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Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de

Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

Yeison Tangarife Morales

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Departamento de Procesos y Energía

Medellín, Colombia 2016

Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de

Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

Yeison Tangarife Morales

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ingeniería Química

Director (a):

Ph. D., Ángela Adriana Ruiz Colorado

Línea de Investigación:

Producción y Aplicación de Metabolitos Secundarios

Grupo de Investigación:

Bioprocesos y Flujos Reactivos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Departamento de Procesos y energía

Medellín, Colombia

2016

La ciencia no sabe de países, porque el

conocimiento le pertenece a la humanidad y

es la antorcha que ilumina el mundo. La

ciencia es el alma de la prosperidad de las

naciones y la fuente de todo progreso.

Louis Pasteur

Agradecimientos

Agradezco a Dios por permitirme vivir esta experiencia tan enriquecedora. A mi

familia por el apoyo incondicional y constante. A amigos y seres queridos que de

una o cierta manera me apoyaron y colaboraron.

A la profesora Ángela Adriana Ruiz Colorado por sus aportes y directrices que

ayudaron a la terminación satisfactoria de esta investigación. Al grupo de

investigación Bioprocesos y Flujos Reactivos de la Universidad Nacional de

Colombia por sus aportes, ideas y apoyo económico y de infraestructura.

Al profesor Roberto Parra Saldívar del Tecnológico de Monterrey por la invitación

a la pasantía de investigación en esta universidad, donde se ganó conocimientos

académicos fundamentales y crecimiento personal. A la Doctora Magdalena Rostro

Alanis por dirigir directamente esta pasantía y al grupo de investigación

Bioprocesos Ambientales por sus valiosos aportes.

A Colciencias por su programa Jóvenes Investigadores e Innovadores, mediante el

cual se pudo financiar gran parte de la maestría.

Resumen y Abstract IX

Resumen

El hongo Fusarium spp es un patógeno que produce marchitación en plantas, generando

pérdidas económicas cuantiosas en el sector alimentario. Este microorganismo tiene la

capacidad de producir lacasas, una enzima que cataliza la degradación de compuestos

fenólicos. En este trabajo se evalúo la separación y purificación de lacasa producida a

partir del extracto crudo del microorganismo Fusarium spp. Se realizó esta purificación con

la Partición de Tres Fases y se obtuvo un rendimiento de 115% y 1.25 veces de

purificación. Luego de separar y Purificar, se aplicó la lacasa purificada sobre material

lignocelulósico, raquis de palma. Este residuo es generado de la producción de aceite de

palma. En este pretratamiento enzimático se comparó la aplicación de lacasa purificada y

extracto crudo, se maximizó la cantidad de fenoles formados a pH 4.0 y temperatura

58.7°C. Finalmente las remociones de lignina fueron del 15% para el extracto purificado y

la purificación aumentó la acción de la lacasa en el raquis de palma.

Palabras clave: Lacasa, Fusarium spp, pretratamiento enzimático, Separación y

purificación, raquis de palma.

X Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

Abstract

The fungus Fusarium spp is a pathogen that produces withering plants, generating large

economic losses in the food sector. This microorganism has the ability to produce laccases,

an enzyme that catalyzes the degradation of phenolic compounds. In this work, it was

evaluated the separation and purification of the laccase produced from the crude extract of

the microorganism Fusarium spp. This purification was achieved by the Three Phase

Partitioning and a yield of 115% and fold purification of 1.25 was obtained. After separation

and Purification, the purified laccase was applied on lignocellulosic material, rachis of palm.

This residue is generated from the production of palm oil. In this enzymatic pretreatment

the application of purified laccase and crude extract was compared, the amount of phenols

formed by pH 4.0 and 58.7 °C were maximized. Finally the lignin removals were 15%.

Purification increased the action of the laccase on the palm rachis.

Keywords: Laccase, Fusarium spp, enzymatic pretreatment, Separation and

purification, palm rachis.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Contenido ...................................................................................................................... XI

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XIV

Lista de Abreviaturas ................................................................................................... XV

Introducción ................................................................................................................... 1

1. Contexto General .................................................................................................... 3

Resumen ...................................................................................................................... 3 Introducción .................................................................................................................. 3 1.1. Lacasa ............................................................................................................... 3

1.1.1. Fuentes de producción ................................................................................ 4 1.1.2. Condiciones de producción ......................................................................... 5 1.1.3. Aplicaciones en diferentes procesos ........................................................... 6 1.1.4. Bioquímica de la lacasa .............................................................................. 7

1.2. Fusarium spp ..................................................................................................... 9 1.2.1. Características ............................................................................................ 9 1.2.2. Aplicaciones en distintos procesos ............................................................ 10 1.2.3. Producción de lacasa a partir de Fusarium spp ......................................... 11

1.3. Separación y purificación de proteínas ............................................................. 12 1.3.1. Tipos de separación y purificación ............................................................ 12

1.4. Materiales lignocelulósicos ............................................................................... 17 1.4.1. Celulosa .................................................................................................... 18 1.4.2. Hemicelulosa............................................................................................. 18 1.4.3. Lignina ...................................................................................................... 18 1.4.4. Clasificación de Materiales Lignocelulósicos ............................................. 19

1.5. Pretratamiento de materiales lignocelulósicos .................................................. 20 1.5.1. Tipos de pretratamientos ........................................................................... 21 1.5.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 23 1.5.3. Estado del arte del pretratamiento enzimático ........................................... 24

1.6. Raquis de Palma .............................................................................................. 26 1.7. Conclusiones .................................................................................................... 27

2. Métodos de separación y Purificación para lacasa de Fusarium spp ............... 29

Resumen .................................................................................................................... 29 Introducción ................................................................................................................ 29 2.1. Separación y purificación de lacasas ............................................................... 29 2.2. Subproductos de la separación y purificación de lacasas ................................. 30 2.3. Métodos Reportados ........................................................................................ 30 2.4. Selección del método ....................................................................................... 33 2.5. Partición de Tres Fases (TPP) ......................................................................... 34

2.5.1. Principio .................................................................................................... 35 2.5.2. Impactos del Sulfato de amonio ................................................................ 35

XII Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

2.5.3. Impactos del Ter-butanol ........................................................................... 36 2.5.4. Ventajas y Desventajas ............................................................................. 36 2.5.5. Aplicaciones .............................................................................................. 36

2.6. Conclusiones .................................................................................................... 37

3. Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de

Fusarium spp. ............................................................................................................... 39

Resumen .................................................................................................................... 39 Introducción ................................................................................................................ 39 3.1. Metodología ..................................................................................................... 40

3.1.1. Microorganismo ......................................................................................... 40 3.1.2. Activación de inóculo de Fusarium spp ..................................................... 40 3.1.3. Fermentación sumergida de inóculo producido ......................................... 40 3.1.4. Medición de actividad enzimática lacasa y proteína .................................. 41 3.1.5. Partición Trifásica (TPP) ........................................................................... 42 3.1.6. Diseño Experimental ................................................................................. 42

3.2. Resultados y Discusión .................................................................................... 43 3.2.1. Partición Trifásica (TPP) ........................................................................... 43

3.3. Conclusiones .................................................................................................... 50

4. Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico .............................. 53

Resumen .................................................................................................................... 53 Introducción ................................................................................................................ 53 4.1. Metodología ..................................................................................................... 54

4.1.1. Raquis de Palma ....................................................................................... 54 4.1.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 55 4.1.3. Determinación de Compuestos Fenólicos ................................................. 55 4.1.4. Diseño Experimental ................................................................................. 56 4.1.5. Comprobación ........................................................................................... 56

4.2. Resultados y Discusión .................................................................................... 56 4.2.1. Caracterización ......................................................................................... 56 4.2.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 57 4.2.3. Comprobación ........................................................................................... 60

4.3. Conclusiones .................................................................................................... 62

5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63

5.1. Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2. Recomendaciones............................................................................................ 63

Anexos .......................................................................................................................... 65

Anexo A. Curva de Calibración de Proteínas. ............................................................. 65 Anexo B. Determinación pH para TPP. ....................................................................... 67 Anexo C. Curva de Calibración de Fenoles Totales por Folin-Ciocalteau. .................. 69 Anexo D. Prueba de Diferencia Significativamente Honesta para el tiempo de pretratamiento. ............................................................................................................ 71 Anexo E. Análisis Granulométrico del Raquis de Palma. ............................................ 75 Anexo F. Resultados de proteína cruda (Kjeldahl). ..................................................... 77

Referencias ................................................................................................................... 79

Contenido XIII

Lista de figuras Figura 1-1: Ciclo catalítico de la lacasa. Tomado de (Desai & Nityanand, 2011) ............. 4 Figura 1-2: Estructura del sitio activo (a) Estructura molecular del cobre T1 en sitio

activo, mostrando cisteína (amarillo) e histidinas (azul). (b) Estructuras moleculares de

los cobres T2 y T3 en sitio activo de la lacasa y los residuos de carboxilatos (D77 y

D456). (c) Absorbancia en espectro UV-Vis. Tomado de (Jones & Solomon, 2015). ....... 8 Figura 1-3: Transporte de electrones en una reacción con lacasa como catalizador.

Tomado de (Hakulinen & Rouvinen, 2015). ...................................................................... 9 Figura 1-4: Precipitación de proteínas. Precipitación salina (parte superior) y con

compuestos orgánicos (inferior). Proteína de interés (círculo), compuestos polares

(triángulos) y compuestos no polares (estrellas). ............................................................ 13 Figura 1-5: Formación de fases. ATPE (parte superior) y TPP (Parte inferior)............... 14 Figura 1-6: Tipos de cromatografía. Adaptado de (Hedhammar et al., 2006) ................ 15 Figura 1-7: Purificación por filtración. ............................................................................ 16 Figura 1-8: Tipos de Centrifugación. Adaptado de Frei (2011) ...................................... 17 Figura 1-9: Estructura de los materiales lignocelulósicos. Adaptado de (Menon & Rao,

2012) .............................................................................................................................. 17 Figura 1-10: Estructura de la celulosa.Tomado de (van Zyl et al., 2011) ....................... 18 Figura 1-11: Los tres mayores precursores de la lignina. Tomado de (Munk et al., 2015).

....................................................................................................................................... 19 Figura 1-12: Tusa o raquis de palma Tomado de (Cenipalma 2014) ............................. 26 Figura 2-1: Representación Esquemática de la TPP. .................................................... 35 Figura 3-1: Relación de los distintos factores de entrada con respecto al Rendimiento. 47 Figura 3-2: Relación de los distintos factores de entrada con respecto a las Veces de

Purificación. .................................................................................................................... 48 Figura 3-3: Formación de Fases en sistema con condiciones donde se maximiza los

factores de respuesta. .................................................................................................... 49 Figura 4-1: Raquis de Palma en natura. Molino con malla de 2mm. Raquis de Palma

molida. ........................................................................................................................... 54 Figura 4-2: Resultados del Diseño Central Compuesto para el Pretratamiento enzimático

....................................................................................................................................... 58 Figura 4-3: Relación del pH y la Temperatura con los Fenoles Totales ......................... 59

Figura A- 1: Curva de calibración obtenida para proteínas medido por Bradford……….65 Figura B- 1. Cambios del rendimiento variando el pH en sistema TPP…………………..66 Figura B- 2. Cambios de las veces de purificación variando el pH en sistema TPP…....67 Figura C- 1: Curva de calibración obtenida para fenoles totales por Folin-Ciocalteau…..68 Figura E- 1. Análisis granulométrico diferencial…………………………………………..…74 Figura E- 2. Análisis granulométrico acumulativo………………………….………………..74

XIV

Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

Lista de tablas Tabla 1-1: Aplicaciones de la lacasa en la industria. ........................................................ 6 Tabla 1-2: Genomas de Fusarium spp (Brown & Proctor, 2013; Ma et al., 2013). .......... 10 Tabla 1-3: Aplicación de Fusarium spp en la industria. .................................................. 11 Tabla 1-4: Porcentaje de los diferentes componentes de los materiales lignocelulósicos. (Betts, Dart, Ball, & Pedlar, 1991) ................................................................................... 19 Tabla 1-5: Porcentaje de los diferentes monolignoles presentes en la lignina para varios tipos de plantas (Chávez-Sifontes & Domine, 2013) ....................................................... 20 Tabla 1-6: Pretratamientos enzimáticos con lacasa en materiales lignocelulósicos reportados en literatura. ................................................................................................. 25 Tabla 1-7: Composición de Raquis de Palma. ............................................................... 27 Tabla 2-1: Separación y purificación de lacasa encontrados en la literatura .................. 31 Tabla 2-2: Condiciones de TPP para lacasa reportados ................................................ 37 Tabla 3-1: Componentes de medio líquido para producir lacasa a partir de Fusarium spp. ....................................................................................................................................... 40 Tabla 3-2: Composición de elementos trazas. ............................................................... 41 Tabla 3-3: Diseño Experimental para la Partición de Tres Fases (TPP) del extracto crudo ....................................................................................................................................... 43 Tabla 3-4: Resultados del diseño experimental .............................................................. 43 Tabla 3-5: ANOVA de las veces de purificado y el Rendimiento en TPP ....................... 45 Tabla 3-6: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión. .................................................................................................... 49 Tabla 3-7: Comparación de TPP de lacasas .................................................................. 50 Tabla 4-1: Protocolos NREL .......................................................................................... 55 Tabla 4-2: Diseño Experimental para el pretratamiento enzimático del raquis de palma 56 Tabla 4-3: Comparación de los resultados de caracterización del raquis de palma de otros reportes con este estudio. ..................................................................................... 57 Tabla 4-4: ANOVA de los fenoles totales obtenidos en la fase líquida del pretratamiento enzimático. ..................................................................................................................... 59 Tabla 4-5: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión para fenoles totales ..................................................................... 60 Tabla 4-6: Comparación pretratamiento con lacasa purificada y extracto crudo. ............ 61 Tabla B- 1. Grupos generados por el análisis de diferencia de significativamente honesta. ……………………………………………………………………………………………………..67 Tabla D- 1: Grupos formados a 45°C y pH 4…………………………………………...…... 69 Tabla D- 2: Grupos formados a 34.4°C y pH 5.7………………………………………...…. 69 Tabla D- 3: Grupos formados a 55.6°C y pH 4.3……………………………………...……. 69 Tabla D- 4: Grupos formados a 55.6 °C y pH 5.7…………………………………...……… 70 Tabla D- 5: Grupos formados a 45 °C y pH 6………………………………………...…….. 70 Tabla D- 6: Grupos formados a 34.4 °C y pH 5.7…………………………………...……… 70 Tabla D- 7: Grupos formados a 60 °C y pH 5……………………………………………..... 70 Tabla D- 8: Grupos formados a 30 °C y pH 5……………………………………...……….. 71 Tabla D- 9: Grupos formados a 45 °C y pH 5………………………………………...…….. 71 Tabla E- 1. Número de tamiz y diámetro…………………………………………………….. 74

Contenido XV

Lista de Abreviaturas

ANOVA Análisis de Varianza

ATPE Extracción Acuosa de Dos Fases

NREL Laboratorio Nacional de Energía Renovables

PDA Agar Papa Dextrosa

PDB Caldo Papa Dextrosa

TNC Cúmulo de Cobre Trinuclear

TPP Partición de Tres Fases

VF Veces de Purificación

Y Rendimiento

Introducción 1

Introducción La lacasa degrada grupos fenólicos y aromáticos y utiliza O2 como aceptor de electrones.

Generalmente, la lacasa se produce de forma extracelular y pertenece a las enzimas

multicobre (Desai & Nityanand, 2011). Esta enzima tiene baja especificidad de sustrato, lo

que permite usarla en varios procesos. Dentro de sus aplicaciones está el tratamiento de

aguas residuales degradando compuestos aromáticos, degradación de colorantes como el

índigo carmesí y el remazol azul brillante R y la degradación de lignina en materiales

lignocelulósicos (Cañas & Camarero, 2010).

La producción de esta enzima se da en bacterias, plantas, algunos artrópodos, rumen de

bovinos y hongos, siendo esta última donde se alcanza mayor producción (Dwivedi et al.,

2011). Un hongo productor de lacasa es el Fusarium spp que pertenece al género de los

ascomicetos, patógeno en las cadenas productivas de varios alimentos, en especial el

maíz (de la Torre-Hernández et al., 2014). Este hongo se encuentra aislado y conservado

en el Laboratorio Bioprocesos y Flujos Reactivos, de la Facultad de Minas de la

Universidad Nacional de Medellín (Lopera, 2009).

Para el Fusarium spp, se tienen condiciones de cultivo específicas para la producción de

lacasa (Cano, 2011; Certain, 2015), sin embargo es necesario realizar la separación y

purificación de la enzima producida, ya que los microorganismos producen de forma

simultánea sustancias que inhiben la actividad enzimática de la lacasa, como proteasas,

celulasas, isoformas de lacasa provenientes de procesos postraduccionales, compuestos

hidrofóbicos y polisacáridos de bajo peso molecular (Camperi et al., 2014).

Para las lacasas provenientes de hongos, se ha desarrollado varios métodos de

separación y purificación. Entre los más reportados, se encuentran la precipitación,

formación de fases, cromatografía, filtración, entre otros. Para la lacasa proveniente de

hongos como el Fusarium solani o Fusarium proliferatum, se ha realizado cromatografía

por intercambio iónico para separar y purificar la lacasa producida. Para lacasa de

Fusarium spp aislada y conservada en el laboratorio de Bioprocesos y Flujos Reactivos de

la Facultad de Minas de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín no se han

reportado métodos de separación y purificación.

Se planteó en este trabajo, como objetivo general, evaluar un proceso de separación y

purificación de enzimas para la lacasa de Fusarium spp, y se establecieron los siguientes

objetivos específicos

2 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos

Seleccionar el método de separación y purificación adecuado para lacasa de Fusarium

spp.

Determinar las condiciones óptimas para el método de separación y purificación que

aumente la actividad enzimática lacasa.

Establecer la acción lacasa purificada en un material lignocelulósico.

Contexto General 3

1. Contexto General

Resumen

La lacasa es una enzima con la capacidad de degradar compuestos fenólicos y aromáticos,

la cual es producida a partir de animales, plantas, bacterias y hongos. Uno de estos

microorganismos es el Fusarium spp, debido a que el extracto crudo producido contiene

otras proteínas y compuestos, es necesario seleccionar el método de separación y

purificación adecuado, dentro de los que se encuentra la precipitación, formación de fases,

cromatografía, filtración, centrifugación, entre otras.

Introducción

Con la necesidad de realizar pretratamientos sobre materiales lignocelulósicos para

remover la lignina presente, se han desarrollado varios tipos de procesos, que abarcan

desde la modificación de la temperatura y la presión, hasta los pretratamientos del tipo

ácido y alcalinos (Chiaramonti et al., 2012), sin embargo estos pretratamientos generan

altos costos económicos y generan inhibidores innecesarios. Una alternativa son los

pretratamientos enzimáticos, que se usan condiciones cercanas al ambiente, reduciendo

el uso excesivo de energía. Estos pretratamientos se hacen con la enzima lacasa, el cual

es una oxidorreductasa que puede degradar las unidades fenólicas y aromáticas de la

lignina presente en los materiales lignocelulósicos (Munk et al., 2015). El objetivo de este

capítulo es mostrar un contexto general sobre la lacasa, las fuentes y condiciones de

producción, aplicación y lo relacionado con su bioquímica. Además, se profundizó sobre el

Fusarium spp del cual se tiene una cepa conservada en el laboratorio Bioprocesos y Flujos

Reactivos de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín., conociendo que el

microrganismo produce varios tipos de compuestos, se examinó los distintos tipos de

separación y purificación que se usan para la lacasa. Se presenta un contexto sobre los

materiales lignocelulósicos y sus pretratamientos, enfatizando en los pretratamientos

enzimáticos y el raquis de palma.

1.1. Lacasa

La lacasa (bencenodiol: oxígeno oxidorreductasa (EC 1.10.3.2)) consume O2 para

degradar compuestos fenólicos y aromáticos (da Silva et al., 2012), retirando electrones

de los sustratos (oxidación) que luego se entregan al aceptor de electrones (O2) para

convertirse en H2O (Giardina & Sannia, 2015). La lacasa pertenece a la clase de enzimas


que es capaz catalizar la reducción de oxígeno, junto a la citocromo-c oxidasa, L-ascorbato

oxidasa, ceruloplasmina, bilirrubina oxidasa, y fenoxazinona sintasa (Giardina et al., 2010).

En comparación con otras oxidorreductasa, la lacasa tiene un bajo potencial redox, que le

da, la capacidad de ser un buen agente reductor (Desai & Nityanand, 2011).

Figura 1-1: Ciclo catalítico de la lacasa. Tomado de (Desai & Nityanand, 2011)

1.1.1. Fuentes de producción

Bacterias: La lacasa bacteriana se produce a partir de bacterias del género

Azospirrullum y Bacillus. Estas bacterias se encuentra en grasas y cereales y por lo

general producen lacasa intracelular (Dwivedi et al., 2011). Su actividad se incrementa

en temperaturas y valores de pH altos (Strong & Claus, 2011) pero su comercialización

es difícil ya que los mediadores suelen ser muy costosos (Muthukumar & Murugan,

2014).

Hongos: Son los más usados para la producción de lacasa (Rivera-Hoyos et al., 2013),

siendo, hasta ahora, el grupo de las lacasas más importante dentro de los grupos que

se han caracterizado (Giardina et al., 2010). Este tipo de lacasa proviene de hongos

llamados de podredumbre blanca (More et al., 2011), son hongos del filo Ascomycota

y Basidiomycota (Dwivedi et al., 2011; Rivera-Hoyos et al., 2013). La lacasa de estos

hongos interviene en la degradación de la vegetación, en especial de material

celulósico (Dwivedi et al., 2011). Se ha dado producción de lacasa a partir de hongos

del genero Trametes, Cerrena, Melanucarpus, Trichoderma (Viswanath et al., 2014).

Plantas: Se ha identificado que se produce la enzima de varias fuentes frutales como

el mango, piña, durazno, entre otros (Dwivedi et al., 2011). La lacasa producida de

estas fuentes, tiene mayor peso molecular, además de que tiene alta retención de las

unidades de cobre de la enzima, estabilidad térmica y aumento en la actividad en la

enzima debido a que la planta generadora de la enzima permite la glicosilación de

forma más sencilla que en otras fuentes (Dwivedi et al., 2011). Desafortunadamente,

Contexto General 5

no se han hecho muchas investigaciones sobre plantas debido a la complejidad de su

estructura, viéndose desplazada por los hongos y bacterias (Hakulinen & Rouvinen,

2015).

Animales: En animales es donde menos existe aplicación, siendo secretado en

insectos para esclerotización de la cutícula en la epidermis (Giardina et al., 2010) y en

el rumen de bovinos (D. M. Mate & Alcalde, 2015).

1.1.2. Condiciones de producción

Generalmente, la lacasa es secretada de forma extracelular (Shraddha et al., 2011), en

algunas ocasiones se expresa de forma intracelular (Cañero & Roncero, 2008). Esta

enzima es producida en los microorganismos como metabolismo secundario (Viswanath

et al., 2014) influenciada por los siguientes factores:

Fuente de carbono: El carbono es la fuente de vida de todos los organismos, ya que

al romper los enlaces de esta fuente, se genera energía usada para su crecimiento y

desarrollo. La glucosa es una de las fuentes de carbono más usada, en especial por

los hongos del género Basidiomiceto como Trametes versicolor o Pleurotus florida

(Viswanath et al., 2014). Hay otras fuentes de carbono como la xilosa, manosa,

fructosa, lactosa, sacarosa, galactosa, ácido galacturónico, pectina, inulina, entre otros

(Desai & Nityanand, 2011; Shraddha et al., 2011; Viswanath et al., 2014). También se

usan algunos residuos a base de celulosa y almidón como el arroz y el maíz (Shraddha

et al., 2011).

Fuente de Nitrógeno: La producción de lacasa se da por el agotamiento de nitrógeno,

aunque existen algunas fuentes que no afectan a la actividad enzimática (Shraddha et

al., 2011). Altas concentraciones de nitrógeno en ocasiones pueden aumentar la

actividad enzimática lacasa, pero no afectan al incremento o disminución de la

biomasa del microorganismo (Viswanath et al., 2014). Las fuentes de nitrógeno usadas

son el tartrato de amonio, peptona, caseína, sales de nitrato, ácido glutámico, glicina,

desechos de maíz, extracto de levadura, extracto de carne, entre otros (Desai &

Nityanand, 2011; Muthukumar & Murugan, 2014).

Inductor: Es necesario agregar compuestos xenobióticos al microorganismo

productor, ya que la producción de lacasa sin inductor genera enzimas con baja

actividades enzimáticas. Hay varios tipos de inductores, como los compuestos

aromáticos, siendo los más usados el ABTS, HBT, ácido verátrico y ácido ferúlico


(Viswanath et al., 2014; Zucca et al., 2011). Los aminoácidos como la asparagina,

histidina, arginina o ácido aspártico pueden ser buenos inductores, aunque la cisteína

inhibe completamente la producción (Viswanath et al., 2014). Otros inductores usados

son las sales de cobre (Tinoco et al., 2011) y algunos alcoholes como el etanol y el

metanol (Manavalan et al., 2013)

pH y Temperatura: Para hongos se han usado valores de pH entre 4 y 6 y temperatura

entre 25 y 30°C, pero los niveles de aumento de la actividad enzimática no se controlan

(Muthukumar & Murugan, 2014; Shraddha et al., 2011; Viswanath et al., 2014).

Otros factores que afectan la producción de lacasa son: el tiempo de cultivo, si se hace

el cultivo sumergido o estacionario, concentración de compuestos orgánicos e

inorgánicos distintos a los ya nombrados, aeración, degradación o activación por

proteasas, entre otros (Shraddha et al., 2011).

1.1.3. Aplicaciones en diferentes procesos

En la Tabla 1-1 se muestran aplicaciones reportadas para la lacasa. De estas aplicaciones,

las más usadas son la decoloración de tintes, la industria de papel y el tratamiento de

materiales lignocelulósicos.

Tabla 1-1: Aplicaciones de la lacasa en la industria.

Industria Aplicación Referencia

Decoloración de

tintes

Degradación de colorantes como

Índigo Carmesí, Remazol Azul

Brillante R, Amaranto, entre otros

(Giardina et al., 2010; Mate &

Alcalde, 2015)

Industria del papel Mejoramiento del algodón,

producción de tableros de fibra

(Polizeli & Rai, 2014; Strong

& Claus, 2011)

Contexto General 7

Biorremediación Degradación de herbicidas,

pesticidas, insecticidas.

(Strong & Claus, 2011)

Materiales

lignocelulósicos

Degradación de lignina para

aumentar la cantidad de celulosa

disponible

(Adrio & Demain, 2014;

Munk et al., 2015)

Alimentos Mejoramiento de parámetros

sensoriales, mejoramiento del

gluten.

(Dwivedi et al., 2011; Vohra

& Satyanarayana, 2012)

Cosméticos y

fármacos

Productos de belleza, higiene

personal, sedantes, antibióticos y

antiinflamatorios.

(Shraddha et al., 2011;

Vohra & Satyanarayana,

2012)

Nanotecnología Sensores para identificar

compuestos fenólicos.

(Polizeli & Rai, 2014)

Celdas de

Biocombustible

Generación de energía con motor

basado en lacasa y celulasa.

(Polizeli & Rai, 2014;

Shraddha et al., 2011; Vohra

& Satyanarayana, 2012)

Síntesis Formación de polímeros de

polifenol, polímeros de acrilamida y

compuestos orgánicos funcionales.

(Polizeli & Rai, 2014)

1.1.4. Bioquímica de la lacasa

La lacasa tiene en su sitio activo 4 átomos de cobre que pueden ser clasificados en tres

tipos basados en su espectroscopía (Jones & Solomon, 2015):

1 cobre tipo 1 (T1) que exhibe una absorción intensa alrededor de los 600 nm,

correspondiente al color azul profundo, que forma enlaces altamente covalentes entre

el cobre y la cisteína y está unido a dos histidinas y cisteína en configuración sp3.

1 cobre tipo 2 (T2) que no muestra absorbancia y se les consideran cobres normales,

los cuales están ligado a dos histidinas y un ligando enlazado con agua en un arreglo

sp2.

2 cobres tipo 3 (T3) que tiene una alta absorbancia con una longitud de onda 330 nm,

se generan momentos antiferromagnéticos, está ligado a tres histidinas en un arreglo

sp3.


Los cobre T2 y T3 están arreglados en un cúmulo de cobre trinuclear (TNC) que están

conectados con T1 mediante la cisteína del T1 y las histidinas de los T3 a una distancia de

13 Å, fuera de esto, se encuentran residuos de carboxilatos que ayudan al mecanismo de

reacción, todo esto ilustrado en la figura 1-2.

Figura 1-2: Estructura del sitio activo (a) Estructura molecular del cobre T1 en sitio activo, mostrando cisteína (amarillo) e histidinas (azul). (b) Estructuras moleculares de los cobres T2 y T3 en sitio activo de la lacasa y los residuos de carboxilatos (D77 y D456). (c) Absorbancia en espectro UV-Vis. Tomado de (Jones & Solomon, 2015).

En la figura 1-3, se muestra el mecanismo de reacción que se da en el sitio activo, donde

el sustrato le pasa electrones al cobre T1. Luego estos van al TNC mediante un enlace

intermolecular mediante la cisteína del T1 y las histidinas del TNC. Finalmente. el O2 es

capaz de transformarse en agua en el TNC (Hakulinen & Rouvinen, 2015; Jones &

Solomon, 2015).

Contexto General 9

Figura 1-3: Transporte de electrones en una reacción con lacasa como catalizador. Tomado de (Hakulinen & Rouvinen, 2015).

1.2. Fusarium spp

El Fusarium spp es un hongo patógeno filamentoso del filo Ascomycota (Ma et al., 2013).

Este hongo es conocido por ser patógeno del maíz mediante micotoxinas llamadas

Fumonisinas (Waskiewicz et al., 2012). Debido a esta patogenicidad, este hongo genera

pérdidas económicas, ya que requiere esfuerzos de erradicarlo (Kotowicz et al., 2014;

Miller et al., 2014). En Colombia, se ha visto que los hongos de este género afectan a

plantaciones de productos alimenticios de la canasta familiar, provocando principalmente

marchitez (Rodríguez Estupiñan & Ossa Canencio, 2007).

1.2.1. Características

La taxonomía del hongo Fusarium spp está definida a continuación (Kotowicz et al., 2014):

1. Dominio: Eukaryota.

2. Clado: Ophisthokonta.

3. Reino: Fungi.

4. Subreino: Dikarya.

5. Filo: Ascomycota.

6. Subdivisión: Pezizomycotina

7. Clase: Sordariomycetes.

8. Subclase: Hypocreomycetidae.


9. Orden: Hypocreales.

10. Familia: Nectriaceae.

11. Género: Fusarium.

Para los hongos del género Fusarium, se han secuenciado varias especies, como se

muestra en la Tabla 1-2.

Tabla 1-2: Genomas de Fusarium spp (Brown & Proctor, 2013; Ma et al., 2013).

Especie Cepa Cromosomas Genes

F. graminearum PH-1 4 13332

F. verticillioides 7600 11 14179

F. oxysporum 4287 15 17735

F. solani 77-13-4 17 15707

F. circinatum FSP34 Desconocido 15713

F. fujikuroi IMI58289 12 14813

Los Fusarium para su reproducción generan micelios haploides (puede haber reproducción

sexual o asexual) (Ma et al., 2013). En general, para los microorganismos del género

Fusarium predomina la fase asexual (Brown & Proctor, 2013). El proceso de reproducción

asexual (solo mitosis), hay 3 formas especiales de esporas: Microconidias, macroconidias

y Clamidosporas (Ma et al., 2013).

1.2.2. Aplicaciones en distintos procesos

Debido a que es un patógeno que genera pérdidas en la industria agricultora, muchas de

las investigaciones apuntan a la remoción de otros patógenos del mismo tipo. Sin embargo,

es utilizado para producción de metabolitos secundarios generados por estrés externo o

remoción de contaminantes por su capacidad de degradación de fenoles y aromáticos.

Contexto General 11

Tabla 1-3: Aplicación de Fusarium spp en la industria.

Aplicación Referencia

Producción de enzimas: lacasa, celulasa,

xilanasa, entre otras.

(Ravalason et al., 2012; Roberts et al.,

1996)

Extracción de metales alcalinos y

alcalinotérreos

(Mahmoud et al., 2013)

Degradación de materiales lignocelulósicos (Hernández Fernaud et al., 2006)

Estudios de impacto de diferentes patógenos

en plantas

(de la Torre-Hernández et al., 2014;

Pizzolitto et al., 2013)

Producción de etanol (de Almeida et al., 2013)

Prevención de enfermedades (Babič et al., 2015; Cocchi et al., 2011)

Degradación de contaminantes (Guillén-Jiménez et al., 2012)

Producción de sustancias químicas quirales (Monsalve, 2009)

1.2.3. Producción de lacasa a partir de Fusarium spp

Los hongos del género Fusarium puede producir varias isoenzimas de lacasa a partir de

varios genes (Ravalason et al., 2012), con la capacidad de producir lacasa con estructuras

primarias de 540-640 aminoácidos, con pesos moleculares de 60-73 kDa. Lacasa

producida se pueden secretar al medio (extracelular), permanecer en el interior del hongo

(intracelular) o enlazada a la membrana celular (Cañero & Roncero, 2008).

En el grupo de investigación de Bioprocesos y Flujos Reactivos, se han desarrollado

trabajos con el hongo Fusarium spp con miras a producir lacasa, aplicable en materiales

lignocelulósicos. Inicialmente se realizaron trabajos de aislamiento y conservación de la

cepa (Lopera, 2009), la cual fue obtenida en la región del Urabá antioqueño. Luego de

tener la cepa productora aislada, se determinaron condiciones ambientales, como

temperatura y agitación, que favorecen la producción de lacasa. Se encontró que la

temperatura de producción es 30°C y 200 rpm (Cano, 2011). Posterior a esto, se determinó

la fuente de carbono y nitrógeno adecuado para la producción de lacasa. Se encontró que

esta enzima tiene producción óptima con xilosa y peptona como fuentes de carbono y

nitrógeno respectivamente. También se encontró que el metanol es un inductor adecuado

para obtener lacasa con mayor actividad (Certain, 2015).


1.3. Separación y purificación de proteínas

Para avances en el campo de la biotecnología, el desarrollo de técnicas y métodos de

separación y purificación de proteínas ha sido una parte importante en los productos

biobasados durante las últimas décadas (Janson, 2012). Escoger un método adecuado

para separar y purificar proteínas permitirá desarrollar diversas la aplicaciones de la

proteína. Para separar y purificar de forma exitosa, es necesario seleccionar las técnicas

más adecuadas, optimizar su rendimiento para tener los resultados requeridos y reducir el

número de etapas necesarias (Amersham Pharmacia Biotech, 1998).

1.3.1. Tipos de separación y purificación

Precipitación:

Se utiliza una sustancia que se agrega al caldo enzimático, modificando las propiedades

del sistema: pH, temperatura, constante dieléctrica, pI, entre otros, provocando una

precipitación selectiva de enzimas (Scopes, 2002). La base de su separación es la

solubilidad y tiene una resolución baja (Camperi et al., 2014). Varios tipos de precipitación

se han dado, por ejemplo, con sales inorgánicas y solventes orgánicos (Camperi et al.,

2014; Viswanath et al., 2014), estos métodos se ilustran en la figura 1-4. En la precipitación

salina, se produce un efecto salting-out, donde la proteína de interés forma enlaces

hidrofóbicos con ella misma y se precipita. Mientras que en la precipitación con solventes

orgánicos se forman micelios donde se aprovecha la naturaleza hidrofóbica e hidrofílica de

la proteína de interés.

Contexto General 13

Figura 1-4: Precipitación de proteínas. Precipitación salina (parte superior) y con compuestos orgánicos (inferior). Proteína de interés (círculo), compuestos polares (triángulos) y compuestos no polares (estrellas).

Formación de fases:

En este método, los compuestos son separados o se forman sustancias inmiscibles o

parcialmente inmiscibles, en donde la enzima es estable en uno de ellos (Scopes, 2013).

Este tipo de técnicas involucra varios efectos como salting out, precipitación isoiónica y

precipitación de enzimas osmolíticas y kosmotrópicas (Dhananjay & Mulimani, 2009).

Dentro de las técnicas más usadas están la formación de dos y tres fases (Hong Yang,

2013; Rachana & Lyju Jose, 2014). En la formación de dos fases (extracción acuosa de

dos fases ATPE) se usa un compuesto salino y otro polimérico generalmente, donde los

compuestos interaccionan con el extracto crudo y uno de ellos (el más afín al compuesto

de interés) extrae la proteína que se desea separar. Para la formación de tres fases

(Partición de Tres Fases TPP), se usa un compuesto salino y otro orgánico (generalmente

un alcohol C5) que al interactuar con el extracto crudo forma una fase o precipitado

intermedio donde se encuentra la proteína de interés. Ambos métodos se presentan en la

Figura 1-5.


Figura 1-5: Formación de fases. ATPE (parte superior) y TPP (Parte inferior)

Cromatografía:

De los métodos más reportados en la purificación de enzimas. La salida de la proteína se

retrasa con respecto al resto de compuestos por medio de un material absorbente (Scopes,

2013). Hay varias formas de cromatografía: intercambio iónico (distribución de cargas),

afinidad (reconocimiento molecular o especificidad del ligando), entre otros (Camperi et al.,

2014; General Electrics Healthcare, 2007). La cromatografía de intercambio iónico se basa

en la competencia entre proteínas con distintas cargas superficiales que se enlaza con un

adsorbente que tiene cargas opuestas a la proteína de interés (Hedhammar et al., 2006).

En la cromatografía de afinidad se enlaza el compuesto que se quiere separar acoplándolo

a ligandos específicos (General Electrics Healthcare, 2007). Otros métodos usados en

menor medida para purificación son los de interacción hidrofóbica y de fase reversa. Los

métodos cromatográficos se ilustran en la Figura 1-6.

Contexto General 15

Figura 1-6: Tipos de cromatografía. Adaptado de (Hedhammar et al., 2006)

Filtración:

En este método se basa en cambios de presión para separar los distintos compuestos en

el sistema. El extracto se coloca en una malla en la que se aplica diferenciales de presión

haciendo que quede un retenido con la lacasa y un permeado con el resto de compuestos

que había en el caldo enzimático (Amersham Pharmacia Biotech, 1998; Camperi et al.,

2014). Dentro de los métodos más usados para este tipo de separación y purificación están

la ultrafiltración y la filtración en gel (Amersham Pharmacia Biotech, 1998). Para la

ultrafiltración convencional, hay una barrera semipermeable donde queda atrapada la

proteína de interés y el resto pasa la barrera, haciendo que la proteína aumente conforme

se disminuya el volumen inicial (Arakawa, Ejima, & Akuta, 2016). La filtración en gel es una

combinación de la ultrafiltración y la cromatografía, donde en la columna hay un adsorbente

específico que retiene la proteína. El esquema general de la filtración se muestra en la

Figura 1-7.


Figura 1-7: Purificación por filtración.

Centrifugación:

Este método usa la fuerza centrífuga para separar las partículas presentes en el extracto

crudo producido. Dependiendo del tamaño de partícula y la densidad, los distintos

compuestos presentes se sedimentan de distintas maneras, logrando una separación de

partículas. Esta sedimentación se logra al girar el sistema sobre un eje de rotación a altas

velocidades, las partículas en suspensión se muevan por fuerzas centrifugas radiales lejos

de su eje (Frei, 2011). Aquí se diferencian dos tipos de centrifugación especiales para la

separación y purificación de proteínas: Diferencial y Zonal con gradiente de densidad. Los

distintos tipos de centrifugación se ilustran en la Figura 1-8. En la centrifugación diferencial,

las partículas se sedimentan a distintas velocidades, a medida que aumenta el tiempo, se

varía la velocidad de centrifugación (Figura 1-1 (a)), sin embargo partículas livianas pueden

verse contaminadas por partículas pesadas. Para solucionar este problema, se utiliza

centrifugación zonal con gradiente de densidad. Con este método se suspende la proteína

en un medio que tenga un gradiente de densidad, haciendo que a una velocidad constante,

las partículas menos densas se enlazan en la parte superior y las más pesadas en la parte

inferior (Figura 1-1 (b) y (c)). Hay dos tipos de este tipo de centrifugación: en una de ellas

coloca la muestra en la parte superior del medio con el gradiente y las partículas se

sedimentan al bajar generando bandas de concentración (zona de velocidad), y en la otra,

se forman las bandas solo por su densidad haciendo que no se forme ninguna en la parte

superior del sistema (isopícnico)

Contexto General 17

Figura 1-8: Tipos de Centrifugación. Adaptado de Frei (2011)

1.4. Materiales lignocelulósicos

Los materiales lignocelulósicos son una fuente alternativa de azúcares para la producción

de jarabes fermentables y posterior bioetanol, entre otras aplicaciones. Estos materiales

no afectan negativamente las cadenas de producción y suministro de alimentos, de hecho,

en la producción de jarabes y biocombustibles se usan los residuos de estas cadenas. Esta

biomasa tiene 3 componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Estos

componentes están enlazados de tal manera que la estructura formada del material es

compleja y reacia a descomposiciones sencillas. La variedad de los componentes

principales determina la dureza y flexibilidad del material (Haghighi Mood et al., 2013).

Figura 1-9: Estructura de los materiales lignocelulósicos. Adaptado de (Menon & Rao, 2012)


1.4.1. Celulosa

Es el componente orgánico más abundante obtenido a partir de biomasas. Es un

polisacárido con una fórmula base (C6H10O5)n y consiste en una cadena lineal de miles de

unidades de glucosas unidas por el enlaces β (1,4) glicosidicos. Estos conforman

estructuras tanto cristalinas como amorfas (Ummartyotin & Manuspiya, 2015).

Figura 1-10: Estructura de la celulosa. Tomado de (van Zyl et al., 2011)

1.4.2. Hemicelulosa

La hemicelulosa es otro polisacárido que tiene una estructura más compleja que la

celulosa. Este biopolímero está compuesto de otro biopolímeros como xilano, manano,

galactano y arabinano generalmente, siendo el xilano el más abundante. El xilano es un

biopolímero conformado por residuos de xilosa en su mayoría, con sustituyentes de

glucosa, arabinosa y acetatos. Estas xilosas se enlazan mediante enlaces β (1,4)

glicosidicos. Otro biopolímero presente en la hemicelulosa es el manano, el cual se

conforma de manosa, galactosa y glucosa (Van Dyk & Pletschke, 2012).

1.4.3. Lignina

La lignina es uno de los biopolímeros más abundantes junto a la celulosa y la hemicelulosa

(Chávez-Sifontes & Domine, 2013), es un polímero hidrofóbico con unidades

fenilpropanoides que se presenta en las paredes celulares de las plantas, está presente

en materias primas usadas en la industria del papel y en la producción de biocombustibles

celulósicos. Este biopolímero se compone mayoritariamente de tres precursores

monoméricos (Chávez-Sifontes & Domine, 2013): alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico

y alcohol sinapílico, cuyas estructuras se muestran en la figura 1-11. Cuando estos

Contexto General 19

precursores son incorporados en los polímeros de lignina, entran como unidades

monoméricas de p-hidroxifenil (H), guayacil (G) y siringil (S) (Munk et al., 2015).

Figura 1-11: Los tres mayores precursores de la lignina. Tomado de (Munk et al., 2015).

Si bien la estructura de la lignina tiene una alta complejidad, numerosos estudios de

fisiología de plantas, estructura general de lignina y síntesis de lignina tienen buen

acercamiento a la realidad (Munk et al., 2015). La composición de la lignina está

fuertemente influenciada por las condiciones de origen y crecimiento de la planta e incluso

puede variar entre los distintos tipos de células, dentro de la misma planta (Moura et al.,

2010).

1.4.4. Clasificación de Materiales Lignocelulósicos

Los materiales lignocelulósicos se clasifican según el contenido de lignina, hemicelulosa y

celulosa, como se muestra en la Tabla 1-4. Las materias duras tienen altos contenidos de

celulosa y bajos de lignina, importantes a la hora de definir pretratamientos, ya que requiere

de menos esfuerzos para remover la lignina.

Tabla 1-4: Porcentaje de los diferentes componentes de los materiales lignocelulósicos.

(Betts, Dart, Ball, & Pedlar, 1991)

Lignina (%) Celulosa (%) Hemicelulosa (%)

Maderas duras 18-25 45-55 24-40

Madera Blanda 25-35 45-50 25-35

Herbáceas 25-30 25-40 25-50


Debido a esta clasificación, la lignina clasificá tres tipos de plantas de acuerdo a la

composición de sus unidades monoméricas (Djikanović et al., 2012):

Madera blanda (gimnospermas): compuestas mayormente por unidades monoméricas

G con unidades menores de H.

Maderas duras (angiospermas dicotiledóneas): están compuestos de unidades G y S

aproximadamente en iguales cantidades.

Ligninas herbáceas (angiospermas monocotiledóneas): contiene todas las unidades

monoméricas pero sus cantidades varían.

En la Tabla 1-5 se muestran los porcentajes de las unidades monoméricas (representadas

en precursores monolíticos o monolignoles) en los distintos tipos de plantas mostrados en

la tabla 1-4.

Tabla 1-5: Porcentaje de los diferentes monolignoles en la lignina para varios tipos de

plantas (Chávez-Sifontes & Domine, 2013)

Tipo de Planta Porcentajes (%)

P-cumarílico Coniferílico Sinapílico

Gimnospermas Madera Blanda <5 >95 0

Angiospermas Dicotiledóneas (maderas duras) 0-8 25-50 45-75

Monocotiledóneas (Herbáceas) 5-35 35-80 20-55

1.5. Pretratamiento de materiales lignocelulósicos

Los pretratamientos en materiales lignocelulósicos tienen como objetivo degradar la mayor

cantidad de lignina y hemicelulosa, para que aumente la celulosa disponible y con ello

obtener mayor cantidad de producto (Singh et al., 2015). Este proceso es necesario, ya

que la lignina y la hemicelulosa (en especial la lignina) forma una barrera que disminuye la

acción de la celulasa en la celulosa disponible, una de las razones principales, para costos

elevados de producción de etanol a partir de materiales lignocelulósicos (Moilanen et al.,

2011).

Contexto General 21

1.5.1. Tipos de pretratamientos

La Lignina puede ser aislada del material lignocelulósico por varios métodos que incluyen

procesos mecánicos y/o químicos, los cuales se pueden agrupar en dos vías principales

(Chávez-Sifontes & Domine, 2013):

1. Liberación de la celulosa y la hemicelulosa mediante solubilización, dejando la

lignina como residuo insoluble.

2. Dilución de la lignina, dejando como residuos insolubles la celulosa y la

hemicelulosa, seguido de la recuperación de la lignina a partir de fase líquida.

No se ha llegado a un método disponible para realizar aislamiento de la lignina sin el riesgo

de modificarla estructuralmente durante el proceso, pero se ha llegado a información

valiosa sobre su reactividad química y su estructura (Bauer et al., 2012). Los

pretratamientos en materiales lignocelulósicos tienen como objetivo degradar la mayor

cantidad de lignina y hemicelulosa, para que aumente la cantidad de celulosa disponible y

con ello obtener mayor cantidad de producto (Singh et al., 2015) ya que la lignina y la

hemicelulosa (en especial la lignina), forma una barrera que disminuye la acción de la

celulasa en la celulosa disponible. (Moilanen et al., 2011). Según Menon y rao (2012), un

pretratamiento efectivo se caracteriza por: la preservación de las fracciones de

hemicelulosa, lo que limita la formación de inhibidores debido a productos de degradación,

aumento del área superficial, reducción de la energía requerida, rentabilidad energética y

económica, recuperación de productos de alto valor agregado, entre otros.

Térmico:

También llamado autohidrólisis, es uno de los pretratamientos más usados (Radeva et al.,

2012), ya que dentro de sus procesos incluye expansiones de vapor de agua y separación

acuosa (Singh et al., 2015). Es un método amigable con el ambiente ya que reemplaza

agentes químicos ácidos o alcalinos (Zakaria et al., 2016) pero usa grandes cantidades de

energía (Egüés et al., 2012). Provoca la fusión de la lignina pero produce rompimiento

imparcial de la matriz de la celulosa (Singh et al., 2015). Manteniendo el proceso en pH de

4-7, la suspensión generada después del pretratamiento se puede filtrar para obtener dos

fracciones: una fracción sólida enriquecida de celulosa y una fracción líquida rica en

azúcares derivados de la hemicelulosa.


Ácido:

Uno de los métodos más usados para obtener altos rendimientos de azúcar a partir de

biomasas lignocelulósicas, en donde se usan sustancias ácidas como el ácido sulfúrico

con condiciones de pH y temperatura tal que se rompen los enlaces intermoleculares de

la lignina con la celulosa (Lee et al., 2013), sin embargo este pretratamiento no logra

remover completamente la lignina de la celulosa (Singh et al., 2015).

Este pretratamiento es usado para reducir la cantidad de hemicelulosa para hacer más

accesible la celulosa a la acción de la celulasa, pero a estas condiciones también se puede

degradar la lignina presente. Este pretratamiento se realiza con ácido sulfúrico, que puede

estar concentrado o diluido. Sin embargo, trabajar con ácido concentrado es poco atractivo

debido a que tiene efectos corrosivos sobre los equipos usados y forma compuesto

inhibidores (Alvira et al., 2010).

Además del ácido sulfúrico también se puede usar ácido nítrico, ácido clorhídrico, ácido

fosfórico, ácido peracético y ácido oxálico. Generalmente se usa más el ácido sulfúrico

debido a su bajo costo, alta actividad y disponibilidad, pero se pueden producir compuestos

inhibidores provenientes de la hemicelulosa. Estos productos se pueden reducir utilizando

ácido maleico y fumárico (Singh et al., 2015).

Básico (Alcalino):

Es igual que el pretratamiento ácido, solo que se usan sustancias como hidróxido de sodio,

potasio, calcio y amonio, cuya característica es pH más altos (Singh et al., 2015) y produce

menos productos inhibitorios que el pretratamiento ácido (Shaibani et al., 2011). Este

pretratamiento es más efectivo en maderas duras y cultivos herbáceos con bajos

contenidos de lignina, en maderas blandas con altos contenidos de lignina, este

pretratamiento es poco efectivo (Deejing & Ketkorn, 2009).

Ozonólisis

El ozono es un oxidante potente que muestra una alta eficiencia de deslignificación. Esta

eliminación de la lignina aumenta el rendimiento de la hidrólisis enzimática. El

pretratamiento se realiza generalmente a temperatura ambiente y presión normal y no

conduce a la formación de compuestos inhibidores que pueden afectar a la hidrólisis y la

fermentación posterior (Balat, 2011). Un inconveniente importante a considerar es la gran

cantidad de ozono necesaria, que pueden hacer que el proceso sea económicamente

inviable (Limayem & Ricke, 2012).

Contexto General 23

Organosolvente

Se utilizan diferentes mezclas de disolventes orgánicos o acuosos como: etanol, acetona,

etilenglicol y alcohol tetrahidrofurfurílico, con el fin de solubilizar la lignina y celulosa para

la hidrólisis enzimática. La principal ventaja es la recuperación de subproductos como la

lignina la cual es relativamente pura. Los disolventes deben ser recuperados por técnicas

de separación, para que puedan ser reciclados y disminuir los costos, además de que estos

solventes pueden tener efectos inhibidores de la hidrólisis enzimática y fermentación de

microorganismos (Chiaramonti et al., 2012).

Líquidos iónicos

El uso de líquidos iónicos como disolventes para el pretratamiento de la biomasa celulósica

ha recibido recientemente mucha atención. Líquidos iónicos son sales, normalmente

compuestos por cationes orgánicos grandes y pequeños aniones inorgánicos, que existen

como líquidos a temperaturas relativamente bajas; a menudo a temperatura ambiente. Los

líquidos iónicos tienen una gran ventaja ya que no se forman gases tóxicos o explosivos

(Pérez de los Ríos & Hernández Fernández, 2014).

Explosión de fibra de amoniaco (AFEX)

En el proceso AFEX, la biomasa se trata con amoníaco anhidro líquido a temperaturas

entre 60 y 100 ° C y alta presión durante un período de tiempo variable se libera la presión,

luna rápida expansión del gas amoníaco que causa inflamación y ruptura física de las fibras

en la biomasa y descristalización parcial de la celulosa. A diferencia de otros

pretratamientos como la expansión a vapor que se puede separar una fase liquida de la

sólida en el AFEX solo se recupera un sólido pretratado (Chiaramonti et al., 2012).

1.5.2. Pretratamiento enzimático

Con el objetivo de usar compuestos más amigables con el ambiente y reducir el uso

excesivo de energía debido a condiciones de temperatura y presión, una opción es la

degradación de lignina con biocatalizadores como lacasas, manganeso peroxidasa, lignina

peroxidasa, entre otros, los cuales provienen de hongos de podredumbre blanca

(Chiaramonti et al., 2012; Van Dyk & Pletschke, 2012).


En la naturaleza, la lignina de los materiales lignocelulósicos son selectivamente

degradados por hongos de podredumbre blanca, (Lange et al., 2013). Es más común usar

lacasa como enzima en estos pretratamientos que las distintas peroxidasas, ya que la

lacasa usa como aceptor de electrones el oxígeno, que es económicamente más barato

que el peróxido de hidrógeno usado por las peroxidasas (Munk et al., 2015). La lacasa no

puede actuar directamente sobre la lignina del material lignocelulósico, por lo que esta

requiere un mediador (Munk et al., 2015).

La unión de la lacasa con el mediador se le llama Sistema Mediador Lacasa (LMS). Este

mediador permite que se dé una transferencia de electrones, un radical de transferencia

de átomo de hidrógeno, o un mecanismo iónico en la reacción de degradación de lignina,

dependiendo del mediador que se use (Widsten & Kandelbauer, 2008). El uso del LMS

permite que las velocidades de reacciones sean mayores, hayan aumento de rendimientos

y adhieren nuevas reacciones oxidativas a la lacasa (Kunamneni et al., 2008). Un mediador

ideal es una molécula pequeña, que genera radicales estables que no interactúen con la

enzima (Cañas & Camarero, 2010). Se ha identificado que para aumentar la degradación

de lignina en materiales lignocelulósicos, el mediador usado para el LMS puede tener

similitudes con la lignina, es decir, estos pueden tener fenoles y aromáticos, sin embargo,

es necesario verificar que estos mediadores fenólicos y aromáticos sean capaces de

transportar electrones, ya que no todos los compuestos de este tipo tienen esta

característica (Munk et al., 2015).

1.5.3. Estado del arte del pretratamiento enzimático

En la literatura, se encuentran pretratamientos enzimáticos con remociones que superan

el 50%, algunos alcanzan remociones del 80%. Estas diferencias en las remociones de la

lignina ocurren debido a la estructura de la lignina, que varía según el material

lignocelulósico (Moilanen et al., 2011; Munk et al., 2015) y la estructura de la lacasa varía

según el microorganismo (Hakulinen & Rouvinen, 2015).

Contexto General 25

Tabla 1-6: Pretratamientos enzimáticos con lacasa en materiales lignocelulósicos

reportados en literatura (elaboración propia).

Lacasa Mediador Sustrato Remoción

de lignina Referencia

Cerrena unicolor -- Caña de azúcar

pretratada 80%

(Moilanen et al.,

2011)

Melanocarpus

albomyces ABTS, HBT Pino 53%

(van de Pas et al.,

2011)

Myceliophthora

thermophila

Siringato de metilo,

Siringaldehido

Pulpa de

Eucalipto 50% (Babot et al., 2011)

Siringato de metilo Materia prima

de eucalipto >50% (Rico et al. , 2014)

ácido violúrico,

siringaldehido

Pulpa de

Eucalipto 50%

(Gouveia et al.,

2012)

Sclerotium sp. ABTS Paja de Trigo 84.23% (Qiu & Chen, 2012)

Thermus

thermophilus

ABTS, HBT,

Guaiacol

Pulpa de paja

de trigo 27% (Zheng et al., 2012)

Trametes villosa

HBT Hierba para

elefantes 50%

(Gutiérrez et al.,

2012)

HBT, Ácido violúrico,

Siringaldehido

Materia prima

de eucalipto 55-60%

(Garcia-Ubasart et

al., 2011; Moldes &

Vidal, 2011)

Laurilgalato Residuos de

papel 50%

(Cusola et al.,

2013)

Trichoderma reesei - Caña de azúcar 84% (Kuila et al., 2011)

Como antecedentes para el microorganismo del género Fusarium, se ha realizado

aplicaciones sobre pino con lacasa de Fusarium proliferatum, con remociones de lignina

entre el 50 y el 60% (Regalado et al., 1997, 1999). Para esta aplicación se cultivó el

microorganismo directamente sobre el material lignocelulósico, a diferencia de otros

pretratamientos. Otra aplicación con F. proliferatum se hizo sobre papel a partir de sisal,

que tuvo remociones entre el 54 y 59% (Hernández Fernaud, Carnicero, et al., 2006). En

residuos de soya, se ha removido entre el 60 y 80% con lacasa a partir de Fusarium solani


(Lozovaya et al., 2006). Para estos pretratamientos se usaron como mediadores ABTS y

HBT.

En investigaciones pasadas, se realizó pretratamientos de la lacasa de Fusarium spp sobre

tallos de yuca (Liscano-Martinez & Tangarife-Morales, 2015). Se obtuvo una remoción de

lignina del 40%. Sin embargo, también hubo degradación de celulosa

1.6. Raquis de Palma

La palma de aceite Elaeis guineensis Jacq, es la palma más usada para la producción de

aceite de palma del mundo, la cual es originaria de África. Esta palma, es usada

principalmente en los trópicos debido a sus bajos costos, facilidad de establecimiento y

altos rendimientos, haciendo el cultivo de aceite más eficiente en el mundo (Dislich et al.,

2016). Colombia es el cuarto productor de aceite de palma en el mundo y el primero en

Latinoamérica teniendo una capacidad de producción de 1.143.446 toneladas de aceite

crudo aproximadamente. Sin embargo el aceite extraído de palma representa

aproximadamente el 10% de la palma inicial, lo que dejó aproximadamente 10.606.980 de

toneladas de residuos al año (Fedepalma, 2016).

Parte de estos residuos se generan al extraer de la palma el fruto con un tambor rotatorio,

donde se separan los frutos y se obtienen racimos vacíos, tusas vacías o raquis,

representan el 20.2% de la carga inicial. Este raquis se dispone a campo abierto o en

plantas de compost (Cenipalma, 2014).

Figura 1-12: Tusa o raquis de palma Tomado de (Cenipalma 2014)

Contexto General 27

En la Tabla 1-7 se muestran reportes relacionados con la composición del raquis de palma.

Cabe señalar que clasifica como madera dura, material de interés para los pretratamientos

enzimáticos deseados para este trabajo.

Tabla 1-7: Composición de Raquis de Palma.

Compuesto (C. Lu et

al., 2010)

(Piñeros

Castro,

2012)

(Mora Cano &

Flórez Pérez,

2016)

(Medina

et al.,

2016)

(Chin et

al., 2015)

(Fang et

al., 2015)

Celulosa (%) 42.0 37.9 30.0 28.0 39.9 38.3

Hemicelulosa

(%) 30.1 26.2 33.0 24.2 27.1 20.7

Lignina (%) 14.2 22.1 22.0 29.9 24.6 24.6

Extractivos (%) 10.2 7.9 15.0

-- 9.5 --

Cenizas (%) 2.8 2.9 3.2 1.6 --

Humedad (%) -- -- -- -- -- 3

Proteína (%) -- -- -- 3.36 -- --

Total (%) 99.3 97.0 100.0 88.7 102.51 86.6

1.7. Conclusiones

Los distintos métodos de separación y purificación de enzimas pueden mejorar los

pretratamientos enzimáticos realizados con lacasa de Fusarium spp.

Por los reportes de literatura, se encontró que el raquis de palma, al ser un material

duro, es una biomasa lignocelulósica y se puede aplicar pretratamientos con la lacasa

de Fusarium spp.

Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp

29

2. Métodos de separación y Purificación para lacasa de

Fusarium spp

Resumen

Varios han sido los métodos usados para la separación y purificación de lacasas obtenidos

de extracto crudo, se caracterizan la cromatografía, centrifugación, formación de fases,

precipitación y filtración. En este trabajo se escogió la formación de fases para la

purificación de lacasa de Fusarium spp, específicamente, la Partición de Tres Fases. Este

método consta de la interacción de sulfato de amonio y ter-butanol con el extracto crudo

que favorezca efectos kosmotrópicos y de salting out. Con esto se forma una fase o

precipitado intermedio de una fase superior orgánica y una fase acuosa.

Introducción

Generalmente, la lacasa producida a partir de hongos viene acompañada de otros tipos de

compuestos como isoformas, proteasas, celulasas y oros compuestos derivados de la

producción del extracto crudo (Janson, 2012). Entre los distintos métodos de separación y

purificación se encuentran la cromatografía, precipitación, formación de fases,

centrifugación, filtración, entre otras, los cuales se utilizan dependiendo de la utilidad de la

proteína purificada, ya sea identificación o mejorar un proceso posterior (Camperi et al.,

2014). Entre estos procesos se encuentra la Partición de Tres Fases (TPP por sus siglas

en ingles), en el que se agrega un alcohol orgánico (ter-butanol) y un compuesto salino

(sulfato de amonio) a un extracto crudo con lacasa producida, donde se forman tres fases:

una fase orgánica, una fase salina y un precipitado intermedio donde se encuentra la

lacasa (Gagaoua & Hafid, 2016). El objetivo de este capítulo esjustificar la selección de la

TPP como método de separación y purificación de la lacasa producida por Fusarium spp

para aplicarse en raquis de palma.

2.1. Separación y purificación de lacasas

Como se vio en la sección 1.3, es necesario separar y purificar enzimas, ya que en la

producción de enzimas, se forman subproductos que no permiten una actividad enzimática

óptima (Camperi et al., 2014). Para el caso particular de lacasas, se ha desarrollado varios


métodos para separar y purificar esta enzima a partir de Basidiomicetos, Ascomicetos y

bacterias (Rivera-Hoyos et al., 2013).

2.2. Subproductos de la separación y purificación de lacasas

Para el caso específico de la producción de lacasas a partir de hongos, se ha encontrado

los siguientes subproductos:

Celulasas: Estas enzima se encargan de degradar la celulosa presente en materiales

lignocelulósicos (Maitan-Alfenas et al., 2015). Hongos del género Fusarium han

producido celulasas y lacasas (Ravalason et al., 2012). Ya que la intención de este

trabajo es usar la lacasa para degradar la lignina presente en materiales

lignocelulósicos, se hace necesario retirar la celulasa presente, porque quedaría

menos celulosa disponible para procesos posteriores.

Proteasas: Estas enzimas se encargan de degradar proteínas, al estar en altas

concentraciones puede generar partición proteolítica de la lacasa (Pierce, 2005). Se ha

demostrado que los hongos ligninolíticos pueden producir proteasas que afectan

procesos posteriores (Brown & Proctor, 2013; Kirk et al., 1987; Polizeli & Rai, 2014;

Strong & Claus, 2011; Van Dyk & Pletschke, 2012; Viswanath et al., 2014).

Isoformas: Son lacasas que en su estructura primaria tienen alta similitud con su

estructura nativa, pero en las estructura secundaria y terciaria pueden variar,

desactivando su sitio activo (Strong & Claus, 2011). Es posible que por procesos post-

traduccionales del Fusarium spp se generen este tipo de estructuras que disminuirían

la actividad enzimática, es necesario separarla de la lacasa activa.

Compuestos contaminantes: Sustancias hidrofóbicas y demás moléculas generadas

a partir de la producción de la misma lacasa. Estas pueden afectar la estructura de la

enzima, modificando su sitio activo y reduciendo su actividad enzimática (Camperi et

al., 2014).

2.3. Métodos Reportados

Tradicionalmente, los procesos que se han realizado para separar y purificar lacasas han

usado métodos cromatográficos, aclarando que siempre aparece un paso previo de

precipitación con sulfato de amonio. Para comparar la efectividad de los métodos, se

verifica cuánto es el rendimiento de la enzima y en cuanto aumentó la actividad específica


31

de la lacasa (Veces de Purificación). El cual se determina usando las ecuaciones (2-1)-(1-

3) (Referencia).

Y=LAf

LA0

×100% (2-1) FP=SAf

SA0

(2-2) SA=LA

P (2-3)

Donde Y es el rendimiento, FP es las veces de purificación, LAf y LA0 son las actividades

enzimáticas (U/L) de lacasa purificada y el extracto crudo respectivamente, SAf y SA0 son

las actividades específicas (U/mgproteína), y P es la concentración de proteína (mg/mL).

Como se observa en la ecuación (2-1), el rendimiento es el cambio de actividad enzimática

en el proceso aplicado, el cual puede ser mayor a 100% debido a que la actividad puede

ser levemente aumentada. La ecuación (2-2) describe las veces de purificación, que es el

cambio de actividad específica. Este término se incluye el cambio de actividad enzimática

y la proteína, lo que puede describir mejor si una purificación usada es viable o no.

Tabla 2-1: Separación y purificación de lacasa encontrados en la literatura

Método de separación y

purificación Microorganismo Recuperación

Veces de

purificación Referencia

Formación de fases

Partición

trifásica

Pleurotus ostreatus 161% 27.8 (Kumar et al., 2012)

Ganoderma sp. 60% 13.2 (Rajeeva & Lele,

2011)

Coriolopsis trogii 72% 14 (Liu et al., 2015)

Extracción

acuosa en

dos fases

Agaricus bisporus 95% 2.48 (Mayolo-Deloisa et

al., 2009)

Trametes

versicolor 96% 1.91

(Prinz et al., 2014)

Pleurotus sapidus 64% 1.84

Peniophora

cinerea 107% 1.61

(Moreira et al.,

2013)

Lentinus

polychrous 99% 1.98

(Ratanapongleka,

2012)

Pleurotus ostreatus 98.31% 9.97 (Bertrand et al.,

2016)


Tabla 2-1: (Continuación)

Método de separación y

purificación Microorganismo Recuperación

Veces de

purificación Referencia

Precipitación

Solventes

orgánicos

Coriolus

versicolor 92.7% 4.79

(Peng et al.,

2012)

Compuestos

salinos

Pseudomonas

aeruginosa 49.48% 0.74

(Peter &

Vandana, 2014)

Cromatografía

Intercambio

iónico

Leptographium

qinlingensis 23.5% 25.6 (Hu et al., 2013)

Pleurotus ferulae 26.91% 4.85 (Ding et al.,

2014)

Russula

virescens 36.1% 128.1

(Zhu et al.,

2013)

Pleurotus

ostreatus 11.82% 147.74

(Othman et al.,

2014)

Carica papaya 61.5% 1376.70 (Jaiswal et al.,

2015)

Afinidad

Agaricus

bisporous 0.8% 8

(Bhadauria et

al., 2014)

Ganoderma

lucidum 30.65% 7.19

(Ding et al.,

2012)

Cerrena sp. 39.8% 3.1 (J. Yang et al.,

2014)

Trametes hirsuta 31% 180 (Haibo et al.,

2009)

Filtración

Ultrafiltración

Pycnoporus

sanguineus 71% 1.9

(Ramírez-

Cavazos et al.,

2014)

Trametes

Versicolor 44% --

(Martínez-

Morales et al.,

2014)

Filtración en

gel

Paraconiothyrium

variabile 22% 0.85

(Forootanfar et

al., 2011)


33

Para lacasa producida a partir de microorganismos del género Fusarium, se han

desarrollado algunos métodos de separación y purificación. Entre las especies que se han

purificado se encuentran Fusarium solani (Wu et al., 2010) y el Fusarium ploriferatum

(Hernández Fernaud et al., 2006) con veces de purificación de 75.9 y 69.1 respectivamente

y rendimientos de 9 y 23%. Los métodos usados por Wu y colaboradores, y Hernández

Fernaud y colaboradores. Incluyen precipitación con sulfato de amonio y columnas

cromatográficas de intercambio iónico. En trabajos previos con la lacasa de Fusarium spp,

la separación y purificación se realizó mediante precipitación con sulfato de amonio

(Liscano-Martinez & Tangarife-Morales, 2015; Rodríquez-Siza, 2015). Donde se obtuvo

rendimientos de 130% y veces de purificación de 1.26 y 1.31.

2.4. Selección del método

Para seleccionar el método dentro de los reportados para lacasa (Tabla 2-1) y aplicados

para proteínas en general (sección 1.3.1), se tuvo cuenta varios factores:

Disponibilidad de aplicación.

Conservación de la actividad de la enzima (Rendimiento, (2-1)).

Tiempos de separación bajos (1h-1 semana).

Cantidad de proteína purificada (Veces de purificación, (2-2)).

Con estos factores, inicialmente se descarta la centrifugación para separar la lacasa de

Fusarium spp. Este método según lo reportado por Frei (2011), es ideal para separar

enzimas de remanentes de biomasa en el extracto enzimático y para analizar estructuras

y tiempos de separación variable. Sin embargo, genera fases donde está la proteína

objetivo, con otras proteínas de peso molecular similar generando confusiones, genera

modificaciones estructurales de la proteína y los rendimientos muy bajos para la actividad

enzimática (Shi, 2016).

Si bien los métodos cromatográficos son los más usados y con altas veces de purificación,

para este trabajo se descartan. Si se observa la Tabla 2-1, los rendimientos son menores

al 30% , lo que indica que lacasa purificada obtenida tiene alta actividad específica pero

se obtiene en pocas cantidades, es poco conveniente a la hora de aplicarlo a un

pretratamiento. Generalmente, estos métodos son usados para la producción de fármacos

y la identificación de proteínas (Camperi et al., 2014), lo cual no es el objetivo de esta

investigación. Además, tiene tiempos largos de separación (1 día-1 semana) que incluye


equilibrio, limpieza de columna y diálisis (General Electrics Healthcare, 2007) y puede

haber limitaciones de selectividad por grupo (Hedhammar et al., 2006).

La filtración tiene tiempos de separación variable, sin embargo puede generar cambios de

presión muy altos (Seader & Henley, 2006) lo que puede afectar la estructura de la lacasa

y por consiguiente su actividad enzimática. Además, como se puede ver en la Tabla 2-1,

sus resultados son bajos en comparación con métodos como formación de fases. Se

descarta la filtración como método para separar y purificar lacasa usada en este trabajo.

La precipitación como se presenta en esta investigación es un método sencillo, que solo

requiere de un compuesto interactúe con los compuestos que hay en el extracto enzimático

y afecte ciertas propiedades como el pH, solubilidad o cargas de la proteína que se quiere

precipitar y tiempos de separación variable (Camperi et al., 2014). Sin embargo, para los

reportes de literatura mostrados en la Tabla 2-1, los resultados son muy bajos con respecto

a otro métodos, Se descarta la precipitación.

Por último queda la formación de fases, donde se caracterizan la Extracción Acuosa de

Dos Fases (ATPE) y la Partición de Tres Fases (TPP). Ambos tienen resultados parecidos,

donde se conserva la actividad enzimática por encima del 50% y la cantidad de proteína

no es tan baja como la cromatografía. Para la ATPE, donde se usan polímeros como

Polietilenglicol (PEG) y UCON y sales fosfato y sulfato, es difícil determinar la fase donde

la enzima de interés termine, inconveniente que no tiene la TPP. Además, es posible que

la actividad enzimática se vea afectada por estar en contacto constante con un polímero o

sal que inhiba la reacción deseada (Hong Yang, 2013). Con esto, se puede descartar la

ATPE, dejando la TPP como el método de separación y purificación usado para esa

investigación.

2.5. Partición de Tres Fases (TPP)

La partición de Tres Fases (TPP por sus siglas en inglés), es un método sencillo, fácil y

rápido, que se realiza en un paso (Gagaoua & Hafid, 2016). En este método se agrega un

compuesto salino (generalmente sulfato de amonio) y un compuesto orgánico (un alcohol

orgánico de alto peso molecular) que forman un precipitado entre una fase superior

orgánica y una fase salina inferior (Borbás et al., 2003; Dennison & Lovrien, 1997), como

se muestra en la Figura 2-1.


35

Figura 2-1: Representación Esquemática de la TPP.

2.5.1. Principio

Se usan sulfato de amonio como compuesto salino y ter-butanol como compuesto

orgánico. Este alcohol es miscible en agua, pero al agregar una sal como la que se usa en

este método se forman dos fases inmiscibles. De esta manera, como se muestra en la

Figura 2-1, en la fase inferior quedan compuestos polares afines al sulfato de amonio como

proteínas y carbohidratos, y en la parte superior quedan compuestos no polares afines al

ter-butanol como pigmentos y lípidos. Denison y Lovrein (1997) veían este método como

el fortalecimiento de la proteína de interés con iones sulfato y la parte no polar del ter-

butanol, mientras Borbás y colaboradores (2003) como la adsorción de proteínas a un

fluido estable en la interface generada. La capacidad de la TPP de formar la fase

intermedia se basa en dos reacciones (Rachana & Lyju Jose, 2014). La primera reacción

se tiene la proteína en el extracto crudo totalmente penetrada por el agua que pasa a estar

conformacionalmente más apretada con menos penetración de moléculas de agua. En la

segunda reacción los cambios en viscosidad son más evidentes y la proteína, al estar

mucho menos penetrada por el agua, realiza interacciones hidrofóbicas con otras

proteínas, lo que produce la precipitación y formación de la fase o precipitado intermedio.

2.5.2. Impactos del Sulfato de amonio

Su efecto es importante, ya que es la encargada de realizar el proceso de salting-out, en

el cual al aumentar la concentración de sal, se disminuye la cantidad de agua disponible

en la proteína y empieza a precipitar. El sulfato de amonio es la sal más usada por este

método debido a su alta solubilidad y fuerza iónica (Rachana & Lyju Jose, 2014). Los iones


que conforman esta sal están al final de su respectiva serie de Hofmeister, sus efectos

caotrópicos son los más bajos, favoreciendo el efecto de salting out. Esta sal juega un rol

importante en la TPP ya que es la encargada los enlaces proteína-proteína (Gagaoua &

Hafid, 2016).

2.5.3. Impactos del Ter-butanol

El ter-butanol es un alcohol orgánico C4, que reduce efectos caotrópicos y sirve como

solvente diferenciador. Este compuesto orgánico no es capaz de penetrar la proteína

debido a que su tamaño molecular es más grande que los espacios generados en la

estructura tridimensional de la proteína. Se ha descubierto que el ter-butanol tiene

importantes efectos kosmotrópicos (contrario a los efectos caotrópicos) y de

amontonamiento sobre la proteína de interés cuando el sistema trabajado se incuba a

temperaturas entre 20-40°C, lo que mejora la estabilidad de la proteína.

2.5.4. Ventajas y Desventajas

Además de lo ya mencionado, otras ventajas de la TPP (Gagaoua & Hafid, 2016; Rachana

& Lyju Jose, 2014):

El uso de menos cantidad de sal en comparación con precipitaciones salinas.

La concentración de la proteína obtenida es mayor que la cromatografía.

Se usa a temperaturas cercanas al ambiente, evitando las temperaturas bajas.

Las condiciones donde se maximiza la TPP favorecen la estabilidad de la proteína.

Facilidad en procesos de escalado (scale-up y scale-down).

Además, tiene la capacidad de formar un proteína purificada más rígida (Rather & Gupta,

2013), sin embargo, puede desestabilizar proteínas con estructuras cuaternarias.

2.5.5. Aplicaciones

Como se nombró en la Tabla 2-1, ya se han hecho aplicaciones de este método sobre

extractos crudos con actividad lacasa. En la tabla 2-2 se muestran las condiciones

reportadas en literatura. Es importante marcar que se usan grandes cantidades de sulfato

de amonio, la temperaturas usadas favorecen efectos kosmotrópicos de la lacasa y la

cantidad de ter-butanol no supera la relación 1:2.


37

Tabla 2-2: Condiciones de TPP para lacasa reportados

Microorganismo Extracto-Ter-

butanol (v:v)

Sulfato de

amonio

(%)

Temperatura

(°C)

Rendimiento

(%)

Veces de

Purificación Referencias

Pleurotus

ostreatus 1.0:1.8 60 42±3 161 27.8

(Kumar et al.,

2012)

Ganoderma sp. 1.0:0.5 80-90 35 60 13.2 (Rajeeva & Lele,

2011)

Coriolopsis trogii 1.0:1.0 40 20 75 20 (Liu et al., 2015)

También se ha aplicado para remover pigmentos de la celulosa producida para

sacarificación (Rachana & Lyju Jose, 2014), separar la captesinas de hemoglobinas (que

se desestabilizan por su estructura cuaternaria) presentes en la sangre (Gagaoua & Hafid,

2016), y para separar y purificar gran cantidad de enzimas y proteínas como α-amilasa,

proteinasa, proteasa, galactosidasa, lipasa, albúminas, entre otras (Rather & Gupta, 2013).

2.6. Conclusiones

La separación y purificación por formación de fases, fue el método escogido para aplicarse

sobre el extracto crudo con actividad lacasa de Fusarium spp. Esto se debió a que con

este tipo de métodos se concentra la proteína mejor en comparación a los demás métodos.

Sin embargo, si el objetivo de purificar fuera diferente a la posterior aplicación, es posible

cambiar por otro método. Si el objetivo es concentrar todas las proteínas presentes en el

extracto crudo, la precipitación y la ultrafiltración son buenas opciones. Si se necesitan

cantidades bajas para procesos a bajas escalas o identificar el tipo de lacasa que se está

trabajando, la centrifugación y la cromatografía toma importancia.

Dentro de la formación de fases, se escogió la TPP por encima de la ATPE debido a poca

certeza sobre ciertos factores de la ATPE. Ya que la lacasa no cuenta con estructura

cuaternaria la TPP no se va a desestabilizar con este método. Sin embargo, para

maximizar la separación y purificación de la lacasa es necesario tener en cuenta el sulfato

de amonio, ter-butanol y temperatura de incubación del sistema, que varían los efectos

kosmotrópicos de la lacasa.

Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.

39

3. Condiciones óptimas para el método de separación y

purificación de lacasa de Fusarium spp.

Resumen

En este capítulo, se presenta las condiciones donde se maximiza la cantidad de lacasa

purificada mediante TPP. Los factores más importantes del proceso, encontrados en

reportes de literatura, fueron el sulfato de amonio, el ter-butanol y la temperatura de

incubación, que corresponden a un máximo de la variable respuesta. Estos factores se

ingresaron a un Diseño Central Compuesto, las variables respuesta fueron, El rendimiento

y las veces de purificación, definidas en las ecuaciones (1-1) y (1-2). Mediante un Análisis

de Varianza (ANOVA) se encontró que los factores que afectan de forma significativa a

esta purificación, son la saturación de sulfato de amonio y la relación volumétrica del

extracto crudo con el ter-butanol. Las condiciones que favorecieron el rendimiento y las

veces de purificación máximo fueron, 1.0:1.13131 relación extracto crudo con ter-butanol,

38.4°C de temperatura y 77.9798% m/v de saturación de Sulfato de Amonio, con los que

se obtiene 114.13±7.69% de rendimiento y 1.216±0.183 de veces de purificado.

Comparado con los métodos reportados, se concluyó que se logra maximizar la TPP para

lacasa de Fusarium spp.

Introducción

El hongo Fusarium spp es un hongo ascomiceto patógeno que genera grandes pérdidas

económicas (Miller et al., 2014). Este hongo, aislado en el Urabá Antioqueño, tiene

potencial ligninolítico, con la capacidad de producir lacasa (Lopera, 2009), sobre el cual

hay un medio específico para producción de lacasa (Cano, 2011; Certain, 2015). Sobre el

extracto crudo producido se ha hecho aplicaciones en materiales lignocelulósicos,

concluyendo que es posible que hayan otras enzimas como celulasas o peroxidasas que

disminuyen los rendimientos del proceso de remoción de lignina (Liscano-Martinez &

Tangarife-Morales, 2015). Para mejorar esto, se propone separar y purificar lacasa

producida mediante TPP. El objetivo de este capítulo es determinar las condiciones para

la TPP, aumente la actividad específica de la lacasa.


3.1. Metodología

3.1.1. Microorganismo

Fusarium spp fue aislado por el laboratorio de Bioprocesos y Flujos Reactivos del

Departamento de Procesos y Energía de la Facultad de Minas, en la Universidad Nacional

de Colombia, sede Medellín (Lopera, 2009), el cual presentó potencial ligninolítico en

estudios previos (Cano, 2011).

3.1.2. Activación de inóculo de Fusarium spp

Se preparó 20 mL de PDA en agua destilada y esterilizó a 15 psi durante 15 minutos. Luego

de agregar PDA a caja de Petri, se inoculó hongo que se tiene aislado y conservado

(Lopera, 2009). Se selló e incubó a 25°C durante 10 días. Se prepararon 100 mL de PDB

que se esterilizan a 15 psi durante 15 minutos. Del medio de cultivo incubado en medio

sólido se sacaron 3 o más discos agar de aproximadamente 5 mm de diámetro de la

periferia del crecimiento y se agregaron en PDB. Se incubó el inóculo a 25°C y a 150 rpm

durante 5 días.

3.1.3. Fermentación sumergida de inóculo producido

Se prepararon 100 mL de medio de cultivo con los compuestos nombrados en las Tablas

3-1 y 3-2, basados en el trabajo hecho por Certain (2015):

Tabla 3-1: Componentes de medio líquido para producir lacasa a partir de Fusarium spp.

Compuesto Concentración Compuesto Concentración

Xilosa 1.53 g/L CaCl2 0.1 g/L

Peptona 0.56 g/L Acetato de sodio 3.3 g/L

Metanol 1% v/v Tween 80 (10%) 5 mL/L

KH2PO4 2 g/L Metanol 1% (v/v)

MgSO4*7H2O 0.5 g/L Elementos trazas 10 mL/L


41

Tabla 3-2: Composición de elementos trazas.

Componente Concentración (g/L)

MgSO4*7H2O 3.00

MnSO4 0.50

NaCl 1.00

FeSO4*7H2O 0.10

CoCl2 0.10

ZnSO4*7H2O 0.10

CuSO4 0.10

H3BO4 0.01

Na2MoO4 0.01

AlK(SO4)2 0.01

A excepción del metanol, se esterilizó el medio de cultivo a 15 psi durante 15 minutos.

Luego de la esterilización, se agregó asépticamente el metanol. Se agregó 1mL de inóculo

líquido y se incubó a 25°C y 100 rpm en agitador orbital. Luego de la incubación, se filtró

el medio de cultivo en un sistema de filtrado al vacío con porosidad de 0.2 µm, obteniendo

un extracto crudo.

3.1.4. Medición de actividad enzimática lacasa y proteína

Para un sistema de reacción de 1mL, se agregaron en dos celdas para espectrofotómetro

100 µL de amortiguador Acetato de sodio/Ácido acético 1M pH 5, 700 µL de agua destilada

y 100µL de muestra a analizar. Se Incubaron las celdas a 40°C durante un minuto. En una

de las celdas incubadas, se agregó 100µL de amortiguador acetato (blanco). En la otra

celda, se agregaron 100µL de sustrato ABTS 5mM disuelto en amortiguador acetato

(muestra). Se pusieron las celdas en espectrofotómetro UV-VIS y se leyeron los

incrementos de absorbancia a una longitud de onda de 436 nm cada 15 segundos durante

3 minutos, verificando que el comportamiento sea lineal. Para calcular la actividad

enzimática se utilizó la ecuación (2-1).

E.A.=A×Vt×Fd

t×ε×Vm

(2-1)


Donde E.A. es la actividad lacasa (U/L), A es el cambio de absorbancia a 436 nm (Absinicial-

Absfinal), Vt es el Volumen total de la reacción, Fd es el factor de dilución, t es el tiempo de

dilución, ε es el coeficiente de extinción molar de ABTS oxidado que es 29300 M-1cm-1 y

Vm es el Volumen de muestra.

La unidad de actividad enzimática es la cantidad de micromoles catalizadas por la lacasa

por minuto, ahora considerando El ABTS como indicador de la enzima se obtiene una

definición de actividad enzimática de lacasa, como la cantidad de ABTS oxidado por

minuto.

Para la medición de proteína se usó el método de Bradford (Walker, 2002), usando como

colorante el azul de Coomasie G250 y como estándar la albúmina, generando una curva

estándar mostrada en el Anexo A.

3.1.5. Partición Trifásica (TPP)

Al extracto enzimático producido (con actividad enzimática y concentración de proteína

previamente medidos) se le agregó sulfato de amonio y ter-butanol. Luego, se homogenizó

el sistema mediante agitación moderada con equipo vórtex. El sistema homogéneo se

incubó durante 1 hora en baño maría, donde se formaron 3 fases. Posterior a la incubación,

se sometió a centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos a 25 °C en centrífuga Thermo

scientific IEC CL31R, con el objetivo que el precipitado intermedio quede más compacto y

sea fácil de separar. Después, se separaron las fases con un embudo de separación,

donde queda la fase intermedia, la cual se depositó en buffer fosfato pH 7 (Determinación

de pH Anexo B). Por último se determinó la actividad enzimática y la concentración de

proteína de lacasa purificada para compararla con las medidas en el extracto crudo

producido. Esta comparación se hizo mediante el cálculo del rendimiento y las veces de

purificación (fold purification) según las ecuaciones (2-1) y (2-2) ya mostradas.

3.1.6. Diseño Experimental

Para el TPP, se realizó un diseño central compuesto, usando 4 repeticiones del punto

central, donde los factores de entrada fueron la relación de extracto crudo con ter-butanol

(1.00:0.50-1.00:3.00 v:v), la temperatura de incubación (25-60 °C) y la saturación de sulfato

de amonio (20-90 %p/v). Los factores de respuesta fueron el rendimiento y las veces de


43

purificación definidos en la sección anterior. Los análisis estadísticos se realizaron en el

software Minitab versión 16.1.0.0 de prueba, con un nivel de significancia del 5%. En la

tabla 3.3 se presentan los datos del diseño experimental.

Tabla 3-3: Diseño Experimental para la Partición de Tres Fases (TPP) del extracto crudo

Factores de entrada Símbolo Unidades codificadas

- 0 +

Relación de extracto crudo con ter-butanol (v:v) A 1.00:0.50 1.00:1.75 1.00:3.00

Temperatura (°C) B 25 42.5 60

Saturación de (NH4)2SO4 (% w/v) C 20 55 90

3.2. Resultados y Discusión

Para la experimentación aquí mostrada, el extracto crudo tuvo una actividad lacasa de

51.75 U/L y 0.062 g/L de proteína. En comparación con los extractos usados en otros

estudios de partición trifásica (V. Vinoth Kumar et al., 2012; Liu et al., 2015; Rajeeva &

Lele, 2011), la actividad enzimática y la cantidad de proteína son muy bajos. Es posible

que el rendimiento se mantenga alrededor del 100% pero las veces de purificación pueden

verse disminuidas.

3.2.1. Partición Trifásica (TPP)

En la tabla 3.4 se muestra los resultados del diseño experimental mostrado en la tabla 3.3.

Dentro de lo más apreciable de esta tabla, se observa que a valores bajos de saturación

el precipitado intermedio no tiene actividad lacasa, representando valores de rendimiento

y veces de purificación nulos. Por el contrario, cuando hay valores altos de saturación, el

precipitado formado tiende a tener altos valores de actividad enzimática.

Tabla 3-4: Resultados del diseño experimental

Extracto crudo-ter-butanol (v:v) Temperatura (°C) Saturación de

(NH4)2SO4 (%w/v) Rendimiento (%) Veces de purificación

1.00:1.75 42.5 55.00 90.74 0.91

1.00:1.01 32.1 34.19 0.00 0.00

1.00:1.01 52.9 34.19 0.00 0.00


Tabla 3-4: (Continuación)

Extracto crudo-ter-butanol (v:v) Temperatura (°C) Saturación de

(NH4)2SO4 (%w/v) Rendimiento (%) Veces de purificación

1.00:2.49 32.1 75.81 59.26 0.59

1.00:2.49 32.1 34.19 0.00 0.00

1.00:1.75 42.5 90.00 50.00 0.75

1.00:3.00 42.5 55.00 12.96 0.16

1.00:1.75 25.0 55.00 127.78 1.22

1.00:1.01 32.1 75.81 142.59 1.34

1.00:1.75 60.0 55.00 44.44 0.69

1.00:1.75 42.5 55.00 40.46 0.38

1.00:1.75 42.5 20.00 0.00 0.00

1.00:1.75 42.5 55.00 118.52 1.53

1.00:1.75 42.5 55.00 94.44 0.92

1.00:1.75 42.5 55.00 40.74 0.43

1.00:2.49 52.9 75.81 37.04 0.42

1.00:1.01 52.9 75.81 146.30 1.78

1.00:1.75 42.5 55.00 118.52 1.07

1.00:0.50 42.5 55.00 38.89 0.55

1.00:2.49 52.9 34.19 5.56 0.07

Los resultados experimentales fueron ajustados a ecuaciones de segundo grado completo

con interacciones. Las ecuaciones (2-2) y (2-3) representan el modelo encontrado para el

rendimiento y las veces de purificado respectivamente. La tabla 3-5 muestra el análisis de

varianza (ANOVA) hecho sobre el modelo propuesto en las ecuaciones obtenidas de la

regresión. La tabla 3-4 indica que, para las veces de purificación los factores que influyeron

de forma significativa fueron la saturación de sulfato de amonio y la relación de extracto

crudo y ter-butanol. La relación de estos factores es significativo, lo que indica que un

aumento o disminución del sulfato de amonio afecta los cambios de ter-butanol agregado

en el sistema formado, lo que indica una dependencia de estos factores entre sí. Por otro

lado, la temperatura no generó cambios significativos en las veces de purificado, lo que

indica que en este rango de temperaturas no hubo cambios significativos en las veces de

purificado.


45

Por otro lado el único factor que afectó de forma significativa el rendimiento es la saturación

de sulfato de amonio. Para este factor de respuesta, la relación de extracto crudo y ter-

butanol tiene significancia en el rendimiento de estos experimentos siempre y cuando esté

relacionado con el sulfato de amonio. En general, para la purificación de lacasa proveniente

de Fusarium spp por TPP, fue muy importante la cantidad de sulfato de amonio que se

agregue al sistema, siendo más importante que los otros factores evaluados, como se ha

dicho Gagaoua y Hafid (2016), argumentándolo bajo el hecho que aumenta el efecto

salting-out en el sistema, aumentando la interacción proteína-proteína que forma la fase

intermedia.

VP= -5.56289+2.77265*A+0.0472930*B+0.110477*C-0.483529*A2-4.93380*10-4

*B2

-5.97983*10-4

*C2-0.00886738*A*B-0.0176121*A*C+0.000113846*B*C (2-2)

Y(%)= -536.748+248.389*A+4.50474*B+11.8843*C-48.2994*A2-0.0499026*B2

-0.0623623*C2-0.329235*A*B-1.60128*A*C-0.0138963*B*C (2-3)

Tabla 3-5: ANOVA de las veces de purificado y el Rendimiento en TPP

Factor Valor P

Veces de Purificado Rendimiento

Modelo 0.013 0.014

A- Extracto crudo: ter-butanol 0.047 0.069

B-Temperatura 0.642 0.201

C- Saturación de (NH4)2SO4 0.002 0.003

A2 0.016 0.013

B2 0.558 0.536

C2 0.018 0.012

A*B 0.55 0.815

A*C 0.038 0.046

B*C 0.828 0.782

Falta de Ajuste 0.454 0.093

R2 85.94 % 85.50 %

R2 Ajustado 70.13 % 69.20 %


Adicionalmente, en la Tabla 3-5 se observa que el valor p del modelo dio menor que el

nivel de significancia (α=0.05) y la falta de ajuste dio mayor para las veces de purificación

y el rendimiento. Lo que indica que las regresiones propuestas son adecuadas para los

experimentos propuestos. Al revisar los coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado),

vemos que hay más cercanía entre los valores dados para las veces de purificación que

con el rendimiento, lo que indica que las veces de purificación predice de forma más

acertada la TPP hechas en estos experimentos en comparación con el rendimiento.

En las Figuras 3-1 y 3-2 se muestran la respuesta de las veces de purificación y el

rendimiento basado en las condiciones del experimento y la regresión hecha como gráficas

de superficie y de contorno. Se observó que los cambios de temperatura hacen que los

cambios de las veces de purificado sean muy bajos, corroborando los resultados de la

ANOVA en la Tabla 3-5. No obstante, la temperatura tiene valores altos de respuesta

cercanos a su límite inferior. Para el sulfato de amonio, los valores donde la respuesta se

maximiza fueron cercanos al límite superior, resultados cercanos a los propuestos por

Rajeeva y Lele (2015). Por último, la relación de extracto crudo-ter-butanol maximizó las

veces de purificación y el rendimiento en valores entre 1.0:1.2 y 1.0:2.0, rango donde esta

relación es similar a lo reportado por Kumar y colaboradores (2012).

Los valores máximos predichos para las veces de purificación y rendimiento basado en los

modelos de regresión calculados (ecuaciones (2-2) y (2-3)), fueron calculados y se

muestran en la Tabla 3-6, cuyas fases formadas se muestran en la Figura 3-3. Esta figura

muestra que claramente hay una fase intermedia formada entre una fase superior y una

fase orgánica. Al realizar la validación de estas condiciones, se obtuvo respuestas

experimentales que al comparar con las respuestas teóricas se interceptan sus rangos, por

lo que ambos valores no muestran diferencias significativas.


47

Figura 3-1: Relación de los distintos factores de entrada con respecto al Rendimiento.


Figura 3-2: Relación de los distintos factores de entrada con respecto a las Veces de Purificación.


49

Tabla 3-6: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión.

Factor Valor

Relación de extracto crudo con ter-butanol (v:v) 1.0:1.13131

Temperatura (°C) 38.4

Saturación de (NH4)2SO4 (% m/v) 77.9798

Rendimiento Teórico (%) 124.04±18.61

Veces de Purificación Teórico 1.427±0.214

Rendimiento Experimental (%) 114.13±7.69

Veces de Purificación Experimental 1.216±0.183

Figura 3-3: Formación de Fases en sistema con condiciones donde se maximiza los factores de respuesta.

La Tabla 3-7 compara los resultados obtenidos en la Tabla 3-6 con los resultados

reportados en otros estudios. Las condiciones en las que se hace el TPP para este estudio

son más cercanas a las condiciones usadas por Rajeeva y Lele (2011). El resultado de

rendimiento obtenido en este estudio fue mayor a 100%, además es uno, de lo más altos

obtenidos para este proceso. Esto indica que la TPP para lacasa de Fusarium spp aumentó

en 14% la actividad enzimática. Sin embargo, las veces de purificación obtenida fueron

muy bajo comparado con los estudios reportados en la Tabla 3-7. Esto señala que el

precipitado intermedio obtenido, tuvo lacasa sin pérdida de actividad enzimática pero en

muy poca cantidad. Es posible que las veces de purificación hayan sido muy baja en

comparación con otros estudios debido a que la proteína presente en el extracto crudo


puede ser en su gran mayoría lacasa, en comparación con los extractos crudos usados en

los estudios reportados, donde puede haber más cantidad de compuestos a separar. Para

identificar si hay varios compuesto en el extracto a purificar, se sugiere realizar

electroforesis, donde de forma cualitativa se identifican los compuestos presentes ya sea

en el extracto crudo o en la lacasa purificada.

Tabla 3-7: Comparación de TPP de lacasas

Componente Este estudio (Kumar et

al., 2012)

(Rajeeva & Lele,

2011)

(Liu et al.,

2015)

Microorganismo Fusarium spp. Pleurotus

ostreatus Ganoderma sp.

Coriolopsis

trogii

Extracto-Ter-

butanol (v:v) 1.0:1.1 1.0:1.8 1.0:0.5 1.0:1.0

Sulfato de

amonio (%) 77.98 60 80-90 40

Temperatura (°C) 38.4 42±3 35 20

Rendimiento (%) 114.13 161 60 75

Veces de

Purificación 1.2 27.8 13.2 20

3.3. Conclusiones

Se logró realizar purificación de lacasa producida a partir de Fusarium spp por la TPP.

Mediante un Diseño Central Compuesto, se encontró que el sulfato de amonio es el factor

de mayor significancia para los experimentos desarrollados en comparación con la

temperatura y relación de extracto crudo producido y ter-butanol.

Fue posible realizar una regresión lineal cuadrática completa con interacciones tanto para

el rendimiento y las veces de purificación. Estas regresiones fueron adecuadas para los

experimentos propuestos ya que, mediante el ANOVA realizado, el modelo fue significativo

y la falta de ajuste no lo fue. La regresión propuesta para las veces de purificación tuvo

mejor capacidad de predicción que la propuesta para el rendimiento, debido a que los

coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado) encontrados para las veces de purificado

son más cercanos que los encontrados para el rendimiento.


51

Con los experimentos realizados, se encontraron condiciones para las veces de

purificación y el rendimiento máximos. Con una relación de extracto crudo-ter-butanol de

1.0:1.1, una saturación de sulfato de amonio de aproximadamente 78% y una temperatura

de 38 °C, se mejoró la actividad enzimática en 14% y la actividad específica en 20%.

Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 53

4. Acción de lacasa purificada en un material

lignocelulósico

Resumen

Con la lacasa purificada mediante TPP, se procede con la aplicación de esta lacasa a una

biomasa lignocelulósica. Para este capítulo, se realizaron caracterizaciones de un raquis

de palma, con características de material duro, es factible un pretratamiento enzimático

debido a la concentración de lignina. Con el material caracterizado, se logró realizar un

diseño central compuesto donde las variables de estudio fueron el pH y la temperatura, las

constantes fueron la cantidad de sólidos, agitación y la cantidad de enzima, y la variable

de respuesta fue la concentración de fenoles totales en la fase líquida generada. Se

encontró que a temperaturas de 58.7 °C y pH 4 se dio la máxima producción de fenoles.

Luego de encontrar el máximo de producción de fenoles, se comparó pretratamientos con

lacasa purificada y extracto crudo en el raquis. Se encontró que la lacasa purificada

removió más lignina y degradó menos celulosa. Aunque la remoción de lignina fue baja en

comparación con lo reportado en literatura. La lacasa purificada mejoró el pretratamiento

enzimático.

Introducción

El raquis de palma es uno de los principales desechos generados de la producción de

aceite de palma. Es necesario un pretratamiento para degradar la lignina, la cual inhibe la

acción de celulasas necesarias para aumentar la cantidad de celulosa disponible para otros

procesos en los que se requiera de este biopolímero.

Sabiendo que la lacasa de Fusarium spp ya cuenta con un método de separación y

purificación mediante la TPP, el objetivo de este capítulo es establecer la acción de la

lacasa purificada sobre un material lignocelulósico, en este caso el raquis de palma. Donde

se comparó la acción de esta enzima con el extracto crudo.


4.1. Metodología

4.1.1. Raquis de Palma

El raquis de palma usado fue donado por la Federación Nacional de Cultivadores de Palma

de Aceite (Fedepalma). Este material fue secado a temperatura ambiente hasta que la

humedad de la muestra fuera inferior a 10%. Luego se redujo el tamaño de partícula con

molino de cuchillas con malla 2mm y almacenado en bolsas de plástico a 23°C.

Figura 4-1: Raquis de Palma en natura. Molino con malla de 2mm. Raquis de Palma molida.

Los métodos usados para la caracterización del material lignocelulósico siguió las

metodologías del Laboratorio Nacional de Energías Renovables NREL (Hames et al.,

2008; a Sluiter et al., 2008; A. Sluiter et al., 2004) mostrados en la Tabla 4-1. La proteína

cruda se determinó mediante la técnica de Kjeldahl basado en NTC 4657, realizado por el

Laboratorio de Análisis Químico y Bromatológico de la Universidad Nacional de Colombia.

La determinación de carbohidratos, se realizó por cromatografía líquida de alta resolución

en fase reversa (HPLC). Usando la columna Aminex HPX-87H, HPX-87P marca BIORAD.


Tabla 4-1: Protocolos NREL

Procedimiento Protocolo

Preparación de muestras NREL/TP-510-42620

Determinación de humedad NREL/TP-510-42621

Determinación de cenizas NREL/TP-510-42622

Extractivos con hexano, agua y etanol NREL/TP-510-42621

Lignina soluble e insoluble NREL/TP-510-42618

Celulosa y Hemicelulosa NREL TP-510-42618

Se realizó un análisis granulométrico que se muestra en el Anexo E.


El raquis de palma caracterizado fue sometido a tratamiento con lacasas de Fusarium spp

que fueron purificadas bajo las condiciones obtenidas en el capítulo anterior. Este

tratamiento se hizo con presencia de mediador ATBS 5 mM, en baño maría a 150 rpm. Se

usó un buffer acetato con pH variable, con una carga de sólidos en base seca de 10% en

Erlenmeyer de 500 mL con un volumen de trabajo de 100 mL con una carga de enzima de

1 U/gsustrato. El tratamiento duró 24 h, tomando muestras a 1, 2, 3, 4, 5, 7 y 24 h. Luego del

tratamiento se sacó una muestra a la que se agregó NaOH al 1.5% p/v con el fin de detener

la reacción y extraer todos los compuestos fenólicos en la fase líquida generada (Piñeros

Castro, 2012). Luego de ello se deja incubando a 60°C durante 1 hora. Posterior a esto se

centrifuga a 6000 rpm y se sacó el sobrenandante para determinar los compuestos

fenólicos. Para evitar interferencias provocadas por el NaOH y otros compuestos presentes

en la fase líquida, se hicieron controles: uno sin el sustrato y otro sin la enzima.

4.1.3. Determinación de Compuestos Fenólicos

La determinación de compuestos fenólicos en la fase líquida del pretratamiento realizó

mediante el método colorimétrico Folin-Ciocalteau. Se realizó agregando 20 µL de

muestra, 1580 µL de agua desionizada, 100 µL de colorante y 300 µL de solución

carbonato de sodio, que se deja incubando a 40 °C durante 30 minutos. Luego se lee la

absorbancia del sistema en espectrofotómetro UV-VIS a 765 nm. La absorbancia obtenida

se ingresa a una curva de calibración (Anexo C) con ácido gálico (Waterhouse, 2003).


4.1.4. Diseño Experimental

Para el pretratamiento con lacasas, se realizó un diseño central compuesto, usando 4

repeticiones del punto central, donde los factores de entrada fueron el pH (4-6) y la

temperatura (30-60 °C). El factor de respuesta fue la concentración de fenoles totales

medido por Folin-Cicolteau en la fase líquida. Los análisis estadísticos se realizaron en el

software Minitab versión 16.1.0.0 de prueba, con un nivel de significancia del 5%. En la

tabla 4-2 se presentan los datos del diseño experimental.

Tabla 4-2: Diseño Experimental para el pretratamiento enzimático del raquis de palma

Factores de entrada Símbolo Unidades codificadas

- 0 +

pH A 4.0 5.0 6.0

Temperatura (°C) B 30 45 60

4.1.5. Comprobación

Luego de obtener el punto donde la concentración de fenoles totales en la fase líquida es

máximo, se realizó dos pretratamientos con las condiciones críticas de pH y temperatura,

en los cuales se diferenció el uso de lacasa purificada y extracto crudo con el objetivo de

establecer la acción de la lacasa purificada sobre el raquis de palma en comparación con

el extracto crudo. Para ello, se hizo medición de fenoles totales, proteína (Bradford) y

azucares presentes en la fase líquida, y caracterización de la fase sólida por los protocolos

de NREL.

4.2. Resultados y Discusión

4.2.1. Caracterización

La caracterización sobre el raquis de palma molido comparado con los mostrados en la

Tabla 1-7, se muestra en la Tabla 4-3. Debido a la concentración de lignina, este material

puede corroborarse que es un material duro. El contenido de celulosa obtenido en este

estudio es comparable con el reporte hecho por Lu y colaboradores (2010). La

hemicelulosa es comparable con el estudio hecho por Mora y Flórez (2016). La

composición de Lignina entra en un rango cuyos valores son los reportes propuestos por

Piñeros Castro (2012) y C. Lu y colaboradores (2010). Se observa que la cantidad de

extractivos es más alto que los reportados y la cantidad de cenizas se acerca a lo reportado


por Chin y colaboradores (2015). Según Khiari y colaboradores (2010), la mayoría de las

cenizas están compuestas de átomos de Ca, Cl, K y Na.

Tabla 4-3: Comparación de los resultados de caracterización del raquis de palma de otros reportes con este estudio.

Compuesto Este estudio (C. Lu et al., 2010)

(Piñeros Castro, 2012)

(Mora Cano & Flórez Pérez, 2016)

(Medina et al., 2016)

(Chin et al., 2015)

(Fang et al., 2015)

Celulosa (%) 42.58±0.28 42.0 37.9 30.0 28.0 39.9 38.3

Hemicelulosa (%) 33.48±0.21 30.1 26.2 33.0 24.2 27.1 20.7

Lignina (%) 15.35±0.26 14.2 22.1 22.0 29.9 24.6 24.6

Extractivos (%) 16.46±0.74 10.2 7.9 15.0

-- 9.5 --

Cenizas (%) 1.71±0.48 2.8 2.9 3.2 1.6 --

Humedad (%) 1.75±0.05 -- -- -- -- -- 3

Proteína (%) 2.7±0.0 -- -- -- 3.36 -- --

Total (%) 109.58±2.02 99.3 97.0 100.0 88.7 102.51 86.6


Los resultados del Diseño Central Compuesto se muestran en la Figura 4-2. Se observó

que a partir de las 5 horas no se dan cambios significativos en los fenoles totales, los cuales

se verificaron con prueba de diferencia significativamente honesta (ver Anexo D). Se

determinó que 5 horas es el tiempo donde se maximiza el pretratamiento enzimático.

Además que la mayor cantidad de fenoles producidos se generó a temperaturas de 55.6°C

y pH de 4.3, comparado con 34.4 °C y pH 4.3 que es un punto donde se generaron bajas

concentraciones. Inicialmente, los pretratamientos obtuvieron la mayor cantidad de fenoles

al usar pH bajos y temperaturas altas. También es necesario un control del sustrato.


Figura 4-2: Resultados del Diseño Central Compuesto para el Pretratamiento enzimático

Los resultados experimentales fueron ajustados a una ecuación de segundo grado

completo con interacciones. La ecuación (4-1) representa el modelo encontrado para la

cantidad de fenoles totales obtenidos en la fase líquida. La tabla 4-4 muestra el análisis de

varianza (ANOVA) hecho sobre el modelo propuesto en las ecuaciones obtenidas de la

regresión. Esta tabla indica que todos los factores evaluados afectaron de forma

significativa la formación de fenoles totales. Sin embargo, la relación entre factores no fue

significativa, lo que indica que un cambio de pH hizo cambios significativos sobre los

fenoles obtenidos pero sin ser afectado por los cambios de temperatura y viceversa. En

general, para el pretratamiento enzimático de raquis de palma con lacasa purificada fue

importante la temperatura del sistema y el pH al cual está el medio.

Fenoles (mg/L)=315.742 -134.867*A+7.16907*B+11.5815*A2 -0.0634622*B2+0.0713172*A*B (4-1)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 1 2 3 4 5 6 7

Fe

no

les T

ota

les (

mg

/L)

Tiempo (horas)

T=45.0 °C pH=5.0 T=45.0 °C pH=4.0 T=34.4 °C pH=5.7

T=55.6 °C pH=4.3 T=45.0 °C pH=6.0 T=34.4 °C pH=4.3

T=60.0 °C pH=5.0 T=30.0 °C pH=5.0 T=55.6 °C pH=5.7


Tabla 4-4: ANOVA de los fenoles totales obtenidos en la fase líquida del pretratamiento enzimático.

Factor Valor p

Modelo 0.000

A- pH 0.001

B-Temperatura 0.000

A2 0.019

B2 0.043

A*B 0.868

Falta de Ajuste 0.429

R2 94.53%

R2 Ajustado 90.63%

Adicionalmente, en la Tabla 4-4 se observa que el valor p del modelo dio menor que el

nivel de significancia (α=0.05) y la falta de ajuste dio mayor que α. Lo que indica que la

regresión propuesta es adecuada para los experimentos propuestos. Al revisar los

coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado), se observa que hay cercanía entre estos

parámetros, además que son valores por encima del 90%, lo que indica que el modelo

propuesto tiene un poder de predicción mayor al 90%.

En Figura 4-3 se muestra los cambios de los fenoles producidos con base en las

condiciones del experimento y la regresión hecha como gráficas de superficie y de

contorno. Se observó que los valores en los que la respuesta tiene valores máximos fueron

cuando la temperatura se acerca a su límite superior, mientras que el pH maximiza la

respuesta cuando sus valores son cercanos al límite inferior.

Figura 4-3: Relación del pH y la Temperatura con los Fenoles Totales


El valor máximo predicho para los fenoles totales basado en el modelo de regresión

calculado (ecuación (4-1)) fue calculado y se muestra en la Tabla 4-5. Debido a que el pH

donde se maximiza la producción de fenoles dio en el extremo inferior, fue necesario

comprobar los valores obtenidos variando el pH a un valor menor. Para este estudio se

comprobó el máximo comparando el pH con otro experimento donde este factor vale 3.8.

Al comparar los valores experimentales del máximo obtenido y la comprobación, se

observó que no hay diferencias significativas. Además, el máximo teórico y el máximo

experimental se interceptan, lo que indica que no hay diferencias significativas.

Tabla 4-5: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión para fenoles totales

Factor Valor Comprobación

pH 4.0 3.8

Temperatura (°C) 58.7029 58.7029

Fenoles Totales Teórico (mg/L) 180.477±8.497 --

Fenoles Totales Experimentales (mg/L) 174.527±6.982 177.938±16.139

4.2.3. Comprobación

Al realizar un pretratamiento con extracto crudo y compararlo con la lacasa purificada, se

realizó un balance de masa mostrado en la Tabla 4-6. Como se observó en la tabla, los

balances tuvieron errores que no superaron el 1%, por lo que no hubo pérdidas apreciables

de masa. Si bien aumentó la concentración de celulosa en la biomasa pretratada, hay parte

de la celulosa inicial que en el pretratamiento se convirtió en glucosa y va a la fase líquida.

Según Haghighi Mood y colaboradores (2013), las estructuras de las biomasas

lignocelulósicas tienen estructuras complejas y reacias, donde la lignina se entrelaza con

la celulosa y la hemicelulosa, por lo que puede haber rompimientos de fracciones de estos

polisacáridos. Sin embargo, el pretratamiento con lacasa purificada removió menos

celulosa que el realizado con extracto crudo, lo que indica que la purificación con TPP

realizado en el capítulo 3 aumento la disponibilidad de celulosa.

La lignina removida por el pretratamiento con lacasa purificada fue mayor que el

pretratamiento con extracto crudo. Esto significa que la purificación aumentó la capacidad

catalítica que tiene la lacasa en el pretratamiento, pero esta capacidad de remoción fue


muy poca comparado con otros reportes mostrados en la Tabla 1-6. La cantidad de fenoles

formados en el líquido no correspondieron a la cantidad de lignina degradada, esto pudo

pasar por la formación de nuevos polímero en la fase líquida (Munk et al., 2015). Debido a

la reducción de lignina y azúcares en la biomasa, compuestos como cenizas y extractivos

aumentaron.

Tabla 4-6: Comparación pretratamiento con lacasa purificada y extracto crudo.

Compuesto Biomasa inicial Biomasa pretratada (Lacasa Purificada)

Biomasa pretratada (Extracto Crudo)

Fase sólida (g) 12.00±0.00 10.01±0.09 8.82±1.08

Celulosa (%) 42.58±0.28 32.60±0.11 32.65±0.72

Hemicelulosa (%) 33.48±0.21 40.14±0.32 45.55±0.29

Lignina (%) 15.35±0.26 19.84±1.25 24.09±1.99

Extractivos (%) 16.46±0.74 20.07±1.62 18.17±0.82

Cenizas (%) 1.71±0.48 1.27±0.07 1.01±0.05

Proteína (%) 2.7±0.0 2.5 <2.5

Fase líquida (g) 100.28±0.25 g 102.70±0.49 103.06±1.13

Fenoles Totales (mg/L) -- 174.53±6.98 160.36±3.86

Proteína (mg/L) 7.16±0.801

87.45±15.75 37.33±3.94 6.24±0.702

Glucosa (%) -- 0.73±0.06 1.02±0.06

Xilosa (%) -- 0.00±0.00 0.00±0.00

Error del Balance (%) -- 0.58±0.38 0.55±0.37

Remoción de Lignina (%) -- 14.83 8.82

La baja capacidad de remoción pudo darse por varias razones:

Como se había dicho en el capítulo anterior el extracto tiene poca proteína, por lo que

hay poca lacasa, que puede haberse inhibido por exceso de sustrato.

Según Munk y colaboradores (2015), es posible que se haya dado la polimerización de

los monolignoles, generando estructuras secundarias que se forma simultáneamente

al rompimiento de la lignina presente.

Debido a la complicada estructura que puede tener la lignina, es posible que a la lacasa

le cueste degradar este biopolímero.

1 Proteína inicial en extracto crudo 2 Proteína inicial en lacasa purificada


4.3. Conclusiones

La biomasa tratada en este capítulo fue un material adecuado para realizar pretratamientos

debido a los contenidos de lignina. Al ser una madera dura es posible realizar

pretratamientos enzimáticos con menor esfuerzo y entregar un material libre de lignina.

Se logró obtener una regresión que explica más del 90% de la formación de fenoles a

partir de un pretratamiento con variaciones en el pH y la temperatura. Mediante este

modelo, se obtuvo un punto donde se maximizó la cantidad de fenoles presentes en la fase

líquida resultante del pretratamiento 175 mg/L de fenoles a partir de un pretratamiento con

pH 4 y temperatura de 58 °C.

Aunque los pretratamientos enzimáticos no tienen la misma capacidad de remoción que

los reportados en literatura, la lacasa purificada logró aumentar la remoción de lignina en

41%, en comparación con el pretratamiento con extracto crudo. Además redujo la cantidad

de azúcares presentes en la fase líquida resultante en 40%.

Conclusiones 63

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1. Conclusiones

Fue posible encontrar un método de separación y purificación como la TPP que

aumente la actividad enzimática de lacasa y concentre las proteínas con la posibilidad

de aplicación en métodos de pretratamientos enzimáticos.

Se encontró que la TPP de lacasa de Fusarium spp maximiza su separación y

purificación cuando la relación de extracto crudo-ter-butanol es 1.0:1.1, la saturación

de sulfato de amonio es aproximadamente 78% y la temperatura 38 °C. Con esas

condiciones maximizadas se obtiene un rendimiento de 115% y veces de purificación

de 1.25 veces.

El raquis de palma, al ser un material lignocelulósico duro, tuvo la suficiente

concentración de lignina para considerarse en los pretratamientos enzimáticos con

lacasa.

Fue posible maximizar los fenoles totales producidos por el pretratamiento, ajustando

el pH a 4 y la temperatura a 58.7 °C.

La lacasa purificada mejoró el pretratamiento enzimático en 40% comparado con el

pretratamiento realizado con extracto crudo.

5.2. Recomendaciones

Con la necesidad de identificar completamente el microorganismo productor y la lacasa

producida, es necesario identificar las rutas metabólicas y biología molecular del

Fusarium spp, con los que se identifiquen otros compuestos producidos en el extracto

crudo.

Es necesario realizar electroforesis, con los que se evalué de forma cualitativa la

proporción de la lacasa con respecto a otros compuestos.


Al mejorar la remoción de lignina con extracto purificado, es importante analizar las

estructuras que quedan luego del pretratamiento. Según Moilanen y colaboradores

(2011) es posible que los pretratamientos enzimáticos mejoren o empeoren la hidrólisis

con celulasas por esos cambios de estructura.

Anexos 65

Anexos

Anexo A. Curva de Calibración de Proteínas.

Figura A—1: Curva de calibración obtenida para proteínas medido por Bradford.

Para la Figura A—1, se tiene la ecuación (A—1), con un coeficiente de determinación (R2)

de 98.22%.

Absorbancia=-0.0070+1.4156*Proteína (mg

L) (A-1)

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 200 400 600 800 1000

Ab

so

rban

cia

Concentración de Proteína (mg/L)

Anexos 67

Anexo B. Determinación pH para TPP.

Para verificar el pH del buffer usado en la fase intermedia se establecieron condiciones de

literatura (Vaidyanathan Vinoth Kumar et al., 2011; Liu et al., 2015; Rajeeva & Lele, 2011).

Las respuestas generadas se compararon mediante una prueba de diferencia

significativamente honesta.

Condiciones

Factores estables: Temperatura (40°C), relación de extracto crudo a t-butanol

(1.00:1.00 v:v), Saturación de (NH4)2SO4 (60% w/v), buffer fosfato

Factores variables: pH (6, 7, 8).

Factores de respuesta: Rendimiento, Veces de purificación.

Resultados

Figura B- 3. Cambios del rendimiento variando el pH en sistema TPP.

0

20

40

60

80

100

120

pH6 pH7 pH8

Ren

dim

ien

to (

%)


Figura B- 4. Cambios de las veces de purificación variando el pH en sistema TPP.

Tabla B- 1. Grupos generados por el análisis de diferencia de significativamente honesta.

pH Grupo

7 A

6 B

8 B

Según las figuras B-1 y B-2, el pH que genera mejores resultados es el pH 7 el cual es un

pH neutro. Al realizar el análisis de diferencia de significativamente honesta, se genera la

Tabla B-1, en la que se corrobora que los resultados a pH 7 son significativamente distinto

y genera resultados mayores que los otros pH. Estos resultados corroboran que el proceso

busca la estabilidad estructural de la lacasa (Gagaoua & Hafid, 2016; Rachana & Lyju Jose,

2014).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

pH6 pH7 pH8

Fo

ld P

uri

fic

ati

on

Anexos 69

Anexo C. Curva de Calibración de Fenoles Totales por Folin-

Ciocalteau.

Figura C- 1: Curva de calibración obtenida para fenoles totales por Folin-Ciocalteau.

Para la Figura C-1, se tiene la ecuación (C-1), con un coeficiente de determinación (R2) de

99.93%.

Absorbancia= -0.0008+0.0011*Fenoles (mg

L) (C-1)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 100 200 300 400 500

Ab

so

rban

cia

Concentración (mg/L)

Anexos 71

Anexo D. Prueba de Diferencia Significativamente Honesta para el

tiempo de pretratamiento.

Realizando las pruebas con α=0.05, se obtuvo un valor P de 0.000, por lo que hay

diferencias significativas. Se obtuvieron los siguientes grupos.

Tabla D- 1. Grupos formados a 45°C y pH 4

Tiempo (h) Grupo

5 A

24 A

7 A

4 B

3 B

2 C

1 C

Tabla D- 2. Grupos formados a 34.4°C y pH 5.7

Tabla D- 3. Grupos formados a 55.6°C y pH 4.3

Tiempo (h) Grupo

7 A

24 A

5 A

4 B

3 B

2 C

1 C

Tiempo (h) Grupo

4 A

7 A

24 A

5 A

3 A

2 A

1 B


Tabla D- 4. Grupos formados a 55.6 °C y pH 5.7

Tabla D- 5. Grupos formados a 45 °C y pH 6

Tabla D- 6. Grupos formados a 34.4 °C y pH 5.7


Tiempo (h) Grupo

24 A

5 A

7 A

4 B

3 B

2 B

1 C

Tiempo (h) Grupo

5 A

24 A

7 A

4 B

3 B C

2 C D

1 D

Tiempo (h) Grupo

5 A

24 A B

7 B

4 C

3 D

2 E

1 F

Tiempo (h) Grupo

24 A

4 A

3 A

5 A

7 A B

2 B

1 C

Anexos 73



Como se observó en las tablas D-1 a D-9, el pretratamiento tenía diferencias significativas

hasta las 5 horas, a partir de allí no había diferencias. Se determinó que el tiempo donde

se da la mayor cantidad de fenoles fue a las 5 horas.

Tiempo (h) Grupo

7 A

5 A

24 B

4 B

3 B C

2 C D

1 D

Tiempo (h) Grupo

24 A

5 A B

7 A B

4 B

3 C

2 C D

1 D

Anexos 75

Anexo E. Análisis Granulométrico del Raquis de Palma.

Para hacer el análisis granulométrico del Raquis de palma, se usaron tamices tipo Pinzuar

referencia Sieve Test. Los tamices usados se registran en la Tabla E-1.

Tabla E- 2. Número de tamiz y diámetro.

Número de Tamiz Diámetro (micrómetros)

18 1000

20 850

35 500

40 425

70 212

80 180

100 150

200 75

Para calcular la biomasa retenida por cada tamiz se usó la ecuación (E-1)

Xi(%)=Mi

MT

(E-1)

Donde Xi es el porcentaje de biomasa retenida en el tamiz i, Mi es la cantidad de biomasa

retenida en el tamiz i y MT es la cantidad de biomasa total.

Los análisis granulométricos diferencial y acumulado se muestras en las Figuras E-1 y E-

2 respectivamente. Se observa que aproximadamente el 90% del raquis de palma

trabajado en los pretratamientos tiene un tamaño de partícula entre 0.2 y 1 mm de

diámetro. Además, se concluye que es posible realizar los procesos de caracterización

según NREL, ya que aproximadamente el 71% de la biomasa tiene un tamaño de partícula

entre 0.85 mm y 0.18 mm que son los tamaños requeridos para este procedimiento, lo cual

representa una amplia mayoría de la biomasa usada en los pretratamientos enzimáticos.


Figura E- 3. Análisis granulométrico diferencial.

Figura E- 4. Análisis granulométrico acumulativo.

0

5

10

15

20

25

30

1 0.85 0.5 0.425 0.212 0.18 0.15 0.075

Re

ten

ció

n (

%)

Diámetro (mm)

0

20

40

60

80

100

1 0.85 0.5 0.425 0.212 0.18 0.15 0.075

Re

ten

ció

n (

%)

Diámetro (mm)

Anexos 77

Anexo F. Resultados de proteína cruda (Kjeldahl).

Referencias 79

Referencias

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