que la quantiteacute de matiegraveres organiques preacutesentes dans leffluent nest pas toujours un facteur favorisant la survie des bacteacuteries en eau de mer Il semble que cest plutocirct la nature de ces matiegraveres qui serait importante En effet des travaux anteacuterieurs sur les pheacutenomegravenes dhalotoleacuterance ont montreacute limportance de la preacutesence de substrats eacutenergeacutetiques et de composeacutes osmoprotecteurs tels que la proline ou la glycine-beacutetaiumlne (Csonka 1981 Le Rudulier et Brouillard 1983) Dautre part il est indispensable que les bacteacuteries aient linformation geacuteneacutetique neacutecessaire pour mettre en oeuvre ces meacutecanismes et pouvoir accumuler sils existent dans le milieu les composeacutes osmoprotecteurs
En ce qui concerne les activiteacutes ~-galactosidase par litre de ces diffeacuterents effluents dilueacutes en eau de mer (fig 89 10) elles sont de lordre de 10-3 agrave 10-4 IlMl-lmin-l agrave TO au cours des deux premiegraveres expeacuteriences et leacutegegraverement plus eacuteleveacutees (10-2 agrave 10-3
1lMl-1min-l ) lors de lexpeacuterience du 30 aoucirct
Les variations de ces activiteacutes ~-galactosidase par litre dans le temps bien que correacuteleacutees avec les courbes de survie sont tregraves faibles Les valeurs des activiteacutes ~-glucuronidase par litre sont geacuteneacuteralement du mecircme ordre de grandeur que les activiteacutes ~-galactosidase par litre et suivent la mecircme eacutevolution dans le temps
Les activiteacutes enzymatiques par cellules rapporteacutees au nombre de bacteacuteries cultivables (lactose + sur geacutelose de Drigalski) sont de lordre de 10-7 agrave 10-9 IlMmin-lceU-l en moyenne ce qui correspond agrave des valeurs obtenues avec E coli dont lactiviteacute avait eacuteteacute induite par lIPTG Il est inteacuteressant de noter que dans le cas deffluents les bacteacuteries rejeteacutees sont tregraves actives sur le plan de lactiviteacute ~-galactosidase et que cette activiteacute se maintient agrave un niveau eacuteleveacute pendant toute lexpeacuterimentation ou peut mecircme augmenter de 1 agrave 2 Log comme lors des expeacuteriences des 27 juillet et 30 aoucirct 1993
14
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
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-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
C - ETUDE DES CORRELATIONS
1 Correacutelation entre les activiteacutes enrymatiques et les numeacuterations bacteacuteriennes
Dans le cadre deacutetudes preacuteceacutedentes des correacutelations entre activiteacutes enzymatiques et numeacuterations bacteacuteriennes avaient eacuteteacute trouveacutees sur des eacutechantillons naturels de la baie de Morlaix (fig Il) (Fiksdal et al (1994) Pommepuyet al (soumisraquo Les correacutelations obtenues eacutetaient
log ~gal =074 log CF - 544 log ~glu = 068 log CF - 531
avec ~gal = activiteacute ~-galactosidase (JtMl-lmin-l )
~glu =activiteacute ~-glucuronidase (flMI-1min- l )
CF Coliformes feacutecauxl00 ml
Les coefficients de correacutelation pour ces deux eacutequations eacutetant hautement significatifs
Dans le cadre de cette eacutetude il nous a paru inteacuteressant dapprofondir ce travail et linterpreacutetation de ce type de correacutelations Nous avons dune part associeacute les donneacutees obtenues agrave TO afin deacutevaluer la relation pouvant exister entre numeacuteration et activiteacute enzymatique pour des bacteacuteries non stresseacutees et dautre part observeacute leacutevolution de ces deux paramegravetres en fonction du temps dexposition des bacteacuteries agrave leau de mer (eacutetude du stress)
11 Evaluation de lactiviteacute enzymatique des bacteacuteries non stresseacutees agrave TO
Sur la figure 12 nous avons reporteacute les reacutesultats obtenus agrave TO E coli induit E coli non induit et eaux deffluent dilueacutees dans leau de mer syntheacutetique
Trois familles de points se distribuent ainsi
- E coli non induit se deacutetache particuliegraverement du reste des points avec des activiteacutes par litre tregraves faibles
- E coli induit forme une famille de points avec des numeacuterations et des activiteacutes ~ galactosidase tregraves eacuteleveacutees
- Les eaux deffluent se situent dans le prolongement dE coli induit avec des numeacuterations bacteacuteriennes et des activiteacutes plus faibles Les points infeacuterieurs sont caracteacuteriseacutes par des valeurs de lordre de 102 UFCml pour une activiteacute ~galactosidase par litre denviron 10-4 flMmin-1
Leacutetude des correacutelations de lensemble des points aligneacutes agrave TO (E coli induit et eaux deffluent) donne la relation suivante (fig 13)
log ~gal =082 log CF - 490 avec n =41 et r = 097
15
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
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21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
- t t-1 1shy
1- -gt MUGalase MUGluase middot-1shy-shy= middot -~ ~ -= -~ N
~ -middot-CJ
-lt eo -0 log YMUGluase = 068 log x - 531 Cl ~- -
A- 6 -1 8
Log CFUI00ml
Fig 11 Relation entre le nombre de coUfonnes feacutecaux ct lacthiteacute enzymatique (~-galactositlase et ~-glucuronidase) Estuaire de Morlaix (27 nril1992 4 mai 1992)
0
-1--2
middot -j-
i-~ ~ 1shyr ~ -shy shy
shy
-1
-
shy- shybull
YMUGalase = 074 log x - 544
2
B-galactosidase
2 3 J i 1) Numeacuteration
Log UFC 100 ml
Fig 12 Activiteacute ~-gdactositlase il TO X Eaux de smtions deacutepuration dilueacutees en eau de mer o E coli induit (IPTG)
6 E coii Don induit
1 -
0
1
= - middot1 - ~ -0c-
middot2
middot3
J
)0 08 ()
0lt (008 0
x )(
x
xx x
x
x l( l(
bull 1 11middot11 t i 1 t t 1 11 Il f
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
1-1
~ =shy 15
1- = 05 shy
-0 ~ - shyshy
-~- - shyshy shy-1 shy~ shy- - shyshyshyshy--~
-25 -
-
shy shy-~- Y= 082 x - 490
-= r = 097-~ _ -c
n=41_A
-45 shy~-------~-----~----~---------------------------------------------
~- 4 --- --- -f
Log CFUml
Fig 13 Correacutelation Log Act ~gal - Log CFUml
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
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-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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MARTINS MT RIVERA IG CLARK DL STEWART MH WOLFE RL OLSON BH 1993 Distribution of mid A gene sequences in E coli isolates in water sources and comparison with the expression of ~-D-glucuronidase activity in 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide media Appt Env Microbiol 592271-2276
MATIN A AUGER EA BLUM PH and SCHULTZ JE 1989 Genetic basis of starvation survival in nondifferenting bacteria Annu Rev Microbiol 43 293-316
MUNRO PM 1988 Modifications somatiques et adaptation dE coli en milieu marin Thegravese de Doctorat de lUniversiteacute dAix-Marseille II
MUNRO PM GAUTHIER MJBREITTMAYER VA BONGIOVANNI J 1989 Influence of osmoregulation processes on starvation of E coli in seawater Appl Environ Microbiol 55 (8) 2017-2024
PALMER CJ TSAr YL LEE LANG A SANGER MANO LR 1993 Evaluation of coliber-marine water for detection of total coliforms and E coli in the marine environment Appl Environ Microbiol 59 786-790
POMMEPUY M FIKSDAL L CAPRAIS MP CORMIER M 1993 Evaluation of bacterial contamination in an estuary using rapid enzymatics techniques Soumis pour Congregraves Budapest lAWQ 17e confeacuterence Juillet 1994
REEVE CA BOCKMAN AT and MATIN A 1984 Role of protein degradation in the survival of carbon starved Escherichia coli and Salmonella typhimurium J Bacteriol 157 758-763
REEVE CA AMY PS and MATIN A 1984 Rote of protein synthesis in the survival of carbon-starved Escherichia coli K12 J Bacteriol 160 1041-1046
ROSACK DB et COLWELL RR 1987 Metabolic activity ofbacterial cells enumerated by direct viable count Appl Env Microbiol vol 53 pp 2889-2982
20
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SINGH A YEAGER R et GA Mc FETERS 1986 Asessment of in vivo revivaI growth and pathogenicity ofE coli strains after copper and chlorine injury Appl Env Mie 52 832-837
WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
Lactiviteacute moyenne par cellule est dans ce cas de 120 10-8 IlM min-l La pente de la relation preacuteceacutedente eacutegale agrave 082 (cr = 0032) et non agrave 1 fait que lon ne peut consideacuterer que lactiviteacute par cellule soit constante quelque soit le nombre de cellules mecircme en inteacutegrant lerreur lieacutee agrave limpreacutecision des mesures (= 05 log pour les deux types danalyses) confirme ce reacutesultat Le traitement des deux groupes de points (E coli induit - eaux deffluent) donne une pente infeacuterieure agrave 1
Lors des faibles numeacuterations lactiviteacute par cellule apparaicirct systeacutematiquement leacutegegraverement plus eacuteleveacutee que dans les fortes concentrations bacteacuteriennes plusieurs explications peuvent ecirctre avanceacutees un deacuteficit en inducteur par forte charge bacteacuterienne une meilleure expression de lactiviteacute lorsquil y a peu de cellules (problegraveme des flocs) une saturation du spectrofluorimegravetre lors danalyse avec des eacutechantillons trop chargeacutes (ou une analyse bacteacuteriologique plus preacutecise pour des concentrations faibles)
Une autre conclusion importante est que lactiviteacute enzymatique des eaux deffluent est tregraves eacuteleveacutee on a donc en milieu naturel de fortes inductions des bacteacuteries puisquelles se situent dans la gamme des reacutesultats obtenus avec un E coli induit
A Morlaix lactiviteacute par cellule pour des eaux deffluent ou des eaux situeacutees en amont de lestuaire (tregraves contamineacutees par le rejet de brut du by-pas - fig Il - points situeacutes en haut agrave droite du graphique - variaient entre 3 agrave 5 10-8 JlMmin- Pour E coli non induit lactiviteacute est de lordre de 10-11 voire 10-12 IlMmin-l Les bacteacuteries des eaux deffluent preacutesentent donc des activiteacutes enzymatiques importantes traduisant ainsi un meacutetabolisme actif
12 Evolution de lactiviteacute enzymatique en fonction du temps de seacutejour de la bacteacuterie en eau de mer
Dans nos expeacuterimentations nous avons SUIVI leacutevolution des activiteacutes et des numeacuterations apregraves un seacutejour en eau de mer (plusieurs jours)
La figure 14 reporte les reacutesultats obtenus en numeacuteration et activiteacute enzymatique par litre en fonction du temps On observe dune maniegravere geacuteneacuterale que ce soit pour la souche dE coli ou pour les eaux useacutees une deacutecroissance plus rapide de la numeacuteration bacteacuterienne (nombre duniteacute formant colonie) que de lactiviteacute enzymatique (les points au cours de lexpeacuterience se deacuteplaccedilant de la droite vers la gauche en dautres termes si lon reporte lactiviteacute par litre au nombre de cellules qui cultivent on obtient des activiteacutes cellulaires qui augmentent avec le temps
Linterpreacutetation des activiteacutes cellulaires tregraves eacuteleveacutees donne lieu agrave plusieurs hypothegraveses
- les bacteacuteries immergeacutees dans leau de mer subissent une induction qui augmente lactiviteacute ~-galactosidase ou ~glucuronidase Martin et al (1989) et Kjelleberg et al (1987) ont montreacute une augmentation de certaines activiteacutes enzymatiques lors de stress quils interpregravetent comme une reacuteponse aux changements environnementaux De mecircme Fiksdal et al (1989) observent eacutegalement laugmentation de lactiviteacute hydrolase chez les bacteacuteries en eacutetat de stress Il est cependant peu vraisemblable que sans inducteur (E coli est immergeacute dans de leau de mer syntheacutetique) lactiviteacute ~-galactosidase puisse ecirctre augmenteacutee agrave des niveaux aussi eacuteleveacutes (16 10-6 )lMmin-I ) dautant plus quentre un E coli non induit et un E coli induit lactiviteacute passe de 10-11 - 10-12 IlMmin- i agrave 10-8 JlMmin- i seulement et ceci pour des
16
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
8-galactosidase
1 shy
0 TaT7 0-- 0 rEG rP 0
0
-sect -1 shy
= TO x x~ -2
O
3 -3 shy
-4 shy
52 3 4 6 7 8 9 Numeacuteration
UFC100 ml
Fig 14 Evolution en eau de mer de lactiviteacute enzymatique et du nombre de bacteacuteries en fonction du temps
o E coli induit
x Eaux de stations deacutepuration 10 Temps initial de seacutejour en eau de mer T7 Fin de lexpeacuterience (7 jours en eau de mer)
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
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-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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20
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WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
bacteacuteries en bon eacutetat physiologique (fin de phase exponentielle de croissance en milieu nutritif et preacutesence dinducteur)
- La deuxiegraveme hypothegravese est quil existe un maintien de lactiviteacute enzymatique dans la cellule qui ne cultive plus soit par non deacutegradation intracellulaire de lenzyme soit par maintien de la production enzymatique chez ces bacteacuteries viables non cultivalbes
En ce qui concerne la persistance de lenzyme apregraves la mort de la cellule Lewin B (1988) indique quen milieu carenceacute sans inducteur on observe une deacutegradation tregraves rapide des proteacuteines et des ARN messagers Nos expeacuteriences avec le chlorampheacutenicol et celles de congeacutelation-deacutecongeacutelation tendent agrave montrer quun blocage de linduction ou la lyse bacteacuterienne saccompagne dune diminution parfois limiteacutee (chlorampheacutenicol) de lactiviteacute enzymatique En tout eacutetat de cause il semble peu vraisemblable que lenzyme -qui est une proteacuteine - puisse subsister et rester active pendant 4 agrave 7 jours en milieu carenceacute apregraves la mort de la cellule Lactiviteacute f3-galactosidase deacutetecteacutee serait plus vraissemblablement attribueacutee aux cellules viables et non cultivables qui persistent dans le milieu
2 Coeacutelation entre les activiteacutes ~-galactosidase et ~-glucuronidase
Sur les expeacuteriences reacutealiseacutees les 27 juillet 13 et 30 aoucirct 1993 nous avons eacutetudieacute simultaneacutement ces deux activiteacutes sur des eaux deffluent dilueacutees dans de leau de mer artificielle
Les reacutesultats sont reporteacutes sur la figure 15 la correacutelation trouveacutee est
log ~ glu = 085 log ~ gal - 070 avec r =084 et n =52
Ce reacutesultat est un peu diffeacuterent de celui trouveacute preacuteceacutedemment dans lestuaire de Morlaix ougrave nous avions (Fig 16)
log ~ glu = 096 log ~ gal - 0278 avec r =097 et n =32
On sait que lactiviteacute f3-glucuronidase est plus speacutecifique dIE coli que lactiviteacute f3shygalactosidase qui elle reflegravete lactiviteacute des coliformes feacutecaux Selon les sites et les preacutelegravevements il est vraisemblable que le rapport des deux flores puisse changer ce qui expliquerait le changement des variables de cette correacutelation
17
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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ROSACK DB et COLWELL RR 1987 Metabolic activity ofbacterial cells enumerated by direct viable count Appl Env Microbiol vol 53 pp 2889-2982
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SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
-1 shy
-shy
-c t - - shy shy--1shy- 0( -
y = 085 x-o70
- - 5 --
r = 084 shy n = 52
-~ _ ~------~----~-----------------------------
~ -~ -~ -_- --- -- -~ = - shy- -- - --- - ---Log Act ~gall
Fig 15 Correacutelation Log Act ~gIu - Log Act ~ga1
o) [
lJJ 0 1
middot150-
~ C1 middot20
1
J 1 y=O96x-O2iuml8lt( 1IJ 1
1 ) pO97
n-321middot-150
SYI --- 500 lm JOO 200 00 100
Log Actl r 13 Gall)closidase
Fig 16 Correacutelnion cntre les activiteacutes ~-g11actosidlSe ct ~-giucuroniugrave~1Sc ucircruaire de Morlaix (mars avril 1992 ct janvier 1993)
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
18
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
AUGOUSTINOS MT GRABOW NA GENTHE B KFIR R 1993 An improved membrane filtration method for enumeration of faecal coliforms and E coli by a fluorogenic j3-glucuronidase assay Wat Sci Tech 27 (3-4) 267-270
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19
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MUNRO PM GAUTHIER MJBREITTMAYER VA BONGIOVANNI J 1989 Influence of osmoregulation processes on starvation of E coli in seawater Appl Environ Microbiol 55 (8) 2017-2024
PALMER CJ TSAr YL LEE LANG A SANGER MANO LR 1993 Evaluation of coliber-marine water for detection of total coliforms and E coli in the marine environment Appl Environ Microbiol 59 786-790
POMMEPUY M FIKSDAL L CAPRAIS MP CORMIER M 1993 Evaluation of bacterial contamination in an estuary using rapid enzymatics techniques Soumis pour Congregraves Budapest lAWQ 17e confeacuterence Juillet 1994
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REEVE CA AMY PS and MATIN A 1984 Rote of protein synthesis in the survival of carbon-starved Escherichia coli K12 J Bacteriol 160 1041-1046
ROSACK DB et COLWELL RR 1987 Metabolic activity ofbacterial cells enumerated by direct viable count Appl Env Microbiol vol 53 pp 2889-2982
20
SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
SINGH A YEAGER R et GA Mc FETERS 1986 Asessment of in vivo revivaI growth and pathogenicity ofE coli strains after copper and chlorine injury Appl Env Mie 52 832-837
WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
21
GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
CONCLUSION
La qualiteacute microbiologique des eaux cocirctiegraveres est reacuteglementeacutee par des normes qui reacutegissent le nombre de coliformes thermotoleacuterants agrave ne pas deacutepasser pour proteacuteger certains usages (baignade conchyliculture) Le controcircle des eaux est reacutealiseacute par des techniques classiques de numeacuterations bacteacuteriennes obtenues par culture sur membrane ou en milieu liquide et donnant des reacuteponses en 24 voire 48 heures de nouvelles techniques baseacutees sur des activiteacutes enzymatiques speacutecifiques despegraveces bacteacuteriennes ont reacutecemment eacuteteacute proposeacutees pour deacutetecter E coli ou les coliformes thermotoleacuterants Plusieurs auteurs preacuteconisent lemploi de substrats fluorescents permettant de mettre en eacutevidence lactiviteacute ~-galactosidase ou ~ glucuronidase (Berg et Fiksdal 1988 Mates et Shaffer 1988 Palmer et al 1993)
Lutilisation de lactiviteacute ~-glucuronidase est cependant reconnue pour ecirctre plus efficace pour deacutetecter E coli et est recommandeacutee par Augoustinos et a (1993) pour ameacuteliorer cette deacutetection dans les eaux naturelles
Dans cette eacutetude nous avons tenteacute dappreacutehender les possibiliteacutes et les limites de cette technique analytique agrave partir dexpeacuterimentations reacutealiseacutees dune part sur des eaux useacutees (dilueacutees dans de leau de mer) et dautre part sur une souche diE coli stresseacutee ou non linteacuterecirct de ces derniegraveres expeacuteriences eacutetait deacutetudier la variabiliteacute de la reacuteponse enzymatique en fonction du temps
Il semble plus vraisemblable que le maintien de lactiviteacute ~galactosidase puisse ecirctre attribueacute aux cellules qui restent viables et ne cultivent plus Rosack et Colwell (1987) ont montreacute que lorsque les bacteacuteries sont stresseacutees elles passent par diffeacuterents eacutetats ougrave elles gardent une activiteacute physiologique alors quelles ont perdu le pouvoir de cultiver Depuis de nombreux auteurs ont publieacute sur leacutetat viable non cultivable et ont montreacute que pendant cette peacuteriode qui preacutecegravede la mort bacteacuterienne diffeacuterents reacuteajustements physiologiques avaient lieu afin de permettre agrave la bacteacuterie de survivre en particulier de nombreuses proteacuteines de stress sont seacutecreacuteteacutees par activation de gegravenes (Kolter 1992 Hood et al 1986 Reeve et al 1984)
En conclusion en ce qui concerne laspect surveillance sanitaire des eaux cocirctiegraveres dans lesquelles se rejettent des eaux useacutees si lhypothegravese que nous avons deacuteveloppeacutee savegravere confirmeacutee (maintien de lactiviteacute enzymatique chez les bacteacuteries viables non cultivables) lanalyse par la MUG de lactiviteacute enzymatique est inteacuteressante En effet par cette technique il serait possible de suivre une contamination feacutecale reacutemanente de maniegravere plus fiable puisquelle prendrait en compte les bacteacuteries stresseacutees Par ailleurs Munro et al (1989) montre que lactiviteacute ~-galactosidase disparaicirct au bout de 14 jours de stress environ
Quoiquil en soit il existe une excellente correacutelation entre les deux activiteacutes le choix de lune ou lautre analyse peut se faire agrave partir de critegraveres tels quune meilleure seacutelectiviteacute (~-glucuronidase - E coli) Cependant le fait que la mesure de la ~-galactosidase soit plus sensible (meilleure reacuteponse pour des contaminations faibles) peut jouer en faveur du choix de cette derniegravere
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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FIKSDAL L POMMEPUY M CAPRAIS MP MIDTTUN 1 1994 Monitoring of fecal pollution in coastal waters by use of rapid enzymatic techniques Appl Env Microbiol 60 5 1581-1584
FRAMPTON EW RESTAINO L 1993 Methods for E coli identification in food water and clinical sampi es based on ~-glucuronidase detection J Appl Bacteriol 74 223shy233
FREIDELDER D 1990 La reacutegulation de lactiviteacute des gegravenes chez les procarystes In Biologie Moleacuteculaire 263-280
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MATIN A AUGER EA BLUM PH and SCHULTZ JE 1989 Genetic basis of starvation survival in nondifferenting bacteria Annu Rev Microbiol 43 293-316
MUNRO PM 1988 Modifications somatiques et adaptation dE coli en milieu marin Thegravese de Doctorat de lUniversiteacute dAix-Marseille II
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POMMEPUY M FIKSDAL L CAPRAIS MP CORMIER M 1993 Evaluation of bacterial contamination in an estuary using rapid enzymatics techniques Soumis pour Congregraves Budapest lAWQ 17e confeacuterence Juillet 1994
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ROSACK DB et COLWELL RR 1987 Metabolic activity ofbacterial cells enumerated by direct viable count Appl Env Microbiol vol 53 pp 2889-2982
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SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
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WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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SOMMAffiE
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INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
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MATES A SCHAFFERM 1988 Quantitative determination ofE coli from faecal coliforms in seewater Microbios 53 161-165
MARTINS MT RIVERA IG CLARK DL STEWART MH WOLFE RL OLSON BH 1993 Distribution of mid A gene sequences in E coli isolates in water sources and comparison with the expression of ~-D-glucuronidase activity in 4shymeacutethylumbelliferyl-~-D-glucuronide media Appt Env Microbiol 592271-2276
MATIN A AUGER EA BLUM PH and SCHULTZ JE 1989 Genetic basis of starvation survival in nondifferenting bacteria Annu Rev Microbiol 43 293-316
MUNRO PM 1988 Modifications somatiques et adaptation dE coli en milieu marin Thegravese de Doctorat de lUniversiteacute dAix-Marseille II
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20
SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
SINGH A YEAGER R et GA Mc FETERS 1986 Asessment of in vivo revivaI growth and pathogenicity ofE coli strains after copper and chlorine injury Appl Env Mie 52 832-837
WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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GRAND PROGRAMME QUALITE - EPURATION DES EAUX
Il - EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION
SUR LA SURVIE ET LETAT PHYSIOLOGIQUE
DESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTAN
EN EAU DE MER
J DUPONT - O KEVORKIAN
SOMMAffiE
fi- EFFET DUN EFFLUENT DE STATION DEPURATION SUR LA SURVIE ET VETAT PHYSIOLOGIQUE DESCHERCHIA COLI ET SALMONELLA MANHATTANEN EAU DE MER
INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
BffiLIOGRAPHIE 43
SHUV AL H COHEN l and KOLODNEY 1973 Regrowth of colifonns and fecaI colifonns in chlorinated wastewater effluent Wat Res 7 537-546
SINGH A YEAGER R et GA Mc FETERS 1986 Asessment of in vivo revivaI growth and pathogenicity ofE coli strains after copper and chlorine injury Appl Env Mie 52 832-837
WARREN LS BENOIT RE JESSEE lA 1978 Rapid enumeration offecaI colifonns in water by a colimetric ~-D-gaIactosidase assay Appl Env Microbiol 35 136-141
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SOMMAffiE
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INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
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INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
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INTRODUCTION 24
MATERIEL ET METHODES 24
1 Effluent de station deacutepuration 24 2 Eau de mer 25 3 SQuches bacteacuteriennes 25 4 Microcosmes 25 5 Plan expeacuterimental 25 6 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 26 7 Etat Physiologique des bacteacuteries survivantes 26
7J Substrats utiliseacutes 27 72 Cineacutetiques de croissance 27 73 Expeacuterimentations teacutemoins 27
RESULTATS 28
1 Survie des bacteacuteries dans les microcosmes 28
J J Evolution du nombre de bacteacuteries cultivables en fonction du temps de seacutejour en eau de mer 28 JJJ Escherichia coli 28 JJ2 Salmonella manhattan 29
J2 Estimation et modeacutelisation des effets des facteurs saliniteacute effluent et tempeacuterature sur la survie bacteacuterienne 29 J2J Escherichiacoli (tableau Jfigure 3) 30 J22 Salmonella manhattan (tableau 2 figure 4) 30
2 Etat physiologique des bacteacuteries survivantes 31
2 J Expeacuterimentations teacutemoins 31 2 J J Croissance des bacteacuteries dans le milieu mineacuteral minimum M63 sans
substrat 31 212 Influence de la saliniteacute et de la concentration en effluent du milieu
M63 avec substrat sur la croissance des bacteacuteries survivantes 31
22 Evolution de lassimilabiliteacute des substrats et du niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes en fonction de leur temps de seacutejour en eau de mer 31 22J Escherichia coli 32 222 Salmonella manhattan 33
23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
DISCUSSION 38
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23 Estimation et modeacutelisation des effets de la saliniteacute de leffluent et de la tempeacuterature sur lassimilabiliteacute des substrats et le niveau dactiviteacute meacutetabolique des bacteacuteries survivantes 34 231 Escherichia coli 34 232 Salmonella manhattan 36
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