Evolutionary Microbiology

Chapter 9. Microbial Taxonomy & Harmful Algal Bloom

Jong-Soon Choi

Chungnam National Univ. GRAST

University of Science and Technology

Korea Basic Science Institute

170

I. Microbial Taxonomy

“지구상의 미생물” 지구상의 미생물 개수 : 4~6x1030, 30~50억 톤 전체 biomass의 50% 곰팡이 150만 종, 원핵미생물(세균+고균) 1백만~10억 종 추정*현재까지 등록된 미생물: 곰팡이 10만 종, 원핵미생물 9천 종

바이러스 2천 종, 원생생물 10만 종

미생물이 잘 발견되지 않는 이유 미생물의 난배양성 : 인위적 배양배지에서 99%가 못 자람 바닷속 가장 많은 Pelagibacter : 해양 원핵미생물의 1/3 차지

지난 100년간 미생물 배양과정에서 확인불가바닷물 속 미생물 유전체 분석(2002)으로 확인

지구에 존재하는수 많은 미생물 중알려진 미생물은빙산의 일각

Morris et al., (2002) SAR11 clade dominates ocean surface bacterioplanktoncommunities. Nature 420, 606.

(Source: 재난미생물 -여문각) 171

미생물의 분류기준

미생물은 형태적 특성으로 분류하기는 불가능함

미생물분류학

분류학이란? 생물계를 일정 규칙에 따라종,속,과,목,강,문,계 등의 단계로 정리

이것들의 상호관계나 계통분화 연구학문

16S rRNA의유전자 염기서열을 계통학적분석에 도입한Carl Woese박사와George Fox 박사 (1977)

I. Microbial Taxonomy

172(Source: 재난미생물 -여문각)

미생물분류학 우즈 박사의 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 분석 도입 생명계통수 겉으로 보이는 표현형이나 생화학적 특성 < 유전자들의 분자수준에서 유사도 비교

(분자계통학)

16S rRNA 유전자와16S rRNA의 리보솜구성성분으로서의 역할

리보솜 유전자는 세대가 지나도크게 변이가 생기지 않고 잘 보존리보솜 : 진화 역사 추적의 최적의유전물질 중 하나

• 5S 유전자: 120nt, 너무 짧아내재 정보양이 적음

• 23S 유전자: 2,906nt, 너무 커서 서열판독 비용과 노력이 큼

• 16S 유전자: 1,542nt, 적절16S rRNA 유전자를 증폭하는데 사용되는 대표적인 공통 프라이머

I. Microbial Taxonomy

173(Source: 재난미생물 -여문각)

생물분류에서 최상위단계의 체계 우즈 박사가 제안한 3개도메인 체계

5 kingdom system

Animalia

Plan

tae

Fungi

Protista

Monera

3 domain system

Bacteria

Arch

aea

Eucarya

Archaeaarchaios (Gk) 고대의, 원시의고온, 강산성, 강염기성, 고염도 극한미생물Archaebacteria(고세균) < Archaea(고균)Monera: 세균 + 고균

I. Microbial Taxonomy

174(Source: 재난미생물 -여문각)

세 개 도메인을 구분하는 특징들

고균은 핵막, 염색체,인트론, 리보솜, 오페론 등에서는 세균과닮았음

세포벽, 단백질합성, DNA-히스톤 복합체, RNA중합효소, tRNA인트론 등은 고균과진핵생물과 유사

I. Microbial Taxonomy

175(Source: 재난미생물 -여문각)

미생물 종(species)의 정의

Ernst Mayr의 제안: 다른 종과 생식적으로 격리되어 종 내에서만 교배를 통해 생식능력을 온전히 갖춘 자손을 생산할 수 있는 무리

그런데, 많은 미생물들은 성별 없이 무성생식으로 번식. 어떤 기준으로‘종’을 정의??

현재까지 성립되어있는 종의 정의 : 조상부터후손까지 내려 온 수직적 유전자의 전달경로를추적하여 유전자 특성이 확연히 달라지는 분지점(clade)를 찾는 것 ‘종’규명의 시작

수평적유전자이동(horizontal gene transfer): 계통적으로 거리가 먼 서로 다른 종간 유전물질을 주고 받음 종 구분을 어렵게 함

‘종’의 경계가 모호함 1. 균주간의 DNA-DNA 혼성화율 70%이상이면 같은 종2. 균주간의 16S rRNA 염기서열 유사도 97%미만다른 종

I. Microbial Taxonomy

176(Source: 재난미생물 -여문각)

미생물 종(species)의 규정

1987. 국제원핵미생물분류위원회(Int’l Committee on Systematic Prokaryotes) 원핵 미생물 종의 기준 : DNA 혼성화(DNA-DNA hybridization)>70% DNA 혼성화 실험은 유전체간 유사도를 가장 잘 반영하나 실험 자체가 까다롭고 비용이 많이 발생, DB공유 어렵고 먼 유연관계 적용 어려움

DNA-DNA 혼성화 실험의 원리-1969년 Brenner에 의해 개발-변성-재결합 과정을 통해 DNA-DNA 염기쌍 형성 정도를 측정1) 분광공도법 @260nm2) 멤브레인 고정법 NC,

Isotope label3) 마이크로플레이트법 PB,

SybrGr4) S1뉴클레아제, HA법 ssDNA

분해5) 유전체시퀀스기반 ANI값

I. Microbial Taxonomy

177(Source: 재난미생물 -여문각)

미생물 종(species)의 규정

DNA 혼성화실험결과와 ANI와의 상관성 조사

ANI 값과 DNA-DNA 혼성화율과의 상관관계 그래프(Goris et al., 2007. IJSEM57, 81)

16S rRNA에 의한 계통분류방법이 DNA 혼성화율보다 실험이쉽고 빠르며 값싸고 실험결과안정적이며 DB 공유 가능

ANI, Average Nucleotide Identity

16S rRNA 염기서열 유사도 97%미만균주들은 DNA 혼성화율 또한 70% 미만

16S rRNA 유사도가 97% 이상일 때, DNA 혼성화율은 10~100%

16S rRNA 염기서열 차이 3%이상이 다른종, 이하이면 같은 종 또는 다른 종일 가능성

I. Microbial Taxonomy

178(Source: 재난미생물 -여문각)

표준균주 새로운 세균 무리를 발견, 새로운 종으로 지정하기 위한 대표 표준균주 선정 필요 표준균주로 선정된 균주는 이 종을 대표하여 종의 경계를 설정하는 쉼점 역할 새로운 균주 발견시, 표준균주와 비교하여 DNA 혼성화율이 70%이상 같은 종

종의 표기법 속명(genus) + 종명(species) : 종을 묘사하는 형용사형 예) Escherichia coli : 미생물학자 Escherich의 이름을 따 리틴어화 coli, Lk. of the colon 대장의 (column의 형용사형) 예) Staphylococcus aureus : aureus, Lk. golden ‘금빛 포도상구균’

원핵미생물 명명 관리 명명에 관한 법전 (Bacteriological Code) 국제원핵미생물분류위원회 (ICSP) : 법전에 따라 세균과 고균의 이름을 관리하는 기구 1980년 1월1일, ICSP에서 이전 체계 없이 관리되던 원핵미생물 종명을 정리 과거 수 만종의 미생물 2,500종(1980) 9,000종(2010) 매달 출간하는 Notification list(IJSEM)와 Validation list(기타 저널)에 실어서 공표 ICSP에서 신종으로 인정하기 곤란한 미생물 종은‘invalid name’으로 표시 예) “Pseudomonas denitrificans”

I. Microbial Taxonomy

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동일 종 내 서로 다른 균주 구분법 균주(strain) : 하나의 세포에서 증식하여 유전적으로 동일한 군집 즉, 유전인자 중 일부 변이된 경우 모세포와 다른 독립적 균주로 분리 균주명 작성법 : 처음 보고자가 숫자와 영문자 조합하여 정함 예) Mycobacterium tuberculosis CTRI-2 예) Mycobacterium tuberculosis H37RvT (표준균주)

원핵미생물의 균주(strain) 개념

균주센터(Culture Collection)

I. Microbial Taxonomy

180(Source: 재난미생물 -여문각)

새로운 미생물 종의 입증 신종 발견 및 국제적 인정을 받으려면 (1) 신종 등록 균주센터 기탁, (2) 종의 형질

기술, 논문 출간 국제원핵미생물학회는 적어도 서로 다른 국가에 있는 2곳 이상의 균주센터에 균주를

기탁한 경우에만 종의 지위를 인정 신종 등록을 위해서 균주센터를 정해서 기탁신청서와 함께 균주 전달 균주센터에서는 자체 동정 실시, 균주품질 검사 후 장기보관용 저장분(stock) 제작 장기보관 위해 균주를 동결건조, -80도 이하 초저온 냉동고에 보관 신종의 논문 출간을 위해 유전체적/표현형적 특성을 기술

원핵미생물 종 기술을 위한다상적 분류체계의 범위

I. Microbial Taxonomy

181(Source: 재난미생물 -여문각)

유전체적 특성1. 16S rRNA 계통분석 : 표준균주 염기서열과 비교 분석 (EzTaxon, RDP, Silva 등)

16S rRNA 유전자 염기서열을 모아정리한 데이타베이스

계통분석 (CLUSTAL, jPHYDIT, MAFFT, Muscle 등)

염기서열 정렬모식도

염기서열간의 거리(distance)에 기반한 계통수 추정과정의 모식도

I. Microbial Taxonomy

(Source: 재난미생물-여문각) 182

유전체적 특성2. DNA G+C content : 유전체 염기서열에서 GC가 차지하는 비율, 20~80 mol%

예) 대장균 GC%=50, 방선균 GC%=73, 종 내 균주간 5% 차이, 속내 종간 10%

GC content 측정을 위한Tm법과 HPLC법

3. DNA fingerprinting : 유전체와 유전체 사이 관계를 대략적으로 확인하는 방법예) RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

PFGE – Pulsed Field Gel ElectrophoresisARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction AnalysisAFLP – Amplified Fragment Length PolymorphismRAPD – Random Amplified Polymorphic DNARibotyping

전체 유전자

개별 유전자

DNA Fingerprinting의원리

I. Microbial Taxonomy

(Source: 재난미생물-여문각) 183

표현형적 특성1. 형태적 특성 : 세포 형태와 콜로니 형태, 크기, 내생포자(endospore) 형성여부,

내포물, 편모, 운동성 여부, 그람염색(Gram-staining)

형광현미경, 주사전자현미경, 투과전자현미경을사용한 세포 형태 관찰

2. 생리적 특성 : 탄소/질소원, 에너지원, 발효산물, 영양형태(자가/타가영양), 최적 생장조건(온도, 염도, 산도, 호기도), 이차 대사산물, 항생제감수성, 효소활성 등

API 20NE를 사용한생리적 특성검사의 예

I. Microbial Taxonomy

184(Source: 재난미생물 -여문각)

표현형적 특성3. 화학적 특성 : 세포의 화학적 구성성분 차이를 바탕으로 균주분류

예) 지방산, 마이콜릭산(마이코박테리움 세포벽), 극성지방, 퀴논, 세포벽성분

그람 양성균과 음성균의세포막/세포벽 구성과화학분류적 실험결과예시

I. Microbial Taxonomy

185(Source: 재난미생물 -여문각)

알긴산 분해 미생물 AlyHP32T

성게 내장에서 분리

그람음성, 운동성, 단편모 보유16S rRNA 분석 Vibrio 속

주요 지방산 : C16:1 6/7c, C16:0DNA G+C content : 44.1 mol%Predominant quinone : ubiquinone Q-8Vibrio hemicentroti sp. nov.registered AlyHP32T=KCTC32085T=DSM 26178T

I. Microbial Taxonomy

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II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

녹조란?녹조(綠藻), green tide (초록 밀물)

녹조의 발생기전수생 환경에서 현미경적 조류 미생물의 숫자가 이상 증식하는 현상담수(fresh water)나 해수(marine water)에서 발생, 식물성 플랑크톤

녹조는 왜 녹색?녹색 색소(클로로필, chlorophyll), 500nm 녹색파장 빛 흡수

클로로필 자체는 청색과 적색을흡수하므로 상대적으로 녹색으로보여짐.우리 눈의 망막 색소층에 있는색소 단백질 로돕신(rhodopsin)의 색소 레티날(retinal)은 반대로녹색을 흡수함.

187(Source: 재난미생물 -여문각)

분광학(Spectroscopy)과 분광측정기(Spectrometer)

미지의 분자구조와 성질을 알기위해서 외부에서 빛을 쪼여 나타나는 현상으로 규명외부에 빛 조사 분자는 회전(rotation), 진동(vibration) 같은 특정 에너지 파장 흡수 특이한 흡수 스펙트럼(absorption spectrum) 물질의 정성-정량분석, 분광측정기

분광측정기 : 어떤 물질의 반사(reflection)나 투과(transmission)의 특성을 파장 함수로나타내는 정량 측정장치

단일 빔 분광기의 내부구조화학반응의 평형점에서반응물과 생성물의상대적 농도 측정

큐벳 내 담겨있는 용액에 빛을 입사 및 투과물질의 정량분석 : 비어-람버트 법칙(Beer-Lambert Law)A=-log(I1/I0)=abc (a, 물질의 흡수계수, b, 액층두께, c,물질농도)T=I1/I0=10-abc A=-logT, T=10-A

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

188(Source: 재난미생물 -여문각)

녹조를 일으키는 미생물?남조류(藍藻類, blue-green algae) 또는 남세균(藍細菌, cyanobacteria)진핵생물 조류(藻類, algae)

조류란?해초(seaweed, alga)자가영양생명체(autotrophic organism) (예, 거대 켈프 해초류 ~65m)

남세균?유산소 광합성 원핵미생물, 35억년 전 출현스트로마토라이트(층상석회석, stromatolite)

서호주 샤크만에서발견되는 스트로마토라이트 (수직 층상석회석)

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

189(Source: 재난미생물 -여문각)

녹조의 발생 원인?부영양화(eutrophication)에 의한 식물성 플랑크톤의 이상증식물리적, 화학적, 생물학적 요인들의 복합적인 요인

녹조의 위험성?수계 바닥의 탈산소환경(저산소증 hypoxia, 무산소증 anoxia)

녹조를 일으키는 미생물?녹조(green alga, Chlorophytes), 와편모충(dinoflagellates,지중조류(cryptophytes), 황금색조류(chrysophytes), 남세균(cyanobacteria)

녹조 발생 낙동강 하류지역에서 폐사한 물고기

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

190(Source: 재난미생물 -여문각)

남세균도 독소를 만든다?남세균은 각종 독소물질을 만들어 인간을 포함한 가축에도 피해를 입힘

주요 남세균 이상증식의 대표적 질소고정 남세균 (좌로부터, Anabaena, Aphanizomenon, Nodularia)

주요 남세균 이상증식의 대표적 질소비고정 남세균 (좌로부터, Microcystis aeruginosa, Oscillatoria, Lyngbya sp.)

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

(Source: 재난미생물 -여문각) 191

녹조 발생요인

- 질소(nitrogen)와 인(phosphorus)- 유기물질(organic matter)- 철(iron)과 미량원소(trace elements)- 전도도(conductivity)와 염도(salinity)- 수계의 교란상태(turbulence)- 강물의 머무름(residence) 또는 세척(flushing) 시간- 물기둥의 수직층상화(vertical stratification) 및 안정성- 미생물, 경쟁자와 소비자와 상호작용- 인간의 개임과 종의 치환(displacement)- 기후변화(climate

change)

N:P molar ratio20, 진핵세포성 조류의 이상증식

물기둥의 층상화 > 30일,녹조 현상 발생

온도 > 15도, 녹조발생 시작온도=20, 녹조 최적 온도

N, P 풍부, 질소 비고정녹조미생물 번성P 풍부, 질소고정 남세균번성

남세균의 이상증식을 나타내는 시공간 상에서 물리, 화학, 생물학적 환경과상호작용 관계를 나타내는모식도

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

192(Source: 재난미생물 -여문각)

16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 녹조 미생물 균총분석16S rRNA의 변이부위의 종 특이적 부위를 유전자증폭을 통한 DNA 단편 서열분석Gene bank에 2천만 개 염기서열 등록, 이 중 9천 개 이상이 16S rRNA 염기서열

병원성 미생물(Bacillus anthracis, B. thuringiensis, Shigella)은 16S rRNA 서열만으로는 종 식별이 불가능하므로 항존유전자(rpoB, GyrB, groE) 등을 이용

차세대 대용량 염기서열분석법을 이용한 DNA 분석실험 과정

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

193(Source: 재난미생물 -여문각)

대용량 염기서열분석법과16S rRNA 유전자를이용하여 분석한 7종류의 젖갈시료의 고균(A)과 세균(B)

16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 미생물 균총분석

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

194(Source: 재난미생물 -여문각)

녹조 남세균 졸들의 유연관계. 남세균의 16S rRNA 염기서열 기반의계통수(왼쪽)와 nifH 유전자 염기서열에 기반을둔 계통수(오른쪽)

16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 녹조 미생물 균총분석

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

195(Source: 재난미생물 -여문각)

남세균 독소

남세균 간독성 물질 : Microcystin,Nodularin(환형 펩티드),

Cylindrospermopsin(알카로이드)남세균 신경독성물질 : Anatoxin(항아세틸린콜린효소 물질)

1996. 브라질 카우아루 지역 혈액투석 환자 50명 집단 사망 음용수 내 남세균독소 마이트로시스틴LD50 of MC = 25~60g/kgLD50 of cyan gas = 4mg/kg

남세균 독소에 대한 해독제 없음

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

196(Source: 재난미생물 -여문각)

녹조 미생물을 이용한 바이오 에너지 개발

조류를 이용하여 생물연료와 부산물을 개발할수 있는 다양한 방법과경로

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

197(Source: 재난미생물 -여문각)

녹조 미생물을 이용한 바이오 에너지 개발

광합성 미생물을 배양하기 위한 유리관 광생물반응기

조류 바이오매스 활용기술 관련 국가별 논문발표 현황

II. Algal Bloom and Microorganisms (녹조와 미생물)

198(Source: 재난미생물 -여문각)

The most recent meteorites to leave Mars for Earth

Does Earth Share Microbes With Mars Via Meteorites - Or Are They Interestingly Different For Life?

(Source: www.google.com) 199