evaluation of scavenging activity assessed by co(ii)/edta-induced luminol chemiluminescence and...

6
Evaluation of scavenging activity assessed by CoII)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay Irene Parejo a , Carles Codina a , Christos Petrakis b , Panagiotis Kefalas b, * a Department of Natural Products, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona, Avda. Diagonal 643, 08028 Barcelona, Catalonia, Spain b Mediterranean Agronomic Institute of Chania, P.O. Box 85, 73100 Chania, Crete, Greece Received 24 July 2000; accepted 1 November 2000 Abstract The scavenging activities of three standard antioxidants, quercetin, ascorbic acid, and trolox, were evaluated by CoII)/ethylenediamine- tetraacetic acid EDTA)-induced luminol chemiluminescence and the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH ) free radical assay. Therefore, the aim of this study was to characterise an enzyme-free and time-independent chemiluminescence method for the assessment of the scavenging profile of compounds in a cell-free system using the CoII)/EDTA±luminol ±peroxide system. These results showed that the three standards were efficient and effective in inhibiting both CoII)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and the free radical DPPH . For all the data obtained in this work, the scavenging activity for the standards tested decreased in the following order: quercetin > trolox > ascorbic acid. The present study has applied a simple and precise procedure for the study of hydroxyl radical scavenging activity by CoII)/EDTA-induced luminol chemiluminescence, and this was assessed by DPPH free radical scavenging. D 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: Chemiluminescence; Luminol; Cobalt II); DPPH ; Antioxidant 1. Introduction Several methods to determine free radical scavenging can be used. In the present study, the effect of three standard antioxidants, quercetin, ascorbic acid, and trolox 6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), were analyzed on the stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH ) radical and on hydroxyl radicals generated by Fenton's reaction. Recent reviews evidence the wide use of luminol che- miluminescence as a sensitive assay for monitoring free radicals and reactive metabolites from cell-free Krol et al., 1990; Yasaei, Yang, Warner, Daniels, & Ku, 1996; Yildiz & Demiryu Èrek, 1998; Yildiz, Demiryu Èrek, Sahin-Erdemli, & Kanzik, 1998), enzyme Puntarulo, Galleano, Sanchez, & Boveris, 1991), cell Yildiz & Demiryu Èrek, 1998), or organ Afanas'ev, Ostrachovitch, Abramova, & Korkina, 1995; Araujo, Barbosa, Hsin, Maranhao, & Abdalla, 1995; Lissi, Salim-Hanna, Pascual, & Del Castillo, 1995; Nabi, Rashid, & Yaqoob, 1996) systems and for screening antioxidant activity Krol et al., 1990; Lissi, Pascual, & Del Castillo, 1992; Yildiz & Demiryu Èrek, 1998; Yildiz et al., 1998). This method will allow us to evaluate the antiradical scavenging activity Desmarchelier, Barros, et al., 1997; Desmarchelier, Schaus, Coussio, & Ciccia, 1997; Heilmann, Merfort, & Weiss, 1995; Lissi et al., 1995; Merfort, Heilmann, Weiss, Pietta, & Gardana, 1996), considering luminol chemilumi- nescence to be an index of radical reactions. * Corresponding author. Tel.: +30-821-81151; fax: +30-821-81154. E-mail address: [email protected] P. Kefalos). Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 44 2000) 507± 512 1056-8719/01/$ ± see front matter D 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII:S1056-871901)00110-1

Upload: irene-parejo

Post on 18-Sep-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��������� � ���� ��� ��������

��� �� � �� ���������������� � ������

�� ������ �� � �� �����

�� ����!� ���"�!��#�����#�$���

# #������ �����

�# ��# %�� ��#� � ������ ��#����� � �#�&��� ��������� ' ����� (����������� ������ �������� ���� �� ��������� ���������� ����� ���

����� ������ ���� ! "! ����� ��� #��� ���� $�����%������������ ������� &�������� #������ ��'� �( !)� *�+ #������ #����� ,�����

) � �� � �* +��� �,,,- ��� !� � " .�� �� # �,,,

��������

�� ���� ��� �������� � � ��# �����#� ����/����� 0� #� �� ����#��� ���� �� �#���/ 1 # ������ � �� ������� ���� ����� �

� �#��� ��� ���� ����������� � ������ �� ������ �� � �� �� � ����!� ���"�!��#�����#�$�� ������� # #������ �����2 �� # �#

�� ��� � ���� ����� 1�� �� ���#��� #�� � $�� �# �� ��� ��� ! � � �� ������ �� � � ���� �# �� ��� ��� � � ��

���� ��� !#��� � ���!���� � � � ���# ���� � ���� �� �����������3������3! #�/�� ���� �2 �� � # ����� ���1 � ���� ��

��# �����#�� 1 # ��� � �� ���� � �������� ���� ���������������� � ������ �� ������ �� � �� �� # #������ �����24�# ��� �� ���� ����� � � ���� 1�#& �� ���� ��� �������� �# �� �����#�� � �� � � �# �� � � �� ����1�� �#� #5

0� #� �� 6 �#���/ 6 ����#��� ����2 �� !# � � ����� ��� �!!�� � � ���!� �� !# ��� !#�� ��# �# �� ����� � ���#�/�� #������

���� ��� �������� �� ���������������� � ������ �� ������ �� � �� ���� 1�� ��� �� � �� ����� # #������ ���� ���2 � �,,"

��� �� # 7�� � ��2 ��� #����� # � #� �2

-��.���/ �� ������ �� � - 8�����- ������ ����- �����- ����/����

� ���� ������

7 � #�� � ����� �� � � #�� # #������ ���� ��� ��

� �� �2 � �� !# � � ����� �� �� � ��# �����#�

����/����� 0� #� �� ����#��� ���� �� �#���/ �9�

���#�/��� : ; <�� �#�� ������#��������#��/���� �����

1 # ����$ � � �� ����� � ����!� ���"�!��#�����#�$��

������� #������ �� � ���#�/�� #������� � #�� � ��

4 ��=� # �����2

) � � # �� 1� ��� � �� 1�� �� � ������ �� �

������ �� � �� � � ����� ����� �# �����#�� #

#������� �� # ����� � ������� � #�� � ���# �'#�� � ��2

">>,- ?��� � ?�� @�# # ��� �� A '� ">>9- ?����$ A

� ��#��B# & ">><- ?����$ � ��#��B# & 7�����#� ��� A

'�$�& ">><� $�� �����#��� C��� �� 7��� $ A

D�� #�� ">>"� � �� �?����$ A � ��#��B# & ">><� �# �#��

�����= � E��#��������� ��#����� A '�#&�� ">>:-

�#��%� D�#���� ��� F�#���� A ������� ">>:- 8����

7�������� ������� A � � �������� ">>:- .��� )�����

A ?�0��� ">>9� ���� �� �� �# ��# �� ����/����

�������� �'#�� � ��2 ">>,- 8���� ������� A � � ��������

">>�- ?����$ A � ��#��B# & ">><- ?����$ � ��2 ">><�2 ����

� ���� 1��� ����1 �� �� ������ �� ���#������ ���� ���

�������� �� ���#�� �� # D�##�� � ��2 ">>;- � ���#�� �� #

7����� ������� A ������ ">>;- � ���� F #�#� A

@ ��� ">>:- 8���� � ��2 ">>:- F #�#� � ���� @ ���

�� ��� A C�#��� ">>9� ����� #�� ������ �� �������

�� � �� � � �� / � #������ # ������2( ��## �!���� �����#2 � �25 GH,�<�"�<"":"- �/5 GH,�<�"�<"":*2

01��� �������5 !���I�����2�# ��2 ' �����2

+��#�� � ���#����������� �� ��/���������� F ����� ** ��,,,� :,;3 :"�

",:9�<;">�,"�J 3 � #�� ���� # � �,," ��� �� # 7�� � ��2 ��� #����� # � #� �2

���5 7" , : 9 � < ; " > � , " � , , "" , � "

�� �� ������ �� � � ���� ��� � 1�� �� �� � ��

� � ����� ����� �# �����#�� # #�������2 C #���� �

# ����� �/�� �! �� � ���� ����� 1���� �� � �����# �

�� � ��#� �� � ������ � #�2 8���� ������ �� �

��#& ��� ��!��� � �� ������ �8 � � �F���$�1� � ��2

">>*� 1���� # ���� 1��� ���#�/� ! #�/�� ������ �# ���

��� "�2 ������ ���� ���!� / � 1��� ���� ����� �� �#��

�� ��� ���� ������ �� ��!��� � ��������� �� �#����� �

���#�/�� #������� ��� �� 4 �� # ����� �# ������ � �� H�

�?����$ A � ��#��B# & ">><- ?����$ � ��2 ">><�2 � ��� �

�� ! � � �� $�� �# �� ������ �� � � ����

��� � � �� �� � ����������� ��� � � ��#�� �

!# ������� ���# %� � �#�&�� A ' ���� �,,,�2 �� �����

��� � ���� � ���� �� ���� �� �� ������ �� � �� ���

�� � # ��� � !��� �� 1� # �� � # ��� ����� �# H, �

��/���� �� ���� �� � �� � # ��#� � 1������ ����

�� �#����2 8� �#��� 1�� ���� ��� #� � � �1 �� �����

�� �� � �� ���� � �� �����#� ��� �#����� � ��E�2

�� # �# �� ��� � ���� ����� 1�� �� !#�!�� � �!!�����

��� � �� ���� �� ������ �� � � ���� �# �����#�

�� ���#�/�� #������ �#����� �� �� � � ��! � ��# ��

!#�� ��# � � ���# ���� �� �# ��� ��� � � ���� ���

!#��� �� ��2

8� �� E� � ����� �*H, �� �"����� � ��E� � ��H� � �E� � �E� ���E��

� � ��H� � E� � ���� �H�

�� ��% ���� � ���� ����� 1�� �� � � #�� �� �������

� 0� #� �� ����#��� ���� �� �#���/ �� ������ #

#������� � � � ���# ���� � ���� ����������� �������

��� � �� ��������� � �� ���� �� ����� �����

# #������2

������� � # #������ ���� � #� �� ���� �� �������

�� � ������� � ��� �� � � �# �� � �� ������ �� ���

������� � �� ���� ����1�� �� �������� � �� �#

����/���� ��������2

8�1 ��E� ��� �#����� 1 # �!��� � �# ��

0��������� �������� � �#� # �� � �# �� �� #�� �

��� �����!��� �� ����1 � � �� # �������� � ��

# ������ � �� ����2 � ��1 #�� � #������ !#�������

1��� ��& !������ �� �������� � ����/����� ��

���#�����# �� ������#�����# ��� �#���� �8���� �

��2 ">>:�2

) � ��� � 1 � ���� �# # #������ ���� ��� 1��

� � ��! � �D#���@������� ��� �� # A D #� � ">>:�2

7! ���� ���!���� �# /�#���� �# ����1 � �� # ��� 1���

�� ����� #������ ����� � � ����� ������� �C�� $ �

��2 ">><- 8����� �1�#����& D��$����� A ' #� ">><-

E����� F�#������ ���� ?�� A '��� ">><- 7�����#��0

� C��� %�� �#����� A K���� ">>>- 7��� $�F�# �

8�##��#� A 7��#������/�� ">><- K� C���1 +��� #� A

����� ">>;�2 �� # ������ � ������# ����� *� ��

�����# � �� �� � �# �� � �� ����#��� � ��� #������ ��

:": � ��� �!� # ������ �� � ����/���� ���� ��

����#!��� ����!! �#�2

����� � �� ���� � � � � �*�

� ������������

"�+� 2�������

���� ������ �H�����!��������#�$� � ����� H H� *� : ;�! �����#����� �0� #� ��� �� ��#�� ����

1 # !�#���� � #�� 7���� �C #����- ������ ���� ����#�

�� � /����#�� 1�� !�#���� � #�� �2 F #�& �C #�

����- �#���/ 1�� !�#���� � #�� ���#��� �� �2

�L7��- �� 8�����#��� ���� 1�� !�#���� � #�� 7 #��

�L7��2 � #���#�� H,M ��E� C) ���2 .�2 "2,;�",

�������� � �# ���� # ���#�� � �! #���# 1�� !�#���� �

#�� �2 F #�&2

"�"� ���3� ������ ���������� � ������� �������

�����

�� �� � �� ��# ����/����� � ����� #������ 1��

������ � ����#��� �� �� !#�� ��# � ��#�� � �� D#���

@������� � ��2 �">>:�2

��� �� �! ��#�!����� �#�� ���� 1 # ��0��# � ���� �

�� <*:�� ���� �##�� 7! ��#�!����� � # � � ",���

0��#�$ ��� �� 2

� ���0��� � � ����� �,2" ��� ������� �������

�� # � ��� �#����� � �����#�� �"2, � ", � H

;2: � ", � * :2, � ", � * �2: � ", � * "2, � ", � * F�

1�� ��� � �� H2> �� � ����� 92,� ", � : F � � ����

��2 �� � �# �� � �� ����#��� 1�� � � #�� � ��

:": � 1� �� # ����� # ��� � � !��� ��2 F �����

1�� �� � �� $ #� �� �! ���!����� � #2 �� ����#��� �

�� ����� #������ 1������ �� ����/���� ����#��� 1��

� ���# � �����2

�� /��� ������ ����� ��� �#���� �#������ � ��

# ����� � ���� 1�� �������� � #�� �� �����#����

��#� 1��� �� 0����� � �:": �� N �92�*;#�����

������� G 92<"H� ", � H �� N 2>>>>9 �� � � #�� � ��

�� �# # �# ����2

�# �����#� /! #�� �� 1 # ��##� � ��� � �#� # ��

� � #�� �� ��� � ���#� �� # ��� �� �� ��� ���� 2 �� 1��

� � �# 0� #� �� "2: �� �# ����#��� ���� �� ": �� �#

�#���/2 �� ��� ��� � 1 # ���� ���� # � � ��

��� #���# �7��� $�F�# � � ��2 ">><�2

4�# ��� ����/���� ��� �#���� � �� � �� ! #� ���

� ����� # ����� �� �� �� ��� ���� 1�� �������� � ��

����1�5 M ����� # � N O�����P4�O�����P4 N , 1� # 4 ��

�� ��� � ���#� �� # ��� �� �� ��� ���� 2 �� � ���� �

1 # !���� � ��2 ��� � ����/�������� ����� �� ����� ��

����� � ����/���� � ���#� �� � �# �� �� ������

����� ��� �#���� �� :,M ���:,�2

������� ����� ������ �����

&� ����5 �� � � 6 7���� ������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �� 8" 9 ) *:)+":,<

"��� #'8&&960�4�1������� ���� ����� �����������

�����

�� ������ �� � � ���# � �� 1 # ��##� � ��� � �

F�� � 9�,, 4���#�� � # +�.@�? �+ 1�� C#����#

C# 4 ��� � ����1 ��� / �F9 H 8D� & !�� ��

���! � �� ���� ��� �� !���������!�� # � �� �!!�#����2

D� # ������� �" ��- ��#�� ���� ,2,: F !� � >�

������� ������ �� ������ �� ���� �", ������ 1��

�#�� ��#� / � �# ": � � � 1 �� 1��� ",, �� � �� ������

�",, ����� :29� ", � * F� �� # ������� ���#�� ���� ,2,:

F !� � >� � � � �� ��� 2 �� :, �� � ��E� �0� ���

������� �:� ", � H F� 1�� � !���� � � �� ������ � �

",� ", ����� ��� �� ���� !# ����� !�! �� �2 �� �������

�� # ���&���� 1�� ��� � #�!���� �� �� ��� �� 1��� �

���� �# !�! �� �� ���#������ ��/ � �# ": � � �#� # ��

������ �� �� ������ �� � # ����� � ���� ���� �� �2

��� ���� �� �� #1�#� 1� �� �� ���� � ������

# ��� � �� ��/���� �: �� � �� ���!� 1 # ��� �

�� �� ������ ��� � �# �� 1�� # ��#� �2

���� "

���� � ��� �#����� ���#������ ��� �� � �� &� ��� ������������ � �� ��# ����/����� � �� �5 �#���/ ����#��� ���� �� 0� #� ��

7����#�� ��:,� ��� '� ��� 7��! � ��## ����� �� ��� ��

�#���/ ,2,>< Q *2*� ", � * "2�* Q ,2*< 4��� �"3"2: ��� � <29<;< � ,2>;*9

����#��� ���� ,2"�9 Q ,2," <2, Q ,2; 4��� �"3"2: ��� � <2,<>� � ,2>:;;

R� #� �� ,2,9; Q <2"�", � H "*2: Q "2< 8�1 �9,3 "�, ��� � "92*;< � ,2>:<;

) ����� �# � � Q 72�2 ��N H� � S 2,:2� ���� � ��� �#���� ���� � ����/�������� ������5 ����� � ����/���� � � �� � �# �� �� ������ ����� ��� �#���� �� :,M2� ���#������ ��� ��5 "���:,2� �/!� ���� ��� � � OM ����� # �P N ; O��� � ����/�������� �����P G �2

4��2 "2 �/!� ���� ��#� � �� ! #� ��� � # ����� ����� �� � ����� � ��� � ����/���� ! # ��� �����2���� ���� ���� �#���/- �D�� ���� ����

����#��� ����- ���� ���� ���� 0� #� ��2 ���� ���� 1�� � � � � ��# � � #������� � Q 72�2�2 ������� � ��#��� �7��������� �# @���1� *2, �1��1��

�.EK�� 1�� �� � �� ��� �� �� ��� #� � �� # � � � �1 M���� # ����� �� ��� �#�����2 �� # � � 1 # ����� # � �� � �������������

�������� 1� �� � ���� 1�� � �� ��� 2,:2 7������� �� # � � 1 # ���5 � ���� � 1 # ,2,,,* �# �#���/ ,2,,* �# ����#��� ���� �� ,2,* �#

&� ����5 �� � � 6 7���� ������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �� 8" 9 ) *:)+" :,>

�� ������ ��� # ������ � ������ �� ���� ����� �

�� �� ������� � �� �����#� 1�� �������� � �� &2 ��

����� �� ���� � �� ��� � � �����#� 1�� �������� �

�� &�2

� ������� �� ���������

��+� ���3� ������ ���������� �����

�� ��� �#���� � ����/���� � � �� � �# �� ��

������ ����� ��� �#���� ���:,� �� :,M �� � !�#�� � #

1�� �� �� � �� � ���# �� ����/���� �������� �7��� $�

F�# � � ��2 ">><�2 �� ��1 # �� ��:, �� ���� # ��

����/���� !�1 #2 ���� # !�#�� � # 1�� � � �5 ���#��

����� ��� �� ��� N "���:,� �# ���#������ !�1 # ��)��

�D#���@������� � ��2 ">>:�2 �� ���� # �� �� �� ���� #

�� ����/���� ��������2 �� ���� ����� � �# ���1 �

���� "2

4�# ��� �� ���� ����� � � ���� 1�#& �� ����/����

�������� � ���# � �� �� �� �# �� �����#�� � �� �

� �# �� � � �� ����1�� �#� #5 0� #� �� 6 �#���/ 6 ����#�

��� ����2

4��2 " ���1� �� &� ��� � ������# ����� � �# �� ��#

�����#�� �� �� # � ��� �#����� /!# �� � �� ����#

#���� ���� ����/�������� ������2 �� ����1�� � #��

/!� ���� ��� � �!!�� �5 � OM ����� # �P N ; O���

����/�������� �����P G � 1� # ; �� �� ���! �� �

�� �� #� !� �D#���@������� � ��2 ">>:�2 ���� ��## �����

�� ��� �� 1 # ����� �2 �� ���� # �� ��� �#����

�� �� ! # �� ���! � �� �� ��1 # �� # ����� �����2��� 0� ��� �� ���! � ��� � �� �� !�#�� � #� ��

���!�# ����/���� ��� �� � �� # � ����/����� ��

�� ��� ��� �#���� 1��� � # # � ���!��� ��#���/�2

4#�� �� ���� � �� !# � � 1�#& �4��2 "� 0� #� �� 1��

"2> ��� � ��# ��� � ��� �#���/ � � �# ���� ��

����� ������ ��� �#���� �� ����#��� ���� 1�� "2,

��� � � �� ��� � ��� �#���/ � � �# ���� �� �����

������ ��� �#����2

7�����# �# ��� � � �� ���� ����1 � �� �������� �

�� �# ����/���� ������� � � #�� � �� 0����� � �#���/

��� �#����2 �� � ���� ������ � ���� 0� #� �� 1�� "29

��� � ��# ���� ��� �#���/ �� ����#��� ���� 1�� "2H

��� � � �� ���� ��� �#���/2

��"� #'8&&960�4�1������� ���� ����� �����������

4�# �� ��# �����#�� ��:, �� �� 1 # � � #�� � �

�#� # �� ������ �� �# # ����� ���#�/�� #������ ���� ���

�������� ���!�# � �� �� # # � ���!��� ��#���/�2 4�#

�� ���� � �� !# � � 1�#& ����� �� 0� #� �� # 0��# �

,2,: ��� � ��1 # ��� �#���� ��� �#���/ � �#� # ��

� �# �� �� ������ �� ������ �� � �� ���� �&�� ��

:,M �� ����#��� ���� # 0��# � �2* ��� � ��# ��� �#��

��� ��� �#���/ � �#� # �� � �# �� �� ������ �� �������

�� � �� ���� �&�� �� :,M2

�� ����/���� �������� �# �� �����#�� � �� �

� �# �� � � �� ����1�� �#� #5 0� #� �� 6 �#���/ 6 ����#�

��� ����2

���������������� � ������ �� ������ �� � 1��

� !# �� � �� 0� #� �� �#���/ �� ����#��� ���� �4��2 ��2

�� ��� ��� �#����� 1 # � �� � �# ��� �����#�2 ��

���� ��#& � �������� � �� ������ �� ������ �� �

�� ���� 1�� ��� #� � �� 0� #� �� �� �� � �� ��#& �

�������� �� ����#��� ����2 R� #� �� � � �� � ������

���!� � �������� �>;2* Q ,2HM� �� �� ���� �� ��� �#��

��� �� � �",, ���� ����2

���� �

���� � ��� �#����� ���#������ ��� �� � �� &� ��� ������������ � �� ��# ����/����� � �� �5 �#���/ ����#��� ���� �� 0� #� ��

7����#�� ��:,� ��� 7��! �

��## �����

�� ��� ��

�#���/ ",2, Q ,2* ,2" Q H2;� ", � H ,2,<;9 ,2>>>:

����#��� ���� �H2; Q ,2* ,2,* Q ;2*� ", � * ,2,*�* ,2><,:

R� #� �� ,2> Q ,2,� "2"� Q ,2,�* ,2H:9, ,2>>>9

) ����� �# � � Q 72�2 ��N H� � S 2,:2� ���� � ��� �#���� ����� � ����/�������5 ����� � ����/���� � � �� � �# �� �� ������ �� ������ �� � �� ���� �� :,M2� ���#������ ��� ��5 "�&:,2� 8� �# # �# ���� �N ;(G �2

4��2 �2 &��& �� � ����� � ����� � �����#� ��� �2 &��& ���� � 1 #

����� � ��� ���� �� �� # �� �����#� �������2 ��� ���� ���� 0� #� ��-

�D� ���� ���� �#���/- ��� ���� ���� ����#��� 2 ���� ���� 1�� �� � �

� ��# � � #������� � Q 72�2�2 ������� � ��#��� �7��������� �#

@���1� *2, �1��1�� �.EK�� 1�� �� � �� ��� �� �� ��� #� �

�� # � � � �1 �� #���� &��& �� ��� �#����2 �� # � � 1 #

����� # � �� � ������������� �������� 1� �� � ���� 1�� � �� ��� 2,:2

7������� �� # � � 1 # ���5 � ���� � 1 # ,2,,,,: �# 0� #� ��

,2,,,, �# �#���/ �� ,2,,"� �# ����#��� ����2

&� ����5 �� � � 6 7���� ������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �� 8" 9 ) *:)+":",

�� ������ ��� # ������ � ������ �� ���� ����� �

�� �� ������� � �� �����#� �� � ����� # � �� �

� ���# � ��� ����/���� ��������2 �� ����� �� ���� � ��

��� � � �����#� �&�� 1�� � �# �� � �� ������� � ��

�����#� ����/���� ��� �#���� �� � ���� &2

4�# �� ��# ���!���� �� � ���# � #���� &��& 1��

!#�!�#����� �� �� ��� �#�����2 �� ���! � �� #����

&��& ��2 ���#���� � ! # ��� # !���� � 1�� �� � � ���# �

�� # �������� � �� �����#� ��1�#� �� ���#�/�� #�������2

� ���!�#��� � �� ���! ����� � �# �� # # �

���!��� ��#���/� ����1 � �� �������� � �� ����/�

���� ��� �� �8���� � ��2 ">>:�2 4#�� �� ���� � ��

!# � � 1�#& �4��2 �� 0� #� �� 1�� ��# ��� � ��#

��� � ��� �#���/ � � �# ���� �� ������ �� �������

�� � �� ���� �&�� �� ����#��� ���� 1�� �1� ��� �

� �� ��� � ��� �#���/ � � �# ���� �� ������ �� �����

�� �� � �� ���� �&��2

7�����# �# ��� � � �� ���� ����1 � � �������� �

�� �# ����/���� ������� � � #�� � �� 0����� � �#���/

��� �#���� �8���� � ��2 ">>:�2 �� � ���� ������ � ����

0� #� �� 1�� *29 ��� � ��# ���� ��� �#���/ ��

����#��� ���� 1�� �2* ��� � � �� ���� ��� �#���/2

� ������� � �� ��� �� � � �� �����#�� � ���# � 1 #

�� # � �# ��� � ���� �� �� �� �� # � &� ���

# �����2 ��1 � # �� �#� # � ����/���� �������� ���

1�� �� ��� 2

�� !# � � �� ������ �� � � ���� �# �� ����� �

���#�/�� ���� ��� �������� � � #������ �� ���!� # ���

�� �� � �� ��& �� � $�� � ���� � #�T� $�)�UT$

C�#�UT����T���� ������ A �#�� ">><- .���� A +�� T $

">>>� �# �� �#���� � �� �� ���� � # �!�� �'���

E����� A '�1������ ">>>�2 �� ���#�� ����� ��

���!� �� ��� � ���� � �� �! � � # �!�� ��������

��� � �# �� �2 �� ���!�# � 1��� �� ����� ����� ��

���1� ���� � �������� ��� �� ��� �#���� � ��

� ���# � �����#�� #�� #�� " �� ",, ������ �# �� ���

������� � �4��2 �� 1� # �� �# ����� �� � #�� #�� "

�� ", ������ �� �/! #�� ��� � �����2 �� ���� ��� 1��

�� �# #�� � �� ���� !# �����- �� !# ����� � ��

� ���� 1�� �� �& � �� � �� � �#�!����� ������ 1���

�� ��� �� � ��#����� 1 # �������� � �# ����� �����#�

� ������ N �2HM�2 ��1 � # � ���������� 1�� ��� � �

��1 # !#����������� �;2<M�2

� �������� �� � # ����� ���1 � ���� �� ��#

�����#�� 1 # ���� �� ��� � � �������� ����

���������������� � ������ �� ������ �� � �� ��

# #������ �����2 4�# ��� �� ���� ����� � � ���� 1�#&

�� ���� ��� �������� �# �� �����#�� � �� � � �# �� �

� �� ����1�� �#� #5 0� #� �� 6 �#���/ 6 ����#��� ����2

�� !# � � 1�#& ��� �!!�� � � ���!� �� !# ���

!#�� ��# �# �� ����� � ���#�/�� ���� ��� ��������

�� ���������������� � ������ �� ������ �� � ��

���� 1�� ��� �� � �� �� ����� # #������ ���� ���2

�� # �# ���� !�! # ��� � ��#�� � � 1 �!!#���� � �

!#������ � ���� �# �������� ����/���� ��������2 @

�# ��## ��� 1�#&�� � �� � � ��!� � � �� � ����

�# #���� ��# �� � ����/���� �������� � !���

/�#���� �� 1� �2

����������

����= � �2 D2 E��#��������� �2 �2 ��#����� .2 �2 A '�#&�� 82 C2

�">>:�2 �� # � ����/���� �������� � � ���������� #��� �#��� ��

�#���� #������ #���2 ��������� ������� �� ) 9�;3 9H:2

�#��%� 42 D2 D�#���� �2 72 ��� �2 ?2 F�#���� )2 �2 A ������� �2

72 �2 �">>:�2 ��������� � �/������ ��# �� � !��� �� 1��� ��! #��!��

� ���2 ������� ����� ++* 9"3;"2

D#���@������� @2 ��� �� # F2 �2 A D #� � �2 �">>:�2 L� � � #

#������ � ���� �� ������ ����/���� ��������2 4���� �� "! �:3 H,2

��� �2 � #�T� $�)�UT$ +2 C�#�UT����T���� 42 ������ F2 A �#�

�� F2 D2 �">><�2 � ��!��� � ���� �# �������� � �� �����

����/���� �������� � !��� ��� #���2 ����������� ��� ���� <

">93 �,�2

� ���#�� �� # �2 D�##�� 72 ) ! ��� F2 8���## 82 )2 '��� F2 �����

��� +2 A ������ C2 �">>;�2 *�. #��������� ���� #�� ��������

�!!2 ���� � � ! #�/�� #������� �� ������� 4 ������ ! � � �.�

����� 2 � ���� %����� �� :9"3 :9H2

� ���#�� �� # �2 7����� 42 @2 ������� +2 A ������ C2 �">>;�2 ��

��� � ���# � �#��� #�� #��� ��� ��� F� ��2��#�2 � ��

!#������� � ����� �/�� #�������2 7���� 0���������� ��

)!� + �:+ !�

C�� $ �2 8�� �� 82 8 72 '2 V�� 82 V��� D2 4�� �2 � $$���

+2 F2 A '����# �2 �2 �">><�2 ����/���� ������� �������� �

#�� ��������� �� �� ������2 7���� ������ ������� �+

;,93 ;,<2

� ���� +2 F #�#� �2 A @ ��� F2 �">>:�2 )������ ���� � # �������� �

�� # � H� *�������#�/�������� �� " :����� ���0���� ���� ����� �

�� �������� � �� ������ �� � 2 � ���� %����� �+ *H:3 *H<2

'��� ?2 E����� F2 A '�1������ F2 �">>>�2 � � ���� � ��!�� ! #�

�/������ ������$ � �� �� ��� � �#� �� � ���# � � � ����/����

�������� � 1� �� �� ��������� � ����$ #2 7���� ������ ����

��� �� #�������� �* ";<"3 ";<:2

'#�� @2 �$��� V2 7�� � # 72 C��#�� +2 C#��� � 72 A 7��� +2 �">>,�2

�����/���� !#�! #�� � ������� /�#��� � !#�!���� ����� �� �����

�� � �� �������� �� �� ������ �� � �/������ � ������2 ��1

��������� &���������� "+ :>H3:>;2

8���� �2 ������� �2 A � � �������� F2 �2 �">>��2 8����� ���� �� �

���� � �� � ����$������������!#�!� � �� #�������2 ���� 2����� 2�1

������ #����������� +* �>>3 H""2

8���� �2 7�������� F2 ������� �2 A � � �������� F2 �2 �">>:�2

��������� � ����� ����/���� !�� ���� ��)��� �� ����� ����/����

# �������� #�� ������� ��� � �� ������ �� � � ���# � ��2

���� 2����� �� �� = %������� +! ":H3 ":<2

8����� �2 �1�#����& �2 D��$����� �2 A ' #� �2 �">><�2 ����/����

�� # ���� ��� !#�! #�� � � �0� $ � %��� #�� ����& #�����

�2������� ������� 82 ��# ������ #���2 ����������� 2������� +"

:,�3 :,92

F #�#� �2 � ���� +2 @ ��� F2 �� ��� �2 A C�#��� �2 �">>9�2

)������ ���� � # �������� � ��# ������� � ������� � ����� � ��

�������� � �� ������ �� � � ���� �F.�2 � ���� %����� �"

�<>3 �>�2

F���$�1� �2 4�%����� '2 7�$�&� �2 A ?����� '2 �">>*�2 � � #����

��� � !���!����!�� ���#�! #�/�� � ���� ������ �� ��������� � �

�����! #�#��� ��0��� ��#������#�!��2 %����� 0�>�� ��� ���

H�*3 HH�2

.��� �2 )����� �2 A ?�0��� F2 �">>9�2 �� ������ �� � � � #����

��� � ���� �� #�� �� ��1 �% ���� ������� 1��� ��������$ � ���� ��

� #�� �/���� 2 ��� ����� ?������ "< ��<"3 ��<<2

.���� F2 +2 A +�� T $ �2 F2 �">>>�2 �� ������ �� � � ����� �

��������� � � #�� �������2 7���� ������ ���� ��� �� #���1

����� �* "<H3"<>2

&� ����5 �� � � 6 7���� ������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �� 8" 9 ) *:)+" :""

E����� F2 F�#������ �2 ���� 72 ?�� ?2 A '��� )2 �">><�2 ������

��� � ���#� ���� �� ���� ! #�/������ �� �� ������� �� �� ����#�!�

��!��2 ������������� � "�":3"�"<2

��# %� �2 � �#�&�� �2 A ' ���� �2 ��,,,�2 � �#������ � ��� ��� �

������ �� ������ �� � � !# � � � � �� ����#2 7���� ����1

��� ���� ��� 4(�� ���� %������ ��� "<H3 ">,2

����#��� 72 C��� �� F2 7��� $ )2 �2 A D�� #�� �2 �">>"�2

7�! #�/�� ��� �� ���#�� ! #�/�� � �������� � ���� � ��

�#���� �/ � ��#�� � #������2 ��������� �� ��������� ����

+ *� �;;3 �<H2

7�����#��0 � C��� %�� .2 �#����� �2 A K���� .2 �">>>�2 ���!�#����

����� � !���!� �� ���� ��� �������� � ��� �� � �� �� # � � ���

���2 7���� ������ ���� ��� �� #�������� �* *�:3*H"2

7��� $�F�# � �2 8�##��#� +2 �2 A 7��#������/�� 42 �">><�2 � !#�� �

��# �� � ����# �� ���#������ ��� �� � !���!� ���2 7����

��� $������ �� ��� ������ ���� *� �;,3 �;92

K� C���1 �2 +��� #� �2 A ����� �2 42 �">>;�2 ���!�#��� � ��

����/���� �������� � ��!������ 1��� ���� � ��� # !��� !� ��� �

#������ � � ����� ����� �������� ������!� #�� D�� �� D��2 7��1

�� ������ ���� ��� �� #�������� �) 9H�3 9H<2

?��� � �2 F2 ?�� C2 �2 @�# # �2 )2 ��� �� �2 �2 A '� ?2 �">>9�2

7��� � �/�� �/������ � ��!��� # ������ #�� !������ ����� � ���

��$ #� � !# � � � ����/�����2 7���� ��� �������� '� #��1

�����@ $����� *� "";;3 ""<"2

?����$ C2 A � ��#��B# & �2 �2 �">><�2 4 ##��� �#������ � ������

�� ������ �� � 5 � � ���� �# ���#�/�� #������ �����2 7����

������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �< ";>3"<*2

?����$ C2 � ��#��B# & �2 �2 7�����#� ��� �2 A '�$�& �2 �">><�2

���!�#��� � ����/���� �������� � � ���������� � ���������

�� �� ������ �� ������� ��� � �� ������ �� � 2 �������

7���� ������� �� +"� >,:3>",2

&� ����5 �� � � 6 7���� ������� ���� ��� 4(�� ���� %����� �� 8" 9 ) *:)+":"�