Cromatografa

Cromatografa1Descubridor El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919) DefinicinCromatografa es un mtodo de separacin en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla.3Cromatografa, definicin (cont.)Una columna u otro soporte mantienen a la fase estacionaria y la fase mvil acarrea a la muestra.Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase estacionaria estarn ms tiempo dentro de la columna.4Si es en columna :Conforme los componentes son eluidos de la columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para anlisis posterior5Mtodos cromatogrficosDe gasesEn capa finaEn lquidos inmovilizadosDe exclusin molecularIntercambio inicoHidroxiapatitaHidrofbicaAfinidadHPLC6Exclusin molecularFase estacionaria:Dextrn con enlaces cruzadosAgarosa con enlaces cruzadoPoliacrilamida Las molculas grandes fluyen ms rpido que las pequeas. 7Desarrollo de una cromatografa de exclusin molecularDeterminacin del tamao de la columna Hidratacin y lavado de la resinaEmpaque de la columnaDeterminacin del volumen vacoCorrimiento de la muestra8Caractersticas de las resinas de EM clsicasBioGel

Sephadex

P-60P-100P-200P-300G-50G-100G-150G-2003-605-10030-20060-3002-304-1505-3005-600NombreCdigoRango de Fraccionamiento(kDa)Flujo mximo(cm/hr)554355329Intercambio inico10Intercambio inicoLas protenas difieren mucho en su afinidad por materiales cargados positiva o negativamente.Los soportes pueden ser:Dextrn con enlaces cruzadosAgarosa con enlaces cruzadoPoliacrilamidaCelulosaPoliestirenoSlice11Grupos intercambiadoresCarboximetilo (CM) CH2 CH3(CH2) NHCH2 CH3+PO3-CH2 COO-Fosfato (P)Dietilaminoetil (DEAE)212Principios del intercambio inicoLa afinidad de una protena es proporcional a la concentracin de sal requerida para liberarla del material.

Una columna se carga (de protenas) con un amortiguador de baja fuerza inica y la elusin se inicia por incremento de la concentracin del amortiguador de elusin.13Desarrollo de una cromatografa de intercambio inicoHidratacin y Lavado de la resinaActivacin (lavado con cido y base fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usar ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) Volumen de la columna y capacidad de retencin de la resina.14Amortiguadores Para intercambiadores aninicos se deben usar amortiguadores catinicos o zwitterionicosNo usar amortiguadores aninicos pues se unen a la resina.Usar detergentes catinicos o no inicos.15Hidroxiapatita (HA)Introducida por Tiselius et al. en 1956Bernardi realiz un estudio sistemtico16Frmula Forma cristalizada de fosfato de calcio

(Ca10(PO4)6(OH)2)17Unin selectiva de protenas a la hidroxiapatitaA, es una protena bsica.B, es una protena acdicaEl tringulo indica enlaces de coordinacin.Los dobles parntesis indican repulsin.Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos amino son atrados por los sitios fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para los carboxilos.18Adsorcin de grupos aminoSe debe a interaccin electrosttica no especfica entre su cargas positivas y las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de fosfato.19Incremento de la unin de aminas por bloqueo de la repulsin.A, es una protena bsica.B, es una protena acdicaEl tringulo indica enlaces de coordinacin.Los dobles parntesis indican repulsin.Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos fosfatos en solucin pueden cubrir a calcios que repeleran a los grupos aminos.20Disociacin selectiva de la hidroxiapatitaA, es una protena bsica.B, es una protena acdicaEl tringulo indica enlaces de coordinacin. Notar que estos no se afectan.

21UsosPurificacin de:Protenascidos nuclicosVirus 22Bases de la TcnicaSu selectividad no depende de la masa molecular, densidad de carga o punto isoelctrico.23Bases de la tcnicaLa adsorcin y la elucin de las protenas no son procesos en reversa de un solo efecto.Los grupos amino y carboxilo actan de manera diferente en la adsorcin de las protenas a la HA.La elucin de protenas cidas y bsicas por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.24Ventajas HA tiene poco poder de adsorcin de molculas de masa molecular baja como nucletidos, sales y aminocidos.Es relativamente incompresible.Existen variantes cermicas ms fciles de trabajar pues no se compactan.25Cromatografa hidrofbica26 Cromatografa HidrofbicaLos grupos adicionados al soporte son el alcohol octlico, grupos bencnicos u otros grupos hidrfobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18).

Los centros hidrfobos de las protenas son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.27Cromatografa de AfinidadSistema muy poderoso de purificacinSistema restringidoSe basa en la interaccin especfica de dos compuestosAntgeno - AnticuerpoEnzima - sustratoReceptor - Ligando28HPLCCromatografa lquida de alta resolucinHigh-performance liquid chromatography 29Limitaciones de la cromatografa a bajas presionesImposibilidad fsica de aumentar el flujoResinas compresiblesCorridas de muchas horasGrandes volmenes

30Descubrimientos que facilitaron la HPLCSntesis de resinas incompresiblesNuevas tcnicas en el empaque de las columnasMicroparticulacin de las resinasAdelantos en la tecnologa espectrofotometrica31Tipos de HPLCDe exclusin molecularIntercambio inicoHidrofbicaAfinidadDe fase reversa32InstrumentacinSistema de bombeoResistente a qumicosPoca variabilidadPresiones de 30 as 400 atmFlujo constante (libre de pulsos)Buen mezclado de los solventesReproducibilidad en la formacin de los gradientes33Tipos de bombasJeringaPistn recprocoDiafragmaPresin constante34DetectoresDetectores de UV-Visible que pueda leer 2 o ms longitudes de onda al mismo tiempoDetector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.

35Cromatografa de fase reversaSe basa en las propiedades hidrofbicas de las protenas.

El proceso de elucin es diferente que en la cromatografa hidrofbica.

La fase mvil es un solvente orgnico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).36Fase estacionariaSlica acoplada con un derivado alquilsilano.La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4, C8, C18.La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 AEl tamao de las partculas es de 5 a 20 mo37Fase mvilLa acidez de la fase mvil:Influencia el estado inico de la protenaControla la ionizacin de la superficie silanolForma pares inicos con la zona catinica de la protenaFavorece la exposicin de zonas hidrofbicas de la protena38HPLC de Fase ReversaSeparacin eficiente an con concentraciones altas de protenasBajo ruido de fondoSolventes voltilesFcil formulacin de la fase mvil Reproducibilidad de gradientes.39

HPLC WATERS modelo antiguo40

HPLC WATERS41

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44Cromatgrafo de Gases

45Principales componentesGas de acarreoControladores de flujoInyectoresColumnasDetectoresSistema de datos

46Gas de acarreoCon ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (make-up).

El make-up, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector.

El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxgeno.

Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares. 47