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69EXPOSICIÓN MULTIVALENTE CON LA UTILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PVIII DE LA CÁPSIDA DE LOS FAGOS FILAMENTOSOS

EXPOSICIÓN MULTIVALENTECON LA UTILIZACIÓNDE LA PROTEÍNA PVIIIDE LA CÁPSIDA DE LOS FAGOSFILAMENTOSOS1FRANCO FELICI, 2YAQUELIN PUCHADES, 2MARIA ELENA FERNÁNDEZ DE COSSIO,2NELSON SANTIAGO VISPO

CAPÍTULO 5

Una de las aplicaciones más importantes de la tecnología de presentación depéptidos y proteínas en la superficie de los bacteriófagos es la construcción debibliotecas peptídicas combinatorias. Estas representan una fuente de secuen-cias a partir de las cuales se han logrado identificar epítopos, mimotopos, sitiosaccesibles y/o funcionales de diferentes antígenos [1], modificaciones post-traduccionales de moléculas diversas [2]; y también se han logrado generarantagonistas de interacciones intermoleculares [3].

Las secuencias al azar de péptidos o proteínas de estas bibliotecas son presen-tadas como proteínas de fusión con elementos de la cápsida de los fagosfilamentosos como son las proteínas pIII o pVIII [4-8]. Los fagos selecciona-dos pueden ser purificados por afinidad y su ADN puede ser secueciado parainferir la secuencia aminoacídica del péptido expuesto.

Entre estas dos proteínas la pVIII es la proteína mayoritaria de la cápsida,presentada en 2700 copias aproximadamente en cada partícula de fago mien-tras que pIII es representada solo por cinco copias. Esto constituye una impor-tante diferencia entre los dos tipos de proteínas que las hace específicas parapropósitos diferentes: la selección de uniones de baja afinidad o de alta afinidad,respectivamente.

El alto número de copias de la proteína recombinante pVIII por partícula fágicaha permitido obtener un sistema de alta sensibilidad, donde bibliotecas de péptidostanto lineales como conformacionales han sido favorablemente usadas en laselección de ligandos específicos para diferentes anticuerpos monoclonales y

1 Università di Messina. Salita Sperone, 31. 98166 Messina, Italy.2 Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

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policlonales [9]. Esta alta valencia tiene ventajas en experimentos en los que losblancos son receptores de baja afinidad. En el extremo amino terminal de pVIIIpueden hacerse inserciones de péptidos de hasta seis aminoácidos sin que estosinterfieran en el ensamblaje de la partícula viral [10-12].

La presentación de péptidos mayores inmunológicamente accesibles sólo esposible cuando se superinfecta con un fago auxiliador y la actividad del promo-tor frente al gen VIII se modula, de modo que se ensamblan cápsidas híbridasdonde pVIII fusionada está dispersa en un contexto de pVIII nativa. La densi-dad del péptido en la superficie del fago depende de la secuencia del péptido yvaría desde menos de 100 hasta 1000 por fago y puede ser modulada medianteel control de la actividad del promotor [13-15].

El uso de estas dos proteínas ha permitido manipular las afinidades de los ligandosseleccionados y mejorar considerablemente la interacción entre moléculas. Di-ferentes grupos han empleado la multivalencia de pVIII para acumular un am-plio espectro de péptidos en los primeros ciclos de selección para un blancodado y a partir de las moléculas seleccionadas se construyen nuevas bibliotecasen el sistema de exposición de péptidos en pIII, donde la valencia es baja, con elfin de encontrar mayores afinidades.

El aislamiento de péptidos que unen y activan el receptor de la eritropoyetina esun ejemplo donde ha sido aplicada esta estrategia que permitió aislar un péptidode 20 aminoácidos capaz de unirse y activar el receptor para la eritropoyetina[16, 17]. En los primeros experimentos se utilizó la alta valencia de pVIII paraseleccionar péptidos de una afinidad en el orden de los micromoles (KD » 10 µM).Una vez identificadas estas secuencias se construyeron sub-bibliotecas de lospéptidos seleccionados a partir de la presentación monovalente de pIII y selogró capturar péptidos que interaccionaron con mayor afinidad (KD » 200 nM)con la molécula blanco. En este caso la secuencia del péptido seleccionado nose encontraba en la secuencia lineal de la eritropoyetina.

Los procedimientos que siguen describen la construcción de una biblioteca denonapéptidos aleatorios en la proteína pVIII de la cápsida de los fagosfilamentosos con el vector PC89 el cual contiene el gen VIII bajo el control delpromotor lac inductivo con IPTG [14].

PREPARACIÓN DEL INSERTO (BIBLIOTECA)Para obtener una biblioteca de péptidos de nueve aminoácidos con secuenciasal azar presentados en la proteína pVIII se sintetizaron oligonucleótidos consecuencias degeneradas, cuyos esquemas de codones pueden ser NNN o NNG/C,


los cuales codifican para los 20 aminoácidos esenciales y para los 3 codones deparada en el primer caso y uno solo (TAG) en el segundo. El ADN de doblecadena que se obtuvo fue clonado, en el vector PC89, como fusión al gen quecodifica para la proteína VIII de la cápsida de los bacteriófagos (Fig. 5.1).

1. Hibridación de los oligonucleótidos (R35: GCGGGATCC(N) 27GAATTCACCCGy R36: CGGGTGAATTC.

1.1. Mezclar Oligo 5’ (200 pmol), Oligo 3’ (200 pmol), SOH (40 µL) (Tris-HCl 200mM pH 7,5, MgCl2 50 mM, NaCl 250 mM) y H2Od (Vf = 200 µL)en tubos de microcentrífuga.

1.2. Calentar durante 5 min a 65ºC.

1.3. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente.

Este procedimiento debe realizarse por triplicado

2. Síntesis de la doble cadena de los oligonucleótidos.

2.1. Añadir a cada tubo 40 µL de dNTP-s (Pharmacia, Suecia) (cadadeoxinucleótido a una concentración de 2,5 mM), 10 µL de Klenow(Subunidad de la ADN polimerasa, 1,5 U/µL. Boehringer Mannheim,Alemania) e incubar a 37 ºC durante 2h.

Figura 5.1. Representación esquemática de la construcción de la biblioteca de nueve aminoácidosal azar insertados en la proteína pVIII de los fagos filamentosos.

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Para este procedimiento se recomienda el uso de la Klenow en lugar de lareacción en cadena de la polimerasa (PCR), de esta manera se evita lasobre-amplificación de algunas clases específicas del oligonucleótido molde.

3. Aplicar 10 µL de la mezcla de reacción en un gel de agarosa NuSieve GTGal 4 % (FMC BioProducts, Estados Unidos) en una solución de TBE 0,5X(Tris-Borato 0,45 M, EDTA 0,01M). En paralelo, aplicar 10 pmol deloligonucleótido R35 utilizado como molde, una diferencia entre las dos mues-tras en cuanto a la migración será claramente visible.

4. Mezclar las tres muestras, realizar una extracción con fenol, otra con fenol-cloroformo, y una última con cloroformo, seguidamente realizar 3 extrac-ciones con éter y concentrar en una centrífuga a vacío.

5. Resuspender el precipitado en agua.

6. Preparar la reacción de digestión enzimática en tampón de restricción com-patible (50 µL), EcoRI (200 u), BamHI (200 u) y H2Od (Vf = 500 µL) eincubar a 37ºC durante 7 u 8 h

7. Realizar una extracción con fenol, otra con fenol-cloroformo y una últimacon cloroformo, seguidamente realizar 3 extracciones con éter y concentraren una centrífuga a vacío. Resuspender el precipitado en 100 µL de agua.

8. Preparar el vector y la reacción de ligamiento.

9. Transformar las células mediante electroporación.

10. Recolectar las células y conservarlas a -70ºC en glicerol al 15 %.

AMPLIFICACIÓN DEL FAGO AUXILIADOR M13 K07El empleo del fago auxiliador en combinación con un fagómido tiene importan-tes ventajas: las células infectadas sobreviven, crecen y continúan secretandofagos indefinidamente. Los clones pueden ser propagados como plásmidos ycomo fagos. Debido a que el fago contiene un genoma de ADN circular desimple cadena, la secuencia nucleotídica puede ser rápidamente analizada. Lainformación foránea puede ser clonada y expresada como parte de una proteínaestructural del virus, y la purificación del virus recombinante se simplifica con-siderablemente.

1. Cultivar células XL-1blue en TB (triptona bacteriológica) 12 g/L, extractode levadura 24 g/L y glicerol 4 mL (emplear placas de medio mínimo), disol-ver en 900 mL de agua destilada y esterilizar en autoclave. Refrescar hasta


60 ºC, adicionar 100 mL de solución de KH2PO4 17 M estéril y Tetraciclina(20 µg/mL) hasta alcanzar una DO (600nm) = 0,125-0,2.

2. Incubar durante 15 min a 37ºC con agitación muy suave.

3. Infectar 20 µL de células XL-1blue (Stratagene, Estados Unidos) con 10 µLde la dilución deseada del M13K07 [1010UT-KanR/mL (unidades detransducción resistentes a kanamicina)]. Incubar durante 15 min a 37ºC sinagitación, añadir 100 µL de medio LB (triptona bacteriológica 10 g/L; ex-tracto de levadura 5 g/L; cloruro de sodio 10 g/L) y volver a incubar otros 30min con agitación vigorosa.

4. Sembrar en placas de LB+Kanamicina (70 µg/mL). Cultivar toda la nochea 37ºC. Es importante usar placas bien secas.

5. Tomar una colonia , adicionar 100 µL de TBS 1X (50 mM Tris.HCl pH 7,5,150 mM NaCl) y calentar por 20 min a 70 ºC para eliminar bacterias.

6. Infectar un pequeño cultivo, de 10 a 50 mL, de células XL-1Blue prepara-das de igual manera que en el paso 1.

7. Cultivar las células durante 3-4 h a 37 ºC con agitación vigorosa.

8. Hacer una dilución del cultivo hasta 2 L de medio LB con kanamicina (70µg/mL e incubar toda la noche a 37 ºC con agitación fuerte.

9. Precipitación con PEG / NaCl (I)

9.1. Precipitar las partículas fágicas con la adición de ¼ del volumen dePEG/NaCl (PEG 8000 al 20 %, NaCl 2,5 M). Mezclar por inversióndel tubo e incubar en hielo por 4 h o toda la noche a 4 ºC. Centrifugara 4 500 rpm durante 60 min a 4 ºC. Desechar el sobrenadante yresuspender el precipitado en TBS 1X (1/100 del volumen inicial).

10. Tratamiento con calor.

10.1. Poner a incubar la suspensión fágica 20 min a 70 ºC en un baño contermostato. Centrifugar a 10 krpm 30 min a 4 ºC. Colectar elsobrenadante.

11. Precipitación con PEG/NaCl (II)

11.1. Adicionar ¼ del volumen de PEG/ClNa para precipitar las partículasvirales. Mezclar por inversión del tubo y poner a reposar en hielo du-rante 2-3 h. Centrifugar a 4 ºC durante 30 min a 10 krpm. Desechar elsobrenadante, repetir la centrifugación y eliminar el sobrenadante resi-dual. Resuspender el precipitado en 20 mL de TBS 1X. Centrifugarbrevemente para eliminar el material insoluble.

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12. Añadir 9g de CsCl a la suspensión de fagos y transferir la preparación defago/CsCl a 2 tubos SW40 polyallomer, llenarlos con una solución isotónicade TBS 1X/CsCl, equilibrarlos y centrifugar a 37 krpm durante 48 h a 18 ºC.No utilizar el freno para detener la centrífuga.

13. Extraer con una jeringuilla la banda correspondiente a los fagos (banda dearriba). Transferir el contenido a un tubo de policarbonato, rellenarlo conTBS 1X, mezclar y centrifugar a 50 krpm durante 4 h a 4 ºC en un rotor 70 Ti.Utilizar el freno para detener la centrífuga.

14. Desechar el sobrenadante completamente y resuspender el precipitado en1 mL de TBS 1X-Tween 20 al 0,05 %.

AMPLIFICACIÓN DE LA BIBLIOTECA EN PVIII.PREPARACIÓN Y TITULACIÓN DE LOS BACTERIÓFAGOS

1. Diluir una alícuota (2 mL) de la suspensión de células congeladas en 2 L deLB y ampicillina (50 µg/mL), la DO (600nm) inicial deberá ser aproximada-mente de 0,05. Utilizar erlenmeyers de 5 L para asegurar una buena airea-ción. Incubar a 37ºC con una agitación fuerte hasta que la DO (600nm) = 0,2-0,3(aproximadamente 2-3 h).

2. Infectar el cultivo con 20 UT-KanR del fago auxiliador M13K07, adicionarIPTG 1 mM y cultivar por 5 h a 37ºC con una fuerte agitación

3. Centrifugar durante 30 min a 9 000 rpm y recuperar el sobrenadante.

4. Continuar con el procedimiento habitual de purificación con PEG/NaCl yCsCl manteniendo las proporciones indicadas. (Amplificación del fagoauxiliador M13 K07).

5. Desechar el sobrenadante completamente y resuspender el precipitado en 1 mLde TBS 1X -Tween 20.

6. Inocular células XL1-blue en 10 mL de medio LB e incubarlas a 37 ºC conuna fuerte agitación hasta que una dilución 1:10 del cultivo alcance unaDO (600nm) = 0,15.

7. Titular los fagos mediante diluciones seriadas en TBS 1X-Tween 20 al 0,05 %de la biblioteca amplificada y mezclar 10 µL de cada dilución con 20 µL delas células.

8. Incubar durante 15 min a 37 ºC sin agitación.


9. Añadir 100 µL de medio LB y poner a incubar durante 30 minutos a 37 ºCsin agitación.

10. Sembrar en placas de medio LB con ampicillina (100 µg/mL)-Xgal (20 µg/mLen dimetilformamida) -IPTG (1mM) e incubar toda la noche a 37 ºC.

11. La preparación de la biblioteca debe alcanzar alrededor de 1012UT-AmpR/mL.El número actual de partículas de fagos en la preparación puede ser estima-do con una dilución 1/50 en una solución de TBS (20 µL de fagos + 980 µLTBS) y determinar la DO (269nm) con la fórmula:

En este caso el factor de dilución es 50 y el tamaño del genoma es igual aldel vector PC89 (3441pb).

PREPARACIÓN DEL SOBRENADANTEDEL FAGO A PEQUEÑA ESCALA

1. Extraer una alícuota de fagos con una pipeta pasteur y depositar en un tuboeppendorf con 200 µL de TBS 1X.

2. Calentar a 70 ºC durante 20 min y centrifugar por 30 min para eliminar lasbacterias de la suspensión de las partículas virales.

3. Utilizar diluciones en LB del sobrenadante (que contiene los bacteriofagos)para infectar células XL1-blue que crecieron a 37 ºC hasta una DO(620nm)= 0,3.La suspensión fágica puede ser conservada a 4 ºC.

4. Incubar 15 min sin agitación y otros 30 min con agitación vigorosa a 37 ºC.

5. Sembrar en placas de medio LB, ampicillina (100 µg/mL), glucosa al 1 % eincubar toda la noche a 37ºC.

6. Inocular una colonia en 3 mL de LB y ampicillina (100 µg/mL). Incubar a 37 ºCcon agitación vigorosa (>350 rpm) hasta una DO (600nm) = 0,25.

7. Cultivar otros 15 min a 37 ºC con agitación suave.

8. Infectar con 20 UT-KanR del fago auxiliador M13K07, adicionar IPTG 1 mM,agitar suavemente por 10 min e incubar a 37 ºC durante 5 h con agitación vigorosa.

9. Transferir los cultivos a tubos de microcentrífuga y centrifugar por 30 min aalta velocidad para eliminar bacterias. El sobrenadante del fago se debemantener a 4 ºC. Usualmente los títulos son superiores a 1 x 1010 UT-AmpR /mL.

concentración del fago = A(269nm) tamaño del genomafactor de dilución x 6 x 1016

76 CAPÍTULO 5

SELECCIÓN DE CLONES A PARTIRDE LA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS EN PVIII1. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS RECUBIERTAS CON ESTREPTAVIDINA

1.1. Poner 4 mL de tampón de recubrimiento (NaHCO3 0,1 M, pH 8,6,NaN3 0,02 %) en el borde de una placa petri de poliestireno de 60* 15 mm[Falcon 1007(Becton Dickinson Pty Ltd., Australia)].

1.2. Inclinar la placa para humedecer completamente la superficie.

1.3. Adicionar 40 µL de estreptavidina (Sigma-Aldrich Co., Estados Unidos)(1 mg/mL en NaHCO3 0,1 M, pH 8,6 Tween 20 al 0,02 %) y mezclar.

1.4. Dejar toda la noche a 4°C en una caja plástica húmeda.

2. REACCIÓN DE LA BIBLIOTECA PEPTÍDICA CON EL ANTICUERPOPRIMARIO

2.1. Tomar 1010UT de la biblioteca en TBS 1X-Tween 20 al 0,05 % en untubo eppendorf.

2.2. Adicionar el anticuerpo primario (pre-absorbido durante toda la nochecon 1010 UT-KanR/mL de M13 previamente inactivado por radiacionesUV) a una concentración final de 1 µM para la primera ronda de selec-ción y 10 nM, o menos, para los pasos subsiguientes.

2.3. Mantener la reacción a 4 ºC durante toda la noche.

El paso de pre-absorsión no es necesario si se usa un anticuerpo monoclonalaltamente purificado.

3. B IOPANNING

3.1. Adicionar a la preparación del paso 2 el anticuerpo secundario biotinilado,pre-absorbido toda la noche con 1010 UT-KanR/mL de M13 previamen-te inactivado por radiaciones UV, a una concentración final de 250 nMpara la primera ronda de selección y 2,5 nM (o proporcionalmente me-nos) para los pasos subsiguientes.

3.2. Mantener la reacción a temperatura ambiente durante 3 h.

3.3. Desechar la solución de estreptavidina de la placa, del paso 1.3.3.4. Verter en la placa 10 mL de solución de bloqueo [BSA 29 mg/mL (Sigma-

Aldrich Co., Estados Unidos)] estreptavidina 3 µg/mL, en NaHCO3 0,1M,pH 9,2, Tween 20 al 0,02 %) e incubar 1 h a temperatura ambiente.


3.5. Lavar tres veces con TBS 1X-Tween 20 al 0,05 %.

3.6. Adicionar 1 mL TBS 1X-Tween 20 al 0,05 % de la biblioteca obtenida enel paso 2 y mezclar con pipeta sobre la placa cubierta con estreptavidina,agitar suavemente a temperatura ambiente por 10 min.

3.7. Extraer y conservar las partículas no absorbidas (N) y lavar las placas10 veces con 10 mL de TBS1X-Tween 20 al 0,05 % por un período de60-90 min.

3.8. Añadir 890 µL de solución de elución (HCl 0,1N pH 2,2 ajustado conglicina) a las placas, agitar suavemente por 30-60 min.

3.9. Sacar el eluato (A) y transferirlo a un tubo eppendorf con 110 µL de TrisBase 2 M (sin ajustar pH).

La solución de bloqueo puede ser usada varias veces.

4. T ITULACIÓN DE LAS UNIDADES DE TRADUCCIÓN (UT)DE LA BIBLIOTECA SELECCIONADA

4.1. Deje crecer toda la noche un cultivo de células XL-1 blue.

4.2. Realizar diluciones seriadas 1:10 de las fracciones N y A en alícuotasde 100 µL de medio LB, añadir 100 µL de la suspensión de células ymantener a 37ºC durante 30 min.

4.3. Sembrar en medio sólido con ampicillina 100 µg/mL y adicionar 1mMde IPTG y 20 µg/mL de X-Gal para realizar pesquisaje por color).

La obtención de una relación de 100, entre ambas fracciones, es suficiente-mente pequeña como para pasar directamente a la amplificación individualde algunos de los clones. Esta relación ofrece un estimado de que la mayo-ría de los clones que se seleccionaron presentan una afinidad determinadapor el anticuerpo monoclonal utilizado como elemento de captura.

AMPLIFICACIÓN DE LOS CLONESINDIVIDUALES DE FAGOS

1. Cultivar células XL-1blue (en placas de medio mínimo) en TB y tetraciclina(20 µg/mL) hasta alcanzar una DO (600nm) = 0,125-0,25 de una dilución 1:10en TB.

2. Incubar durante 15 min a 37 ºC con una agitación muy suave.

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3 Infectar 200 µL de células XL1-blue con 10 µL de la dilución deseada delfago recombinante (en TBS 1X). Incubar por 15 min a 37 ºC sin agitación yotros 30 min con agitación vigorosa (vortex).

4. Sembrar en placas de medio LB, ampicillina, 100 µg/mL, y glucosa al 1 %.Poner a incubar a 37 ºC toda la noche.

5. Inocular algunas colonias en 50 mL de LB y ampicillina (100 µg/mL).

6. Cultivar a 37 ºC hasta que la DO (600nm) sea superior a 0,25 y mantener elcultivo otros 15 min con agitación suave.

7. Infectar las células con 20 TU-KanR de fago auxiliador M13K07 (1010 TU-KanR/mL).

8. Incubar a 37 ºC por 15 min sin agitación.

9. Incubar a 37 ºC durante 5 h con agitación fuerte.

10. Centrifugar la suspensión celular durante 40 min a 4 500 rpm y 4 ºC.

11. Continuar con el procedimiento habitual para la purificación con PEG/NaCly CsCl (Algoritmo 2: Amplificación del fago auxiliador M13K07).

12. Desechar el sobrenadante por completo y resuspender el precipitado en 1 mLde TBS 1X-Tween 20 al 0,05 %.

13. Estimar la concentración de la preparación: realizar una dilución 1:50 de lasuspensión en TBS 1X (20 µL fago + 980 µL TBS) y medir la DO (269nm).

INMUNO-IDENTIFICACIÓNY SECUENCIACIÓN DE CLONES INDIVIDUALES DE FAGOS

Con el propósito de confirmar la unión de los fagos individuales a la moléculablanco se utilizan técnicas de inmuno-detección como el dot-blot o un ensayotipo ELISA. Las preparaciones de los clones reconocidos por el blanco de inte-rés se tratan con fenol-cloroformo para obtener el ADN viral de simple cadenacuya secuencia codifica el péptido presentado por cada clon individual.

RESULTADOS

CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS LINEALESDE NUEVE AMINOÁCIDOS

Según se ha demostrado, la proteína mayoritaria de la cápsida de los fagosfilamentosos, el producto del gen VIII, puede ser explotado para la presentación


de oligopéptidos sobre la cápsida de los bacteriófagos. Las proteínas pVIII queportan un extremo amino terminal “extraño” pueden reemplazar completamen-te las pVIII nativas. Sin embargo, la síntesis de pVIII nativas y “modificadas”hace que se formen partículas fágicas híbridas que exponen el oligopéptidoforáneo en una forma inmunológicamente accesible para la interacción con unanticuerpo determinado.

El vector PC89 está basado en un sistema fagómido que expresa el gen VIIIbajo el control del promotor plac. En esta construcción el gen VIII está fusiona-do a través de un codón ámbar al gen que codifica para el α-péptido de laβ-galactosidasa. En adición, el gen VIII se modificó para introducir los sitios derestricción EcoR I y BamH I, que se ubican en los extremos de un segundocodón ámbar dentro de la secuencia codificante del amino terminal de la proteí-na madura. La presencia de estos dos codones entre la secuencia de inicio de latraducción y el α-péptido ofrece una identificación por color de las colonias quecontienen plásmidos con inserciones de oligonucleótidos y que carecen de loscodones de parada ubicados en tándem [14].

SELECCIÓN DE LIGANDOS SOBRE PVIIIEl vector PC89 se usó eficientemente para la construcción de bibliotecaspeptídicas y para la selección de ligandos. Esto último se logró con la técnica deBiopanning descrita por Parmley y Smith en 1988 [18], para seleccionarfagómidos que exponen oligopéptidos que se unen a un anticuerpo monoclonalespecífico contra el péptido VQGEESNDK, que corresponde a los aminoácidos163-171 de la interleucina â-1 humana [14].

Después de tres rondas de selección se detectaron seis grupos de clones cadauno de los cuales expone un péptido diferente. Algunos de estos oligopéptidosmuestran mayor avidez por el anticuerpo monoclonal que el péptido originalcontra el que se generó. No queda claro si esto se debe a una mayor afinidadintrínseca entre el oligopéptido y el anticuerpo, o a una mayor densidad de lospéptidos sobre la cápsida de los bacteriofagos.

También se ha comprobado que la técnica de Biopanning permite seleccionarclones que se unen a una porción muy pequeña del antígeno, lo que sugiere queel sitio de unión posee propiedades moleculares que lo hacen más atractivo quecualquier otra región en la molécula. Resultados similares a estos han sido des-critos por Scott y Smith en 1990 [6] y por Cwirla y cols. en 1990 [19], luego dela caracterización de un alto número de clones, seleccionados por la unión a dosanticuerpos monoclonales diferentes a partir de una biblioteca similar construi-da por fusión a la proteína pIII. Cualquiera que sea la explicación molecular a

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este fenómeno, es posible realizar una caracterización de epítopos mediante laselección de clones que se unen a bibliotecas peptídicas presentadas sobre lacápsida de los fagos filamentosos, debido a que los clones seleccionados mues-tran claramente una relación con el inmunógeno [14].

UTILIZACIÓN DE LA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS DE

NUEVE AMINOÁCIDOS EN LA CARACTERIZACIÓN DE

LOS EPÍTOPOS RECONOCIDOS POR DIFERENTES

ANTICUERPOS MONOCLONALES

CARACTERIZACIÓN DEL EPÍTOPO RECONOCIDO POR EL ACMCB-HEP.1 MEDIANTE EL USO DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS

Con el objetivo de comprobar la funcionalidad de la biblioteca de nueveaminoácidos fusionada a la proteína VIII de la cápsida de los fagos filamentosos,se decidió determinar los residuos aminoacídicos que intervienen en la unión delanticuerpo monoclonal CB-Hep1, específico para el antígeno de superficie dela Hepatitis B (HBsAg). Para determinar si alguna secuencia continua deaminoácidos dentro del determinante “a” contenía el epítopo reconocido poreste anticuerpo monoclonal, se utilizó un juego de péptidos solapados que com-prendían la región 118-153 del HBsAg y un ELISA (Tabla 5.1 y Figura 5.2)donde se fijaron los péptidos a la placa y se utilizó el CB-Hep1 en solución.

Tabla 5.1. Secuencia de los péptidos sintéticos

Se pudo definir que la especificidad del CB-Hep.1 estaba dirigida hacia la se-cuencia aminoacídica 121CKTCTTPAQGTSMFPSC137 del determinante común


“a”. El péptido correspondiente a esta zona (D12-6) contiene los residuos indis-pensables para la unión del CB-Hep.1. Por otro lado se comprobó que la pre-sencia de los residuos 121CKT123 es esencial para mantener el reconocimientode este anticuerpo monoclonal por la mencionada región peptídica.

CARACTERIZACIÓN DEL EPÍTOPO RECONOCIDO POR EL ANTI-CUERPO MONOCLONAL CB-HEP.1 MEDIANTE LA BIBLIOTECADE NONAPÉPTIDOS LINEALES PRESENTADA SOBRE PVIIIPara comprobar la eficacia de la metodología de localización epitópica con labiblioteca pVIII-9aa, comparándolo con el método tradicional de péptidos sinté-ticos anteriormente expuesto, se absorbió el anticuerpo CB-Hep1 a perlas depoliestireno. Una perla de poliestireno se recubrió con este anticuerpo y se hizoreaccionar con la preparación de fagos de la biblioteca (1,6 x 1011 UT-AmpR/mL) yse obtuvieron las siguientes cantidades de fagos después de dos rondas deselección (Tabla 5.2).

La elución del segundo paso de selección se utilizó para infectar un cultivo decélulas de E. coli de la cepa TG1. Se seleccionaron y purificaron clones aisla-dos de fagos reconocidos por el anticuerpo monoclonal CB-Hep 1 medianteinmunodot (Figura 5.3). A partir de estos se extrajo el ADN viral de simplecadena. Con el oligonucleótido 3489, que híbrida en el gen pVIII, se obtuvieronlas secuencias nucleotídica de los insertos de la biblioteca. Estas secuenciasde 27 pares de bases se tradujeron a aminoácidos con el programa BIOSOS y

Figura 5.2. ELISA para la caracterización del epítopo reconocido por el AcM CB-Hep.1 me-diante el uso de péptidos sintéticos.

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se alinearon según la semejanza entre los aminoácidos de los distintos clonessecuenciados (Figura 5.4).

Tabla 5.2. Pasos de selección desarrollados con la biblioteca pVIII-9aa y el CB-Hep1 absorbido a perlas de poliestireno. Las unidades formadoras decolonias (ufc) son una medida de la infectividad, definida como el númerode colonias resistentes a ampicillina que se obtienen después de lainfección de la cepa TG1

Figura 5.3. Determinación del reconocimiento específico por el CB-Hep.1 de tres de losclones de fagos seleccionados. Se utilizó un inmunodot en el que se detectó el CB-Hep.1 biotinilado unido específicamente a los fagos empleando estreptavidina-peroxidasa. (1) 5H, (2) 16H, (3) 5Ha, (4) fago/PC89, (5) fago auxiliador, (6)HBsAg-r, (7) BSA.

Figura 5.4. Secuencia peptídica del determinante “a” del antígeno de la hepatitis B. Las secuenciasde los clones obtenidos se encuentran alineadas con la secuencia correspondiente en elantígeno. Los residuos sombreados corresponden con los presentes en el antígeno original.


En la secuencia de aminoácidos de los péptidos seleccionados se destacó lapresencia de una secuencia consenso (K/R)TXXXP, que es similar a la regiónreconocida por CB-Hep.1 en el HBsAg. De estos mimotopos, o péptidos quesimulan el epítopo que reconoce el AcM CB-Hep.1, dos mostraron una secuen-cia C(K/R)TCXXP que reproduce la región nativa en el antígeno. De acuerdocon este resultado la presencia de la prolina en la posición 127 parece ser tam-bién de importancia para el reconocimiento epitópico de CB-Hep.1, lo que de-berá corroborarse en estudios adicionales. La selección de otros mimotoposque carecen de los residuos C121 y C124 parece indicar que la conformaciónadoptada por estas secuencias se ajusta al sitio de unión del CB-Hep.1 y señalóla importancia de los residuos K/R122 y T123 para ese epítopo, lo que coincidecon los resultados obtenidos por otros autores [20, 21].

La dependencia del reconocimiento del antígeno por parte de este anticuerpode los enlaces disulfuros (C121-C124) además de las características de los clonesseleccionados (5H y 16H) que imitan al antígeno, nos hace pensar que estamosen presencia de un epítopo “conformacional-secuencial”. Algunos de los clonesseleccionados son la imagen exacta del antígeno y otros imitan esta unión apartir del uso de cadenas laterales diferentes con similares superficiestopográficas. Adicionalmente, el reconocimiento del tetrapéptido CK/RTC secorresponde con el carácter común para grupo del determinante reconocidopor el anticuerpo monoclonal CB-Hep.1, ya que estos aminoácidos definen in-distintamente determinantes de subtipo, K para “d” y R para “y” [22].

El grupo de Folgori en 1994 [23], con sueros de individuos vacunados con elantígeno (HBsAg) y la biblioteca de péptidos de nueve aminoácidos, caracteri-zaron la respuesta humoral de estos individuos. Se seleccionó un fagotopo desecuencia CKTCTTPAQGN reconocido por el 80 % de las muestras de suerode individuos inmunizados con el HBsAg, lo que indica que el motivo C(K/R)TCes un epítopo inmunodominante [23].

Debido a su importancia tanto en el desarrollo de vacunas, como en el estable-cimiento de sistemas de diagnóstico, el estudio de la estructura y composiciónepitópica del determinante “a” del HBsAg sigue constituyendo uno de los as-pectos centrales de la investigación en estos campos. No menos importante esel hecho de haber comprobado que el AcM CB-Hep.1, actualmente en uso enel proceso de obtención de la vacuna recombinante Heberbiovac, reconocede manera específica la región CKTC del determinante “a”, crítica para elcarácter “común” de éste, lo que garantiza que durante la inmunopurificaciónse seleccionen aquellas moléculas de antígeno que expongan adecuadamenteesta región, esencial para el desarrollo de una respuesta inmune protectorafrente a diferentes subtipos virales.

84 CAPÍTULO 5

CARACTERIZACIÓN DEL EPÍTOPO RECONOCIDOPOR LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES CB-IL-2.2 Y CB-EGF.1MEDIANTE EL EMPLEO DE LA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS LINEALES

PVIII-9AA

El anticuerpo monoclonal CB-IL-2.2 es específico contra la IL-2 humana. Esteanticuerpo reconoce la IL-2 en forma desnaturalizada, después de ser aplicadaen un gel de SDS-policarilamida y transferida a nitrocelulosa en un ensayo de“western blot”. Además, es capaz de reconocer fragmentos de la molécula deIL-2 luego de un tratamiento proteolítico con BrCn. Esto implica que reconoceun epítopo lineal presente en la molécula de IL-2 [24].

Los pasos de selección de los fagos específicos son iguales a los utilizados conel CB-Hep.1. El anticuerpo monoclonal CB-IL-2.2 se utilizó como elemento decaptura en este proceso de selección y se obtuvieron, después de dos rondas deselección, las cantidades de fagos que se muestran en la Tabla 5.3.

Después de obtener una relación de 70 veces entre el título inicial de los fagosutilizados en el segundo paso de selección y la cantidad de fagos eluidos de lasperlas recubiertas con el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.2, se pasó a la infec-ción de los mismos en la cepa TG1. Se aislaron y purificaron clones individualesde fagos y aproximadamente 1010 UT/mL de los clones 2,20 y 2,18 se fijaron auna membrana de nitrocelulosa que se hizo reaccionar con el monoclonal CB

IL-2.2 y se obtuvo como resultado que estos clones son reconocidos individual-mente por este anticuerpo (Figura 5.5). Los clones se utilizaron para infectarcon el fago auxiliador M13K07 y obtener el ADN viral de simple cadena de losmismos. Las secuencias nucleotídicas se tradujeron a aminoácidos y se alinea-ron según la semejanza entre los distintos clones (Figura 5.6).

Tabla 5.3. Pasos de selección desarrollados con la biblioteca pVIII-9aa y el CB-IL-2.2 absorbido a perlas de poliestireno. Las unidades formadoras decolonias (ufc) son una medida de la infectividad, definida como el númerode colonias resistentes a ampicillina que se obtienen después de lainfección de la cepa TG1


La secuencia del epítopo continuo que reconoce el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.2 se identificó inicialmente por la presencia de una alta homología con elmotivo T101T102F103M104 encontrado en la cara opuesta de las cuatro hélices dela molécula de IL-2, en un lazo que conecta la hélice C con la cadena α Y107-A112. Debido a que no ha sido descrita la estructura del cristal de la zona de estelazo, se construyó un modelo tridimensional de la molécula de IL-2 completaincluyendo los residuos Y98-M104 de acuerdo con el programa de modelaciónmolecular WHATIF [30]. Según este modelo el epítopo se encuentra expuesto enla superficie de la proteína y puede interactuar favorablemente con el anticuerpo.

Esta región, cuya estructura no ha sido totalmente resuelta en los modelos 3Ddescritos previamente, no parece estar involucrada directamente en la interaccióncon el complejo heterotrimérico del receptor de la IL-2, lo que explica el carác-ter no neutralizante del anticuerpo monoclonal CBIL-2.2 (Figura 5.7). De tal

Figura 5.5. Determinación del reconocimiento específico por el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.2 de tres de los clones de fagos seleccionados (1,38, 1,17 y 1,7). Se utilizó uninmunodot en el que se fijaron los fagos a la nitrocelulosa y se empleo el anticuerpomonoclonal CB-IL-2.2 conjugado a peroxidasa. Los controles negativos son dosclones de fagos seleccionados con el anticuerpo CB-IL-2,1. La fila A (1-5)corresponden a 5, 2,5 1,25, 0,625 y 0,312 mg de IL-recombinante. La fila Bcorresponde a los fagos.

Figura 5.6. Alineación de las secuencias aminoacídicas de 15 péptidos seleccionados por el CB-IL-2.2.Se destaca la presencia de una región consenso presente en la secuencia aminoacídica de laIL-2 entre los aminoácidos 101 al 104. Los residuos sombreados corresponden con lospresentes en el antígeno original.

CLUSTAL W(1.60) multiple sequence alignmentIL-2 (101-104) S E T T F MClon 2.20 T T F M S Q S T GClon 2.15 T T F M V I GG AClon 2.1 T T F M I H S K VClon 2.7 T QF M S E T S PClon 2.18 S T Q T T F L H LClon 2.19 P S F T T F L Y SClon 2.5 5 T Q V S F M P H RClon 2.6 T Y P T F I K K VClon 2.4 S D F M E F D K S

86 CAPÍTULO 5

modo la combinación del empleo de anticuerpos monoclonales y la tecnologíade presentación de péptidos y proteínas en la cápsida de los bacteriofagos seconvierte en atractivo instrumento que corrobora elementos teóricos o datosexperimentales de estructuras no resueltas totalmente y contribuye al conoci-miento en el campo del análisis estructura-función de proteínas [24].

El anticuerpo monoclonal CB-EGF-1 es específico contra el EGF humano. Esteanticuerpo reconoce a la molécula de EGF solamente cuando esta se encuentraen su conformación nativa y se pierde el reconocimiento una vez que se rompenlos puentes disulfuros con el β mercaptoetanol; después de ser aplicada en ungel de SDS-policarilamida y transferida a nitrocelulosa en un ensayo de “westernblot”. Este resultado indica que este anticuerpo reconoce un epitopoconformacional en la molécula de EGF (Figura 5.8).

Figura 5.7. Representación de la estructura tridimensional de la IL-2 humana utilizando elprograma WATIF de modelación de proteínas y la estructura tridimensionaldeterminada por difracción de rayos X (Fichero 1IRL de la base de datos de estructuratridimensional de proteínas PDB). Se representan las cadenas laterales de losaminoácidos que componen los epítopos reconocidos por el CB-IL-2.2.


El anticuerpo monoclonal CB-EGF-1 se utilizó como elemento de captura en unproceso de selección y se obtuvieron las siguientes secuencias de péptidos pre-sentados en fagos después de tres rondas de selección (Figura 5.9).

Figura 5.8. Gel de SDS PAGE al 20 % donde se aplicaron 5 µg de EGF con β mercaptoetanol enel buffer de aplicación (EGF desnaturalizado) y sin el mismo (EGF nativo). Westernblot utilizando los anticuerpos monoclonales CBEGF1. Como segundo anticuerpose utilizo un anti ratón conjugado a peroxidasa y se reveló con el Kit de ECL (AmershanBioscience UK).

Figura 5.9. Alineación de las secuencias aminoacídicas de 8 péptidos seleccionados por el CB-EGF-1. Se destaca la presencia de una región consenso presente en la molécula deEGF entre los aminoácidos. Los residuos sombreados corresponden con los pre-sentes en el antígeno original.

Una vez alineadas las secuencias se obtuvo como secuencia consenso el péptidoSKFDR. En el análisis del modelo estructural del EGF se observó que en la mismaregión de 10 Aº se encontraban los residuos obtenidos en la región consenso. En ellugar que ocupaba la F en estos clones se encontraba presente una Y, y en sustitu-ción del D presente en el consenso se encontraba un E. Estas dos sustituciones sonde las mas comunes en estos trabajos, ya que los péptidos obtenidos no son copiafiel del antígeno, los aminoácidos se reordenan a partir del uso de cadenas lateralesmuy similares como son el cambio de F por Y, o a partir de las sustituciones deaminoácidos que presentan la misma carga como son D por E. Con estos datos se

88 CAPÍTULO 5

logró identificar la zona que se muestra en la Figura 5.10 como el sitio de reconoci-miento del anticuerpo CB EGF1 en la molécula de EGF. Este epítopo se encuentracompuesto por los aminoácidos S9, H10, Y13, K28, E40 y R41.

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Figura 5.10. Modelo obtenido a partir de los datos de cristalografía del EGF con el programaWeb lab viewer lite. Los aa son representados con el código de una letra.

Este epítopo topográfico incluye dos aminoácidos fundamentales en lainteracción del EGF con su receptor, ellos son la Y13 y la R41. Estasinteracciones definen el carácter neutralizante de este anticuerpo, el cual habíasido caracterizado previamente en experimentos de inhibición de la unión delEGF a su receptor [31].

Este experimento demuestra la gran utilidad de la utilización de bibliotecas li-neales a la hora de caracterizar epítopos topográficos. El reordenamiento de lascadenas laterales de los péptidos presentados permite obtener secuencias quemimetizan la zona de interacción del anticuerpo, aunque no estén presentes enel epitopo original.


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