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LAZDUNSI<I ET AL.: ~ T U D E Dm BFFETS ~LECTROSTATIQUES 2223

Chaque essai utilise 30 ml de mClange composC conlme suit: 11 ml de tampon, 1 ml d'enzyme de con- centration adCquate, 1 ml de phosphate de p-nitrophhnyle de concentration suffisante pour que la vitesse initiale dCterminCe puisse &tre considCrCe comrne une vitesse maximum, le nombre de millilitres de dioxanne nCcessaire b l'obtention de la concentration de dioxanne dCsirCe dans le milieu, e t la quantitC d'eau distillCe necessaire pour completer le volume i 30 ml.

I1 n'existe dans la IittCrature aucune mention d'un tampon standard perinettant de dCfi11ir de fason satisfaisante I'Cchelle de pH dans les inClanges eau-dioxanne. Marshall e t Grunwald (4) ont inontrC que I'Clectrode de verre e t I'Clectrode B hydrogene rkpondeilt de la m&me maniere B des variations de llactivitC des ions hydrogene dans des solutioils contenant jusqu'i 827, de dioxanne en poids. Inagami e t Sturtevant (5) ont constat6 que les appareils de mesure de pH habituels, utilisant une Clectrode de verre Beckman, fonctionneni parfaitement e t de fason reproductible dans des solutions contenant jusqu'b 88% de dioxanne. Les pH des tampons utilisCs dans cette Ctude ont CtC dCterininCs par la inCthode di jb utilisCe par Sturtevarlt (5) qui consiste B Ctalonner le pH-metre B pH 7 avec le tampon Beckinan standard, et B l'utiliser ensuite directement dans les mClanges eau-dioxanne. Les valeurs des pH apparents, lues de cette nlanihre, sont assez peu CloignCes des valeurs de pH lues en milieux purement aqueux. Le pH d'un tampon Cthanolamine- HCI de force ionique 0.1 passe de la valeur 9.05 aux valeurs 8.9 e t 8.65, lorsque la concentration de dioxanne dans le milieu passe de 0% B 20% puis 507, en volume. Le pH des tampons THAM-HCI est moins affect& Un tampon THAM-HCI de force ionique 0.1 ayant un pH de 8.15 dans l'eau prend successivement des pH de 8.11 B 8.07 dans des solutions B 20y0 puis 50y0 de dioxanne en volume.

(3) ~tz rde de l'injluence de la force ioniqzre du milieu rdactionnel sur la vitesse initiale d'hydrolyse Les vitesses de &action ont 6th CvaluCes par titrage de l'acide phosphorique IibCrC par hydrolyse du

phosphate de p-nitrophbnyle. L'appareillage manufacture par Radiometer (Copenhague) est compos.6 d'un pH-metre T T T 1-b muni

d'une Clectrode B calomel e t d'une electrode de verre type B, d'un enregistreur type SBr2b e t d'une seringue microburette type SBUla.

Le deroulement des opCrations est le suivant: le inClailge rhactionnel est compos.6 de 19 ml d'une solution contenant les quantitCs adequates de phosphate de p-nitrophCnyle e t de chlorure de potassium ou de bromure de tCtraCthylammonium utilisCs comme modificateurs de force ionique. Lorsque ce melange a atteint la tempCrature constante de 15.3 "C, il est port6 par le systeme pH-stat, B la valeur de pH choisie. La reaction d'hydrolyse est alors amorcCe par addition de 1 ml d'une solution de phosphatase alcaline Cgalement B tempkrature de 15.3 "C. Le titrigraphe enregistre, en fonction du temps, les quantitCs de soude necessaires au maintien du pH. Les pentes initiales des courbes obtenues sont utilisees B I'Cvaluation des vitesses initiales de rCaction. La quantite de soude ajoutCe au cours de la rbct ion reprCsente en moyenne 1 B 27, du volume rkactionnel total. La manipulation est faite en atmosphere d'air dCbarrassCe de gaz carbonique.

PARTIE THEORIQUE A. Efet de solvant

Les thCories de cinbtique chimique s'accordent B reconnaitre que la vitesse d'une ritaction est dCterminCe par une variation de 1'Cnergie libre AG* qui se manifeste lors du passage des rCactifs de 1'Ctat initial B l'ittat activit.

L'expression gitnitrale dCcrivant la constante de vitesse est:

oh AG,.,.,.* et AG,.,.* repritsentent respectivement les contributions non itlectrostatiques et Clectrostatiques 5 l'itnergie libre d'activation, h est la constante de Planck, R, la con- stante des gaz et N, le nombre d'Avogadro.

Barnard et Laidler (6) ont appliquC ces concepts aux interactions entre le centre actif de l'enzyme et le substrat. Nous avons tent6 de considitrer toute la molCcule d'enzyme colnlne un ion dont la charge varie avec pH du milieu.

(1) Formation du complexe enzyme-substrat La reaction de formation du complexe enzyme-substrat est reprksentke schCmatique-

ment dans la Fig. 1A. La protitine est figurite par une grosse sphPre de rayon R, et de charge nette Z,e situite en son centre. Le substrat est figurit par une petite sphPre de rayon RA et de charge ZAe. Le complexe activit, formit par association des deux espGces ioniques,

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FIG. 1.4. MCcanisrne de formation du cornplexe enzyme-substrat. FIG. 1B. MCcanisrne de dCcomposition du cornplexe enzyme-substrat.

a la forine d'une sph6re unique de rayon R1* ayant pour charge (Z , + ZB)e. La variation d1Cnergie libre, AG,.,.*, dCrivCe de 1'Cquation de Born, est donn6e par:

oh e reprksente la charge de 1'Clectron et D, la constante diklectrique; d'oh

k1° est la constante de vitesse de forination du coinplexe enzyme-substrat en solution infiniment diluCe.

(2) Dtcomposition du conzplexe enzyme-substrat Le rnkcanisine hypothktique de cette dCcomposition est reprCBentC dans la Fig. 1B.

Le coinplexe enzyme-substrat est present6 sous la forrne d'un ion sphCrique de rayon R et de charge Ze = ( Z , + ZB)e qui, en passant A 1'Ctat activC, A charge constante, change de rayon (R 4 Rz*) sans changer de forme; Rz* peut etre infCrieur, Cgal ou supCrieur A R

kro est la constante de vitesse de dCcoinposition du cornplexe enzymesubstrat en solution infiniment dilu6e.

Con~me la suite le nlontrera, ces Cquations perrnettent une interprbtation satisfaisante des rCsultats expCrirnentaux.

B. Efet de la force ionique L'Cquation de Bronsted-Bjerrum perrnet d1Cva1uer la constante de vitesse d'une

rCaction dont le mCcanisme serait du type:

.4 + B -+ X* -+ produits.

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ya, yn, ys sont les coefficients d'activitC des espcces A, B et du complexe active X ; k o est la constante de vitesse en solution infinilnent diluCe. L'expression familiere du co- efficient d'activitk est donnCe par 1'Cquation de Debye et Hiickel:

a , est le rayon d'exclusion de l'espece i qui possede une charge Zi. Le parain6tre K reprC- sente l'inverse de la dimension de l'atmosph6re ionique.

A 15 "C, 1'Cq. [7] peut s'Ccrire:

oh B = 0.33 X lo8 et p est la force ionique. Dans le cas le plus commun oh A et B sont de petits ions, la quantiti: a i B d P peut

etre nCgligCe en comparaison de 1, dans le terme 1 + a i B d P . LICquation [GI peut alors etre Ccrite:

PI log k = log ko + Z A Z B d p

Cette Cquation classique est utilisCe A tort en cinCtique enzymatique; la protCine a, en gCnCral, un rayon d'exclusion tel qu'il est impossible de nCgliger la quantitC a i B d P dans le te r~ne 1 + a i B d P ; pour des valeurs arbitraires at = 20 A et dP = 0.1, a i B d P = 0.66.

( I ) Formation d u complexe enzyme-sz~bstrat Cette rCaction de formation, reprksentze schCmatiquement dans la Fig. lA, fait appel

A un mkcanisme bimolCculaire. Les equations [GI et [8] permettent d'obtenir 1'i.q. [lo] qui rend coinpte de l'influence de la force ionique sur la constance de vitesse k1:

a,, a , et al+ reprksentent les rayons d'exclusion du substrat, de l'enzyn~e et du complexe activC. Les autres parametres ont CtC dCfinis dans la section prCcCdente.

( 2 ) Dkcom$osition du complexe enzyme-substrat Si la dCcomposition du complexe enzyme-substrat se fait selon le mod6le unimolCculaire

reprCsentC dans la Fig. lB , la vitesse de dCcomposition est donnee par 1'Cquation:

y et y+ sont les coefficient d'activitk du complexe ES et du coinplexe activb ES*. L'Cqua- tion [12] rend compte de I'influence de la force ionique sur la constante de vitesse k ~ .

a et as+ reprCsentent les rayons d'exclusion du complexe ES et du complexe activi: ES*; Z = z, + 2,.

Les Cquations qui ont 6tC dkcrites permettent dlinterprCter les rCsultats obtenus avec la papaine (€9, la inyosine (7) et I1urCase (9).

*Ce terlne est &gal b 0.509 b 25 OC.

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2226 CANADIAN JOURNAL OF CHEMISTRY. VOL. 43. 19G5

A. Influence de la constante diklectrique sur la vitesse m a x i m u m de la rkaction d'hydrolyse Avant de traiter l'effet produit par le dioxanne sur la cinktique de la r6action enzyina-

tique coinme un effet purement klectrostatique, il convient de s'assurer que les concen- trations de dioxanne utilis6es n'ont pas d'action spkcifique tendant B suppriiller l'activit6 phosphatasique. A 20 ml de mklange eau-dioxanne de concentration adkquate sont ajoutes 5 rnl d'une solution d'enzyrne A concentration de 2 / 1 000 (en poids). Le mklange est laissk B 25.7 "C pendant 30 rnin. Ce laps de temps kcoulk, on se sert d'un inillilitre de cette solution d'enzyrne pour provoquer la rkaction d'hydrolyse du phosphate de 9- nitrophknyle. Cette experience a kt6 faite A pH 9.3 en milieu d'incubation de concentration en dioxanne allant de 0 B 50%. La vitesse initiale dCterrnin6e est indkpendante de la concentration en dioxanne du milieu d'incubation. Nous avons observk le m&me phkno- m&ne en utilisant conline solvant rnixte le initlange kthanol-eau.

FIG. 2. Representations de log vm en fonctioll de l/D. Courbe superieure: pH 7.45. Courbe infkrieure: ph 10.42. Temp6rature: 15.3 "C.

La Fig. 2 reprksente un certain nombre de donnkes caractitristiques obtenues B diffkrents pH en adoptant la reprksentation classique qui consiste B kvaluer log vm en fonction de l /D. Aux deux ternpkratures, 15.3 "C et 25.7 "C, et B tous les pl-I ktudies, cette reprksentation est linkaire. Les valeurs de D utilisites sont celles d'Akerlof et Short (10).

Les valeurs des pentes d log vm/ d(l/D) calculkes avec les valeurs d'Alterlof ont kt6 reprksentkes en fonction du pH, aux tempkratures de 15.3 et 25.7 "C dans la Fig. 3. Nous avons obtenu des rksultats sernblables avec les m6langes kthanol-eau B 25.7 "C (Fig. 4). Dans les deux cas, I'effet de constante diitlectrique passe par un inaxirnum pour la m&me valeur de PI-I. Des r6sultats se~~lblables ont kt6 rapportks pour la chymotqrpsine par Castafieda-Agullo et Castillo (11).

B. Influence de la force ionique sur la vitesse wzaximum et l a constante de iVichaelis de l a rkaction d'hydrolyse

La Fig. 5 repr6sente les rksultats obtenus en portant le logarithille de la vitesse relative d'hydrolyse, v , en foilction de la racine carr6e de la force ionique. L'expkrience

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d log Fm FIG. 3. Inllue~lce du p1-I sur la quantit6 - d(llD) en presence de dioxanne.

log en presence d'kthanol B 25.7 "C. FIG. 4. Influence du pH sur la quantite - d( l /D)

a 6tC faite B PI-I 7.5, B une tempkrature d e 15.3 OC et pour plusieurs concentrations d e substrat. Le modificateur de force ionique utilisi: est le chlorure de potassium.

La meme exp6rieilce a Cti: r6alisi:e dans les m&mes conditions de pH e t de tempkrature en utilisant le bromure de tCtraCthylaminoniun~ comme nlodificateur de force ionique. L'accord satisfaisant entre les ri'sultats obtenus avec les deux substances permet d'assurer que l'effet observi' est bien essentiellen~ent un effet de force ionique.

Les donni'es repri'senti'es dans la Fig. 5 permettent d'obtenir des courbes de Line- weaver-Burlt 2 force ionique constante. Elles permettent B leur tour l'i'valuation des grandeurs I?,,, vm et I?vI, en fonction de la racine carrCe de la force ionique. Les resultats ainsi obteilus ant Ct6 reprCsentCs dans les Figs. 6 , 7 et 8.

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CANADIAN JOURNAL O F CHEMISTRY. VOL. 43. 1905

FIG. 5. Influence de p sur le logarithme de la vitesse d'hydrolyse, en unites arbitraires, A pH 7.5 e t temperature 15.3 "C. (A) [S] = 2.5 X lo-' llf; (B) [Sl = 5 X lo-" 114; !C) [S] = 1.5 X 10-3 ilf; (D) [S] = 6 X Af.

FIG. 6. Influence de .\/,u sur pI?,,, A 15.3 "C.

FIG. 7. Influence de d p sur log Vm exprime en unitCs arbitraires. Les points sont exp6rimentaux. (11) Trace experimental; (B) trace thborique: a2" = 20 A, a = 22.3 A.

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4 .6 - A

B

C

4.3 -

4.0 -

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 dT FIG. 8. Influence de dp sur la quantitk log RF,, en unitks arbitraires. Les poi?ts sont expbrimentaux.

(A) TracC expbrimental; (B) track thkorique: a,* = 20 A, aB = 19 A, a . ~ = 4 A; (C) track thkorique: a," = 20 A, a. = 18 A, a. = 4 A.

Injluence d u pH S Z L ~ l'effet de force ionipue La mSme expCrience a C t C faite A pH 9.55 et A 15.3 "C. L'effet de force ionique observb

Ace pH est faible tant sur Vrn que sur Em. La Fig. 9 traduit l'influence de .\/F sur log Vrn. Les rCsultats ont C t C obtenus en prksence de chlorure de potassiuill et de brolnure de tCtraCthylammonium.

DISCUSSION A. Effet de solvant

( 1 ) Injluence des facteurs de nature non e'lectrostatipue Si l'on a l'intention d'interprkter les donnCes expCrinlentales obtenues en analysant

l'effet de solvant, il convient de ne pas oublier les facteurs de nature non Clectrostatique dont la contribution pourrait expliquer les phCnom6nes observes. Les plus importants de ces facteurs sont les suivants:

( a ) Une diminution de la concentration en eau peut provoquer une dCcroissance des vitesses si 1'Ctape dkterminante fait intervenir la participation de n~olCcules d'eau (ce qui peut bien etre le cas dans une rCaction d'hydrolyse).

(b) Une inhibition possible par le composant non aqueux du solvant mixte. (c ) Une dCnaturation de l'enzyine causke par l'addition du solvant organique. L'influence du facteur ( a ) observCe par Inagami et Sturtevant ( 5 ) par 1'Ctude de la

catalyse due A la trypsine en milieu eau-dioxanne ne se manifeste qu'A des concentr a t ' lons de dioxanne supkrieures A goyo. Les expkriences rCalisCes dans cette etude, avec la phos- phatase alcaline, n'ont pas fait intervenir de concentrations en dioxanne supkrieures A 30y0. Dans un tel milieu, la concentration en eau est encore de 39 Ad e t certaiilement tr&s suffisante pour que l'on puisse nCgliger l'influence de ce premier facteur dans l'in- terprktation des rksultats. L'expCrience exposCe plus haut a montrk que l'incubation de l'enzyme en prCsence de fortes quantitCs de dioxanne n'apporte aucune modification de la vitesse d'hydrolyse. Elle 8te beaucoup de son importance au facteur (6) . L'influence du facteur (b ) est certainement negligeable puisque les effets observes sont les m&mes avec deux molCcules aussi diffkentes que 1'Cthanol e t le dioxanne.

Enfin, e t surtout, le fait qu'A tous les pH e t tempCratures CtudiCs, l'influence de l / D sur log Vrn se represente par une droite, cornme le laissent prCvoir les thCories qui traitent uniquement des effets Clectrostatiques, enl&ve beaucoup d'importance aux facteurs secondaires.

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2230 C A N - ~ D I A N JOURNAL OF CHEMISTRY. VOL. 43, 19135

( 2 ) E s s a i de de'termination d u me'canisme i n t i m e de la re'action de de'comfiosition dzr . .

complexe enzyme-substrat Si la r6action se dkroule selon le mod&le monomolCculaire dCcrit dans la Fig. l B l la

pente thkorique a pour expression:

La reprttsentation la plus intkressante (Fig. 12) consiste A figurer la valeur A = A'T en fonction de la c11arg~Z du complexe enzymesubstrat Cvaluke A partir des courbes de titrage (Figs. 10 e t 11). Ce changenlent de variable fait disparaitre l'effet de teinperature qui apparaissait dans la Fig. 3. Colnlne le prCvoit 1'Cq. [13], l'extrapolation du cat6 des charges faibles indique que A = 0 lorsque Z = 0.

La pente des courbes log v, en fonction de 1/D est nkgative quel que soit le pH d16tude; la quantitk

7 7

doit donc $tre positive. Le rayon equivalent de la molttcule de coinplexe enzymesubstrat

o .51 I

0.1 0.3 0 .5 0.7 v'ji

FIG. 9. Influencede dp sur log v,,, exprim6 en unitCs arbitraires; pH 9.55; tempCrature 15.3 "C. Q KC1; 0 (C2Hj)rNBr.

FIG. 10. I ~ l f l ~ ~ e n c e de la temp6rature sur la charge de I'enzyme de poids mnlCculaire SO 000. (A) Tem- p6rature 24.8 "C; (B) tempCrature 15.3 "C.

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FIG. 11. Influence de la force ionique sur la charge de l'enzyme de poids mol6culaire 80 000 B 24.8 OC. (A) p = 0.02; (B) p = 0.1; ( C ) p = 0.5.

est plus grand 3 l'ktat initial qu'8 l'ktat activk. De toute kvidence, la figure n'est pas dkcrite par une kquation du type y = ax2 (kq. [13]). La quantitk

1 1 - - - R2* R

varie doilc en fonction du pH. La fonction

a kt6 calculke pour chaque valeur de Z 8 partir des donnkes expkimentales qui apparais- sent dans la Fig. 12. Cette fonction ainsi obtenue est reprksentke par la Fig. 13, de facon

FIG. 12. Influence de is charge Z du con~plexe enzymesubstrat sur Is quantite T X . 62 25.7 "C; 0 15.3 "C.

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CANADIAN JOURNAL O F CHEMISTRY. VOL. 43. 1965

I I

0 10 20 30 40 Z

B I G 13. InRuer~ce d e la charge Z du complexe enzymesubst ra t sur la quantitC (m. 0 25.7 'C; 0 15.3 "C.

lin6aire. L'activation se fait sans changernent de dimensions lorsque la charge du com- plexe enzyme-substrat devient Z = -45. Selon la temp6rature d'etude, les pH cor- respondants A cette charge sont colnpris entre 10.5 e t 11. I1 est interessant de remarquer que la diff6rence entre R e t Rz* est n~inirnurn dans une rbgion de pH correspondant A une vitesse maxirnurn de decomposition du complexe enzyn~e-substrat (1).

Cette constatation est A rapprocher des conclusions de Rruice e t Pandit (12) A l'issue d'une etude sur la catalyse intramol6culaire de l'hydrolyse des monoesters de diacides. Ces auteurs ont montr6 qu'une d6composition A catalyse intramol6culaire non enzylnatique est d'autant plus rapide que la conformation de l'ktat fondamental de la mol6cule est plus voisine de celle de son 6tat activ6.

B. Effet de force ionique (1) Formation du complexe enzyme-substrat Les difficultes de mesure directe de la constante de vitesse k1 rendent difficile, sinon

impossible, 1'Ctude syst6matique de l'influence de la force ionique sur la vitesse de forma- tion du coinplexe enzyme-substrat. N6anmoins, si l? = l/&, ne reprbsente pas, cornnle Michaelis l'admettait implicitement, la constante d'equilibre kl/k-1 de la rbaction

mais plut8t le rapport kl/k2, il est kvident que la quantit6 l?Pm est egale A kl[E]o. Toutes les 6tudes les plus sores, faites avec la catalase (13, 14), les trypsines (15), la

peroxydase (16, 17), la carboxypeptidase (18, 19) e t la n~yosine (20) ont montri: que k2 Ctait trhs sup6rieure A k-1, de sorte que I? = kl/kz. Nous adrnettrons que ceci est 6gale- ment vrai pour la phosphatase alcaline e t interprhterons la courbe experimentale (A) de la Fig. 8, donnant log I?vm en fonction de d P , cornrne s'il s'agissait de la courbe log (kl relative) en fonction de d p . La courbe (A) a l'allure d'une droite aux tr&s faibles forces ioniques entre dP = 0.05 e t 0.2. Lorsque la force ionique augmente, ensuite, son in- fluence sur log Rvrn devient de rnoins en moins considerable, passe par un maximum entre dP = 0.4 e t 0.5 e t diminue sensibleinent d6s que = 0.6.

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LAZDUNSKI ET AL.: ~ T U D E DES EFFETS ~LECTROSTATIQUES 2233

L'Cquation [lo] perinet de calculer les courbes thkoriques log kl/kP en fonction de d p . La courbe (B) de la Fig. 8 a CtC calculke avec les valeurs suivantes: al* = 20 A, aB =

19 A et a, = 4 A ; la courbe (C) avec les valeurs: al* = 20 A, a~ = 18 A et a, = 4 A. L'allure des courbes thCoriques est t r b seinblable A celle de la courbe expitrimentale

(A). Les valeurs choisies pour les rayons d'exclusion ne permettent pas d'obtenir de maxiinuin entre d p = 0.4 et 0.5. On ne saurait trop attracher d'importance A cette diffCrence; l'kquation de Debye-Hiickel ne s'applique plus parfaiteinent Q des forces ioniques aussi ClevCes. L'expCrience nlontre que les rkactions entre petits ions ne suivent la loi dkcrite par 1'Cq. [9] que pour des valeurs de d p gknkralement infkrieures B 0.3 (21). Les courbes thCoriques (B) et (C), par ailleurs, ont le mitrite d'avoir entre d p = 0.05 et 0.2, des pentes moyennes qui sont en accord satisfaisant avec la pente 4.2 obtenue expCriinen talernent.

(2) De'composition du co7~zplexe enzyme-substrat Puisque le phosphate d'enzyme, E-POB-, seinble 2tre I'intermCdiaire le plus stable

form6 au cours de la catalyse phosphatasique (22-24), la courbe (A) de la Fig. 5 (log Vrn en fonction de y'p) reprksente en fait l'influence de la force ionique sur la vitesse kz de dkcomposition du coinplexe E-PO3=. Cette dCcoinposition, qui est certainelnent B catalyse intrainolitculaire, procitde par un mCcanisme unimolCculaire du type reprCsentC dans la Fig. 1B. La courbe expCrimentale (A) a I'allure d'une droite aux trits faibles forces ioniques, entre d p = 0.05 et 0.2. Lorsque la racine carrite de la force ionique continue B auginenter, ensuite, son influence sur log vm devient moins considkrable et atteint un palier d&s que d p = 0.3.

L'Cq. [12] perinet de calculer les courbes thCoriques log kZ/k2O, c'est-A-dire log T;6, en unitCs arbitraires, en fonction de dp. Pour calculer th6oriquement une droite de pente positive semblable A celle obtenue expkrimentalement Q faibles forces ioniques, il faut nCcessaireinent choisir des valeurs de az*, rayon d'exclusion du coinplexe activit ES*, inferieures B a , rayon d'exclusion du conlplexe enzyme-substrat ES. La courbe (B) d e la Fig. G a itt.6 calculke en rempla~ant dans 1'Cq. [12] les valeurs de az* et de a par: a,* =

20 A et a = 22.3 A. La pente de la courbe (B) entre d p = 0.05 et 0.2 est en bon accord avec la pente l.G

obtenue expitrimentalement. En outre, I'allure des courbes thkoriques est semblable B celle de la courbe expitrimentale (A).

A pH 9.55, l'influence de d p sur log vm est beaucoup plus faible qu'B pH 7.3. Les seuls r6sultats qui seront interpritt6s sont ceux situl-s au-dessous de dP = 0.4. La pente exp6rimentale inoyenne entre d p = 0.05 et 0.2 est de 0.45. En rempla~ant dans 1'Cq. [I21 les valeurs de a e t az* par: a = 20 A et a2* = 19.87 A pour la courbe (A) et a = 22.3 A et az* = 22.17 a pour la courbe (B), et en utilisant la charge de la phosphatase 3 pH 9.55 pour une force ionique de 0.02 Q 15.3 "C, les pentes ainsi calcul6es sont respectiveillent 0.39 e t 0.43. Elles sont en bon accord avec la valeur expitrjinentale.

Les interpretations donnCes aux effets de force ionique et celles donnCes aux effets de solvant inontrent que la molCcule enticre de phosphatase alcaljne joue, par sa charge, un rale iillportant dans la catalyse. Les deux Ctudes sont en bon accord; le rayon R du con~plexe enzyme-substrat est toujours supkrieur au rayon R2+ du co~llplexe activit correspondant; de ~neine le rayon d'exclusion, a, du complexe enzymesubstrat est toujours supitrieur au rayon d'exclusion a2* du coinplexe active correspondant. La difference (a - a2*) coilline la diffCrence (R - R2*) est d'autant plus faible que la charge de la protkine est plus Clevite. Elle passe de 2.3 A A p1-I 7.5 A 0.13 A B PI-I 9.55. Les valeurs an du rayon d'exclusion du substrat utilishes dans les calculs sont nCcessaireinent du bon

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