evaluation of selected membrane filtration and most probable

12
Quantitative Microbiology 2, 129±140, 2000 # 2001 Kluwer Academic Publishers. Manufactured in The Netherlands. Evaluation of Selected Membrane Filtration and Most Probable Number Methods for the Enumeration of Faecal Coliforms, Escherichia coli and Enterococci in Environmental Waters P. JAGALS* Centre for Health and Environmental Research and Development, Technikon Free State, Private Bag X20539, Bloemfontein, 9300, South Africa *Corresponding author: e-mail: [email protected] W. O. K. GRABOW Department of Medical Virology, University of Pretoria, PO Box 2034, Pretoria, 0001, South Africa M. GRIESEL Centre for Health and Environmental Research and Development, Technikon Free State, Private Bag X20539, Bloemfontein, 9300, South Africa C. JAGALS Centre for Health and Environmental Research and Development, Technikon Free State, Private Bag X20539, Bloemfontein, 9300, South Africa Received September 7, 2000; Accepted February 1, 2001 Abstract. Selected methods recommended in national and international water quality guidelines were compared in tests on environmental waters with different levels of faecal pollution. The following methods yielded no statistically signi®cant differences in counts of faecal coliforms and Escherichia coli in raw sewage, semi-treated ef¯uent, polluted urban run-off and stored potable water: Membrane ®ltration (MF) using MFc Agar or Chromocult Coliform Agar containing X-glucuronide, or a miniaturised microtitre-plate Most Probable Number (MPN) assay using a liquid growth medium containing chromogenic 4-methyl-umbelliferyl-b-D- glucuronide. Signi®cant differences were, however, found between the Chromocult and the other methods for unpolluted river water. Counts of faecal enterococci in raw sewage, semi-treated ef¯uent and polluted urban run- off, obtained by the following methods did not differ signi®cantly: MF using M-Enterococcus Agar, Bile-Esculin Agar or Enterococcus Selective Agar, or a microtitre-plate MPN method with a liquid growth medium containing chromogenic 4-methyl-umbelliferyl-b-D-glucoside. Signi®cant differences were, however, found between the MPN and the other methods for unpolluted river water and stored potable water. MF using Chromocult Coliform Agar had useful bene®ts for the simultaneous enumeration of coliforms and E coli. However, in view of cost and practical considerations, MF using MFc Agar or M-Enterococcus Agar proved the methods of choice for respectively enumerating faecal coliforms and E coli, or faecal enterococci, in analyses for general water quality surveillance purposes. Key words: microbiological analyses methods, membrane ®ltration, most probable number (MPN), indicator organisms, faecal coliforms, Escherichia coli, enterococci, environmental water

Upload: phungngoc

Post on 01-Jan-2017

215 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

������������ ��� ������ �� �������� ����

� ���� ������ ������ �� ������� ���!������ �� "�� #����������

��������� � ���� ��� ������� ��������� ������ �������� ������ ������� �� ������������ � ��� �� ��������� ����������� ���� ����� � � � ���������� ������

� $�%�&'(

������ ��� ���� �� ���������� ������� �� ����������� ��������� ���� ����� ������ �� �� !"#�

������������ #" � ��$�� %����

&������������� $����' �(��' )��*����+�+,

) * � %+�,*)

��������� �� -���� .�����/� 0��������/ �� �������� �1 ��2 � "3� �������� 4� ��$�� %����

%+-.'.&

������ ��� ���� �� ���������� ������� �� ����������� ��������� ���� ����� ������ �� �� !"#�

������������ #" � ��$�� %����

/ $�%�&'

������ ��� ���� �� ���������� ������� �� ����������� ��������� ���� ����� ������ �� �� !"#�

������������ #" � ��$�� %����

�������� ������5�� 6� � 7 %������� ��5�$�/ 4� � 4

������ �� '������ ������� ���������� �� �������� ��� ������������� ����� 0������ ���������� ���� ��1����

�� ����� �� ������������� ������ ���� ��!!����� ������ �! !���� 1�������� "�� !�������� ������� ������� ��

������������ �����2��� ��!!������ �� ����� �! !���� ���!���� ��� ��������� ��� �� ��� ������� ����3�������

�!4����� 1������� �� �� ���3�!! ��� ������ 1��� �� �����5 �� ���� 2�������� 678 ����� 7 ���� ��

/�������� /���!��� ���� ��������� 93����������� �� � ������������ ���������31���� ��� ��� � ��

#�� �� 6�#8 ����� ����� � ��0��� ������ ������ ��������� ��������� �3������3�� ����!����3�3:3

���������� '����2��� ��!!������ ����� �������� !���� ������ ��� /�������� ��� ��� ����� ������� !��

��1������� ����� ����� /����� �! !���� �������� �� ��� ������� ����3������� �!4���� ��� 1������� �� �� ���3

�!!� � ������ � ��� !�������� ������� ��� ��� ��!!�� �����2�����5 7 ����� 3.�������� ����� ,���3.�����

���� �� .�������� '������� ����� �� � ���������31���� �# ������ ���� � ��0��� ������ ������ ���������

��������� �3������3�� ����!����3�3:3�������� '����2��� ��!!������ ����� �������� !���� ������ ���

�# ��� ��� ����� ������� !�� ��1������� ����� ����� ��� ������ 1��� �� ����� 7 ����� /�������� /���!���

���� ��� ���!�� ���2�� !�� ��� ������������ ����������� �! ���!���� ��� ��� ;������� �� ���� �! ��� ���

1������ �������������� 7 ����� 7 ���� �� 3.�������� ���� 1����� ��� ������� �! ���� !��

���1������� ����������� !���� ���!���� ��� ���� �� !���� ��������� �� �������� !�� ������� ����� 0������

����������� 1��1����

��� ����� ���� �������� �������� �������� ��� ���� 2��������� ���� 1�� � �� ��� �� 6�#8� ��������

���������� !���� ���!����� ��������� ���� ��������� ������������� �����

!� "����� ���

"�� ��� �! ������� �������� ��������� �� ������ ��� ���� �������� 0������ �! ����� ��

���� ���� ������ ��� ��� ��� 1������� !�� ������ � ������ 6-�)�+/� ����< %�� ���

���=8 "�� 1������ � >����� !�� ����� �������� ��������� ��� ������� �������

������� �� ����� �?��������� �� �� ������� ��� ������ �! ����� ����������� � !����

������ 6%�� ��� ���=< '������� ������� ���@8

7���� ���!���� ��� ������ ���� �� �������� ��� 0������ �! ����� ����� �!4������

������������� !���� ����� ������� ��� ����� �� ������ ������ ��� ����� !�� ����A���

����� ��11�� ��� ����������� ������ 6-'*� ���� ��� ���B< '������� ������� ���@8

������� �� ��� '���� �!���� )���� ������� %���������� !���� ���!���� ������� ���

1���� �� 1������ �! 1�������� ���1���� �� !�� ��� ������������ �! ��!������ �������� ���

�� ���������������� �������������� ���������� ������ ��� ��1���� !���� 6:)�7 6:�1�������

�! )���� �!!���� ��� 7�������8 ���=8 "�� ����1 ������� �! ��� ��� �! ��� ������

�����5����� 8�5���� �����5����� ��� ��������� 6:)�7� ���=8

7�� 1����������� �� ��� 2���� �! ������������� ������ ��� ����������� �1������� ���

�� ������� !��������� ��� ���� ����� �� �������� ����� � � ������ �������� ����1

��0������ � ������3���1 �������� ������ '�� � ����1 ����� � !������� !�� ���

���1����� ��� ����� ����� 6����� ��� ����������8 �! ��� 1�������� �������� ������

� ����� �� ������� ���� ��� ���� ���� �� ��� ������� ��������� ��� �A���� ��0����� !��

��1��? ������� �! �1��2 �������� �������� 6:)�7� ���=8 +���� �� �������������

���� �� � ������ ��� �� � ��� !������ �� ��� �!!���� �� ���� ����� ��������� ���������

��� �����!��� � 1������ ��0��������

������ ��������� ���� !�� �������� !���� ���!���� ��� ��� ��1��? ��� 1������

���������� 0��A ���������� �! !���� ����� 1��������� ��A��� �� �� ����� �������� !�� ��� ��

� ��� �� ������� '������� !���� ���!��� ��� ���� 2�������� 1�������� ��� ���� �����3

�1�� ��� ��� ���� ���� ������ ��� ������ ���� 6'������� ������� ���@8 "���� 1��������

��� ���������� ���1�� ��� �� � 1��!����� ���� �������� ����� � � ���3�?1��� �������

��������� ��� �� � ��� �� �! ��� !���� ���!��� ����1 ��� �� � ���� �1��2 ��������

�! !���� 1�������� ���� !���� ���!���� 6'���� �!���� ,����� �! '�������� 6'�,'8� ��@�<

%�� ���� ����< -������������ *�����C����� !�� '��������C����� 6-'*8� ���B8 '�����������

�������� �! !���� ���!���� ��� ��� ������ �����!���� ���� 1������ ���2�� ��� ��

��2����� ������� !���� !��� ����3 ������ ������� ��� ����� 1�������� �! �����

�������� 6%�� ��� ���=8 "�� 1������ �! ��� �� ����� ���� 1������� ���!�� ��������� �!

��� ���A �! ��!����� �� ����� ;������� ���������� ���1� ��� ��0����� �� ����� ��� �� �����

���1��� '������ ����� �� ��������� �� '���� �!���� ����� ���� � �� �� ���� !�� !����

���!����� ����� ��� ���� ��!2���� !�������� !�� ��2����� ��� 6:)�7� ���=8 "��

������� ����� ���3�?1��� �������� ����� �����!��� � �� ��� ���� !���� ���!���

�������� �� ������ !���� 1�������� �! ���!�� ������

+���� ������1����� �� ��������� �� ������ ������� !�� ���!���� ���� !���������

������� !�� ��� �� ��� ���1�� ���1 � ����� �! � ������ �������� ���� ������ 6��A�

���=8� �� � ���� ���� ��� ���� 2��������� �� ���� �� � ������������ ��������� 1���� ����

1�� � �� ��� �� 6�#8 ������ !�� �������� �! ��� 6-'*� �����< '���2�� ���B8

�D� $�%�&' ." �&

�������� !���� ���!���� ��� ��������� ���� �� 1����1�� ��������� �! !���� 1��������

�� ������ �! ��� ������ �������� �������� ���� ���� ������� �� ���� ����� "����

��������� ��� �?����� �� !���� � ��� ��� ����� ������� ��� ��� ���!�� ��������� ��

��1������ ���������� �! !���� 1�������� �! ����� .������� ��������� ���� � ������

��!� �1�� ���� !���� ���!���� �� ��� �0���� ����������� ��� �� �����!��� � ���� ��

����� !���� 1�������� !�� ������ 1������ �!��� 1�������� �������� 6%�������� �� � ����8

'��� ��� ������������� ������� !�� ��������� ��� ������3������� ���� �������� 0������ �!

����������� ����� �� ������� ��� ��� �! ��������� ��� '���� �!���� )���� �������

%��������� 6:)�7� ���=8 ���� ������� �������� �� ������ ����� 0������ ���������� !��

����������� ������ "���� ��������� ���� 1������ ���!�� ��!�������� ��������� ��� ���A �!

��!����� 1���� �� ����������� ����� �! �����

E������ ������� ���� �� �������� ����� ��� ��� ���� 2�������� �� � ���� ��

����� !���� �������� �� ����� "�� ���������� �! ��� ����� ���� ���� ��� �������

������� �11���� �� � ���� ���� ����� 6:������� ��� ,������� ���B8 ����������

��2�������3������� 1����� �� � '������� ������ 6���@8 ��� -'* 6���=8 ���

�����!��� ��0����� 7������� �� 6���=8 1��1���� � !��� ������ �� ��2�� !����

�������� �!��� ������� ����������� ���� ��� ����������� ������� '�� ���������� ���1�

��������� ��� ��� �! !���� �������� �� �� ��������� ���� ������� ������� !��������

+���� ��� ���3���1� �� � �������� �����3���1� �����3������� ������� !�� !���� �����3

��� ����� �����!��� ������� ��1���� ��� � ����� �! 2��� �1������� �� ������ !����

1�������� �� ����� ��������

+���� ������1����� ��� �� ��� ���3���1 .�������� '������� ����� 6��A� ���F8

������ �� ���� �� � ������������ ��0��� ���� 1�� � �� ��� �� 6�#8 6-'*� ���� 8

������ ��� ��� ������ �� ���������� 6'���2�� ���B8 "���� ��� ������� ����

������� �� ���� ����� �� �������� �� ���� ������ �������� �������� �������

"��� ����� ��1���� ��� ����� ����� ��� �!2���� �! ��� ��� ������� !�� ���

�������� ���� ����������� !���� ���!��� �������� ����������� �� ���� �� ����� !��

!���� ��������

��������� �� �������

9��� �/���

'��1��� !��� ��!!����� ����� ������ ���� �?������ �� ��� ����� ����� �! ��� �������

�������� ������� ��� �?1���� �� ���� !�� ��!!����� ������ ��� ��1�� �! !���� 1��������

7��� ����� ��1�� ���� ������� !��� ��� ����� +���� ������� �� ��� 7��� '����

�������� '���� �!��� �� ��1������ ������� ������ �! !���� 1��������5 6�8 ��� ����������<

6�8 ����3������� ���������� �!4����< 6D8 1������� �� �� ���3�!!� 6�8 ����� ����� ���

�� >���� �� 1�������� !��� �� �� ��������� ��� 6B8 ������� ����� ��11���� ������ ��

��������� ���������

.E�&G�"-*# *7 '.&./".: .,+�#. 7-&"+�"-*# �D�

����/ ����:����� �� ��� ���������

,������ �� H ��� �� H �! ��� ��� ������ ������� ������� �� ��� ������� ����� ����

�������� ������� !�� ����� ��2������� E���2����� ��� ���� ���� �����3���� ������3

2����� ������ ��������� 6��-� � ���I����?�8 ��� ���������� ����� � ���

���������� �! ��� ������ ������ ��� ������� !��� ��� ������� ������� �� ���������

��� 1���� �� �����!����� ���� ��� !������� �! ��� ��- ���� ����1� "��� ��� ���� �

�����A��� ��� ��� ������� ������ ������� !��� ��� �������� ����� �� 1���� ���� ����

6'������� ������� ���@8 /������� ���� 1�A�� �1 ���� ������� ��� � �� �?���� 1���� ��

�����!����� !��� ����� ������� ������� ���� ���� �! ��� ����� ���� �� ��� ����1� "��

������� � ������ !��� ���1�� �������� �! ��� ������� ������ ���� ���1��� �� ��4�� ���� ���

���� 1������� ��� ��� ������� � ��� �������

�������� ����� !��� ��� �# ������ ��� ��� ��0���� ��2�������� �� ��� ��C���� �� ���

�������� ����� ���� �� ��� ����� ��� ��������� ������ �������� 6������� �� � ����8

�������� �/���

��� � ����� 7�� ���� ������ �B ���1��� !�� ��� �������� ����1 1�� ����� ��1� ����

���� �� � ���� ������� ���1�� ��C� �������� 6'������� ������� ���@8 �!��� ��������� ���

2��� �B ���1���� ��� ���� ��!!������ �! ��� ���� ��� ���� ���� �� �������� ��� 2���

������� ���1�� ��C� 6;����� ��� ;����� ���B8 "��� ���1 ��� �������� �� ��2�� ����

���1�� ��C�� �! �B 1�� ����� ��1� ���� ��!2���� !�� ���������� �������� �� ���� �����

������ "�� ����A��3)����� ���� 6;����� ��� ;����� ���B8 ��� ���� �� ��1���

��� ���� �! ��� ������� ����1� "�� "�A�� �����1��3��1������ ���� ��� ���� ��

������!� ��� ������ ���� ��!!���� �����2����� !��� ��� ������ 6;����� ��� ;����� ���B<

'����'����� ���F8

��� �������� �� . ��� ��$�������

7���� ���!��� ����������� ��� ������ ��� � ��� ���� 2�������� 678 ����� 7 ����

6:�!��8 ������� �� '������� ������ 6���@8 �!��� ��� ����� �� �� B �/ � � � �/ !��

�� �� ������� �?�� ����� ��� ������ �! ��� ���� ������ �� !���� ���!����

#�� ��� �! ��� ���� ���������� � 7 ����� /��������� /���!��� ����

��������� ��� �� ������ 93���������� 6��A� ���=8 ��� 1�������� ��� ��C���

�3:3������������� ���� ������ ��� �� ������ 93����������� ������ 1������� �������

�� 1����� � ���A3 ��� �� ������ ����� 6'������� ������� ���@< ��A� ���=8 "��� ���3

���1 ������2����� ������ !�� �������� ��� � ����� �! � ��������� ���1����

��0����� ������ ��2������� 6��A� ���=< &�!����C ��� $����� ���@8 �!��� ��� ����� ��

DF �/ � � B �/ !�� �� �� ��� ������ �! ���1 ���3��3������ ������� ���� ������ �� ���

� ���������� ������ �� 6'���2�8 ���������31���� ���� 1�� � �� ��� �� 6�#8

������ !�� ����������� ��� 6-'*� �����8 ��� ���� "�� �=3���� ���� ����� 1�����

�D� $�%�&' ." �&

��������� ���������� ������ ������ ��� ��������� ��C��� �� ������ �3������3

�� ����!����3�3:3���������� 6G%8 6'���2�� ���B8 �1��2 !�� ��� 6-'*� �����8

���� ��������� ���� �11��1����� ��������� 1�� ���1�� 6-'*� �����8 "�� 1����� ����

��� ���� �� �� �/ � � B �/ !�� � ������� �! D= � ��� � ��?���� �! F� � �!��� �������

"�� ��� ��� �! ��� ��� 1��� ��� 4�������� 61�������8 ����� 6������� ����� � D== �� GE

�����8 ���� ������� � ����������� ��� �� �! 1������� ��������� ���� ������� !��� ���

������� �������� �! ��� ���� ����� 1���� ������� �� -'* 6�����8 ��� ��� ���� ��������

"�� ���� 1�� � �� ��� �� �! ��� 1������ �� ��� ���1�� ��� ���� �������� �������

�� "�����J� !������ 6'������� ������� ���@8 ��� �?1������ �� ��������� 1�� ��� �&

#� ��2�������� ���� ����

/������� �! !���� ���!���� �� 7 ���� ��� ��� �� /��������� /���!��� ����

���� ������� !�� ��2������� ��-� ��. ���� ����1� ���� ���������� ��� ���� ���

�������� ������� �� ��� 1�����1����� �������� �� ��� ������ 1������� ���� ���

�������� ������2����� A�� 6 ���I����?�� ���@8 -� ��������� ���������� ���A ��� ��

������ ������� ������� �� ��� /�������� /���!���� ������ ���� ����� ����

�*E�/'J ������ ������� �� ������� �� ��� ���� ������ 6��A� ���=8 �� ��2�� ���

�������� /�����3��� �������� �!��� ���� ������ ��2���� � 1������� ������ !��������

��� ����0������ ��� 1������ �! ��� ������� ������ ����� ���� ���� !�� ��� �������

���1� �� ���� �� �� ��� ������� ����� �! ���� ����1� ����� 8�5��� ���$�����

���$������ �����$� �$���� ��� ���$������ ��$����� �� ��!����� ���������

��� ����������� ��$�������

7���� �������� ���� ���������� �� 3.�������� ���� 6:�!��8 ������� �� ���

'������� ������ 6���@8 ����� ��� 7 �����0�� �!��� ��� ����� �� DF �/ � � B �/ !��

�� �� ��� ���� ������ �� 1��A ������� ���� ������ �� ��1��� !���� �������� "��

��� ����� ���� ������� ���� ���� �����!����� �� 1����� ���� ,���3.����� ���� 6��A�8

��� ��� ���� !�� � � �� DB �/ 67������� �� � ���=8 /������� �������� ������� ����

������ ���A ���� �� ��A ���� � ��1��� ���A ���� 6���� ���� ����� ��!!����� ���� ���

����������� ����� �� ��� ��� ����8 ���� ��������� �� � !���� �������� 6'�������

������� ���@< -'*� ���=8

.�������� '������� ���� 6��A�8� � �������� ������ !�� !���� ��������

��������� ��� ��� ������� ��� ���� ���� ��� 7 �����0�� �� � ���3���1 ������2����� �!

!���� �������� �!��� ��� ����� �� DF �/ � � B �/ !�� �� �� ��� ���� �� ��A �������

���� � ��1��� ���A ���� ���� ������ �� !���� �������� 6��A� ���F8

"�� ���� ����� 1���� �# �����0�� 6'���2�8 6-'*� ���� 8 ������ !�� ���������

������� �� ���� ���� �� ������� !�� ���� ��� ���� ���� "�� ���� ����� ����� ��������

���������� ������ ������ ��� ��� ��������� �� ��������� ��C��� �� ������

�3������3�� ����!����3�3:3�������� 6G:8 6-'*� ���� 8 �!��� �������� ��� ����

����� 1����� ���� ��� ���� �� �� �/ � � B �/ !�� � ������� �! D= � ��� � ��?���� �!

�@ � "�� 1����� ���� 1���� ���� �� GE� ��������� ��� �� ���� � ���������� �! D== ��

��� ����� ������� ��� ����� ��� ��� 4�������� ���� ��������� 1������� ��� �������

"�� ���� 1�� � �� ��� �� ��� ���� �������� 6'������� ������� ���@< -'*� ���� 8 ���

�?1������ �� ��� ��� �� �! ��������� 1�� ��� �& #� ��2�������� ���� ����

.E�&G�"-*# *7 '.&./".: .,+�#. 7-&"+�"-*# �DD

.������� ������� �� 3.�������� ����� ,���3.����� ���� ��� .��������

'������� ���� ���� ������� !�� ��2������� "�� ����3�� �� �� ��� 1��1���� ��-���

'���1 ����1� 6!�� �������� �������8 ���� ���������� ��� ���� ��� �������� ������� �� ���

1�����1����� �������� �� ��� ������ 1������� 6 ���I����?� ���F8 ������� ������ ����� ����

������ ��� ����� �����������$� �$��� ��� ���������$� ����$� �� ��!����� ���������

#������ �� $�� �����

-����� ���������/

"� �� � ���������� ��� ������� !��� ��� ������ �! ��2������� ����� "�� ������� �������

������� �������� �� 1��������� �! !���� 1�������� !�� ��� �������� ����1 "��

1��������� ���� ������ ���� ��� ��1�� �! ����� ������ .?�1� !�� ��� 1��!������ �!

��� �������� ������� �� ��� ������ ��� !�� ���� �������� ������� �� ����3�������

�!4����� ���� �! ��� ��� ���� 2�������� ������� 1������ ���� ���� �� H !���� 1��������

1��1���� �� ��� ������A !�� �������� ������ ���������� � :������� ��� ,������

6���B8

"� �� � 1������� ��� 1��������� �! ���� 1�������� !�� ��� ������ ��� ����� ��1� "���

��� ���� �� ����� �� 1������ ��� 1�������� ���� ��� ������ ������ ��� !���� ���!���

����1� '��� ��� 7 ������ ��� ��� �������� �� ����� ���� ���� ��� ��1��� ��

1��������� �! ���� 1������� ��� ��2���� ������ ��� ��� �! ���� !���� ���!���� ���

�������� �� ��A��� "�� 1��������� ���� 1������� ��� ��2���� ������� ��� ����

1������� !���� ���!���� �������� ���� ��� /�������� /���!��� ���� ������ ���������

������� ������ ��� ��� �! ���� ��� ���� ��� 7 ������ ������� ���� !���� ���!����

�� ���� ���� ��� ������ ��� 1�������� !���� ���!��� ����1

"�� ,���3.����� ��2������� ���1 ���������� ��1����� ��� ����� ����� �! ���

3.�������� ������ �?�1� !�� 1����� ������� �!4���� "�� ������ !�� ���� �� ������ -�

������� 1������� ������ ��� �� ��� ������ ��� 1����� ������� �!4����� ��� .��������

�5� 4+ ��������� �! ���� 1������� �������� ��������� ������� ���� ������� �������� �������

-������� ����1� +��

������

'���3�������

�!4����

��������

�� ��

����!!

G�1�������

�����

�����

'�����

1��� ��

�����

7���� ���!���� �� 7 ���� @� H 6�F8 F� H 6F�8 @@ H 6F@8 @D H 6�=8 @� H 6��8

��� �� /�������� /���!��� ���� @F H FF H F@ H F� H DB H

��� ���� ���� ����� 1���� �# /��2������� ��� ��0�����

.������� �� 3.�������� ���� �� H �� H @� H @� H @B H

.������� ��2���� ��

,���3.����� ����

�F H @� H @B H @F H �F H

.������� �� .��������

'������� ����

�� H ��� H FF H FB H FB H

.������� ���� ���� ����� 1���� �# /��2������� ��� ��0�����

�D� $�%�&' ." �&

'������� ������ ������� ��� ������� 1�������� �! ���� 1�������� �� �� � ������3���1 �������

�� ��� ��� �11��� �� � �� ����� �� �� ��� ���3���1 3.���������,���3.����� ������

-� �� ��� ������ �� ���� 1�������� �! ���� 1������� �������� �� ���������� �� ���� �?����

��� �# ������� ��� ���� ������� !���� 1������� �������� �� �� ��2������� ����� ����

��0����� "�� 1��!������ �! ����� ������� ���� �����!��� ���� � �������� ������� ���

������� 1��!������� �! ��� ��� ���� 2�������� ������� �� ��� !�������� 2����� "��

������� �! !���� ���!���� ��� ��� ����� ����� ������� ��� ��1���� �� 7����� �

"�� ������ ������� �����0������� ������ �� ���� �� ��� �������� ����� ��� ���� ���

���� 1��������� �! ��� �? 1��� ���� ��� ��!!����� ���������� �! !���� ���!��� ���

��� ������������ !���� ������� ��� ����� ��1�� "���� ���� �� ������������ �����2���

��!!������ ������ ��� ����� ����1� �?�1� !�� ��1������� ����� ������ ����� ���

���$�� 4+ 7���� ���!��� ��� ��� �������� ������ 1��!������ �� ������� ����� ��1��

.E�&G�"-*# *7 '.&./".: .,+�#. 7-&"+�"-*# �DB

/�������� /���!��� ���� ������ ������� �����2����� ������ ������� ���� ��� ����� ���

������� 7�� �!4����� � ������ ������ ����������� ��� !���� ����� ��� /��������

/���!��� ���� ������� �������� ��� ��!!����� ��� ��� ������������ �����2���

"�� 7 ������ �� ��� �������� �� ����� ���� ���� �����!��� ��� ����� �?1�� ����

��� ����� �1����� �! !���� ���!���� �� � 1������� ����� ���1�� ����� 1����� ������

����� ���� ���� !�� ��� ���� ����� ���1��� �� ��� ��� ��� ������� ;������� ���

/�������� ������ ����� 1������ ������ ��� ��� ���� ���� �������� ��������� ���

�1� ����� �� ����� ������ ������ �! ��� ���� ��� 7 ������ ���� ����� !����

���!���� "��� ������ �� ���� ���� ���!�� !�� �1��2���� ����������� ��� �����

,���� �� ��� ������ �! !���� 1�������� !�� ��� !���� ���!���� ��� ��� /�������� �������

��� !���� ���!��� ������ 1����� �� � � ���� ��������� ������ !�� ������� 1�����1����

!���� 1�������� �� ����� ������ �� ���� !�� ������� ���� 1�������� � ��!��� ������ ����

���������� ����� �������� !�� ��������� 1��� �� ���

7����� � ��1���� ��� ��������� �! ��� ����� ������� ���� ��� ���� �! ��� �������

����� ��1�� ���� ����1�� �� 1������� 6��� ����������� ������� �!4����� 1������� �� ��

����!!8 ��� ��1������� 6��1������� ����� ������ ������ �����8 ����� ���������

"���� ���� �� ������������ �����2��� ��!!������ ������ ������� 1������ � ��� �����

������� "�� ������ ������� �����0������� ������ �� ���� �� ��� �������� ����� ��� ���� ���

���� 1��������� �! ��� �? 1��� ������� �������� �� 4�������� �� ��� ���� �! ��� 1�������

����� ������� "��� ��� ��� �� ��� ��������� �� 0������ �! ��� ����� ����� ��1�� �� ���� �������

7����� D ��1���� ��� !��� ������� ���� �� ����� !���� �������� 7�� ��� �������

1������� �� �� ���3�!! ��� ������ 1��� �� ������ ����� ���� �� ������������ �����2���

��!!������ ������ ��� ������� �� �� � �B "�� .�������� '������� ������ ��� ���

������� ������ ������� �! �������� �� �!4���� ����� !�� ���� ����� ����� ��� �#

������ ���� �����2����� ��!!����� ������� ����� �! ��� ��� ��� ��� �������

���$�� �+ 7���� ���!��� ��� ��� �������� ������ 1��!������ �� 1������� ��� ��1������� �����

�D= $�%�&' ." �&

�������� ��� 3.�������� ������ �11����� �� ����� ������� 0���� ������� �� ���

.�������� '������� ������� ����� ������� ��� ��4���� � !���� 1�������� 6"� �� �8

7����� � ��1���� ����� �! !���� �������� � ������ !��� ��� ����1�� 1�������

����� ��������� � ��!!����� ������� "�� ������� �! ��� ,���3.����� ������ ����

��� ����� ��� ��� �! !���� 1�������� ��� ������ � ��1���� ���� ����� �! ���

.�������� '������� ������ ������� "���� ������� ���� ��� .�������� '�������

������ ������� ���� �������� ������ ������� �� 1������� ����� �� ��� ��� ����� ����� �! �

������ ���1 ����������� -� 1������� ������ ��� �# ������ �11����� �� ����� �������

������� �� ��� ��� ���� 2�������� �������� �� !����� �� �� �� �� ��1������� �����

���$�� "+ .������� �������� ������ 1��!������ �� ������� ����� ��1��

.E�&G�"-*# *7 '.&./".: .,+�#. 7-&"+�"-*# �DF

"���� ���� �� ������������ �����2��� ��!!������ ������ ��� ����1� �� ��� 1�������

����� ������� "�� .�������� '������� ������ ������� ��� ������ ������� �� � ������

���1 "�� ������� ������� � ��� �# ������ !�� ��� ��1������� ����� ������� ���� !����

�� � �����2����� ����� ���� ����� �! ��� ����� ����� ������� ��������� ���� ���� ������

����� ��� � ����� �� ���� ���������� !�� 1���� �� !���� 1�������� �� ��1������� �����

�� �����

+������ � ������ �� ���� ����� ������� ���� �� ����� �! ��� ��� 1������ ������������� !��

������� ����� 0������ ���������� 7 ����� 7 ���� ������� ��� ������ �! ���� !��

����������� !���� ���!���� �� ����� �� � ����� �! ������ �! !���� 1�������� 7 �����

/�������� /���!��� ���� ����� � ��� ���� ����� �� �11���� !�� ��� �1��2

����������� �! ���

"�� ������ �� ���� �?1������ �� ��� �?������ ���� ���������� ���� ���������� ���

��2������� ���1� ����� ��� �� ��� ��� �! ��� !���� ���!��� ������� ������ "��

/�������� /���!��� ������ ��� ��� ����� ��������� ���� �� �� 1����� ����� ���!���

��� ��� �� ��� ���� ��� ����� �� ��� ��� "��� ����� � � ���!�� ���� �� ��������

����� ���������� !�� ��� ������ ���!��� ����1 ��� � ��0�����

"�� �# ������ �� ���� � ���� �� ��� 1��� �! ��� ��� ���� 2�������� �������

)���� �� �11���� �� � � ���� �?1������ ������� ��� ��� �! ��� ������ �������� �����

��� 1����3������ !�� ��� ������� ��������� �� ���� �� ��� ���� ������� �� �� ��� ����

2�������� ������ �� �!!��� � ��� ���� �# ������ ���� ���� ��� ��0���� ��� �����

�0��1���� ��� �� ������ 1��1� ��� !������ "�� �������� ������� ���� ��� �

���� !�� 1������� ������� ��1������ �� ��� 1��1��� �! ��� ���� ;������� !�� 1��� �� ������

��� ����������� 3.�������� ������ ���� ,���3.����� ��2������� �11���� �� � ���

���� ����� �� "�� �# ������ ��� � ���� !�� ��1������� �����

���$�� 3+ .������� �������� ������ 1��!������ �� 1������� ��� ��1������� �����

�D@ $�%�&' ." �&

-� ������ � A�1� �� ���� ���� ������� �1��A��� ��� ���� ������� ��1���� �����

��!!����� 1�1�������� �! !���� ���!���� ��� !���� �������� ����� ���� ��� ���� ��

��� �������� �! ��!!����� 1��1������ �! ����� ��������� �������� ���� ��� ��� ���

������������ �� ������� ��� ������� � ������ ������� ���� ��� 1�1�������� �! ���������

������� ��� ������ ������� ��� !�� 1������ 1��1���� �! ����� 0������ ���������� �������

� ������ � ��!!����� ������� !�� !���� ���!���� ��� �������� ��� ��1��� ��

� %�����&�����

"�� #������� +������ 7��������� 1������� ��� !������ !�� ���� 1��>�� "�� '���� !��

.������������ :�����1���� ��� ����������� "����A�� 7��� '���� 1������� ���

��!���������� !�� ��������� ��� ���1��� ��� ������� ��� ��� ��������

#���� ��

���I����? 6���F8 �1���' � -�����2����� ������ !�� '���1���� /�� #� �F=�B , � ����F

���I����? 6���@8 �1� ��. � -�����2����� ������ !�� �����5�������� ��� ����� %���3�������� ���� /��

#� �FB@� , � ����@

:)�7 6���=8 '���� �!���� )���� ������� %���������� E�� � :��������� �! /����������� '�������

:�1������� �! )���� �!!���� ��� 7�������� ��������

& � :�������� $ $ ,������ 6���B8 .��������� �! ����� !�� ����������� �! !���� ����1���� �� ������� �����

���1��� $ ��� ��� ������ '(� �@D���D

$ 7�������� - -�C�� 7 & ����� " 7����� $ %����� 6���=8 � !��� ������ �! ��2������� �! 7����

'���1���� !��� 3.�������� ������ �11���� ��� .������������ ��� ������ )'6=8� ��FF���F@

) * � %�� �� 6����8 ��� ������ �! ����A��� ����� ���������5 +������� ����� ����� -�5 :���A��� )����

��� ������ � �������� ��� +���� :�����1����� 6.� 7�����8 '1������ E������ #�� K��A� 11 �@B���D

) * � %�� �� 6���=8 )���� ���� ��������5 G1���� �� ����� 0������ ���������� ��� ������ )���� '� ''6�8�

��D����

7 %��������� � ;����� # G������ & ��>��� 6����8 7���� ������������ �! ����� ����� ��11�� �� ���

'������� ���� )���� +������ '*� ��D���F

: + ;������ + ;���� 6���B8 '��������� ������ �� )���� +������� .�������� ���������

-�)�+/ 6����8 ,������1����� �� ����� ������� �� ����� 0������ ������ -������������ ���������� 7�� )����

��������� +������ ��� /������ '���� %���1 �� ;����� +������ )���� ��� ������ )���� +������ '*�

B���B�B

-������������ *�����C����� !�� '��������C����� 6-'*8 6����8 )���� ������� � :������� ��� .���������� �!

/���!��� *��������� "������������� /���!��� *�������� ��� 1�����1���� ��������� ��� � ���� �5

�� ���� 7��������� ����� -'* �D�@3�5���� -������������ *����������� !�� '��������������� %�����

-'* 6�����8 )���� ������� � .���������� �! ��� �� '��!�� ��� )���� )����5 � ����������� ����� �

-��������� �� &�0��� ���� 6�#8 :������ -'*�"/��F�'/��)%�3):�D�@3D -������������ *�������3

���� !�� '��������������� %�����

-'* 6���� 8 )���� ������� � .���������� �! ���������� �������� �� '��!�� ��� )���� )����5 �����������

����� � -��������� �� &�0��� ���� 6�#8 :������ -'*�"/��F�'/��)%�3/:F@��3� -������������

*����������� !�� '��������������� %�����

-'* 6���B8 )���� ������� � :������� �! /���!��� *��������� ��� ��������� ��� � ���� �5 �� ����

7��������� ����� -'* :-' �D�@3� -������������ *����������� !�� '��������������� %�����

-'* 6���=8 )���� ������� � :������� �! !���� �������� � ��� ���� 2�������� -'* /�������� :��!� F@��3�

-������������ *����������� !�� '��������������� %�����

.E�&G�"-*# *7 '.&./".: .,+�#. 7-&"+�"-*# �D�

+ &�!����C� + $���� 6���@8 /��1������ �! � #���� /���1����� ��� ��� ��� �������� 2���� �����0��

!�� ����������� ����� ���!���� ��� ��������� ��� ������ �� ����� .������ "�?��� )���� ���� !(�

�BF��=�

��A /��1������� 6���=8 /���!���� ���� ����� ���� ������ /�� #� � ����= ��A ����� =��F� :���������

%������

��A /��1������� 6���F8 ��� ������ ����� &�+* G,�3E ��A ����� =��F� :��������� %������

� �������� & � :�������� $ 7 ;��������� $ :������� 6����8 .���������� � � ������������ ������ �!

��������� ���� �����������$� 5���� ��� �������� �� ��������� �! ��� ������ �! !���� 1�������� �! ������

$������ �! �11���� ,���������� +,� B�B�BD�

'���� �!���� ,����� �! '�������� 6'�,'8 6��@�8 '���� �!���� '������� '1��2����� !�� )���� !�� �������

��11���� '�,' ����� ���3��@� "�� /����� �! ��� '���� �!���� ,����� �! '��������� �������� �B11

'���2 :��������� ������� 6���B8 .���������� �! ��������� ���< ������������ ������ � ���������� �� ��0���

����� 6�#8 /�� �� BDF@�� �����3&� /�0������ 7����

'����'��� 6���F8 '��������� ��!�����5 G���� ����� '�'' '���� -� /�����

'������� ������ 6���@8 '������� ������ !�� ��� .?��������� �! )���� ��� )���� )���� 6���� .��8

6.�� � : .����� & ' /������� � . %���� ���8 ������� �� �� ;����� ����������� )��������� :/�

�3���3��F

��� $�%�&' ." �&