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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
“EVALUACIÓN DEL ZOOPLANCTON COMO VECTOR DEL VIRUS
DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)”
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE:
BIOLOGO MARINO
PRESENTA:
SUSANA BERENICE TERÁN DÍAZ
DIRECTOR:
M. EN C. JOSÉ FERNANDO MENDOZA CANO
LA PAZ, B.C.S. NOVIEMBRE DE 2012
CONTENIDO Página
RESUMEN……………..……………………………………………………………………i
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………………ii
1. INTRODUCCION……………….………………………………………………………1
2. ANTECEDENTES………………………………………………………………………3
3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………13
4. AREA DE ESTUDIO……….…………………………………………………………14
5. HIPÓTESIS..……………..……………………………………………………………16
6. OBJETIVOS.………..…………………………………………………………………17
7. METODOLOGÍA
Colecta de organismos…………………………………………………………….……18
Preparación del inoculo viral……………………………………………………………18
Inoculación experimental en zooplancton…………………………………………..…19
Inoculación viral experimental de Palaemon……………………………………….…19
Inoculación viral experimental de Lysmata……………………………………………20
Extracción de ARN………………………………………………………………………20
Eliminación de ADN genómico contaminante…………………...……………………21
Cuantificación y determinación de pureza del ARN total……………………………21
Detección de ADN genómico contaminante……………………………..……………21
Síntesis de cDNA y detección de VP28…………………………………………….…22
Identificación morfológica y molecular…………………………………………………22
Análisis de secuencias………………………………………………………..…………23
7. RESUTADOS.
Identificación molecular…………………………………………………………………24
Detección de WSSV en organismos colectados………………………………..……27
Detección de ADN genómico contaminante………………………………..…………29
Infección experimental en Calanus pacificus californicus…………………...………30
Infección experimental en Palaemon ritteri……………………………………………32
Infección experimental en Lysmata califórnica…………………………….…………33
8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………34
9. CONCUSIONES………………………………………………………………………40
10. RECOMENDACIONES……………………………………………………………..41
11.LITERATURA CITADA …………………………………………………………...…42
DedicatoriaA Dios por brindarme salud y por permitirme llegar a esta etapa tan importante en mi vida.
A mis padres Jesús y Susana, por su incondicional apoyo, por quererme tanto, y aguantarme. Todo este trabajo ha sido posible gracias a ellos.
A mis hermanos, Tito, Caleb, Diana y Dan, por hacerme reír todo el tiempo y por estar siempre conmigo.
A mi esposo Adrián, por brindarme su apoyo y confianza, por quererme tal como soy.
Agradecimientos
Agradezco al CIBNOR, que me brindó conocimientos y que me ayudo para el desarrollo de mi tesis.
Agradezco de manera especial a mi director de tesis Fernando Mendoza Cano, gracias por toda su paciencia, esfuerzo y dedicación.
Al Dr. Jorge Hernández López y al Dr. Arturo Sánchez, que me brindaron su sabiduría.
A todos los integrantes del CIBNOR Campus Hermosillo, que me brindaron su ayuda.
A mis maestros y revisores de tesis, gracias por su disponibilidad y paciencia.
RESUMEN
El Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha ocasionado cuantiosas
pérdidas económicas a la industria del cultivo de camarón. Este virus se describió
por primera ocasión en Taiwán en 1992, y aparentemente fue introducido a
Estados Unidos en 1995 a través de la importación de camarón congelado.
Aunque el WSSV infecta una amplia gama de crustáceos, la identificación de
especies susceptibles a la infección por este virus permitirá prevenir o limitar su
dispersión. En base a lo anterior, mediante la infección experimental con WSSV,
se determinó la susceptibilidad del copépodo Calanus pacificus californicus
(principal componente encontrado en el zooplancton), Lysmata californica y
Palaemon ritteri a WSSV. Los resultados demuestran que el WSSV posee la
capacidad de infectar y replicarse en copépodos, L. californica y P. ritteri, esto
basado en la detección de transcritos para VP28 a partir de las 48 horas post
infección. En conclusión, los resultados demuestran la susceptibilidad del
copépodo C. pacificus californicus, los organismos L. californica y P. ritteri a la
infección con WSSV, colocando estos organismos en la lista de vectores
potenciales de este virus.
i
LISTA DE FIGURAS PÁGINAS
Figura 1.- Morfología de la partícula viral de WSSV…………………………………..6
Figura 2. Área de Estudio, Bahía de Kino, Sonora, Colecta de organismos (A)….15
Figura 3. Electroforesis del fragmento 16s, de los organismos colectados, Marcador de peso molecular (M), L. californica (L), P. ritteri (P) y Copépodos (C)………………………………………………………………………………..………..24
Figura 4. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos colectados pertenecientes a la clase copépoda (A) y (B) Calanus pacificus californicus (GenBank: AF295333.1) Los puntos similitud entre secuencias. * indica inserción de nucleótido……………………………………………………………………………..25
Figura 5. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos palemonidos colectados (A) y Palaemon ritteri (B) (No. GenBank JF491341.1). Los puntos indican similitud entre secuencias……………………………………………………..26
Figura 6. Análisis de la secuencia obtenida de los organismos del género Lysmata colectados (A) y Lysmata californica (B) (GenBank: HQ315596.1) Los puntos indican similitud entre secuencias……………………………………………………..27
Figura 7. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección del transcrito para VP28 en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L)…………..…………………………..28
Figura 8. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección de ADN contaminante en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L)………………………………………30
Figura 9. Análisis de disociación de fragmentos generados por qPCR para la detección de transcritos para VP28 en las muestras colectadas de C. pacificus californicus, 24 horas (A), 48 horas (B) y 84 horas (C)……………………………...31
Figura 10. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección de ARNm en las muestras colectada de P. ritteri, 24 horas (A), 48 horas (B) y 72 horas (C)………………………………………………………………………..32
Figura 11. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección de VP28 en las muestras de L. californica, 0 (A), 72 (B) y 48 hpi (C)…33
Tabla I. Hospederos de WSSV infectados experimentalmente o de forma natural..8
ii
INTRODUCCIÓN
La acuicultura es una actividad que genera alimentos e ingresos a numerosos
países del mundo. Esta actividad aporta beneficios sociales debido a que la pesca
ha dejado de crecer desde los años 80´s y ha alcanzado su máximo rendimiento
sostenible (FAO., 2010).
El camarón es un crustáceo de gran importancia económica, es el producto
pesquero más solicitado del mundo. Cada año se capturan 3.5 millones de
toneladas métricas (TM) y se producen 2.4 millones TM mediante pesca y
acuicultura respectivamente (FAO, 2010). Aunque existen diversos tipos de
camarones de interés comercial que han sido cultivados alrededor del mundo
(Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus californiensis, Feneropenaeus indicus,
Penaeus monodon y L. vannamei), desde hace más de una década en México L.
vannamei (camarón blanco del Pacifico) es la única especie de peneido producida
mediante acuicultura, esto debido a sus cualidades zootécnicas (crecimiento,
resistencia a enfermedades, fecundidad y adaptabilidad) (Cifuentes., 1999).
Actualmente, los principales estados productores de camarón mediante
acuicultura son Sinaloa, Sonora y Nayarit. La camaronicultura en México es la
actividad pecuaria de mayor crecimiento durante los últimos diez años y ha
aumentado de 23,000 a 142,170 TM en el periodo 2000-2009 (CONAPESCA
2009), la región Noroeste del país (Sinaloa y Sonora) aportan el 80% del total de
la producción. Aunque los datos antes mencionados demuestran el éxito de esta
1
actividad, es fundamental enfatizar que el rápido desarrollo de esta industria, y la
intensidad con la que se realiza, han tenido como consecuencia la aparición de
enfermedades exóticas o endémicas (Lightner 2011). Durante el desarrollo de la
camaronicultura se han manifestado diversas enfermedades producidas por
hongos, bacterias y virus (Morales y Cuellar 2008), siendo estas últimas las más
devastadoras. La producción en Sonora durante los ciclos 2008-09 fue en
promedio de 81,000 TM, sin embargo, en el ciclo 2010-11 esta producción se
redujo un 60%, debido a la presencia del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca
(WSSV, por sus siglas en inglés) (COSAES 2011). Actualmente no se disponen
tratamientos contra este virus (Morales y Cuellar 2008), sin embargo, la filtración
del agua que ingresa a los sistemas de cultivo, empleo de organismos libres de
patógenos específicos y la eliminación de vectores, son estrategias que reducen el
riesgo de entrada de este patógeno (Lightner & Redman 1998)
La producción de camarón en México se realiza en ambientes cerrados y abiertos.
El primero de ellos (cerrado) es llevado a cabo en los laboratorios de producción
de larvas, en donde el abastecimiento de agua, alimento y organismos
reproductores en la mayoría de las instalaciones se emplean estrictos controles
sanitarios. Por otro lado, una vez que las postlarvas son introducidas a los
estanques de engorda, son sometidas a un ambiente abierto en donde los
organismos en cultivo comparten ambiente con diversos crustáceos (jaibas,
2
cangrejos y camarones silvestres), fitoplancton (microalgas) y zooplancton
(copépodos y rotíferos) (OIE 2003).
ANTECEDENTES
Con el aumento de la camaronicultura se han manifestado enfermedades
infecciosas, las cuales son causadas por hongos, parásitos, bacterias y virus
(Morales y Cuellar 2008). Cuatro pandemias de virus han afectado negativamente
a la industria mundial de camarones desde 1980. El Virus de la Necrosis
Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV), Virus de la Cabeza Amarilla
(YHV), Virus del Síndrome de Taura (TSV), y el Virus del Síndrome de Mancha
Blanca (WSSV) ( Lightner 2003).
Enfermedades virales del camarón:
El Virus de Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV), es el
más pequeño de los virus conocidos en peneidos, tiene un diámetro de 22 nm
(nanómetros), sin envoltura, con cadena sencilla de ADN, y su cápside se
compone de cuatro polipéptidos, infecta casi todos los órganos y tejidos del
camarón (Morales 2004) se ha sido clasificado como un miembro de la Familia
Parvoviridae y un miembro del género Brevidensovirus (Gómez- Gill et al.,2001)
Este virus fue detectado en 1981en Hawái, en juveniles de P. stylirostris, donde ha
causado mortalidades por arriba del 90% (Tang y Lightner 2001). La mayoría de
las especies de peneidos pueden resultar infectadas con IHHNV, incluyendo las
3
principales especies cultivadas, P. monodon, L. vannamei y L. stylirostris. La
infección por IHHNV en el camarón azul del Pacífico (L. stylirostris), se caracteriza
por causar epizootias aguda y mortalidades masivas (> 90%), en L. vannamei
produce como enfermedad crónica el “síndrome de la deformidad y del enanismo”
(RDS) donde los principales efectos son un crecimiento reducido e irregular y
deformidades cuticulares (Lightner, 2002).
El Virus de la Cabeza Amarilla (YHV), es un virus de ARN de cadena sencilla, de
forma cilíndrica y varia en tamaño en un rango de 150 nm a 200 nm de longitud
por 40 nm a 50 nm de ancho, posee envoltura, pertenece a la familia Roniviridae
(OIE. 2003) Contiene tres proteínas estructurales presentes en los viriones en
abundancia relativamente iguales, gp 116, gp 64 y p20 (Perlman el al., 2008) se
inactiva por calentamiento a 60 °C durante 15-30 minutos, pero puede sobrevivir
en temperaturas que oscilan entre los 25-28 °C en agua de mar al menos cuatro
días (King et al., 2011). Los camarones infectados pueden mostrar una coloración
amarillenta en el cefalotórax y en hepatopáncreas, y branquias blanquecinas
(Morales y Cuellar 2008). Este virus fue reportado por primera vez al estar
asociado con mortalidades masivas de P. monodon cultivados en Tailandia en
1990 (Walker y Subasinghe 2000), pero se ha demostrado experimentalmente
que puede causar infecciones en otros camarones peneidos (L. vannamei, L.
stylirostris, P. setiferus, P. aztecus y P. duorarum), sin embargo las postlarvas de
P. merguensis no presentan ningún signo de la enfermedad (Morales y Cuellar
2008).
4
El Virus Del Síndrome De Taura (TSV), fue identificado en 1992 en granjas del río
Taura, en Ecuador y posteriormente se esparció en América Latina y en la
actualidad ha sido detectado en P. vannamei en cultivos de China (FAO 2005).
Es un virus pequeño, consiste en una cadena sencilla de ARN de 9 kb (Gómez-
Gill et al., 2001). Se ubica taxonómicamente como un miembro del género
Cripavirus de la familia Dicistroviridae. (Mayo 2002). La mortalidad causada en L.
vannamei, por el TSV han oscilado entre 40 a 90% en poblaciones cultivadas de
postlarvas, juvenil y sub-adulto (Lightner 1996). Provoca lesiones severas en las
células del epitelio del estomago, cuticular y de las branquias. En América latina
este virus causó serias pérdidas en los ingresos de la década de los 90s, de 1-
1,3 miles de millones de dólares EE.UU y en 1992, Ecuador representó una
pérdida de hasta 400 millones de dólares EE.UU (FAO, 2005)
El Virus del Síndrome de La Mancha Blanca (WSSV), fue detectado por primera
vez en Taiwán en 1992, posteriormente se extendió a Japón y casi a todos los
países asiáticos. El primer caso de WSSV en América ocurrió en 1995 en una
granja de camarón al sur de Texas (Hasson et al., 2006). Los camarones
infectados con WSSV desarrollan calcificaciones (manchas blancas) que van
desde 0.5 hasta 3.0 mm de diámetro en el exoesqueleto, apéndices y dentro de la
epidermis. Desde su aparición en 1992, el agente causal de esta enfermedad viral
ha sido nombrado en varias maneras, pero se convirtió en una nueva familia
llamada Nimaviridae (del género Whispovirus).
5
Las partículas virales de WSSV son de forma ovoide o bacilar con un diámetro de
70-167 y 210-420 nm de longitud, La envoltura viral es de 6-7 nm de espesor, la
nucleocápside está compuesta por subunidades globulares de proteína de 10 nm
de diámetro, con 14-15 estrías verticales situadas cada 22 nm, dándole una
apariencia estriada (Figura 1) (Escobedo-Bonilla et al., 2008 y Sánchez-Paz
2010).
Figura 1.- Morfología de la partícula viral de WSSV (Sánchez-Paz 2010).
El genoma del virus es una molécula de doble cadena de ADN circular de
aproximadamente 300 kilobases (kb). Se han encontrado diferencias de 14 kb en
los genomas de Tailandia, China y Taiwán (Sánchez-Paz 2010). El virus es viable
por lo menos a 30 días a 30 °C en agua de mar y en condiciones de laboratorio de
6
3-4 días, tiene un ciclo de replicación aproximadamente de 20 horas a 25°C
(Chang et al., 1998), se distribuye a lo largo de Asia oriental, sudoriental y
meridional, Norte, Sur y Centro América, y recientemente se han reportado brotes
en Europa (EFSA 2007).
El virus WSSV recibe su nombre, debido a que la infección puede inducir la
disfunción del tegumento que resulta en la acumulación de sales de calcio dentro
de la cutícula y dando lugar a manchas blancas. Otros signos de la enfermedad
son: cambio de coloración a rojo en el cuerpo y apéndices, provocada por la
expansión de los cromatóforos, letargo y reducción en el consumo de alimentos
(Escobedo-Bonilla et al., 2008 y Sánchez-Paz 2010).
Se han determinado más de 40 proteínas para el virus WSSV. Por lo menos 38
proteínas estructurales se han situado en el virión, de las cuales 21 forman parte
de la envoltura viral, 10 se han ubicado como componentes de la nucleocápside y
cinco en el tegumento (una estructura situada entre la envoltura y la nucleocápside
(Escobedo-Bonilla et al., 2008). Las proteínas del virus son importantes ya que
estas son las primeras moléculas que interactúan con el huésped (Tsai et al.,
2006). Las más abundantes de la envoltura viral del WSSV son la VP28 y la VP26,
lo que representa aproximadamente el 60%. Diversos estudios resaltan el
importante papel de la proteína VP28, puesto que se ha sugerido que interviene
como una proteína de unión del virus a las células del camarón, además de
ayudarle a introducirse en el citoplasma. La proteína VP26 puede ayudar al WSSV
7
a moverse hacia el núcleo mediante la interacción con la actina (Sánchez-Paz
2010).
Se han enlistado al menos 93 vectores u hospederos de WSSV (Tabla. I) que
incluyen camarones peneidos, langostas, jaibas, cangrejos, langostinos,
poliquetos, copépodos y rotíferos (Sánchez-Paz 2010). Además, se ha reportado
la adhesión del WSSV a microalgas y es transportado por el zooplancton en la
columna de agua, pero deben contener suficiente virus para inducir una infección
en el camarón, (Esparza et al., 2009). Un estudio realizado con Artemia sp.,
sugiere la posibilidad de que este organismo puede ser un vector del WSSV
(Zhang et al., 2009), al igual que el copépodo Nitocra sp. (Zhang et al., 2007).
Resultados similares se han reportado con el rotífero Brachionus urceus (Zhang et
al., 2006). Actualmente se reconoce que los organismos del plancton pueden ser
portadores del WSSV, y se ha demostrado que tiene la capacidad de replicarse en
el copépodo Apocyclops royi, en el cual encontraron los genes tempranos ie1 y los
genes tardíos vp664 y VP28 (Chang et al., 2011).
Tabla I. Hospederos de WSSV infectados experimentalmente o de forma natural.
(tomado de Sánchez-Paz, 2010.)
Orden Familia Especie Tipo de infecciónAnostraca Artemiidae Artemia sp. E
A. franciscana ECalanoida Pseudodiaptomidae Schmackeria dubia NDecapoda Alpheidae Alpheus brevicristatus N
A. lobidens N
8
Decapoda Astacidae Astacus astacus EA. leptodactylus EPacifastacus leniusculus E
Decápoda Calappidae Calappa lophos EC. philargius E
Decápoda Callianassidae Callianassa sp NDecápoda Cancridae Cancer pagurus EDecápoda Cambaridae Orconectes limosus E
O. punctimanus NProcambarus clarkii E
Decápoda Dorippidae Paradorippe granulata EDecápoda Eriphiidae Menippe rumphii EDecápoda Grapsidae Grapsus albolineatus E
Metopograpsus messor E y NDecápoda Leucosiidae Philyra syndactyla EDecápoda Lithodidae Lithodes maja EDecápoda Majidae Doclea hybrida EDecápoda Matutidae Matuta miersi N
M. planipes NDecápoda Ocypodidae Gelasimus marionis nitidu N
Macrophthalmus sulcatus NUca pugilator E
Decápoda Palaemonidae Exopalaemon orientis EMacrobrachium idella EM. lamarrei EM. rosenbergii E y NPalaemon adspersus E
Decápoda Palinuridae Panulirus homarus EP. longipes EP. ornatus EP. penicillatus EP. polyphagus EP. versicolor E
Decápoda Parastacidae Cherax destructor albidus EC. quadricarinatus E
Decápoda Parathelphusidae Parathelphusa hydrodomous EP. pulvinata E
Decápoda Parthenopidae Parthenope prensor EDecápoda Penaeideae Metapenaeus brevicornis E
M. dobsoni E y NM. ensis E y N
M. lysianassa NM. monoceros E
Parapeneopsis stylifera N
9
Penaeus aztecus E y NP. chinensis E y NP. duorarum E y N
P. indicus E y NP. japonicus E y N
P. merguiensis NP. monodon E y N
P. penicillatus E y NP. schmitti E
P. semisulcatus E y NP. setiferus E y N
P. stylirostris E y NP. vannamei E y N
Trachypenaeus curvirostris EDecápoda Portunidae Callinectes arcuatus N
C. sapidus NCarcinus maenas E
Charybdis annulata NCh. cruciata N
Ch. granulata ECh. feriatus NCh. japonica NCh. lucifera E y NCh. natator E
Liocarcinus depurator ELio. puber E
Podophthalmus vigil EPortunus pelagicus E y NP. sanguinolentus E y N
Scylla serrata E y NS. tranquebarica EThalamita danae N
Decápoda Scyllaridae Scyllarus arctus EDecápoda Sergestidae Acetes sp. E y NDecápoda Sesarmidae Sesarma oceanica NDecápoda Solenoceridae Solenocera indica NDecápoda Varunidae Helice tridens N
Pseudograpsus intermedius NDecápoda Xanthidae Atergatis integerrimus E
Demania splendida EHalimede ochtodes E
Liagore rubromaculata EDiptera Ephydridae Ephydrida sp N
Stomatopod Squillidae Squilla mantis N
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aEunicida Eunicidae Marphysa gravelyi NPloimida Brachionidae Brachionus urceus N
N (infección natural) E (Infección experimental)
En Sonora y Sinaloa, cerca de las zonas de cultivo, se han encontrado organismos
silvestres con la presencia del WSSV, sin embargo no se conoce si su replicación
se lleva a cabo en estos hospederos ya que la incidencia del virus aumenta con el
brote de las granjas y disminuye al terminar el ciclo de cultivo (Mañon-Rios et al.,
2010).
Los virus, al carecer de mecanismos para su propia replicación, utilizan enzimas y
precursores de la célula hospedero. Para que se lleve a cabo el proceso de
infección viral ocurren una serie de eventos que inician con la adhesión y
penetración de la partícula viral hacia el interior de la célula, y continua con el
ingreso de la partícula viral al núcleo en donde se inicia el proceso de transcripción
de los ARNm virales, (molécula sirve como molde para la síntesis de proteínas
virales). A partir de la transcripción los virus requieren de algunos orgánelos
celulares para traducir el ARNm en proteínas virales (proteínas implicadas en la
activación de la expresión de genes tempranos y tardíos), enzimas necesarias
para la síntesis del ADN viral y proteínas estructurales necesarias para el montaje
del virión (Kasamatsu y Nakanishi 1998).
El primer paso en el ciclo de replicación de un virus es la adhesión y la entrada a
la célula, las proteínas de adhesión del virus deben ser capaces de unirse a los
receptores de la superficie celular. Una vez adherido este debe atravesar la
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membrana nuclear, luego el virus debe desensamblarse, eliminando o degradando
la cápside para permitir que el genoma quede en el citoplasma, para la
transcripción del ARNm y replicación del virus que está asociada con el ARN
polimerasa. El ensamblaje, comprende el proceso por el cual se forma la partícula
viral inmadura, y puede ser en el citoplasma, el núcleo o en la membrana
plasmática. La maduración del virus ocurre cuando se vuelve infeccioso, las
proteínas de la cápside sufren una escisión proteolítica para aumentar la
estabilidad del virus, por último los virus formados se liberan al ambiente externo
después de la lisis a través de la membrana plasmática (Shors 2009).
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JUSTIFICACIÓN
Los camarones en cultivo comparten el ambiente con diversos crustáceos,
fitoplancton y zooplancton, siendo este último una fuente importante de alimento
natural. Por tal motivo, es importante determinar si el Virus del Síndrome de la
Mancha Blanca (WSSV), tiene la capacidad de infectar y replicarse en el
zooplancton. Generar este conocimiento permitirá determinar los posibles
mecanismos de dispersión y de entrada del virus a los estanques.
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ARÉA DE ESTUDIO
El muestreo se llevó a cabo en Bahía de Kino, ubicado en las coordenadas
meridianos 111°50΄-112°02΄ Oeste y paralelos 28°45΄-28°52΄ Norte, se encuentra
sobre el lado oriental del Golfo de California, a 110 km al oeste de Hermosillo,
Sonora, México (Grijalva-Chon y Barraza-Guardado 1991). Bahía de Kino se
encuentra en un área de surgencia y parece presentar una productividad primaria
constante (Moreno et al., 2005).
El área de muestreo es la laguna costera La Cruz, localizada en los meridianos
111°50΄ y 111°56΄ Oeste, entre los paralelos 28°45΄ y 28°49΄ Norte, presenta un
área de 2.3 km2 y se encuentra separada por una barrera de arena de
aproximadamente 3 km de longitud, del Golfo de California (Grijalva-Chon et al.,
1996), con un clima semicálido, muy seco, con una temperatura promedio anual
de 20 °C y lluvias muy escasas (Valdez-Holguín 1993).
Es importante señalar que Bahía de Kino alberga una de las principales zonas de
producción de camarón, la cual, a partir del 2003-2008 ha aportado en promedio el
24.5% de la producción total de camarón por acuicultura en el Estado de Sonora
(COSAES 2011). Sin embargo, en el año 2011, Bahía de Kino disminuyó su
producción un 70% con respecto al ciclo 2008 (16,222.30 TM) debido a la
presencia de WSSV en los estanques de cultivo (COSAES 2011).
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Figura 2. Área de Estudio, Bahía de Kino, Sonora, Colecta de organismos (A) modificado de (Rio Salas 2011). Los asteriscos señalan las diferentes zonas de producción de camarón.
15
*
*
*
*
HIPÓTESIS
Si el Virus del Síndrome de la Mancha Blanca se replica en el zooplancton y en los
crustáceos del género Lysmata y Palaemon, entonces estos organismos son
susceptibles a la infección por el virus y por lo tanto pueden considerarse vectores
potenciales de este patógeno.
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OBJETIVO GENERAL
• Determinar si WSSV tiene la capacidad de infectar y replicarse en el
zooplancton colectado en Bahía de Kino, Sonora. México.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Detectar mediante qRT-PCR la presencia de ARNm para la proteína
estructural VP28 involucrada en el proceso de infección del virus de la
mancha blanca en el zooplancton.
• Detectar mediante qRT-PCR la presencia de ARNm para la proteína
estructural VP28 involucrada en el proceso de infección del virus de la
mancha blanca en los organismos Palaemon sp. y Lysmata sp.
• Identificar a nivel especie los organismos colectados mediante el análisis
de secuencia con el gen ribosomal 16S.
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METODOLOGIA
Colecta de organismos
Se colectaron muestras de zooplancton con una red tipo bongo de 50 micras, los
organismos colectados se transportaron con aireación constante a las
instalaciones del CIBNOR campus Hermosillo y se colocaron en contenedores de
plástico con agua marina a 35 ppm, se mantuvieron a 28 °C y se alimentaron
diariamente con una mezcla de microalgas (Chaetoceros, Dunaliella, Tetraselmis).
Adicionalmente, organismos del género Palaemon sp., y Lysmata sp se colectaron
con una red de acuario. Estos organismos se transportaron a las instalaciones del
CIBNOR campus Hermosillo y se mantuvieron por separado en contenedores de
plástico con agua marina a 35 ppm, a temperatura 29°C, aireación continua, y se
alimentaron con alimento comercial balanceado para camarón, una vez al día.
Preparación del inoculo viral
A partir de un organismo naturalmente infectado con WSSV se preparó el inoculo
viral de acuerdo a la siguiente metodología. En una licuadora se colocó tejido
muscular con solución salina fisiológica (SSF). Posteriormente, el tejido se
homogeneizó durante 30 segundos en baño de hielo. A continuación, la
suspensión obtenida fue transferida a microtubos de1.7 mL y se centrifugó a 3,000
x g durante 20 min a 4°C. El sobrenadante fue transferido a tubos nuevos y se
centrifugaron, una vez más, a 13,000 x g durante 20 min a 4°C. El sobrenadante
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colectado se filtró a través de una membrana (Acrodisc) de 20 μm y colectado en
un tubo de plástico de 15 mL y almacenado a -80 °C hasta su utilización
Inoculación experimental de zooplancton
Para la inoculación de estos organismos, se emplearon las técnicas descritas por
Zhang et al., 2008, la cual se fundamenta en la ingesta de virus adheridos a
microalgas. Para realizar la adhesión del virus a las microalgas, se
homogeneizaron durante 30 min 50 mL de microalgas (Chaetoceros, Dunaliella,
Tetraselmis) con 5 mL de inoculo viral y posteriormente con esta mezcla se
alimentaron los organismos. Los organismos del zooplancton fueron colectados
mediante una red de 50 micras a las 24, 48 y 84 horas post-inoculación (hpi).
Todos los organismos colectados fueron almacenados a -80 °C hasta su posterior
análisis.
Inoculación viral experimental de Palaemon.
Debido al tamaño de los organismos, una fracción del tejido utilizado en la
preparación del inoculo, se maceró y se suministró a los acuarios conteniendo 60
organismos del genero Palaemon sp. Durante el desarrollo experimental, la
colecta de los organismos se realizó a las 24, 48, 72, hpi. Todos los organismos
colectados fueron almacenados a -80 °C hasta su posterior análisis.
19
Inoculación viral experimental de Lysmata.
Los organismos del genero Lysmata, fueron inoculados por vía intramuscular, para
lo cual se inyectaron mediante una jeringa de 1 ml, 50 µL del inoculo viral entre el
tercer y cuarto segmento abdominal. Adicionalmente fueron inoculados
organismos con solución salina fisiológica (SSF) como organismos controles. Para
los análisis posteriores fueron colectados cinco organismos a las 48 y 72 hpi y
almacenados a -80 °C hasta su análisis.
Extracción de ARN
La extracción de ARN se realizó a partir de los organismos colectados utilizando el
método TRIzol® LSReagent, iniciando la homogenización de la muestra con 750
µL de TRIzol por cada 50-100 mg de tejido. La lisis del tejido se realizó con la
ayuda de un pistilo de plástico estéril. A continuación, se agregaron 200 µL de
cloroformo, se agitó vigorosamente durante 15 s, y se incubó durante 5 min a
temperatura ambiente. Posteriormente, la muestra se centrifugó a 12,000 x g por
15 min a 4 °C. A continuación, la fase acuosa (conteniendo el ARN), fue
transferida a un nuevo tubo, y se agregaron 500 µL de alcohol isopropilico y se
incubó por 10 min a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este periodo, la
muestra se centrifugó a 12,000 x g durante 10 min a 4 °C. El pellet formado en la
centrifugación anterior, se resuspendió en 1 mL de etanol al 75% (4 °C) y se
centrifugó a 7,500 x g por 5 min a 4°C. El sobrenadante fue desechado por
decantación y el precipitado se secó invirtiendo el tubo sobre en papel absorbente
20
por 10 min. La muestra se resuspendió agregándole 50 µL de agua DEPC e
inmediatamente después incubado a 55 °C por 10 min.
Eliminación de ADN genómico contaminante.
Los aislados de ARN fueron tratados con DNAasa (Invitrogen), incubando durante
15 min un µg de ARN total, 1 µL 10X Buffer de reacción, 1 µL DNAasa (1 U/µL) y
10 µL agua DEPC. La inactivación de la DNAasa se realizó adicionando 1 µL de
solución 25 mM EDTA.
Cuantificación y determinación de la pureza del ARN total.
Se determinó la concentración ARN total midiendo la absorbancia a 260 nm
mediante el equipo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) y se determinó el índice de
pureza utilizando la relación 260/280. Por último, los diferentes aislados se
conservaron a 80 °C hasta su análisis.
Detección de ADN genómico contaminante
Para la detección del ADN correspondiente a VP28 del virus WSSV se utilizo la
metodología descrita por Moser et al., (2012), mediante el kit iQ™ SYBR® Green
Supermix y el par de primes VP28F (5’-CTGCTGTGATTGCTGTATTT y VP28R 5’-
CAGTGCCAGAGTAGGTGAC). Las condiciones de amplificación que se utilizaron
fueron las siguientes: 5 min a 95 °C, 35 ciclos de PCR y detección (30 s a 95 °C,
30 s a 60 °C y 72°C 10 s).
Posterior a la amplificación se realizó un análisis de disociación de los fragmentos
amplificados por PCR. Este análisis se basa en la temperatura de fusión o Tm
21
(melting temperature) por sus siglas, corresponde a la temperatura en la cual el
50% de los fragmentos amplificados se encuentran en doble cadena de ADN.
Cuando el ADN se separa, induce un decremento de la fluorescencia del producto
de PCR. La curva de fluorescencia en función de la temperatura es transformada
en sus derivadas negativas (-dF/dT) formando gráficamente unos picos cuyo
máximo es la Tm. La presencia del transcrito para VP28 se baso en aquellas
muestras cuyo valor de Tm fue similar o igual al control positivo.
Síntesis de cDNA y detección de VP28
La síntesis de cDNA a partir del ARNm que codifica la proteína VP28 del virus
WSSV, se realizó mediante el kit iScript™One-Step RT-PCR con SYBR® Green y
los primers VP28F y VP28R siguiendo el protocolo del fabricante. Posteriormente,
la amplificación se realizo mediante la metodología antes descrita para la
detección de VP28.
Identificación morfológica y molecular
La identificación morfológica de los organismos del zooplancton colectados, se
realizó utilizando las claves de clasificación de los crustáceos (Bassedas 1947) y
la Guía FAO para la identificación de especies para los fines de la pesca (Fischer
et al, 1995).
Para la identificación molecular de los organismos se aisló ADN genómico
mediante una matriz de sílica (Glass milk, MP biomedicals) y se cuantificó
(nanoDrop).
22
Posteriormente se amplificó, mediante PCR, un fragmento del gen 16S ribosomal
utilizando el kit puReTaq Ready-To-Go™ y los primers 16SAR (5'-
CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3' y 16SBR 5'-ATTCAACATCGAGGTCACAAAC-
3') reportados por Lindeque et al., 1999. La amplificación se llevó a cabo bajo las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial (5 min. a 95 °C), 35 ciclos de 45
seg. 95 °C, 45 s 50 °C y 45 seg 72 °C. Finalmente, con una extensión final de 10
min a 72 °C. El equipo utilizado fue un termociclador TECHNE TC-412.
Posteriormente, se realizó el análisis electroforético mediante un gel de agarosa al
1.2% (E-Gel® con Syber Safe TM de Invitrogen), un transiluminador de luz
ultravioleta (UVP) y un sistema de documentación de imágenes digital (Kodak
Imaging System).
Los productos de PCR fueron purificados mediante el kit GFX TM PCR DNA and Gel
Band de illustra TM, siguiendo las especificaciones del fabricante, y enviados a
secuenciar al Instituto de Biotecnología (UNAM).
Análisis de secuencias
Las secuencias obtenidas de los diferentes organismos fueron sometidas a un
análisis de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, por sus siglas en ingles),
en donde se determinó el porcentaje de similitud con los diferentes registros de
secuencias reportadas en National Center for Biotechnology Information (NCBI),
(Altschul et al., 1990).
23
RESULTADOS
En base a sus características morfológicas se identificaron los diferentes
organismos colectados y empleados en los experimentos. El grupo de los
copépodos fue el más abundante (98%) en la muestra colectada. Estos
organismos (copépodos) fueron los utilizados en la realización del bioensayo de
infección. Por otro lado, se logró la identificación de los organismos de la especie
Palaemon ritteri y Lysmata californica
Identificación molecular
Mediante la utilización de los primers 16SAR reportados por Lindeque et al., 1999,
se amplificó un fragmento de 550 pares de bases (pb) a partir de cada una de las
muestras de los copépodos, P. ritteri y L. californica empleados en los diferentes
bioensayos (Fig.3).
24
Figura 3. Electroforesis del fragmento 16s, de los organismos colectados, Marcador de peso molecular (M), L. californica (L), P. ritteri (P) y Copépodos (C)
pb
2000
1200
800
400
200
500 pb
M L P C
Posterior al proceso de purificación y secuenciación, cada una de las secuencias
obtenidas fue sometida a un análisis de BLAST. Este análisis se observó que los
organismos de la clase copépoda presentan en su secuencia un grado de
identidad del 99% con Calanus pacificus californicus (GenBank: AF295333.1).
Figura 4. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos colectados
pertenecientes a la clase copépoda (A) y (B) Calanus pacificus californicus (GenBank:
AF295333.1) Los puntos similitud entre secuencias. * indica inserción de nucleótido.
25
El análisis de BLAST de la secuencia de obtenida de la amplificación de un
fragmento del gen 16S de los organismos palemonidos presentan un grado de
identidad del 98% con la secuencia perteneciente a Palaemon ritteri (GenBank:
JF491341.1).
Figura 5. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos palemonidos colectados
(A) y Palaemon ritteri (B) (No. GenBank JF491341.1). Los puntos indican similitud entre
secuencias.
26
Los organismos del género Lysmata presentan un grado de identidad del 99% con
la secuencia perteneciente a Lysmata californica (GenBank: HQ315596.1).
Figura 6. Análisis de la secuencia obtenida de los organismos del género Lysmata colectados (A) y Lysmata californica (B) (GenBank: HQ315596.1) Los puntos indican similitud entre secuencias.
Detección de WSSV en organismos colectados
Los resultados obtenidos indican que, la muestra de C. pacificus californicus (C),
los organismos P. ritteri (P) y L. californica (L), se encontraban libres de WSSV al
momento de su colecta y antes de realizarse la infección experimental con WSSV,
esto basado en el análisis realizado mediante qPCR y la posterior gráfica
generada por el análisis de disociación (Figura 7).
27
Figura 7. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección
del transcrito para VP28 en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P.
ritteri (P) y L. californica (L).
En la figura 7 se ilustra que los fragmentos amplificados y pertenecientes al control
positivo (+) presenta una temperatura de disociación de 85.8 °C en comparación
con los diferentes organismos colectados (C, P, L) los cuales no presentan
fragmentos amplificado.
28
Temperatura (°C)
(+)
C, P, L(-)
dF /dT
Detección de ADN genómico contaminante
Aunque se empleó un kit para extracción de ARN y se utilizó DNAsa, existe la
posibilidad que durante el proceso de aislamiento y purificación de ARN, pudiera
contener ADN. La presencia de ADN en las muestras interferiría en la
interpretación de resultados, ya que la detección de moléculas de ADN por PCR,
indicaría la presencia del genoma. Sin embargo, la detección de ARN, elucidaría si
el virus ha infectado y replicado en los diferentes organismos empleados en el
estudio. El análisis realizado mediante qPCR y la posterior gráfica generada por el
análisis de disociación (Figura 8), demuestran la ausencia de ADN viral
contaminante en los aislados de ARN de las diferentes muestras de C. pacificus
californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L), esto sustentado por la ausencia de
fragmentos amplificados. Adicionalmente, para garantizar que el qPCR se realizó
correctamente, se incluyó una muestra positiva a WSSV (+).
29
Figura 8. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección
de ADN contaminante en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri
(P) y L. californica (L).
Infección experimental en Calanus pacificus californicus.
Los resultados de la infección experimental en copépodos, basado en el análisis
realizado mediante qPCR y la posterior gráfica generada por el análisis de
disociación (Figura. 5), indican que, a las 24 hpi no se detectan transcritos para
VP28. Sin embargo, en las muestras de copépodos colectadas a las 48 y 84 hpi,
30
(+)
(-)(C, P, L)
Temperatura (°C)
dF /dT
se detectaron transcritos para VP28 demostrando que el virus se encuentra en
fase de replicación en estos organismos al virus de WSSV.
Figura 9. Análisis de disociación de fragmentos generados por qPCR para la detección de
transcritos para VP28 en las muestras colectadas de C. pacificus californicus, 24 horas
(A), 48 horas (B) y 84 horas (C)
31
dF /dT
Temperatura (°C)
(+)
(-)
(C)
(B)
(A)
Infección experimental en Palaemon ritteri
En P. ritteri, se demostró la susceptibilidad de la especie a la infección
experimental con WSSV. El análisis de disociación de fragmentos realizado
mediante qPCR (Figura. 6), demuestra que tanto a las 48 como a las 72 hpi se
detectan fragmentos amplificados a partir de transcritos que codifican la proteína
VP28 y este presenta una temperatura de disociación de 83.4 °C semejante a al
control positivo. No se observaron productos de amplificación (o amplicones) en el
control negativo.
32
33
Temperatura (°C)
dF /dT
(-) (A)
(+)
(B)
(C)
Figura 10. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la detección de ARNm en las muestras colectada de P. ritteri, 24 horas (A), 48 horas (B) y 72 horas (C)
Infección experimental en Lysmata californica
Mediante el análisis de disociación de fragmentos realizado por la técnica de
qPCR se demostró la susceptibilidad de L. californica a WSSV (Figura 11), en
donde se demuestra que a las 48 y 72 hpi se detectó ARNm de fragmentos
amplificados, pertenecientes a transcritos de la proteína VP28 en estos
organismos. Los amplicones presentan una temperatura de disociación de 83.4
semejante a al control positivo. En cuanto al control negativo y el tiempo inicial
(cero horas), no se observaron fragmentos amplificados.
34
Temperatura (°C)
dF /dT
(+)
(B)
(-)
(C)
(A)
Figura 11. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qPCR para la
detección de VP28 en las muestras de L. californica, 0 (A), 72 (B) y 48 hpi (C).
DISCUSIÓN
La acuicultura tiene como retos: satisfacer el incremento del consumo per-cápita
de productos acuáticos, ofrecer alternativas para enfrentar el hambre en el mundo
y abastecer la demanda de alimentos generada por el crecimiento de la población
mundial (Magallón-Barajas et al., 2007). Los eventos epidémicos inducidos por la
presencia de patógenos, particularmente los ocasionados por la presencia del
virus de la mancha blanca han ocasionado profundas repercusiones económicas y
sociales (Macías-Rodríguez et al., 2010).
Es de suma importancia para esta actividad económica elucidar como los agentes
patógenos que afectan a la camaronicultura penetran en los estanques de
producción. Esparza-Leal et al., 2009, reportó que en fracciones líquidas y
particuladas de 0.45 a 100 μm, el WSSV se detecta por PCR, indicando que el
virus esta asociado con sub-poblaciones del plancton, tales como microplancton
(20-200 μm) y nanoplancton (2-20 μm).
Diversos modelos de infección con WSSV han sido propuestos. Entre ellos se
incluye la inmersión de camarones en agua marina conteniendo partículas virales
(Chou et al., 1998; Chen et al., 2000). Adicionalmente, este patógeno puede
infectar crustáceos al exponer partículas virales a fitoplancton (microalgas) y su
posterior ingesta (Zhang et al., 2006, y Liu et al., 2007), En crustáceos, (Tan et al.,
35
2001; Durant y Lightner 2002; Granja et al., 2006), reportan infecciones con
WSSV vía la ingestión de homogenizados de tejido infectado (per os). La
inyección de inóculos virales vía intramuscular es otro método empleado para
lograr infecciones con WSSV en organismos (Dhar, et al., 2001, Huang, et al.,
2001, Wu et al., 2002, You et al., 2010 y Moser et al., 2012). En el presente
trabajo, debido principalmente al tamaño de los organismos, se emplearon
diferentes métodos de infección: los copépodos fueron infectados mediante la
ingesta de partículas virales de WSSV adheridos a microalgas, los organismos P.
ritteri mediante el suministro de tejido infectado con WSSV a los contenedores, y
los organismos pertenecientes al genero Lysmata fueron inoculados por inyección
intramuscular. Los tres tipos de infección empleados en el presente trabajo
lograron infectar a los organismos, esto basado en el resultado del análisis de
qPCR en el tiempo 0 y la detección en las muestras de los organismos del ARNm
para VP28 a partir de las 48 hpi.
Se han reportado al menos 93 vectores u hospederos de WSSV que incluyen
camarones peneidos, langostas, jaibas, cangrejos, langostinos, poliquetos, y
diferentes componentes del zooplancton como artemia, cladóceros, rotíferos y
copépodos (Sánchez-Paz, 2010). Sin embargo, es importante señalar que la
detección por PCR de WSSV no confirma la susceptibilidad de los organismos al
virus, esto debido a que la técnica se basa en la presencia o ausencia de
fragmentos del genoma viral, es decir, el genoma del virus pudiera localizarse
intracelularmente, en la superficie o en el contenido intestinal del animal. Para
36
poder confirmar una infección viral pudiera emplearse diversas técnicas como
histología, hibridación in situ, o microscopía electrónica de transmisión.
El presente trabajo, basado en que durante el proceso de infección de un virus, es
necesario la producción de proteínas virales a través de la traducción de ARNm, la
detección de esta molécula para la proteína estructural VP28 mediante PCR en
este trabajo, indica que el virus infectó a los diferentes organismos experimentales
(P. ritteri y L. califórnica y C p. californicus). Por lo cual los resultados de este
estudio demuestran que las tres especies de crustáceos anteriormente
mencionadas son susceptibles a la infección experimental con WSSV. Existe baja
probabilidad de que P. ritteri y L. californica se encuentren en los estanques de
cultivo de camarón, sin embargo es importante estudiar el efecto del virus en
poblaciones silvestres de crustáceos ya que estos camarones son especializados
en la limpieza de parásitos, como en la langosta espinosa de California (Panulirus
interraptus) (Allen et a, 2006). Debido a que experimentalmente se reporta que
diversas especies del género Panulirus son susceptibles al virus de WSSV
(Sánchez-Paz, 2010)
Los copépodos son el mayor y más abundante componente zooplanctónico en los
estanques de cultivos de camarón y en el agua de mar, y con frecuencia son
utilizados como alimento vivo de postlarvas de camarón durante el primer mes de
la cría después de la siembra en el estanque (Reymond y Lagardere, 1990). Se ha
demostrado que los copépodos pueden actuar como vectores mecánicos de
patógenos bacterianos (Huq y Colwell, 1996). El primer registro que se tiene de
37
detección de WSSV en copépodos fue en Schmackeria dubia(Overstreet et al.,
2009). Sin embargo, no se ha establecido si el virus se replica y causa la
enfermedad en estos organismos (Lo et al., 1996). Recientemente, Chang et al.,
(2011) demostró mediante la detección por RT-PCR de transcritos, que WSSV se
replica en el copépodo A. royi. Los resultados en el presente experimento,
coinciden con lo reportado por Chang et al., (2011), en el cual es posible la
detección de mensajes que codifican la síntesis de proteínas virales, sin embargo
es importante señalar que los resultados de la presente investigación en
comparación con lo reportado por Chang et al., (2011), en donde señala la
detección de transcritos para VP28 en el copépodo A. royi hasta las 24 hpi, en la
especie de copépodo colectada en Bahía de Kino, se detectan mensajes en el
muestreo realizado a las 48 hpi. Esta diferencia de 24 horas en la detección de los
transcritos de VP28, pudieran deberse a la susceptibilidad de las diferentes
especies utilizadas en los experimentales o al número de copias virales que
contenía el inóculo. Reportes en peneidos, indican que la expresión de esta
proteína (VP28), ocurre en las primeras 6 hpi (Zhang et al., 2002).
Lotz y Lightner (1999) señalan que el agua es una vía para entrada de WSSV a
una instalación de acuicultura. Otros estudios apoyan la hipótesis que diversos
componentes del fitoplancton y zooplancton son portadores de WSSV, además,
que pueden transportar partículas infecciosas de WSSV y, cuando son ingeridos
por el camarón, son potencialmente infecciosos (Esparza-Leal et al., 2009).
Martorelli (2010), señala la posibilidad que WSSV pueda ser transportado por
corrientes marinas a través de hospederos reservorios o vectores mecánicos.
38
Las especies de microalgas Isochrysis zhanjiangensis (Zhang et al.,2006; Zhang
et al.,2008; Zhang et al., 2010) I. galbana (Liu et al 2007; Chang et al., 2011)
Platymonas subcordiformis (Zhang et al.,2008) Skeletonema costatum, Chlorella
sp., Scrippsiella trochoidea, y Dunaliella salina (Liu et al 2007) se han propuesto
como vectores mecánicos de WSSV, en el presente estudio, se demostró que las
tres especies de microalgas empleadas en el experimento de infección de
copépodos, Chaetoceros, Dunaliella, Tetraselmis, pudieran ser vectores de este
patógeno, sin embargo es necesario realizar investigaciones acerca de la
interacción de la adhesión del virus WSSV- microalgas, como el trabajo reportado
por Jiang (2012) en el cual se demostró mediante hibridación in situ con
fluorescencia la adhesión de WSSV a dinoflagelados Alexandrium tamarense y A.
minutum.
Recientemente se relacionaron los eventos epidémicos de WSSV y las corrientes
marinas del Golfo de California, debido a que, los eventos de mortalidad en la
costa noroeste de México, inician en el Estado de Nayarit y finalizando en el
Estado de Sonora, es decir presentan un patrón hacia el interior del Golfo
(Esparza-Leal 2010). Se ha reportado que la circulación de las corrientes marinas
del Golfo de California es predominantemente estacional, el agua superficial entra
al Golfo por el lado este, dirigiéndose hacia el Noroeste en la mayoría de los casos
en verano, y durante el invierno, el flujo se dirige hacia el exterior por el lado de la
península en dirección suroeste (Rosas-Cota 1977 y Jiménez et al., 2005). Rosas-
Cota (1977) señala que las corrientes en el Golfo de California, se relacionan con
la distribución espacio-temporal de las poblaciones de plancton. En base a lo
39
anterior, y a que el presente trabajo indica que los copépodos son organismos
susceptibles a WSSV, es factible que su dispersión geográfica y en los estanques
sea a través del zooplancton infectado.
Existen reportes de WSSV en organismos silvestres (peces, jaibas, moluscos y
camarones) que habitan en lugares adyacentes a la zonas de cultivo (Mañon-Rios
et al., 2010). En la zona de Bahía de Kino, se encontró que P. ritteri, L. califórnica
y copépodos son organismos susceptibles al virus, y que estos pudieran ser
reservorios de este patógeno.
40
CONCLUSIONES
El virus del Síndrome de la Mancha Blanca, posee la capacidad de infectar y
replicarse en los copépodos C. pacificus californicus colectados en Bahía de Kino,
Sonora. Esto basado en la detección de transcritos que codifican la proteína viral
estructural VP28.
Con base en la detección de transcritos de la proteína viral estructural VP28, el
virus del Síndrome de la Mancha Blanca, infecta y se replica en los organismos
Lysmata california y Palaemon ritteri colectados en Bahía de Kino, Sonora.
Se demostró que al menos una especie de microalga (Chaetoceros, Dunaliella o
Tetraselmis) empleada en el experimento de infección de copépodos, pudiera ser
vector mecánico de este patógeno.
41
RECOMENDACIONES
• Debido a que los copépodos son el mayor y más abundante componente
zooplanctónico en los estanques de cultivos de camarón y en el agua de
mar, es necesario continuar con la búsqueda de especies de copépodos
susceptibles a WSSV.
• Adicionalmente de copépodos, el zooplancton es constituido por larvas de
moluscos, crustáceos, erizos, estrellas de mar, poliquetos, formas adultas
de rotíferos y fases juveniles de peces. Por lo tanto realizar trabajos de
susceptibilidad a WSSV en estos organismos aportaría o descartaría
vectores potenciales de WSSV y alertaría un posible daño potencial a las
poblaciones silvestres de estos organismos en el Golfo de California,
México.
42
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