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CLAUDIA FILONI
Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados
São Paulo 2006
CLAUDIA FILONI
Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Departamento: Patologia
Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada
Orientador: Prof. Dr. José Luiz Catão-Dias
São Paulo 2006
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1729 Filoni, ClaudiaFMVZ Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados /
Claudia Filoni. – São Paulo: C. Filoni, 2006.126 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia. Departamento de Patologia, 2006.
Programa de Pós-graduação: Patologia Experimental e Comparada.Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada.
Orientador: Prof. Dr. José Luiz Catão-Dias.
1. Felidae. 2. Doenças infecciosas. 3. Bactérias. 4. Piroplasmida.5. Vírus. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: FILONI, Claudia
Título: Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Data: ___/___/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr. ______________________________
Assinatura: ____________________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Prof. Dr. ______________________________
Assinatura: ____________________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Prof. Dr. ______________________________
Assinatura: ____________________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Prof. Dr. ______________________________
Assinatura: ____________________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Prof. Dr. ______________________________
Assinatura: ____________________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Aos meus filhotes, as lindas meninas Luciana, de sete anos e
Marcela, de seis anos
À natureza brasileira em toda sua diversidade
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
- ao Prof. Catão, não apenas como Diretor Técnico-Científico da FPZSP e pelo livre acesso
à sua sala na FMVZ-USP durante todo o período do doutorado mas, principalmente, por
sua orientação serena e competente que me descortinou o mundo científico e que me iniciou
na arte de escrever cientificamente, pelo que sou profundamente grata;
- à Regina Hofmann-Lehmann e Hans Lutz que se interessaram pelo projeto, confiaram em
mim e não mediram esforços para que todos os complexos trâmites referentes à minha viagem
e ao transporte das amostras à Vetsuisse Faculty, University of Zurich se efetivassem;
- à minha mãe Maria Fernanda, meu pai Luiz Carlos e minha avó Anna que também não
mediram esforços para que eu dispusesse de tempo e dos mínimos recursos para trabalhar
no meu projeto de tese e de vida.
AGRADECIMENTOS
Registrar agradecimentos a todas as pessoas que colaboraram na execução de um
trabalho de quatro anos é uma tarefa gratificante, mas essencialmente propensa a omissões
involuntárias, pois foram muitas as pessoas e instituições com quem travei contato neste
período, muitas das quais também têm o objetivo de contribuir para o processo
conservacionista. Assim, correndo o risco de omitir alguém que deveria figurar nesta lista,
agradeço:
- a todos que foram muito solícitos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP),
como Dr. Paulo Magalhães Bressan, Dr. João Batista Cruz, Maria José Caldeirane , José
Daniel Luzes Fedullo, Sandra Helena Ramiro Corrêa, Rodrigo Hidalgo Friciello Teixeira
(atualmente de volta ao Zôo de Sorocaba), Ariela Priscila Setzer, Mara Cristina Marques,
Kátia Cassaro, Denise Martins Sanches e Haroldo Soares Barbosa;
- todos os que conheci em com quem trabalhei no Clinical Laboratory, Vetsuisse Faculty,
University of Zurich, como Gert Bay, Valentino Cattori, Marina Meli, Ravi Tandon,
Yousef Ahmed, Maria Alice Gomes-Keller, E. Gönczi, T. Meili Prodan, Elisabeth e Edith,
pela amizade e pela excelente assistência técnica.
- o CENAP–IBAMA e a todos os pesquisadores que colheram e depositaram as amostras
utilizadas em seus projetos de campo por todo o País. Em especial, Rose Lilian Gasparini
Morato e Otávio Borges Maia pela pronta disposição em ajudar na condução de todas as
licenças internacionais requeridas, Ronaldo Gonçalves Morato, Rogério Cunha de Paula e
Rodrigo Silva Pinto Jorge pelo auxílio e prontidão em providenciar amostras de material de
felídeos de vida livre e em sanar diversas dúvidas ao longo deste projeto;
- Cristina Harumi Adania, Claudia Yumi Hashimoto e a todos da Associação Mata Ciliar
pela cessão das amostras de felídeos neotropicais mantidos em diversas regiões do País, pela
disponibilidade em fornecer as informações requeridas sobre as amostras e confiança dada
para a execução deste projeto;
- o Prof. Edison Luiz Durigon que permitiu a utilização de seu laboratório e materiais para
o processamento de amostras durante os dois anos iniciais do projeto e continua mostrando-
se disposto a apoiar novas pesquisas na área;
- o Prof. Dr. Jean Carlos Ramos Silva, Maria Fernanda Vianna Marvulo, caros amigos e
Prof. Dr. José Soares Neto pela concordância na utilização de parte das amostras de
felídeos selvagens mantidos em cativeiro no Brasil colhidas previamente em seus trabalhos;
- as instituições Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
Pró-Reitoria de Pós-Graduação da Universidade de São Paulo e ao International Relations
Office, University of Zurich, Switzerland.
- as pessoas vinculadas à FMVZ-USP pelo seu apoio, como minha querida amiga agora
recém Profa. Dra. Lílian Rose Marques de Sá, tão perspicaz, lúcida e prestativa em suas
muitas sugestões; o Prof. Dr. Marcelo Alcindo B. V. Guimarães pelas nossas conversas na
lanchonete e nas filas do cafezinho nos eventos da Faculdade, onde já tivemos boas idéias
que gostaríamos de concretizar; Sandra Freiberger Affonso pela amizade desde nosso
ingresso no Programa de Doutorado, em que sempre compartilhamos dificuldades nas nossas
pesquisas; o Prof. Dr. Arthur Gruber, sincero e atencioso quando procurado por mim para
solicitação de opiniões sobre minha pesquisa; Silvia Sochiarelli, Dayse M. A. Flexa e
Cláudia Lima pela ajuda nos trâmites burocráticos da Pós-Graduação; Elza M. R. B.
Faquim, Maria Inês Chiarelli de Camargo e Elena A. Tanganini pelo auxílio na recuperação
de informação bibliográfica e disposição do trabalho dentro das diretrizes adotadas pela
Faculdade;
- todos do Instituto Brasileiro para Medicina da Conservação – TRÍADE, que apóiam seus
membros que precisam se afastar temporariamente das atividades do Instituto para
concluírem seus trabalhos acadêmicos;
- o amigo Carlos Yamashita pelas muitas digressões sobre evolução;
- a caríssima amiga de infância, a policial militar Célia Regina Modollo Custódio pelo
auxílio e incentivo na época de conclusão desta tese;
- o Jeep Clube do Brasil, por ter disponibilizado as instalações de sua sede rural para a
redação da tese; e especialmente o Sr. André e família.
EPÍGRAFES
A história chegou tarde a praticamente todos os encontros entre o homem e a
vida selvagem. Quando Colombo fez a primeira vistoria da costa antilhana, mais de dez mil
anos de ocupaçào humana já a haviam transformado de maneira incomensurável até para os
mais dedicados esforços arqueológicos. Apesar disso, de todos os continentes tropicais, a
América do Sul foi o último a ser invadido pelo homem, e o domínio humano de suas
florestas foi muito menos intenso e duradouro que o da Ásia, África e Austrália. Por isso, os
europeus em seu Novo Mundo encontraram uma natureza mais pura que a de outros pontos
dos trópicos e, assim, uma parte muito maior do processo de degradação ocorreu em uma era
de registros escritos. A América do Sul é, portanto, o campo de batalha mais recente para o
historiador florestal, no qual todos os que tombaram ainda jazem insepultos e os vencedores
ainda vagueiam por toda parte, saquando e incendiando o entulho.
A história florestal corretamente entendida é, em todo o planeta, uma história
de exploraçào e destruição. O homem reduz o mundo natural a entornos domesticados,
aparados e moldados para se adequarem a algum uso prático ou à estética convencional (...).
As intervençòes humanas quase nunca realizam as expectativas humanas. Seus campos se
empobrecem, seus pastos se tornam magros e lenhosos, suas cidades entram em colapso. O
mundo natural, simplificado, em desacordo, com os desejos humanos, mas em resposta a seus
atos, converte-se em uma enorme macega cosmopolita de luto. (...)
A preservação de florestas deve (...) basear-se em algo além do argumento do
auto-interesse cultural, ambiental ou econômico; talvez em uma concepção de interesse que
apenas se poderia definir por um autoconhecimento mais perspicaz e uma compreensão mais
profunda e filosófica do mundo natural. Muitos prevêem, com mal-estar, a iminente
extinção das florestas tropicais do planeta.
Warren Dean
O ‘especismo’é um pré-conceito ou uma atitude pré-concebida a favor dos interesses dos
membros da sua própria espécie e desfavorável em relação aos membros de outras espécies. Os
racistas violam o princípio de igualdade quando, ao surgir um conflito entre seus interesses e
os dos representantes de uma outra raça, atribuem mais peso aos interesses dos
representantes da própria raça. Os sexistas violam o princípio de igualdade ao privilegiar os
interesses de pessoas do mesmo sexo que eles. Da mesma forma, os especistas permitem que os
interesses de sua própria espécie sobrepujem os maiores interesses dos membros de outras
espécies. Nos três casos, trata-se do mesmo tipo de comportamento.
Paul Singer
Enquanto o programa dos ecologistas profundos assenta por inteiro na rejeição do
antropocentrismo cartesiano ou utilitarista em nome dos direitos da ecosfera, a lógica de sua
própria postura leva-os a recair numa das mais extravagantes formas de antropomorfismo
(...) Não são eles mesmos antropocentristas quando pretendem saber qual é o melhor para o
meio ambiente natural? Ao imaginarem que o bem está inscrito no ser das coisas, eles
acabam esquecendo que toda valorização , inclusive a da natureza, é obra dos homens, e que,
por conseguinte, toda ética normativa é, de algum modo, humanista e antropocentrista. (...)
O projeto de uma ética normativa anti-humanista é uma contradição em si. (...) Quereriam
conservar a idéia de valor e suprimir suas condições de possibilidade: esquecem, de passagem,
que são eles, enquanto seres humanos, quem valoriza a natureza e não o inverso, que é
impossível fazer abstração deste momento subjetivo ou humanista para projetar no próprio
universo um “valor intrínseco” qualquer. (...) É nessa operação pela qual pretende abstrair a
subjetividade que a filosofia da natureza cede às ilusões do antropomorfismo. (...)
Luc Ferry
RESUMO
FILONI, C. Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados. [ Exposure of wild felids to selected infectious agents]. 2006. 127 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Este estudo avaliou a exposição de 12 espécies de felídeos selvagens de vida livre (n=22) e
mantidas em cativeiro (n=210) no Brasil a 16 agentes potencialmente patogênicos para
membros da família Felidae, como herpesvírus felino 1 (FHV 1), calicivírus felino (FCV),
parvovírus felino (FPV), coronavírus felino (FCoV), vírus da leucemia felina (FeLV), vírus
da imunodeficiência felina (FIV), lentivírus de puma (PLV), vírus da cinomose canina
(CDV), Bartonella henselae, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma
haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’, Candidatus Mycoplasma turicensis’,
Theileria sp e Cytauxzoon sp, através do emprego de IFA, Western blot, ELISA e TaqMan®
PCR e RT-PCR em amostras de soro, sangue, fezes e suabes orais, conforme as amostras
disponíveis para cada animal. A detecção direta de patógenos ou de anticorpos demonstrou
que populações de felídeos selvagens no Brasil estão expostas pelo menos ao FHV 1, FCV,
FPV, FCoV, FeLV e lentivírus felinos, Bartonella henselae, Ehrlichia canis, Mycoplasma
haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ e Cytauxzoon sp, ou agentes
relacionados, quais provavelmente contribuem em quadros não diagnosticados de morbidade
e/ou mortalidade das populações de felídeos selvagens no País. A presença de patógenos
comuns de carnívoros domésticos em felídeos selvagens aponta para a necessidade de
cuidadoso monitoramento destas infecções através de uma abordagem integrada e
multidisciplinar.
Palavras-chave: Felidae; Doenças Infecciosas; Vírus; Bactérias; Piroplasmida
ABSTRACT
.
FILONI, C. Exposure of wild felids to selected infectious agents. [Exposição de felídeos selvagens a agentes infecciosos selecionados]. 2006. 127 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
This study evaluated exposure of 12 nondomestic felid species, both free-ranging (n=22) and
captive (n=210) in Brazil to 16 potential pathogenic agents for members of Felid family, as
feline herpesvirus 1 (FHV 1), feline calicivirus (FCV), feline parvovirus (FPV), feline
coronavirus (FCoV), feline leukemia virus (FeLV), feline immunodeficiency virus (FIV),
puma lentivirus (PLV), canine distemper virus (CDV), Bartonella henselae, Ehrlichia canis,
Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma
haemominutum’, Candidatus Mycoplasma turicensis’, Theileria sp, and Cytauxzoon sp, using
IFA, Western blot, ELISA, and TaqMan® PCR and RT-PCR in serum, blood, feces and oral
swabs, according to available samples for each animal. The antibody or agents detection
demonstrated that Brazilian wild felid populations are exposed to at least FHV 1, FCV, FPV,
FCoV, FeLV, puma lentivirus (PLV), Bartonella henselae, Ehrlichia canis, Mycoplasma
haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’, and Cytauxzoon sp, related agents,
which probably contribute to undiagnosed morbidity and/or mortality scenarios for the
Brazilian populations of wild felids. The presence of common domestic carnivore pathogens
in wild felids address the need of close monitoring of such infections throughout an
integrative and multidisciplinary approach.
Key words: Felidae; Infectious Diseases; Virus; Bacteria; Piroplasmida
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mapa mostrando as áreas geográficas no Brasil em que as amostras dos 22 felídeos de vida livre foram colhidas. São Paulo, 2004.................................................................................................... 47
Figura 2 - As amostras de ácidos nucléicos (DNA e TNA) dos felídeos de cativeiro foram agrupadas utilizando um equipamento robotizado MagNAPure LC (Roche, Rotkreuz, Suíça) de acordo com os esquemas de pipetagem explicitados nas figuras 2a e 2b para realização dos testes conforme demonstrado na figura 2c. São Paulo, 2004........................................................................................................ 57
Figura 3 - Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (28,57%), FCV (28,57%), FCoV (4,76%), Ehrlichia canis (4,76%), Anaplasma phagocytophilum (0) e Bartonella henselae (95,0%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas 21 amostras de soro provenientes de felídeos de vida livre no Brasil. São Paulo, 2004..................................................... 61
Figura 4 - Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (19,04%), FCV (50,79%), FCoV (64,59%), FPV (69,84%), Ehrlichia canis (0,47%) e Bartonella henselae (48,29%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas amostras de soro provenientes de felídeos mantidos em cativeiro no Brasil, tomadas em conjunto. São Paulo, 2004............................... 61
Figura 5 - Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FCoV (72,10%), Ehrlichia canis (0) e Bartonellahenselae (48,29%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas 147 amostras de soro provenientes de felídeos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). Também estão representados os resultados para o espécime de Oncifelis colocolo, CAD 28505, que ainda não havia sido vacinado por ocasião da colheita de material, o qual também se apresentou soronegativo para FHV 1, FCV e FPV. São Paulo, 2004.................... 62
Figura 6 - Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (19,35%), FCV (51,61%), FCoV (46,77%), FPV (70,96%) e Ehrlichia canis (1,61%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), em 62 amostras de soro de felídeos provenientes de diversos zôos no Brasil cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC). São Paulo, 2004............................... 62
LISTA DE QUADROS
Quadro - 1 Testes realizados para 11 patógenos em amostras de material biológico dos felídeos de vida livre. São Paulo, 2004............................................. 48
Quadro 2 - Testes realizados para 14 patógenos em amostras de material biológico dos felídeos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). São Paulo, 2004....................................................................... 49
Quadro 3 – Testes realizados para seis patógenos em amostras de material biológico dos felídeos mantidos em cativeiro cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC). São Paulo, 2004...................................................... 50
Quadro 4 – Testes TaqMan® PCR e RT-PCR realizados para 11 patógenos em amostras de material biológico de seis felídeos de vida livre. São Paulo, 2004............................................................................................... 56
LISTA DE TABELAS
Tabela - 1 Número amostral e instituições cedentes de amostras de felídeos selvagens mantidos em cativeiro e de vida livre. São Paulo, 2004........................................................................................................ 46
Tabela 2 - Resultados dos testes sorológicos realizados para as amostras de felídeos de vida livre, distribuídos em função dos métodos empregados e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004........................................................................................................ 59
Tabela 3 – Resultados dos testes sorológicos realizados nas amostras provenientes dos felídeos da Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), distribuídos em função dos métodos empregados e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004....................................... 59
Tabela 4 – Resultados dos testes sorológicos realizados nas amostras de felídeos cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC), distribuídos em função dos métodos empregados e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004....................................................................................................... 60
Tabela 5 – Resultados dos testes TaqMan® PCR e RT-PCR realizados para seis amostras de felídeos de vida livre, distribuídos em função das amostras utilizadas e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004...... 60
Tabela 6 - Resultados dos testes TaqMan® PCR e RT-PCR para FeLV nos jaguarundis (Herpailurus yaguarondi) mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), distribuídos em função das provas efetuadas e das amostras utilizadas. São Paulo, 2004............................ 63
Tabela 7 Resultados dos testes TaqMan® PCR para bactérias e protozoários piroplasmas realizados em amostras de sangue de 109 felídeos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). São Paulo, 2004............................................................................................. 64
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Instituições e organizações
AMC Associação Mata Ciliar CENAP Centro Nacional de Pesquisas para Conservação de Predadores Naturais CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético CITES Convention on International Trade in Endangered Species - Convenção
sobre o Comércio Internacional de Espécies da Flora e Fauna Selvagens em Perigo de Extinção
FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FPZSP Fundação Parque Zoológico de São Paulo IATA International Air Transport Association – Associação Internacional de
Transporte AéreoPI 650 diagnostic specimen – amostra diagnósticaIBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IUCN International Union for the Conservation of Nature – União Internacional
para a Conservação da Natureza LAPCOM Laboratório de Patologia Comparada ONG organização não-governamental SZB Sociedade de Zoológicos do Brasil USP Universidade de São Paulo VPT Departamento de Patologia
Agentes patogênicos, amostras, unidades de medida e outras substâncias empregadas nos testes diagnósticos
µl microlitro 16S subunidade de RNA CAD número de cadastro individual dos animais na FPZSP CDV canine distemper virus - vírus da cinomose canina CrFK crandell feline kidney cells - células de rim felino de Crandell DNA ácido desoxirribonucléico EDTA ácido dietilenodiaminotetracético ELISA enzyme linked immunosorbent assay FCoV feline coronavirus – coronavírus felino FCV feline calicivirus – calicivírus felino FeLV feline leukemia virus – vírus da leucemia felina FHV 1 feline herpesvirus 1 – herpesvírus felino 1 FITC isotiocianato de fluoresceína FIV feline immunodeficiency virus – vírus da imunodeficiência felina FPV feline parvovirus – parvovírus felino gp70 glicoproteína de peso molecular 70 IFA imunofluorescência indireta IM intramuscular kg quilograma MEM meio mínimo de Eagle mg miligrama
min. minutos n número amostral p12 proteína de peso molecular 12 p15 proteína de peso molecular 15 p24 proteína de peso molecular 24 p27 proteína de peso molecular 27 p58 proteína de peso molecular 58 PBS phosphate buffered saline solution - solução salina fosfatada
tamponada PCR polymerase chain reaction - reação de polimerização em cadeia FECV coronavírus entérico felino FIPV vírus da peritonite infecciosa felinaPIF peritonite infecciosa felina PLV puma lentivirus – lentivírus de puma RNA ribonucleic acid - ácido ribonucléico rRNA ribossomic ribonucleic acid - ácido ribonucléico ribossômico RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain raction – reação de
polimerização em cadeia submetida à ação da transcriptase reversa SB studbook – registro individual internacional TGEV transmissible gastroenteritis virus -vírus da gastroenterite transmissívelTNA total nucleic acids - ácidos nucléicos totais PD - 5 linhagem de células de rim suíno G gammaglobulin - imunoglobulina tipo gama H+L high – pesada e light - leve
Unidades da Federação Brasileira e outras unidades geopolíticas
AC Acre AM Amazonas CA California - CalifórniaDF Distrito Federal EUA Estados Unidos da América GO Goiás MG Minas Gerais MS Mato Grosso do Sul MT Mato Grosso PA Pará PE Pernambuco PR Paraná RJ Rio de Janeiro RO Rondônia RS Rio Grande do Sul SC Santa Catarina SP São Paulo UK United Kingdom - Reino Unido USA United States of America - Estados Unidos da América WA Washington
LISTA DE SÍMBOLOS
°C graus Celsius ® marca registrada ™ Trade mark + adição : divisão
maior ou igual % percentagem
APRESENTAÇÃO
Os ideais que embasaram esta tese foram constituídos nas últimas décadas do século
XX, enquanto as questões ligadas à conservação da natureza tomavam vulto. Entretanto, o
século XXI se iniciou gerando um grande ceticismo de que a natureza viesse a ser mais
respeitada e admirada que meramente espoliada.
Agravaram-se a devastação, o descaso e a displicência dispensados à natureza.
Aqueles que dirigem países ainda não investem ou pensam em sustentabilidade sócio-
ambiental, mas concordam em modificar cruelmente os ambientes naturais em nome de
interesses econômicos progressistas, acreditam erroneamente que a melhora da qualidade de
vida humana está ligada à exploração ilimitada dos chamados recursos naturais, não
enxergam os problemas ligados ao crescimento urbano, e sequer se incomodam com o ritmo
de destruição dos ecossistemas e do cerceamento de todas as áreas selvagens da Terra.
Quisera a sobrevivência humana viesse a ser pautada pela lógica da sustentabilidade
planetária, e não mais pela arbitrariedade econômica. Que os custos ambientais estivessem
sempre presentes nas transações comerciais. Que a humanidade, que foi capaz de realizar
um salto tecnológico tão significativo em tão poucas décadas, quiçá fosse também capaz de
voltar seu olhar para os demais componentes da natureza, ou, pelo menos, olhar para si
mesma a longo prazo.
Apesar deste panorama, existem pessoas dispostas a trabalhar em prol da
conservação, como muitas daquelas que auxiliaram na execução deste projeto. Assim,
acredito que este trabalho seja útil e interessante aos profissionais veterinários e de áreas
afins que se interessam pela metodologia técnico-científica empregada e pela problemática
que envolve a questão da preservação e conservação dos felídeos selvagens em seu meio
natural e no cativeiro.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................ 22
2 OBJETIVOS............................................................................................. 24
2.1 OBJETIVOS GERAIS............................................................................... 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................... 24
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 26
2.1 A FAMÍLIA FELIDAE.............................................................................. 26
2.2 DOENÇAS E CONSERVAÇÃO............................................................... 27
2.3 AGENTES VIRAIS................................................................................... 29
2.3.1 Herpesvírus felino 1 (FHV 1) e calicivírus felino (FCV)...................... 30
2.3.2 Parvovírus felino (FPV)........................................................................... 32
2.3.3 Coronavírus felino (FCoV)...................................................................... 33
2.3.4 Vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da imunodeficiência felina (FIV) e lentivírus de puma (PLV)........................................................... 34
2.3.5 Vírus da cinomose canina (CDV)............................................................ 36
2.4 AGENTES BACTERIANOS..................................................................... 38
2.4.1 Bartonella henselae................................................................................... 38
2.4.2 Ehrlichia canis e Anaplasma phagocytophilum...................................... 39
2.4.3 Hemoplasmas: Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ e ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’.................... 40
2.5 PROTOZOÁRIOS PIROPLASMAS: Theileria sp E Cytauxzoon sp........ 41
2.6 AS TÉCNICAS LABORATORIAIS......................................................... 42
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................... 44
3.1 ANIMAIS E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS......................................... 44
3.2 PATÓGENOS PESQUISADOS................................................................ 48
3.3 TESTES DIAGNÓSTICOS....................................................................... 50
3.3.1 Testes sorológicos..................................................................................... 51
3.3.1.1 Reações de imunofluorescência indireta (IFA).......................................... 51
3.3.1.1.1 Controle de qualidade das lâminas para IFA............................................ 52
3.3.1.2 Ensaios imunoenzimáticos......................................................................... 52
3.3.1.3 Western blot................................................................................................ 55
3.3.2 Testes TaqMan® PCR e RT-PCR.......................................................... 55
4 RESULTADOS......................................................................................... 58
5 DISCUSSÃO............................................................................................. 65
5.1 AMOSTRAGEM....................................................................................... 65
5.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA FELÍDEOS DE VIDA LIVRE............................................................................................. 67
5.3 ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA FELÍDEOS MANTIDOS EM CATIVEIRO................................................................. 71
5.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................... 73
6 CONCLUSÕES........................................................................................ 76
7 REFERÊNCIAS....................................................................................... 78
APÊNDICES............................................................................................. 92
22
1 INTRODUÇÃO
O estudo do papel das doenças constitui um eixo importante das estratégias para a
conservação dos animais selvagens, seja em ambiente natural ou de cativeiro. Estudos
ecológicos reconhecem as doenças como fatores regulatórios de populações naturais, embora
os fatores envolvidos nestas cadeias regulatórias raramente sejam conhecidos. Animais
mantidos em cativeiro são acometidos freqüentemente por doenças de causa nem sempre
elucidada, o que geralmente requer um diagnóstico etiológico para que medidas terapêuticas
e profiláticas possam ser tomadas. Finalmente, as doenças que acometem animais selvagens
também podem ser causadas por agentes zoonóticos, que devem ser identificados para que
medidas preventivas adequadas possam ser tomadas pelas pessoas que lidam diretamente
com os animais ou amostras de seus materiais clínicos.
Considerando-se que toda a família Felidae encontra-se ameaçada (NOWEL;
JACKSON, 1996), que os hábitats reduzem-se progressivamente e que há um número
considerável de felídeos mantidos em cativeiro, torna-se necessário conhecimento acumulado
e aplicabilidade imediata deste conhecimento para resolver questões referentes à saúde desta
família de carnívoros para sua conservação. Embora já exista de fato conhecimento
acumulado na literatura científica, tais dados ou relatos não são extensivos o suficiente para
cobrir as diversas populações ou permitir uma correta avaliação clínica em caso de doenças.
Tratados individualmente ou como populações, a abordagem clínica ou terapêutica dos
animais deve se fundamentar em dados epidemiológicos e laboratoriais.
Os felídeos selvagens são animais carnívoros de topo de cadeia alimentar que em
ambiente natural percorrem extensos territórios em busca de alimentação e abrigo.
Conseqüentemente, estão expostos a uma ampla gama de patógenos presentes no ambiente ou
provenientes de seus contactantes, sejam estes presas, outros competidores, elementos de sua
própria espécie e, muito recentemente em termos biogeográficos e evolutivos, também a
animais domésticos.
Este estudo objetivou avaliar a exposição de 12 espécies de felídeos selvagens, tanto
de vida livre quanto mantidas em cativeiro, a determinados agentes potencialmente
patogênicos para membros da família Felidae, através do emprego de um repertório de
técnicas diagnósticas laboratoriais. O número amostral da população de vida livre (n=22)
analisada neste estudo foi menor que o de cativeiro (n=210) e as espécies de felídeos
avaliadas, entre neotropicais e exóticas, diversificadas. As variações se estendem para as
23
idades dos animais, procedências, estados clínicos e outras. Porém, a amostragem refletiu de
forma consistente o universo populacional de felídeos selvagens disponível no Brasil para
acesso científico.
Foram utilizadas técnicas diagnósticas baseadas em detecção indireta e direta de
patógenos. Foram utilizadas técnicas indiretas sorológicas, capazes de indicar se as amostras
testadas apresentavam anticorpos específicos contra substâncias antigênicas constituintes de
determinados patógenos, revelando desta forma se os animais haviam sido, em algum
momento de suas vidas, expostos a tais substâncias. Entre as técnicas de detecção direta,
foram utilizados procedimentos sorológicos diretos, direcionados para detecção de
substâncias antigênicas constituintes dos patógenos e por fim, técnicas moleculares capazes
de detectar fragmentos específicos de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) dos patógenos nas
amostras.
Um total de 16 agentes infecciosos foram pesquisados, entre os quais os agentes virais
herpesvírus felino 1 (FHV 1), calicivírus felino (FCV), parvovírus felino (FPV), coronavírus
felino (FCoV), vírus da leucemia felina (FeLV), os seguintes lentivírus: vírus da
imunodeficiência felina (FIV) e lentivírus de puma (PLV), o vírus da cinomose canina
(CDV); os agentes bacterianos: Bartonella henselae, Ehrlichia canis, Anaplasma
phagocytophilum, os hemoplasmas Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma
haemominutum’ e ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’; assim como os protozoários
piroplasmas: Theileria sp e Cytauxzoon sp.
24
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Constituíram objetivos gerais deste trabalho:
1) avaliar a exposição de felídeos selvagens de vida livre ou mantidos em cativeiro no Brasil,
mediante técnicas diagnósticas laboratoriais adequadas, a 16 potenciais patógenos:
a) virais: herpesvírus felino 1 (FHV 1), calicivírus felino (FCV), parvovírus felino
(FPV), coronavírus felino (FCoV), vírus da leucemia felina (FeLV), os seguintes
lentivírus: vírus da imunodeficiência felina (FIV) e lentivírus de puma (PLV), o
vírus da cinomose canina (CDV);
b) bacterianos: Bartonella henselae, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum,
os hemoplasmas Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma
haemominutum’ e ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’;
c) protozoários piroplasmas: Theileria sp e Cytauxzoon sp;
2) fornecer parâmetros para a adoção de protocolos preventivos para o manejo de felídeos
selvagens no País.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Constituíram objetivos específicos deste trabalho:
25
1) investigar se doenças infecciosas causadas pelos patógenos pesquisados podem contribuir
nos quadros de morbidade e/ou mortalidade das populações de felídeos selvagens no País;
2) verificar se patógenos associados a carnívoros domésticos circulam em populações de
felídeos selvagens;
3) verificar se as populações de felídeos selvagens no País representam risco para transmissão
de zoonoses
4) identificar patógenos que devem ser investigados durante procedimentos/situações tais
como translocações, quarentenas, manutenção e monitoramento de felídeos selvagens.
26
2 REVISÃO DE LITERATURA
Neste capítulo, serão apresentadas a família Felidae, questões ligadas à doenças e
conservação e os agentes patogênicos e princípios gerais das técnicas diagnósticas utilizadas.
2.1 A FAMÍLIA FELIDAE
A família Felidae pertence à Ordem Carnivora e seus membros apresentam entre 1,3 a
mais de 300 kg de massa corporal. A taxonomia do grupo tem sido debatida, ilustrando as
inconsistências filogenéticas não resolvidas sobre o aspecto evolucionário da família
(NOWAK, 1999; WERDELIN, 1996). Estudos recentes utilizando análises morfológicas e
moleculares esclareceram muitos aspectos dos relacionamentos evolucionários dos felídeos,
mas ainda não foram incorporados em novos esquemas taxonômicos (OLIVEIRA et al.,
2001). Desta forma, o esquema taxonômico proposto por Wozencraft (1993) foi considerado
por Werdelin (1996) o que melhor refletia a variação entre as espécies, tendo sido adotado
pela União Internacional para a Conservação da Natureza (International Union for the
Conservation of Nature – IUCN) e também é adotado no presente trabalho para referir-se às
espécies de felídeos.
As espécies selvagens que compõem a família Felidae distribuem-se por cinco das
seis regiões zoogeográficas da Terra, apenas não tendo ocupado naturalmente a Região
Australiana, determinados arquipélagos e Antártica. As regiões zoogeográficas são divisões
da biosfera terrestre baseadas nas áreas de distribuição geográfica e relacionamentos
filogenéticos dos animais e são consideradas limites naturais para o estabelecimento de
estudos regionais (DARLINGTON, 1957). A América do Sul, América Central (incluindo
Antilhas) e parte tropical do México compõem a Região Neotropical. A fauna neotropical de
felídeos consiste de 10 espécies: onça-pintada (Panthera onca), suçuarana ou puma (Puma
concolor), jaguatirica (Leopardus pardalis), gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus),
gato-maracajá (Leopardus wiedii), jaguarundi ou gato-mourisco (Herpailurus yaguarondi),
gato-do-mato-grande (Oncifelis geoffroyi), gato-palheiro ou gato-dos-pampas (Oncifelis
colocolo), kodkod (Oncifelis guigna) e gato-andino (Oreailurus jacobitus), sendo que apenas
27
estas duas últimas espécies listadas não ocorrem naturalmente no Brasil. Contudo, apesar de
amplamente distribuídas, todas as espécies selvagens de felídeos encontram-se em algum
grau ameaçadas (NOWAK, 1999; NOWELL; JACKSON, 1996; OLIVEIRA; CASSARO,
1997) e portanto, considera-se que todas devam ser alvo de medidas conservacionistas. Entre
as 37 espécies de felídeos reconhecidas, apenas para o gato doméstico (Felis catus), aspectos
clínicos e padrões fisiopatológicos de doenças infecciosas são relativamente bem
compreendidos. Por este motivo, o gato doméstico, que apresenta evidências de descender de
uma subespécie de gato-selvagem africano e do sudoeste asiático (Felis silvestris lybica) e
que posteriormente se miscigenou com o gato-selvagem europeu (Felis silvestris silvestris)
(NOWAK, 1999) é utilizado como parâmetro para o estudo das enfermidades que podem
acometem os membros selvagens da família.
2.2 DOENÇAS E CONSERVAÇÃO
Entre os principais fatores causais de ameaça aos felídeos de todo o mundo, estão a
perda de hábitat, perseguição direta em forma de caça e redução ou eliminação de suas presas
naturais. No entanto, com a deterioração ambiental, a ocorrência de doenças tem emergido
como um problema central na conservação de carnívoros (FUNK et al., 2001; NOWELL E
JACKSON, 1996). As doenças infecciosas são também particularmente relevantes para a
conservação de carnívoros porque muitas espécies ou populações já estão seriamente
ameaçadas pela perda de hábitats e perseguição, e desta forma mesmo aquelas menos severas
podem apresentar efeitos devastadores se ocorrerem em populações já pequenas ou em
declínio. Os efeitos das doenças podem ser agravados quando interagem com outros fatores
comuns em populações ameaçadas, como má nutrição, estresse e endogamia (MURRAY et
al., 1999). Conclui-se que a ocorrência de doenças infecciosas em populações naturais tende a
aumentar à medida que os hábitats diminuem e os animais se concentram em parques e
reservas (DOBSON; GRENFELL, 1995).
A maioria das doenças que exercem impacto negativo em populações ameaçadas têm
origem infecciosa (MUNSON, 2000). Os patógenos causadores destas doenças podem
ameaçar de extinção as populações de hospedeiros de duas formas: ameaçando diretamente a
população em função de elevada mortalidade ou reduzindo sua resiliência ao induzir doenças
28
crônicas e persistentes que podem causar declínios através de efeitos negativos na
fecundidade e recrutamento (CLEAVELAND et. al, 2003). No primeiro caso, situam-se as
doenças infecciosas causadas por patógenos com períodos infecciosos curtos, que geralmente
se disseminam através de contágio direto e que, se não forem letais, tendem a induzir em seus
hospedeiros imunidade de longa duração contra reinfecções; persistem apenas em populações
grandes e estruturadas de hospedeiros, que oferecem continuamente novos indivíduos
susceptíveis através dos nascimentos para a manutenção do ciclo. No segundo caso, situam-se
as doenças infecciosas causadas por patógenos que induzem doenças de decurso crônico, que
se valem de diversas estratégias indiretas para disseminação e normalmente são causadas por
patógenos mais complexos com grande variabilidade antigênica que desta forma tendem a
inibir a imunidade duradoura de seus hospedeiros. Tais patógenos não necessitam
necessariamente de grandes populações para persistirem, pois podem permanecer viáveis no
ambiente por longos períodos e repetidamente reinfectar os hospedeiros (DIAMOND, 1999).
Conseqüentemente ao fato de que os patógenos que causam alta mortalidade não
podem ser mantidos em populações pequenas de hospedeiros, as populações de felídeos
ameaçadas, tipicamente pequenas e isoladas, não são capazes de manter tais patógenos.
Porém, estes podem atingir as espécies ameaçadas se são mantidos em populações mais
comuns e numerosas, como populações de carnívoros domésticos, que agem como potenciais
reservatórios. O rápido crescimento populacional humano e a crescente mobilização de
humanos e animais domésticos não apenas ameaçam diretamente os hábitats e as espécies
vulneráveis, como também favorecem a disseminação e persistência de doenças infecciosas.
(CLEAVELAND et. al., 2003).
Devido ao mecanismo de transmissão inter-específica, os patógenos que apresentam
risco maior para as espécies ameaçadas são os generalistas, que podem infectar diversas
espécies diferentes, e não aqueles mais específicos. (CLEAVELAND et al, 2003). O contato
com gado (Bos sp), cães (Canis familiaris), gatos e outros animais domésticos abrem
possibilidades de transmissão inter-específica de agentes infecciosos (DASZAK et al., 2000;
FIORELLO et al., 2004; MENDES-DE-ALMEIDA et al., 2003; MURRAY et al., 1999).
Considera-se, a priori, que todas as espécies da família Felidae sejam susceptíveis
aos mesmos patógenos (FOWLER, 1986), ainda que muitos aspectos reprodutivos,
hematológicos e outros padrões fisiológicos ainda não sejam inteiramente conhecidos para
todas as espécies de felídeos. É problemática, portanto, a consideração de que as populações
mantidas em cativeiro sejam particularmente afetadas de forma indesejada em função disto,
29
pois são potencialmente expostas a uma grande variedade de patógenos, generalistas e
específicos, uma vez que no ambiente de cativeiro felídeos das mais diversas origens
geográficas são mantidos próximos, em alta densidade populacional, comumente sob estresse
(CLUBB; MASON, 2003) e em muitos casos em contato ocasional com gatos domésticos.
Em situação de vida livre, a invasão dos hábitats por carnívoros domésticos, como cães e
gatos, favorecem a disseminação e persistência de patógenos nestas populações, seja
mediante contato direto, como por predação (JESSUP et al., 1993) ou contaminação
ambiental.
Apesar das implicações das infecções na conservação de espécies selvagens serem
difícieis de serem acessadas, é amplamente aceito que o monitoramento destas infecções seja
uma importante ferramenta de manejo para populações ameaçadas (DASZAK et al., 2000;
MUNSON, 2000; MURRAY et al., 1999). O conhecimento sobre doenças infecciosas em
felídeos neotropicais é muito pequeno, e o impacto de qualquer infecção nestas espécies é
desconhecido. Entre os felídeos neotropicais, as onças-pintadas, suçuaranas e jaguatiricas de
vida livre são melhor representadas em projetos de campo que lidam com carnívoros no
Brasil; mas ainda assim há grande falta de informações referentes à ocorrência de doenças
nos animais monitorados (BRASIL, 2004). A obtenção de informações sobre a exposição de
felídeos de vida livre a potenciais agentes infecciosos deve auxiliar projetos ecológicos e
conservacionistas, assim como fornecer informações para programas de manejo in situ e ex
situ. Na década de 1990, o Grupo de Trabalho Especial idealizou o Plano de Manejo
Integrado para Pequenos Felinos Brasileiros (BRASIL, 1995), quando se iniciaram estudos
sistemáticos com felinos neotropicais mantidos em cativeiro. Foi verificado que muitas
enfermidades relacionadas com felídeos neotropicais cativos em zôos e criadouros no Brasil
eram associadas com manejo, como condições sanitárias inadequadas e deficiências
nutricionais (ADANIA et al., 1998; OLIVEIRA et al. 2001); entretanto, o estudo de doenças
infecciosas nestas populações ainda é incipiente.
2.3 AGENTES VIRAIS
Os agentes virais têm sido implicados como a causa de diversos declínios em
populações de carnívoros. Vírus comuns em carnívoros domésticos foram relatados
30
infectando felídeos selvagens de vida livre e mantidos em cativeiro na África, Europa,
América do Norte e Japão (ARTOIS e REMOND, 1994; DANIELS et al., 1999; FROMONT
et al., 2000; HOFMANN-LEHMANN et al., 1996; LEUTENEGGER et al., 1999a;
MOCHIZUKI et al., 1990; NISHIMURA et al., 1999; OLMSTED et al., 1992; OSTROWSKI
et al., 2003; PAUL-MURPHY et al., 1994; ROELKE-PARKER et al., 1996). Dados
referentes a infecções virais em felídeos neotropicais brasileiros são esparsos e se concentram
principalmente em retrovírus felinos. Os vírus mais importantes que infectam gatos
domésticos e felídeos selvagens são: herpesvirus felino 1 (FHV 1), calicivirus felino (FCV),
parvovírus felino (FPV), coronavirus felino (FCoV), virus da leucemia felina (FeLV) e virus
da imunodeficiência felina (FIV) (HOFMANN-LEHMANN et al., 1996). Felídeos selvagens
também podem ser susceptíveis ao vírus da cinomose canina (CDV) (ROELKE et al., 1996).
2.3.1 Herpesvírus felino 1 (FHV 1) e calicivírus felino (FCV)
Os principais vírus implicados no desenvolvimento de doenças respiratórias em
felídeos são o FHV e o FCV. Apesar de pertencerem a diferentes famílias (FHV:
Herpesviridae e genoma de DNA; FCV: Caliciviridae, genoma de RNA), determinam, em
seus hospedeiros, sinais clínicos semelhantes, que incluem pirexia, depressão, espirros,
hipersalivação, descargas oculares e nasais, conjuntivite, dispnéia, e tosse, traqueíte,
anorexia, letargia. Ocasioalmente, pode ocorrer pneumonia viral primária ou doença
generalizada, particularmente em animais jovens e debilitados. Manifestações mais raras
incluem doença ocular, como ceratite intersticial e ulcerativa. Úlceras cutâneas já foram
descritas em gatos domésticos e em guepardos. Estudos experimentais sugeriram que os
abortos, quando ocorrem, são resultado da natureza sistêmica severa da infecção, e não de um
efeito direto do vírus. (GASKELL; WILLOUGHBY, 1999). Salivação excessiva e úlceras na
córnea sugerem infecção por FHV 1, enquanto úlceras na língua, pálato e faringe são mais
comumente encontradas em infecções por FCV.
O FHV 1 infecta apenas membros da família Felidae. O principal hospedeiro é o gato
doméstico, mas foram obtidos isolados de felídeos selvagens, como os guepardos (Acinonyx
jubatus)e há crescente evidência sorológica de infecção disseminada em felídeos de vida livre
em diversas partes do mundo. (GASKELL; WILLOUGHBY, 1999) Estudos sorológicos têm
31
indicado que o FHV se encontra disseminado em populações de vida livre de leões, pumas e
guepardos (PAUL-MURPHY et al., 1994). Igualmente, o vírus acomete populações de
felídeos mantidas em cativeiro. Cerca de metade dos gatos que apresentam doença
respiratória tem infecção pelo FHV 1 e outra metade apresenta infecção pelo calicivírus
felino. Investigações têm demonstrado que a presença de anticorpos para FHV 1 em colônias
de gatos é cerca de 70%, enquanto que para gatos domiciliados é de menos de 50%.
(GASKELL; WILLOUGHBY, 1999)
O FHV 1 é lábil no ambiente, são bastante sensíveis à desinfecção e não são
conhecidos reservatórios que não os felinos. A disseminação é horizontal, através de contato
direto, fômites ou aerossóis a partir de animais com infecção aguda ou mesmo de carreadores
assintomáticos. (GASKELL; WILLOUGHBY, 1999; MAGGS, 2005) Todos os herpesvírus
são capazes de permanecer latentes em seus hospedeiros naturais; seus genomas latentes
retêm a capacidade de replicação e de causar doença quando reativados. A latência difere da
infecção crônica, uma vez que progênie não está presente. A capacidade de reativação
diferencia a latência da infecção abortiva. Em muitos animais, pode ocorrer recrudescência
dos sinais clínicos. O FHV 1 se replica rapidamente nas células epiteliais das membranas
mucosas, especialmente na conjuntiva, e ascende por axônios dos neurônios sensoriais para
estabelecer latência nos gânglios trigêmeos. (MAGGS, 2005), embora DNA viral
eventualmente seja detectado em outros sítios (neurológicos, turbinados nasais, córnea,
conjuntiva, cavidade oral, glândulas salivares e lacrimais, tonsilas e linfonodos sub-
mandibulares). O estado de carreador é caracterizado pela latência, com episódios
intermitentes de eliminação viral, situações em que o animal representa uma fonte de
infecção. A reativação pode ocorrer em qualquer momento, mas é mais provável que ocorra
durante períodos de estresse, podendo ocorrer transmissão para novos hospedeiros
susceptíveis, sejam eles a população residente no novo ambiente ou a nova geração de
filhotes. (GASKELL; WILLOUGHBY, 1999) A latência permite que os herpesvírus sejam
perpetuados até mesmo em pequenos grupos isolados de hospedeiros. Os testes diagnósticos
laboratoriais baseiam-se na demonstração de uma resposta imunológica ao organismo ou
detecção direta do agente. (MAGGS, 2005) Antigenicamente, todos os isolados são muito
similares e constituem um único sorotipo (GASKELL; WILLOUGHBY, 1999). O
entendimento da patogênese por FHV 1 estabelece um paradoxo com relação ao diagnóstico.
Gatos com infecção primária eliminam vírus em quantidades suficientes para a detecção
viral. Entretanto, os sinais clínicos nesta fase são característicos e auto-limitantes, de forma
32
que neste caso o diagnóstico definitivo é menos impotante. Em contraste, nas síndromes
crônicas associadas ao FHV 1, a presença de vírus é elusiva, dificultando o diagnóstico.
Finalmente, gatos absolutamente normais podem eliminar grandes quantidades de vírus a
qualquer momento. Isto tudo faz com que o diagnóstico individual de FHV 1 seja um desafio
no manejo das doenças crônicas relacionadas ao FHV 1. (MAGGS, 2005)
O FCV ocorre mundialmente e todos os felídeos são susceptíveis. Supõe-se que a
infecção por FCV em felídeos selvagens seja epidemiologicamente similar à que ocorre em
gatos domésticos. A transmissão natural ocorre via aerossol e fômites. Os vírus são liberados
pelos gatos infectados em grandes quantidades; gatos convalescentes continuam a liberar
vírus por muitos meses. O estresse pode precipitar a recrudescência da doença e a liberação
continuada. Linhagens diferentes de FCV variam em virulência; algumas linhagens estão
associadas principalmente com infecções brandas ou doença do trato respiratório anterior;
linhagens altamente virulentas regularmente produzem pneumonia, especialmente em
filhotes. (HURLEY; SYKES, 2003)
2.3.2 Parvovírus felino (FPV)
Todos os felídeos são susceptíveis à infecção pelo FPV (BARKER; PARRISH, 2001;
STEINEL et al., 2001; WACK, 2003). Levantamentos sorológicos têm indicado a presença
de FPV em pumas e bobcats (Lynx rufus) de vida livre nos Estados Unidos da América
(EUA), e em leões na África do Sul. (BARKER; PARRISH, 2001). Entretanto, a maioria dos
relatos de doença clínica associada a FPV em felídeos selvagens refere-se a animais mantidos
em cativeiro.
Freqüentemente, ocorre uma gastroenterite aguda com diarréia e linfopenia. Casos de
FPV ocorrem eventualmente em instituições que mantêm felídeos selvagens em cativeiro no
Brasil, mas geralmente é realizado apenas o diagnóstico clínico presuntivo. A transmissão
ocorre principalmente pela rota fecal-oral, através da ingestão de vírus presentes no ambiente
e em fômites. A dose infectante é baixa e as quantidades de vírus nas fezes de animais
eliminando os vírus são muito grandes. Vírus são eliminados através de todas as excreções de
animais infectados, permitindo também a transmissão direta. A transmissão vertical também
pode ocorrer (BARKER; PARRISH, 2001; GREENE, 1998). Para felídeos selvagens na
33
natureza, a transmissão do FPV através de sítios contaminados seria a principal forma de
disseminação dos vírus, devido aos hábitos solitários e densidades populacionais
caracteristicamente baixas. O FPV também pode acometer outros carnívoros (BARKER;
PARRISH, 2001).
O FPV apresenta tropismo por células em divisão (ASTELL, 1999; PARRISH, 1999).
Sendo assim, as doenças causadas pelos parvovírus envolvem citotoxicidade em tecidos com
alta taxa mitótica. Após infecção oronasal, a replicação viral ocorre em células da orofaringe
e tonsilas, linfonodos, timo, baço e Placas de Peyer em todo o intestino. Ocorre linfocitólise e
depleção celular, com regeneração destes tecidos em animais que sobrevivem. Grande
quantidade de vírus é eliminada pelas fezes. (BARKER; PARRISH, 2001; PARRISH, 1999;
STEINEL et al., 2001) Os sinais clínicos envolvem pirexia, anorexia, depressão, letargia,
diarréia, vômitos, desidratação, desequilíbrio eletrolítico e hipoproteinemia. Tipicamente,
ocorre linfopenia ou panleucopenia. (BARKER; PARRISH, 2001) Porém, as infecções por
parvovírus em carnívoros freqüentemente são assintomáticas ou os sinais são brandos. Pode
ocorrer morte por desidratação ou endotoxemia ou na ausência de qualquer sinal. (ASTELL,
1999; PARRISH, 1999) Em gatos domésticos, existe uma forma hiperaguda da doença
seguida de morte em menos de 12 horas, mimetizando intoxicação (HAGIWARA; ELIAS,
2003). A eliminação dos vírus pelas fezes é suprimida quando se desenvolve uma resposta
imune; nestes casos geralmente não persistem seqüelas, mas extensivo dano intestinal pode
determinar diarréia crônica (PARRISH, 1999).
Uma pequena proporção das infecções por parvovírus em gatos refere-se parvovírus
caninos (CPV-2a e CPV-2b); seqüências genômicas destes parvovírus caninos já foram
detectadas em guepardos, em bobcats e em um tigre-siberiano (P.tigris altaica) apresentando
sinais clínicos (BARKER; PARRISH, 2001; STEINEL et al., 2001).
2.3.3 Coronavírus felino (FCoV)
O FCoV, que pertence à família Coronaviridae, é um importante patógeno de felídeos
domésticos e selvagens. O FCoV é ubiqüitário e endêmico onde há maior densidade
populacional de susceptíveis. (BENETKA et al., 2004) No Brasil, suçuaranas, onça-pintadas,
34
gatos-maracajá e um gato-palheiro mantidos em cativeiro, assim como uma jaguatirica de
vida livre apresentaram-se soropositivas para FCoV (SCHMITT et al., 2003).
Os efeitos da infeçcão podem ser inaparentes ou pode haver um período transitório de
diarréia ou acometimento respiratório, podendo ocorrer também episódios severos de vômitos
ou diarréia, levando à perda de peso ou ainda culminar com a peritonite infecciosa felina
(PIF), responsável por alta taxa de mortalidade (EVERMANN; BENFIELD, 2001). A PIF é
uma doença imunomediada e fatal que acomete felídeos ocasionada pelo FCoV. São
conhecidos duas variantes biológicas de FCoVs: o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV)
e o coronavírus entérico felino (FECV). Estudos sugerem que o FIPV se originou de uma
mutação do FECV (BENETKA et al., 2004). O FCoV apresenta também dois sorotipos (I e
II) baseados em características de replicação em cultura de células e antigenicidade; o
sorotipo II associa-se mais freqüentemente com sinais clínicos e desenvolvimento de PIF
(KUMMROW et al., 2005)
Há fortes evidências da existência carreadores assintomáticos que podem excretar o
vírus por meses ou anos. Tais animais representam reservatórios para o vírus, constituindo
um problema na prevenção de FIP em ambientes de alta densidade de gatos. (BENETKA et
al., 2004) Entre 5 a 10% dos gatos soropositivos desenvolvem FIP, mas há maior incidência
em guepardos e determinadas raças e linhagens de gatos domésticos, sugerindo uma
predisposição genética para a doença. (BENETKA et al., 2004)
2.3.4 Vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da imunodeficiência felina (FIV) e
lentivírus de puma (PLV)
O FeLV quanto e os demais lentivírus felinos, como o FIV e PLV, pertencem à
família Retroviridae; associam-se com uma variedade de síndromes, envolvendo tumores
malignos de longa latência, doenças de emagrecimento progressivo, desordens neurológicas e
imunodeficiências, e determinam altos coeficientes de morbidade e mortalidade em gatos
domésticos no mundo todo (WORLEY, 2001).
Na maioria dos estudos sobre FIV em felídeos selvagens, não foi relatada
patogenicidade aparente atribuída ao vírus. No entanto, estudos recentes envolvendo leões
mantidos em cativeiro concluem que, de maneira similar aos gatos domésticos, esses animais
35
atravessam um período assintomático, sucedendo-se então disfunções linfocitárias,
imunológicas e neurológicas (KENNEDY-STOSKOPF, 1999).
Acredita-se que exclusivamente para o gato-selvagem-europeu (F. silvestris
silvestris), em que o FeLV é consistentemente encontrado em populações de vida livre, o
vírus não apresenta alta patogenicidade. A alta prevalência gatos-selvagens-europeus
soropositivos sugere que o vírus é mantido nestas populações. A possibilidade de que a
infecção por FeLV seja constantemente adquirida através de contato com gato doméstico é
pouco provável, uma vez que a prevalência em gatos-selvagens-europeus é constantemente
maior que aquelas para gatos domésticos nas respectivas regiões estudadas (HOFMANN-
LEHMANN, comunicação pessoal; DANIELS et al., 1999; FROMONT et. al., 2000;
LEUTENEGGER et. al. 1999a). Entretanto, o FeLV foi também associado com doença
severa em um espécime de puma (JESSUP et al., 1993) e de guepardo (MARKER et al.,
2003). Apesar de ser raramente encontrado infectando outros felídeos selvagens que não o
gato-selvagem-europeu, se estabelecido nestas populações, pode ter efeitos devastadores
(ARTOIS; REMOND, 1994; WORLEY, 2001).
Os retrovírus apresentam a capacidade de de se integrar no genoma das células
hospedeiras, não ser detectados pela vigilância imunológica celular e humoral e desta forma
estabelecendo infecções persistentes. Incorporados nas células hospedeiras, em forma de
DNA, são chamados provírus. As partículas virais infecciosas são chamadas exógenas; são
transmitidos vertical e horizontalmente, direta ou indiretamente, mas não através de células
germinativas. São muito lábeis no ambiente, sendo mantidos na natureza porque hospedeiros
infectados podem viver e liberar vírus por anos. A transmissão do FeLV ocorre
principalmente através da ingestão de partículas virais, na saliva e secreções nasais. A
replicação viral inicial ocorre em linfócitos e macrófagos na orofaringe e linfonodos
regionais. Nesta fase de viremia, uma resposta imune eficiente pode eliminar a infecção. Caso
contrário, o vírus se dissemina para a medula óssea e infecta células progenitoras mielóides e
eritróides, macrófagos e linfócitos circulantes. A inabilidade do sistema imunitário em inibir
a replicação inicial do FeLV leva ao estabelecimento de uma viremia persistente,
caracterizada pela presença tanto de vírus livres quanto associados a células no sangue,
quando o animal torna-se fonte de infecção. Tal estado geralmente progride para alguma
doença relacionada a FeLV. Neste caso, a replicação contínua em tecidos hemolinfáticos leva
a um estado progressivo de imunossupressão. Outros animais, porém, contêm a replicação
viral através de resposta imune adequada. Alguns gatos tornam-se resistentes e conseguem
36
extinguir a infecção. No entanto, a maior parte dos animais desenvolve infecção
autolimitante, albergando provírus latentes integrados em células da medula óssea, podendo
haver resposta imune parcial. O risco de reativação espontânea e de desenvolvimento de
doenças relacionadas ao FeLV, nos animais com este tipo de infecção, é pequeno. Nesse
caso, não há replicação e excreção de vírus, a não ser que o animal experimente um estado de
imunossupressão. (FILONI; CATÃO-DIAS, 2005a; 2005b; GOMES-KELLER et al., 2006)
A infecção por lentivírus relacionados ao FIV, em leões e pumas, na África, América
do Norte e Europa, foi demonstrada por Olmsted et al. (1992) e Spencer e Morkel (1993),
entre outros autores. O gene pol do vírus da imunodeficiência felina (FIV) obtido a partir de
uma suçuarana mantida em um zoológico brasileiro foi seqüenciado (CARPENTER et al.,
1996). Antes disso, Brown et al. (1993) havia detectado anticorpos para FIV em um espécime
de suçuarana brasileira de vida livre. Adicionalmente, Leal e Ravazzolo (1998) detectaram
provírus de FIV em onça-pintadas, suçuaranas, jaguarundis, jaguatiricas, gatos-maracajá,
gatos-palheiro e gatos-do-mato-pequenos no Brasil. Em um estudo sorológico conduzido em
populações de pequenos felinos neotropicais mantidas em cativeiro no Estado de São Paulo,
não foram encontradas evidências de exposição aos retrovírus FeLV e FIV (FILONI, 2001;
FILONI et al., 2003a). Desde então, foram encontrados três espécimes de felídeos
neotropicais virêmicos para FeLV (um gato-maracajá e dois gatos-palheiros) em um
levantamento conduzido em zoológicos norte-americanos (KENNEDY-STOSKOPF, 1999).
Foram encontrados, no Brasil, onça-pintadas, suçuaranas, gatos-maracajá e um gato-palheiro
mantidos em cativeiro, assim como uma jaguatirica de vida livre, soropositivos para FeLV
(SCHMITT et al., 2003). Mais recentemente, Carvalho et al. (2004) encontraram leões
soropositivos para lentivírus felinos na população de felídeos da Fundação Parque Zoológico
de São Paulo (FPZSP) (APÊNDICE D).
2.3.5 Vírus da cinomose canina (CDV)
Desde que o CDV foi isolado a partir de cães domésticos (Canis familiaris), em 1905,
verificou-se que em pelo menos oito famílias de carnívoros terrestres (Canidae, Felidae,
Hyaenidae, Mustelidae, Procyonidae, Ursidae, Ailuridae e Viverridae) foram notificadas
37
espécies susceptíveis à infecção pelo CDV (DEEM et al., 2000). O virus da cinomose canina
(CDV) tem se mostrado um problema mundial afetando uma ampla gama de carnívoros. Uma
onça-pintada foi infectada por CDV durante uma epizootia ocorrida em felídeos mantidos em
cativeiro na América do Norte (APPEL et al., 1994, CLEAVELAND et al., 2003; FUNK et
al., 2001).
Os felídeos em geral apresentam um comportamento de menor risco para a
transmissão-interespecífica de patógenos. Entretanto, algumas espécies, como as suçuaranas,
podem ser encontradas tanto em áreas preservadas quanto em áreas periurbanas e rurais,
podendo entrar em contato e mesmo predar animais domésticos, potenciais fontes de
infecção. A susceptibilidade de gatos domésticos ao CDV foi demonstrada mediante infecção
experimental, mas os gatos infectados apresentam apenas um discreto aumento de
temperatura corporal e não eliminam vírus (APPEL; SHEFFY; PERCY, 1974). Por isso, por
muito tempo pensou-se que que o CDV não poderia provocar doença em felídeos. Embora
atualmente haja indicativos de que a infecção por CDV possa contribuir para a ocorrência de
doenças respiratórias e hepáticas em gatos domésticos ( IKEDA et al., 2001), foi somente
quando uma uma epizootia por CDV acometeu diversas espécies de felídeos em zoológicos
norte-americanos, entre 1991 e 1992, que a importância deste patógeno foi reconhecida para
a família Felidae. Naquela ocasião, uma alta mortalidade se concentrou em grandes felídeos,
como tigres (Panthera tigris), leões (Panthera leo) e leopardos (Panthera pardus), além de
uma onça-pintada, enquanto outras espécies, como suçuaranas, bobcats , servais (Leptailurus
serval) e gatos-maracajá apenas soroconverteram (KENNEDY-STOSKOPF, 1999). Em
seguida a esta epizootia, houve outra epizootia com efeitos devastadores na população de
leões de vida livre no ecossistema do Serengeti, África, que eliminou cerca de 30% desta
população em 1994 (ROELKE-PARKER et al., 1996). Os grandes felídeos do gênero
Panthera evidenciam-se como mais susceptíveis ao curso letal da infecção pelo CDV
(APPEL et al., 1994; KENNEDY-STOSKOPF, 1999). Nestes casos, foi demonstrado que os
morbilivírus responsáveis por estas ocorrências eram relacionados com os que circulavam em
outros carnívoros selvagens e cães domésticos locais (BARRET, 1999; HAAS et al., 1996).
No ambiente de cativeiro, pode haver contato com outras fontes de infecção, como carnívoros
domésticos; já foi reportada infecção por CDV em filhotes de tigre que tiveram contato com
cães (APPEL et al., 1994; KENNEDY-STOSKOPF, 1999).
Os felídeos acometidos podem apresentar sinais neurológicos, respiratórios e
gastrointestinais, embora em cerca de 60% dos casos apenas os sinais neurológicos se
38
manifestam, incluindo convulsões, tremores, mioclonia, desorientação, fraqueza, ataxia,
paraparesia, hiperreflexia e coma. A duração dos sinais clínicos varia de um dia a várias
semanas na maioria dos felídeos, mas já foi observado um caso de desenvolvimento de sinais
neurológicos progressivos ao longo de mais de um ano. Alguns animais podem apresentar
anorexia, letargia, descarga nasal e ocular mucopurulenta, diarréia sanguinolenta ou não.
Leões de vida livre apresentam anemia, linfadenopatia, condições precárias corporal e do
pelame e presença de múltiplos ferimentos. Felídeos acometidos podem apresentar alterações
comportamentais, podendo se mostrar deprimidos ou com aumento de agressividade.
(MUNSON, 2001; ROELKE-PARKER et al., 1996) Os felídeos do gênero Panthera
desenvolvem sinais mais severos e apresentem um prognóstico pior. Apenas sinais
gastrointestinais e respiratórios brandos foram observados em pumas, enquanto outras
espécies de felinos menores, como bobcats, servais e gatos-maracajás apresentaram-se
soropositivos e saudáveis. (APPEL et al., 1994)
2.4 AGENTES BACTERIANOS
2.4.1 Bartonella henselae
As bactérias do gênero Bartonella causam infecções intraeritrocitárias crônicas em
uma ampla variedade de animais, incluindo humanos, em que a B. henselae é o agente
etiológico da doença-da-arranhadura-do-gato (cat scratch disease) (CHOMEL et al., 2004b).
O patógeno B. henselae é principalmente transmitido através de pulgas (Ctenocephalides
felis) em gatos domésticos (CHOMEL et. al 1996), que se infectam ao se alimentar de
animais bacterêmicos, e é potencialmente transmissível entre gatos domésticos e felídeos
selvagens (CHOMEL et al., 2004b; JACOMO et al., 2002). Além de pulgas, tem sido
sugerido que carrapatos do gênero Ixodes sejam potenciais vetores para Bartonella sp
(CHANG et al., 2001; CHOMEL et al., 2004a; SCHOULS et al., 1999). Em gatos
domésticos, a bacteremia pode persistir por mais de um ano e em colônias de gatos em que
pulgas são endêmicas, mais da metade dos animais pode estar bacterêmica. Populações de
39
gatos errantes apresentam soroprevalências maiores que de gatos domiciliados
(BREITSCHWERDT; KORDICK, 2000; JACOMO et al., 2002).
Embora o patógeno possa permanecer como parte da microbiota intravascular de
gatos saudáveis, evidências recentes sugerem uma associação deste patógeno com
manifestações insidiosas de doenças renais crônicas (GLAUS et al., 1997). Outras
anormalidades relatadas em gatos infectados com B. henselae incluem febre, discreta anemia
transitória, eosinofilia, linfadenomegalia, colangite, difunção neurológica, lesões cardíacas e
falhas na reprodução (BREITSCHWERDT; KORDICK, 2000; ROTSTEIN et al., 2000).
Estudos têm demonstrado a exposição de uma variedade de felídeos de vida livre e
mantidos em cativeiro à B. henselae, incluindo felídeos neotropicais mantidos em zoológicos
da América do Norte (KELLY et al., 1998; MOLIA et. al, 2004; YAMAMOTO et al., 1998;
PRETORIUS et al., 2004; ROTSTEIN et al., 2000). A soroprevalência nestas populações de
felídeos selvagens são comparáveis às encontradas para gatos domésticos
(BREITSCHWERDT; KORDICK, 2000; ROTSTEIN et al., 2000). Um levantamento
extensivo conduzido nas Américas detectou suçuaranas soropositivas através da maioria das
áreas de ocorrência natural da espécie. (CHOMEL et al., 2004b); a soroprevalência geral
relatada em suçuaranas da América do Sul foi de 22.4%. O estudo incluiu amostras de 11
suçuaranas brasileiras de três estados (São Paulo, Tocantins e Goiás); porém não foram
mencionados resultados individuais, áreas exatas de colheita ou condições de vida dos
animais.
2.4.2 Ehrlichia canis e Anaplasma phagocytophilum
Recentemente foi demonstrado que gatos domésticos são susceptíveis à infecção e
doença causada por Ehrlichia canis e Anaplasma phagocytophilum. A erliquiose em gatos
domésticos tem sido reconhecida cada vez com maior freqüência no mundo todo , inclusive
no Brasil (ALMOSNY; MASSARD, 1999; DAGNONE et al., 2003; TARELLO, 2005).
Classicamente, o diagnóstico da infecção tem sido realizado a partir da demonstração
de inclusões em células. Entretanto, o diagnóstico realizado com métodos moleculares tem se
mostrado eficiente e demonstrou que há pelo menos duas formas de erliquiose felina: uma
causada pela E. canis, com inclusões em células mononucleares (BREITSCHWERDT et al,
2002) e outra pelo A. phagocytophilum, este último associando-se com inclusões em
neutrófilos e possivelmente apresentando implicações zoonóticas (BJOERSDORFF et al.,
40
1999). Os sinais clínicos são semelhantes para os dois agentes, incluindo anorexia,
hiperestesia, letargia, perda de peso, dores articulares, dispnéia, linfadenomegalia, anemia e
hipergamaglobulinemia (TARELLO, 2005). As pulgas (C. felis) são consideradas potenciais
vetores na transmissão destes agentes em gatos (LAPPIN et al, 2006), assim como carrapatos.
Pouco é conhecido sobre erliquioses de forma geral em animais selvagens,
especialmente felídeos. Se em linces-eurasianos (Lynx lynx), um levantamento sorológico
realizado para populações de vida livre no norte da Europa demonstrou uma prevalência de
4% (RYSER-DEGIORGIS et al., 2005), é razoável supor que o clima quente e úmido em
pelo menos parte do ano no Brasil favoreça a transmissão destes agentes pelos vetores e a
doença esteja presente com alta morbidade em nosso meio sem ser reconhecida. Entretanto,
de acordo com nosso conhecimento, não há relatos prévios de infecções por E. canis e A.
phagocytophilum em felídeos neotropicais, seja em animais cativos ou de vida livre.
2.4.3 Hemoplasmas: Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma
haemominutum’ e ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’
O agente etiológico da anemia infecciosa felina, antigo Haemobartonella felis, foi
recentemente reclassificado dentro de um novo grupo de espécies hemotrópicas de
micoplasmas, também chamados de hemoplasmas. O seqüenciamento dos genes 16S rRNA
de diferentes agentes isolados de felinos resultou no reconhecimento de três espécies dentro
deste grupo: Mycoplasma haemofelis (antigo Haemobartonella felis), ‘Candidatus
Mycoplasma haemominutum’ e, mais recentemente, ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’.
Estas espécies apresentam diferenças de patogenicidade em gatos domésticos. O M.
haemofelis e o ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ são associados com severa anemia
hemolítica intravascular, enquanto o ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ usualmente
não induz anemia, mas estabelece relação com insuficiência renal. Os mecanismos pelos
quais os hemoplasmas felinos, especialmente o M. haemofelis, induzem hemólise não são
bem compreendidos; tanto podem ser resultantes de dano eritrocítico direto como pela
remoção dos agentes de eritrócitos infectados que são seqüestrados pelo baço. O curso da
infecção pode ser letal em gatos domésticos, e outros sinais observados incluem anorexia,
depressão, letargia, fraqueza, perda de peso, febre intermitente, palidez de mucosas, icterícia
41
e esplenomegalia. Co-infecções com os agentes virais imunossupressivos FIV ou FeLV
podem favorecer a hemólise observada em gatos infectados. (HAEFNER et al., 2003;
KEWISH et al., 2004; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2005; 2006). Evidências recentes
demonstram a presença das três espécies de hemoplasmas em diversas espécies de felídeos
selvagens nos continentes europeu, africano e americano, sugerindo que todas as espécies de
felídeos sejam susceptíveis. (HAEFNER et al., 2003; WENGI et al., em elaboração).
Pulgas (C. felis) e carrapatos são tidos como potenciais vetores destes
microorganismos (LAPPIN et al., 2006). Foi demonstrado que infecções verticais intra-
uterinas, durante o parto ou durante a lactação podem ocorrer em gatos domésticos, assim
como transmissões horizontais iatrogênicas, mediante transfusões sangüíneas e agulhas
contaminadas (HAEFNER et al., 2003). Os animais infectados que são submetidos a
antibioticoterapia ou que desenvolvem evidente resposta imune, provavelmente permanecem
como portadores crônicos (MESSICK, 2003). O diagnóstico etiológico tradicionalmente
baseia-se na identificação citológica de esfregaços sangüíneos corados, juntamente com a
análise de hemogramas completos e sinais clínicos compatíveis. Entretanto, o
desenvolvimento dos métodos moleculares facilitaram a identificação e quantificação destes
agentes, de maneira sensível e específica, e a PCR é considerada atualmente o método de
escolha para o diagnóstico destas infecções (WILLI et al., 2005; 2006).
2.5 PROTOZOÁRIOS PIROPLASMAS: Theileria sp E Cytauxzoon sp
As técnicas moleculares baseadas em PCR têm ampliado o diagnóstico de diferentes
piroplasmas em novos hospedeiros, sugerindo que sua classificação taxonômica venha a ser
revista. De acordo com a classificação adotada por Ketz-Riley et al. (2003), os gêneros
Theileria e Cytauxzoon são protozoários pertencentes à família Theileridae, ordem
Piroplasmida, filo Apicomplexa. As infecções por Theileria sp e Cytauxzoon sp em seus
hospedeiros mamíferos iniciam-se através da transmissão por carrapatos infectados,
causando parasitemias que podem ser letais. O contato direto entre felídeos infectados na
ausência de carrapatos não constitui risco de transmissão. Após a transmissão, os
protozoários reproduzem-se assexuadamente (esquizogonia) em uma fase eritrocítica e uma
não eritrocítica. Os esquizontes de Theileria sp se reproduzem em células linfocíticas,
42
formam pequenas agregações ou são únicos nestas células e induzem os linfócitos a se
transformarem em linfoblastos, provocando contínua proliferação. Os esquizontes de
Cytauxzoon sp, diferentemente, reproduzem-se em células fagocíticas mononucleares e
formam agregações maiores. Os esquizontes desenvolvem-se como merozoítas, que são
endocitados por eritrócitos e, ao adquirir um aspecto pleomórfico, passam a ser referidos
como piroplasmas (BONDY et al., 2005). As manifestações clínicas das infecções por
piroplasmas são inespecíficas e similares aos de hemoplasmas, incluindo anorexia, letargia,
icterícia, palidez de mucosas, dispnéia, taquipnéia, taquicardia, febre, esplenomegalia,
hepatomegalia, e nos estágios finais da doença, hipotermia, vocalização, convulsões e coma.
Em função da similaridade dos sinais clínicos, métodos diagnósticos moleculares são
recomendados para o diagnóstico e diferenciação destes agentes (BONDY et al., 2005;
CRIADO-FORNELI, et al., 2003)
A espécie Cytauxzoon felis infecta exclusivamente felídeos, tendo sido diagnosticada
desde os anos 1970 em gatos domésticos e diversas espécies de felídeos selvagens mantidos
em cativeiro, como bobcats, guepardos, pumas e tigres (GLENN et al., 1983; KETZ-RILEY
et al., 2003). Os bobcats da subespécie L. rufus rufus geralmente desenvolvem um curso
clínico discreto quando infectados, e são tidos como reservatórios do agente na América do
Norte (BONDY et al., 2005). Mais recentemente, também foram diagnsticados
morfologicamente em felídeos selvagens exóticos e neotropicais no Brasil, como leões,
onças-pintadas e gatos-do-mato-pequenos (SOARES, 2001). Um piroplasma relacionado mas
não identificado como C. felis foi diagnosticado através de métodos moleculares em gatos-
de-Pallas (Otocolobus manul) capturados em vida-livre na Mongólia em 2000 (KETZ-
RILEY et al., 2003), sugerindo que devam existir outras espécies de piroplasmas
relacionadas.
2.6 AS TÉCNICAS LABORATORIAIS
As técnicas diagnósticas laboratoriais podem ser divididas em técnicas indiretas e
diretas. Enquanto as primeiras direcionam-se à detecção de anticorpos específicos, as
segundas são voltadas para a detecção direta dos patógenos. No presente trabalho foram
utilizadas algumas técnicas indiretas e diretas. Entre as técnicas indiretas, foram utilizados
43
testes sorológicos indiretos como o enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) indireto,
Western blot e imunofluorescência indireta (IFA). Entre os testes de detecção direta, foram
utilizados ELISA diretos e testes de reação de polimerização em cadeia (PCR) ou reações de
polimerização em cadeia submetidas à ação da transcriptase reversa (RT-PCR) em tempo real
TaqMan®.
Também foram utilizados testes sorológicos imunoenzimáticos comerciais,
representados pelo o Snap™ Combo FeLV Antigen/FIV Antibody Test Kit (IDEXX
Laboratories, Inc., Westbrook, Maine 04092, USA), que em um único dispositivo combinam
dois testes diferentes: um direto para o antígeno viral p27 do FeLV e um indireto para
anticorpos contra lentivírus felinos.
Os testes de detecção direta TaqMan® permitem quantificação absoluta, são
altamentes sensíveis, confiáveis, rápidos, fáceis de manejar e permitem o processamento de
uma grande amostragem com baixo risco de contaminação (GUT et al., 1999). São
adequados para o processamento de amostras de animais com suspeita clínica de infecção por
patógenos específicos, são úteis para confirmação de resultados de outros testes de triagem,
são excelentes opções para animais em quarentena ou aguardando o transporte e prestam-se
ainda para levantamentos epidemiológicos.
44
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram utilizadas amostras de material biológico de 232 felídeos selvagens, sendo 22
de vida livre e 210 mantidos em cativeiro. As espécies e número amostral utilizado podem ser
verificados na tabela 1.
As amostras dos 22 animais de vida livre foram fornecidas pelo Banco de Amostras
Biológicas do Centro Nacional de Pesquisas para Conservação de Predadores Naturais
(CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos
Naturais Renováveis (IBAMA), sendo provenientes de quatro biomas diferentes, e colhidas
em 13 localidades situadas nas regiões Norte, Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil, entre
1998 e 2004 (Fig. 1, APÊNDICE A). As amostras dos animais de cativeiro foram fornecidas
pela FPZSP e pela organização não-governamental (ONG) Associação Mata Ciliar (AMC).
Entre 2002 e 2004, foram colhidas amostras de 125 felídeos mantidos na FPZSP; também
foram incluídas amostras de um animal necropsiado em 2001 (animal CAD 19696,
APÊNDICE B). Em 2004, a AMC cedeu amostras de 62 felídeos, as quais haviam sido
obtidas entre 1996 e 2002, na vigência do Programa de Identificação e Imunização do Plano
de Manejo para Felinos Selvagens Brasileiros. Estas últimas foram provenientes de 22
zoológicos brasileiros e cinco centros de conservação (APÊNDICE C).
O CENAP forneceu amostras de soro e sangue em ácido dietilenodiaminotetracético
(EDTA), provenientes de felídeos de vida livre e armazenadas a -80°C ou em nitrogênio
líquido e que haviam sido depositadas no Banco de Amostras Biológicas por pesquisadores e
coordenadores de projetos de campo sobre ecologia e conservação de carnívoros selvagens in
situ. No caso de um gato-do-mato-pequeno supostamente de vida livre, que veio a óbito na
cidade litorânea de Ubatuba, SP (animal 20, Fig. 1, APÊNDICE A), o CENAP forneceu
amostras de fezes e soro obtido de coágulos cardíacos que haviam sido depositadas em seu
Banco pelo Laboratório de Patologia Comparada (LAPCOM) do Departamento de Patologia
(VPT) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São
Paulo (USP), onde foi realizada a necrópsia do animal. As amostras obtidas na FPZSP (soro,
plasma, sangue total em EDTA, papa de leucócitos e suabes) ficaram armazenadas a -80°C
desde o dia da colheita até sua utilização. As amostras de soro cedidas pela AMC foram
45
mantidas a -18°C até o momento de sua cessão ao presente projeto, sendo que a partir deste
momento até a utilização ficaram armazenadas a -80°C.
Todas as amostras utilizadas foram transportadas obedecendo as instruções
internacionais da Associação Internacional de Transporte Aéreo (International Air Transport
Association – IATA) como amostras diagnósticas (PI 650) e em completo acordo com
licenças federais específicas como a Convenção sobre o Comércio Internacional de Espécies
da Flora e Fauna Selvagens em Perigo de Extinção (Convention on International Trade in
Endangered Species – CITES) (números de licença 0112928BR e 1562/04), Conselho de
Gestão do Patrimônio Genético (CGEN) e Ministério da Agricultura (CSI 1530/2004).
As amostras dos felídeos de vida livre foram colhidas a campo no próprio local de
captura, enquanto se realizaram exames físicos completos e colocação de colares
transmissores. Os felídeos de maior porte (suçuaranas) foram capturados com a utilização de
cães treinados, enquanto que para os pequenos felinos utilizaram-se armadilhas com presas
vivas como iscas. Os animais foram quimicamente imobilizados com o auxílio de dardos e
uma combinação 10 mg/kg IM de tiletamina e zolazepam (Telazol®, Fort Dodge, Iowa,
USA). Após a recuperação anestésica, os animais foram soltos no local de captura para
posterior monitoramento (MORATO, comunicação pessoal).
Os animais mantidos em cativeiro foram imobilizados com uma combinação de 10
mg/kg IM de cetamina (Ketalar®, Aché Laboratórios Farmacêuticos S. A, Parke-Davis;
Ketamina 50®, Holliday- Scott S. A., Happy Vet Farma, São Paulo, Francotar®, Virbac do
Brasil Ind. e Com. Ltda., São Paulo, Brasil) e 2 mg/kg IM de xilazina (Rompun®, Bayer S.
A. Saúde Animal, Coopazine®, Coopers do Brasil Ltda., Virbaxyl®, Virbac do Brasil Ind. e
Com. Ltda., São Paulo Brasil), após um período de 24 horas de jejum. Na maioria dos casos,
foram utilizados dardos, puçás e caixas de contenção.
46
Tabela 1 – Número amostral e instituições cedentes de amostras de felídeos selvagens mantidos em cativeiro e de vida livre. São Paulo, 2004
Espécies Nomes comuns Procedência
Cativeiro Vida livre
Neotropicais FPZSP1 AMC2 Sub-total CENAP3 Total
Puma concolor suçuarana 2 12 14 18 32
Herpailurus yagouarondi jaguarundi 23 10 33 0 33
Leopardus pardalis jaguatirica 6 10 16 2 18
Leopardus tigrinus gato-do-mato-pequeno 33 10 43 2 45
Leopardus wiedii gato-maracajá 10 10 20 0 20
Oncifelis geoffroyi gato-do-mato-grande 13 10 23 0 23
Oncifelis colocolo gato-palheiro 10 0 10 0 10
Sub-total 97 62 159 22 181
Exóticos
Panthera leo leão 30 0 30 NA4 NA
Panthera pardus leopardo 4 0 4 NA NA
Acynonyx jubatus guepardo 2 0 2 NA NA
Panthera tigris altaica tigre-siberiano 13 0 13 NA NA
Uncia uncia leopardo-das-neves 2 0 2 NA NA
Sub-total 51 0 51 NA NA
Total 148 62 210 22 232
1 FPZSP = Fundação Parque Zoológico de São Paulo. 2 AMC = Associação Mata Ciliar. 3 CENAP = Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais, Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA). 4 NA = não se aplica.
47
Identificação das amostras no Banco de Amostras Biológicas do Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais (CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA): 1 = B61c1609; 2 = 061c6047; 3 = 061bc05f; 4 = 0610a655; 5 = 0610a16c; 6 = PNI Juliana; 7 = Totti 7/6/98; 8 = 061c6683; 9 = 0610d9a3; 10 = 0001f9adf1; 11 = 06110af3b; 12 = 000610d48f; 13 = 000610a00a; 14 = 000610a3b; 15 = 00061c4d0f; 16 = 000610c60e; 17 = 1013; 18 = 004; 19 = 061bd88c; 20 = 003; 21 = 61431; 22 = 301.
Figura 1 – Mapa mostrando as áreas geográficas no Brasil em que as amostras dos 22 felídeos de vida livre foram colhidas. São Paulo, 2004
48
3.2 PATÓGENOS PESQUISADOS
Pesquisou-se um total de 16 patógenos diferentes utilizando-se diversos testes
diagnósticos em diferentes números amostrais. O número de animais avaliados para cada
patógeno estão apresentados nos quadros 1 a 3.
Patógenos Testes sorológicos Número de animais testados
TestesTaqMan®
Número de animais testados
Vírus de DNA FHV 1 IFA 21 PCR 5 FPV IFA 21 PCR 6 Vírus de RNA FCV IFA 21 RT-PCR 5 FCoV IFA 21 RT-PCR 6 FeLV ELISA direto
ELISA indireto Western blot
212121
PCRRT-PCR
55
FIV Western blot 21 PCR RT-PCR
55
PLV ELISA indireto 21 ...1 ...CDV ... ... RT-PCR 6 Bactérias
Ehrlichia canis IFA 21 PCR 1Anaplasma phagocytophilum
IFA 21 PCR 1
Bartonella henselae IFA 20 ... ...
1 ... = Testes não realizados.
Quadro 1 – Testes realizados para 11 patógenos em amostras de material biológico dos felídeos de vida livre. São Paulo, 2004
49
Patógenos Testes sorológicos
Número de animais testados
TestesTaqMan®
Número de animais testados
Vírus de DNA FHV 1 IFA 1 ...1 ...FPV IFA 1 ... ... Vírus de RNA
FCV IFA 1 ... ... FCoV IFA 147 ... ... FeLV Western blot
ELISA indireto Snap™ Combo2
25147 148
PCRRT-PCRPCR (exo U3)
24 24109
FIV Western blot Snap™ Combo
10148
PCR 1
Bactérias
Ehrlichia canis IFA 147 PCR 109 Anaplasma phagocytophilum ... ... PCR 109 Bartonella henselae IFA 147 PCR 109 ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’
... ... PCR 109
Mycoplasma haemofelis ... ... PCR 109 ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’
... ... PCR 109
Piroplasmas
Theileria sp ... ... PCR 109 Cytauxzoon sp ... ... PCR 109
1 … = Testes não realizados.2 Snap™ Combo FeLV Antigen/FIV Antibody Test Kit (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, Maine 04092, USA).
Quadro 2 - Testes realizados para 14 patógenos em amostras de material biológico dos felídeos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). São Paulo, 2004
50
Patógenos Testes sorológicos Número de animais testados (n)
Vírus de DNA FHV 1 IFA 62 FPV IFA 62 Vírus de RNA FCV IFA 62 FCoV IFA 62 FeLV Western blot
ELISA indireto 362
Bactérias
Ehrlichia canis IFA 62
Quadro 3 – Testes realizados para seis patógenos em amostras de material biológico dos felídeos mantidos em cativeiro cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC). São Paulo, 2004
3.3 TESTES DIAGNÓSTICOS
Os testes diagnósticos foram realizados em 2004 no Clinical Laboratory, Vetsuisse
Faculty, University of Zurich, Suíça, com exceção dos testes imunoenzimáticos Snap™
Combo FeLV Antigen/FIV Antibody Test Kit, que foram executados no momento de
colheita das amostras na FPZSP.
Foram realizados testes sorológicos indiretos e diretos e testes moleculares para
detecção direta dos patógenos. Para os testes sorológicos, foram utilizadas amostras de soro
ou plasma, com exceção dos testes imunoenzimáticos Snap™ Combo FeLV Antigen/FIV
Antibody Test Kit, que foram realizados com sangue fresco ou soro. Para os testes
moleculares TaqMan® PCR ou RT-PCR, foram utilizadas amostras de sangue, papa de
leucócitos, suabes ou mesmo soro em alguns casos. Os testes utilizados e o número de
animais avaliados estão apresentados nos quadros 1 a 3. As discriminações individualizadas
do tipo de amostra biológica utilizada para cada animal em cada teste constam nos apêndices
A, B e C.
51
3.3.1 Testes sorológicos
Entre os testes sorológicos indiretos, voltados para detecção de anticorpos específicos
para os patógenos considerados, foram realizadas reações de IFA, ensaios imunoenzimáticos
(testes Snap™ e ELISA) e Western blot. Entre os testes sorológicos diretos, foram
empregados ensaios imunoenzimáticos voltados para a detecção de constituintes dos
patógenos (testes Snap™ e ELISA).
3.3.1.1 Reações de imunofluorescência indireta (IFA)
Os títulos de anticorpos para FHV 1, FCV, FCoV, FPV, E. canis e A.
phagocytophilum foram determinados em amostras de soro ou plasma através de IFA de
acordo com Hofmann-Lehmann et al. (1996). Os testes de IFA foram realizados em amostras
de animais de vida livre e de cativeiro, conforme apresentados nos quadros 1 a 3 e nos
Apêndices E, F e G.
Os substratos para a IFA foram os seguintes: células de rim felino de Crandell (CrFK)
infectadas com FHV 1 (Zurich 5-04, um isolado suíço obtido de um gato apresentando
ceratite herpética; cepa de campo UT 88, C. Haid), FCV (cepa F9, Intervet, UK), e FPV
(FPL/01, Intervet, UK), respectivamente, e células de rim suíno (PD-5) infectadas com vírus
da gastroenterite transmissível (TGEV, cepa Purdue) para a detecção de anticorpos para
FCoV. As células infectadas com estes vírus foram aplicadas e fixadas em lâminas de vidro
para utilização como antígenos de captura, de acordo com Hofmann-Lehmann et al. (1996).
Como conjugado, foi utilizada imunoglobulina G de coelho anti-gato conjugada com
isotiocianato de fluoresceína (FITC), cadeia H+L (Nordic Immunologic Laboratories,
Tillburg, The Netherlands) diluídas nas proporção 1:40 em solução salina fosfatada
tamponada (PBS). Todas as amostras foram inicialmente testadas em uma diluição de 1:20
em PBS. Resultados positivos ou questionáveis para FHV 1, FCV e FPV na diluição 1:20
foram retestados e titulados até o ponto máximo de diluição. Nestes casos, foram realizadas
diluições seriadas das amostras iniciando-se na diluição 1:20 e procedendo-se a um máximo
de 1:640. Resultados positivos para FCoV na diluição 1:20 foram titulados nas diluições
52
1:25, 1:100, 1:400 e 1:1600.
As exposições para E. canis e A. phagocytophilum foram avaliadas inicialmente na
diluição de 1:80 por IFA. Lâminas Mega Screen Fluoehrlichia c. (MegaCor Diagnostik
GmbH, 6912 Hörbranz, Áustria) foram utilizados para detectar anticorpos específicos para E.
canis; lâminas para E. equi (VMRD, Inc. Pulman, WA, USA) foram utilizadas para a
detecção de anticorpos direcionados contra A. phagocytophilum. Amostras positivas foram
tituladas até o ponto máximo de diluição através de diluições seriadas.
As amostras foram também avaliadas para presença de anticorpos para B.henselae por
IFA de acordo com Glaus et al. (1997). Tais amostras foram inicialmente testadas nas
diluições de 1:64 e 1:128. Títulos 1:64 foram considerados positivos. Amostras positivas
foram tituladas até o ponto máximo de diluição através de diluições seriadas.
3.3.1.1.1 Controle de qualidade das lâminas para IFA
Para o controle de qualidade das lâminas de IFA, alíquotas das culturas de células
(140 µl) ou fragmentos raspados das lâminas foram testados através de PCR ou RT-PCR para
certificação de ausência de possíveis contaminações. Para esta finalidade, as amostras foram
incubadas a 40°C por 10 min. em 300 µl de tampão de lise e os ácidos nucléicos totais (TNA)
foram extraídos utilizando-se o equipamento robotizado MagNA Pure LC (Roche, Rotkreuz,
Switzerland). Os ácidos nucléicos purificados foram diluídos em um volume final de 100 µl e
o TNA extraído foi analisado por TaqMan® PCR em tempo real em um equipamento ABI
Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) para a
presença de agentes de interesse: FeLV, FIV, FCoV, FHV 1, FCV, FPV, CDV, A.
phagocytophilum e E. canis.
3.3.1.2 Ensaios imunoenzimáticos
Foram realizados testes imunoenzimáticos em amostras de animais de vida livre e de
cativeiro, conforme apresentados nos quadros 1 a 3 e nos Apêndices E, F e G.
53
Amostras de sangue fresco ou de soro recém obtido dos felídeos da FPZSP foram
testadas para a presença de anticorpos para FIV ou lentivírus relacionados e para a presença
de antígenos de FeLV com os ensaios imunoenzimáticos comerciais Snap™ Combo FeLV
Antigen/FIV Antibody Test Kit, disponíveis comercialmente, e realizados de acordo com as
orientações do fabricante.
Anticorpos para a glicoproteína viral gp70 do FeLV foram avaliados por ELISA em
amostras de soro ou plasma. Adicionalmente, estas as amostras foram testadas para a
presença de proteína p27 do FeLV como medida para viremia por um ELISA sanduíche
(LUTZ et al., 1988; 1983; 1980); amostras positivas foram retestadas na presença de soro de
camundongo (Mus sp) .
Anticorpos reativos a peptídeos específicos de PLV foram detectados mediante
ELISA indireto de acordo com Van Vuuren et al. (2003).
3.3.1.3 Western blot
A técnica de Western blot foi executada para um número limitado de amostras de soro
de animais de vida livre e de cativeiro (Quadros 1 a 3; Apêndices E, F e G).
Para a detecção de anticorpos para FeLV mediante Western blot foi utilizada a técnica
descrita por Hofmann-Lehmann et al. (1995). Amostras contendo anticorpos para a
glicoproteína viral gp 70 e as proteínas virais p58, p27, p15 e p12 foram consideradas
positivas.
Anticorpos para FIV foram detectados pela técnica de Western blot de acordo com
Lutz et al. (1980, 1988). Amostras com anticorpos para as proteínas virais p24 e p15 foram
consideradas positivas.
3.3.2 Testes Taqman® PCR e RT-PCR
Foram realizados testes TaqMan® PCR e RT-PCR para amostras de vida livre (n=6) e
de cativeiro (n=109) que não sofreram descongelamento antes da utilização e que foram
54
permanentemente mantidas a temperaturas iguais ou inferiores a -70°C.
As amostras e testes realizados para a população amostral representativa de felídeos
de vida livre estão apresentados nos quadros 1 e 4. O DNA e RNA de uma amostra de fezes
de um gato-do-mato-pequeno e de uma amostra de sangue de uma jaguatirica foram extraídos
utilizando-se o kit de TNA no equipamento MagNA Pure LC. Adicionalmente, DNA e RNA
de quatro amostras de soro não descongeladas previamente foram extraídos com a utilização
do QIAamp DNA Kit e QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Basel, Switzerland)
Os testes foram executados em um equipamento ABI Prism 7700 Sequence Detection
System. O TNA da amostra de fezes foi analisado por TaqMan® RT-PCR para FCoV de
acordo com Gut et al. (1999), por TaqMan® PCR para FPV de acordo com Meli et al. (2004)
e por TaqMan® RT-PCR para CDV, em que uma seqüência de 84 pb do gene da polimerase
foi amplificado utilizando-se o forward primer 5’-GGAAGCCTTGATGATAGCACTGA-3’,
o reverse primer 5’-GCCGAAAGAATATCCCCAGTT-3’ e a sonda
5’-FAM-TCTGGCGAAGATTATTCCGAAGGAAATGCT-6-TAMRA-3’ (Quadro 4).
O DNA das amostras de soro e o TNA da amostra de sangue mencionadas acima
foram testados utilizando-se TaqMan® PCR para FHV 1 (VOGTLIN et al., 2002), FPV
(MELI et al., 2004), provírus de FIV (LEUTENEGGER et al., 1999b) e provírus de FeLV
(GOMES-KELLER et al., 2006; HOFMANN-LEHMANN et al, 2001; 2006). Além disso, o
RNA e TNA extraídos destas cinco amostras foram testadas por TaqMan® RT-PCR para
FIV, FeLV, FCoV (GUT et al., 1999 ; HOFMANN-LEHMANN et al, 2001; 2006) e FCV
(KUMMROW et al., 2005). O TNA extraído da amostra de sangue também foi avaliado por
TaqMan® PCR para A. phagocytophilum (PUSTERLA et al., 1999) e para E. canis, em que
uma seqüência de 108 pares de bases do gene da subunidade 16S do rRNA foi amplificado
utilizando-se o forward primer, 5’-ATGGCTATTCCGTACTACTAGGTAGATTC-3’o
reverse primer 5’-CATGCAAGTCGAACGGACAAT-3’ e a sonda
5’-FAM-TCTGCCACTAACAATTTCCTATAGCCAGAGGC-6-TAMRA-3’. (Quadro 4)
O número amostral e testes realizados para a população amostral constituída pelos
felídeos mantidos em cativeiro, pela FPZSP, estão apresentados no quadro 2. Foi utilizado o
kit de TNA no equipamento MagNA Pure LC para extração de TNA das amostras de sangue
em EDTA e utilizado o QIAamp DNA Kit para extração de DNA das amostras de papa de
leucócitos (obtidas com a centrifugação do sangue colhido em EDTA). Foram extraídos
TNA das amostras de sangue em EDTA (n = 82) e de DNA de papa de leucócitos (n = 27),
55
perfazendo um total de 109 amostras de ácidos nucléicos oriundos de igual número de
felídeos de cativeiro.
Nestas amostras, foram realizados testes TaqMan® PCR e RT-PCR para os
patógenos FIV, FeLV, B. henselae, E. canis, A. phagocytophilum, ‘Candidatus Mycoplasma
haemominutum’, Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’, Theileria sp
e Cytauxzoon sp (RYSER-DEGIORGIS et al., 2005; WILLI et al., 2005; 2006) (Quadro 2).
Tais testes não foram realizados individualmente para cada amostra; os ácidos nucléicos
(TNA ou DNA) extraídos das amostras foram agrupados (pools) pelo equipamento MagNA
Pure LC da forma esquematizada na figura 2 (2a, 2b e 2c). A intersecção entre linhas e
colunas de cada um dos dois esquemas de pipetagem ou a repetição dos testes em grupos
progressivamente menores permitiu a individualização dos resultados positivos.
56
Espécies/Identificação das amostras1
Material biológico
Testes TaqMan® /Patógenos
PCR RT-PCR
Puma concolor n = 4
3, 4, 5 e 6 Soro(DNA e RNA)
FHV 1 FPVFIV provírus FeLV provírus
FCVFCoVFIVFeLVCDV
Leopardus pardalis n = 1
22Sangue (TNA)
FHV 1 FPVFIV (provírus) FeLV (provírus) Anaplasma phagocytophilum Ehrlichia canis
FCVFCoVFIVFeLVCDV
Leopardus tigrinus n = 1
20Fezes(TNA)
FPV FCoV CDV
1 = Identificação das amostras no Banco de Amostras Biológicas do Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais (CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA): 3 = 061bc05f; 4 = 0610a655; 5 = 0610a16c; 6 = PNI Juliana; 20 = 003; 22 = 301.
Quadro 4 –Testes TaqMan® PCR e RT-PCR realizados para 11 patógenos em amostras de material biológico de seis felídeos de vida livre. São Paulo, 2004
57
2a) Pipetagem A: cada amostra de uma mesma linha ou coluna contribuiu com o volume de 5µl para a composição de 16 agrupamentos (pools) de 40 µl , mostrados como A1 até A8 e B1 até B8.
95 96 97 98 99 N1 101 102 A1103 104 105 106 109 110 128 129 A2130 131 N 137 138 139 140 145 A3146 147 148 149 150 152 153 154 A449 56 58 59 60 61 63 N A564 69 70 71 72 73 74 75 A676 000a 78 79 80 81 82 83 A784 85 86 87 91 92 93 94 A8
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8
1 N = controle negativo: 5 µl de solução salina fosfatada tamponada (PBS).
2b) Pipetagem B: cada amostra de uma mesma linha ou coluna contribuiu com o volume de 5µl para a composição de 16 agrupamentos (pools) de 40 µl , mostrados como C1 até C8 e D1 até D8.
1 18 54 55 56 57 58 61 C1 63 65 N1 66 67 68 70 77 C2 79 85 88 89 90 111 112 113 C3
114 115 116 117 118 119 120 121 C4 122 123 124 125 N 126 127 151 C5
1 21 22 23 31 32 33 34 C6 42 43 44 45 46 47 48 49 C7 50 51 54 55 57 62 000f 000e C8
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
1 N = controle negativo: 5 µl de solução salina fosfatada tamponada (PBS).
2c) Disposição dos grupos (pools) de solução de ácidos nucléicos (DNA e TNA) originados das pipetagens A e B em placa de 96 orifícios para a realização dos testes Taqman® PCR e RT-PCR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A11 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D
E F G H
1 = cada orifíco da placa recebeu o volume de de 40 µl originado da somatória de 5µl de oito amostras.
Figura 2 - As amostras de ácidos nucléicos (DNA e TNA) dos felídeos de cativeiro foram agrupadas utilizando um equipamento robotizado MagNAPure LC (Roche, Rotkreuz, Suíça) de acordo com os esquemas de pipetagem explicitados nas figuras 2a e 2b para realização dos testes conforme demonstrado na figura 2c. São Paulo, 2004
58
4 RESULTADOS
Os resultados de todos os testes sorológicos realizados estão apresentados nas tabelas
2, 3 e 4. Estes resultados estão apresentados de forma individualizada nos apêndices E, F e G.
Foram detectados anticorpos para FCoV em uma jaguatirica de vida livre, anticorpos
para FeLV, FIV, e PLV (ou lentivírus antigenicamente relacionados) em suçuaranas de vida
livre e anticorpos para B. henselae nas três espécies de felídeos (jaguatiricas, suçuaranas e
gatos-do-mato-pequenos). As taxas de prevalências de anticorpos, baseadas em amostras de
soro de 21 animais foram aproximadamente: B. henselae (95%); FPV (48%); FHV 1 and
FCV (29%); FeLV e PLV (10%); e FCoV, FIV, e E. canis (5%). Anticorpos para A.
phagocytophilum não foram detectados (Tabela 2).
As diferenças percentuais dos resultados dos testes indiretos de IFA para os patógenos
pesquisados nas populações amostrais constituídas de indivíduos de vida livre (n=21) e de
indivíduos mantidos em cativeiro (n=210) podem ser comparadas graficamente observando-
se as figuras 3, 4, 5 e 6.
Os resultados individualizados dos testes moleculares TaqMan® PCR e RT-PCR que
foram realizados em amostras de soro, sangue e fezes de seis felídeos de vida livre estão
apresentados na tabela 5.
Em amostras de sangue de dois espécimes de jaguarundis mantidos pela FPZSP
foram detectados provírus de FeLV (DNA) e RNA viral. Também foram detectados provírus
e RNA viral de FeLV amostras de soro e saliva (suabe oral) de um destes animais. Os
resultados dos testes PCR voltados para detecção de provírus (região exo U3) foram positivos
para amostras dos jaguarundis citados acima, mas negativos para amostras dos demais
felídeos. Estes resultados estão apresentados de forma individualizada na tabela 6.
Os resultados dos testes moleculares TaqMan® PCR para os agentes bacterianos B.
henselae, E. canis, A. phagocytophilum, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’, M.
haemofelis, ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ e dos protozoários piroplasmas Theileria sp
e Cytauxzoon sp estão apresentados na tabela 7 e de forma individualizada no apêndice H.
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Tabela 4 – Resultados dos testes sorológicos realizados nas amostras de felídeos cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC), distribuídos em função dos métodos empregados e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004
IFA1 Western blot2 ELISA
FHV 1 FCV FCoV FPV Ehrlichia canis FeLV
indireto FeLVgp70
Amplitude dos títulos IFA 20-320 20/1280 25-1600 20-5120 320 NA3 NA
Total resultados positivos/total de amostras analisadas
12/62 32/62 29/62 44/62 1/62 0/2 10/62
Percentagem (%) 19,35 51,61 46,77 70,96 1,61 0 16,12
1IFA = Imunofluorescência indireta. Os títulos de anticorpos são relatados como recíprocas das respectivas diluições de soro. Títulos negativos foram definidos como < 20 para FHV 1, FCV, FPV, FCoV, < 80 para E. canis e < 64 para B.henselae, respectivamente. 2 Os testes de Western blot para FeLV não foram realizados para as amostras dos 62 felídeos cedidos pela AMC, mas apenas para 2. 3 NA = não se aplica.
Tabela 5 – Resultados dos testes TaqMan® PCR e RT-PCR realizados para seis amostras de felídeos de vida livre, distribuídos em função das amostras utilizadas e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004
Identificação das amostras1Testes / Patógenos pesquisados Puma concolor
n = 4Leopardus pardalis
n = 1Leopardus tigrinus
n = 1TaqMan® PCR Soro Sangue Fezes 3 4 5 6 22 20 FHV 1 -2 - - - - ...3
FPV P4 P P - - -FIV - - - - - ...FeLV - - - - - ...Ehrlichia canis ... ... ... ... - ...Anaplasma phagocytophilum ... ... ... ... - ...
TaqMan® RT-PCR
FCV - - - - - ...FCoV - - - - - -FIV - - - - - ...FeLV - - - - - ...CDV - - - - - -
1 = Identificação das amostras no Banco de Amostras Biológicas do Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais (CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA): 3 = 061bc05f; 4 = 0610a655; 5 = 0610a16c; 6 = PNI Juliana; 20 = 003; 22 = 301. 2 - = Resultados negativos. 3 ...= Testes não realizados. 4 P = Resultados positivos.
61
Vida livre - IFA
FHV 1FCV
FCoV FPV
E. can
is
A. pha
gocy
tophil
um
B. hen
selae
Contro
les +
0
50
100
%
Figura 3 – Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (28,57%), FCV (28,57%), FCoV (4,76%), Ehrlichia canis (4,76%), Anaplasma phagocytophilum (0) e Bartonella henselae (95,0%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas 21 amostras de soro provenientes de felídeos de vida livre no Brasil. São Paulo, 2004
Cativeiro - IFA
FHV 1FCV
FCoV FPV
E. can
is
B. hen
selae
Contro
les +
0
50
100
%
Figura 4 - Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (19,04%), FCV (50,79%), FCoV (64,59%), FPV (69,84%), Ehrlichia canis (0,47%) e Bartonella henselae (48,29%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas amostras de soro provenientes de felídeos mantidos em cativeiro no Brasil, tomadas em conjunto. São Paulo, 2004
62
FPZSP - IFA
FHV 1FCV
FCoV FPV
E. can
is
B. hen
selae
Contro
les+
0
50
100
%
Figura 5 – Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FCoV (72,10%), Ehrlichia canis (0) e Bartonella henselae (48,29%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), nas 147 amostras de soro provenientes de felídeos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). Também estão representados os resultados para o espécime de Oncifelis colocolo, CAD 28505, que ainda não havia sido vacinado por ocasião da colheita de material, o qual também se apresentou soronegativo para FHV 1, FCV e FPV. São Paulo, 2004
AMC - IFA
FHV 1FCV
FCoV FPV
E. can
is
Contro
les +
0
50
100
%
Figura 6 – Representação gráfica do percentual em que foram detectados anticorpos para FHV 1 (19,35%), FCV (51,61%), FCoV (46,77%), FPV (70,96%) e Ehrlichia canis (1,61%), através de testes de imunofluorescência indireta (IFA), em 62 amostras de soro de felídeos provenientes de diversos zôos no Brasil cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC). São Paulo, 2004
63
Tabela 6 – Resultados dos testes TaqMan® PCR e RT-PCR para FeLV nos jaguarundis (Herpailurus yaguarondi) mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), distribuídos em função das provas efetuadas e das amostras utilizadas. São Paulo, 2004
Identificação das amostras (CAD)1
FeLV TaqMan®
RT-PCR PCR PCR (exo U3) 2Herpailurus yaguarondi n = 23 sangue soro suabe sangue suabe sangue
20761 P3 P P P P P 20762 -4 -5 ...6 - ... - 21566 - ... ... - ... - 21810 P ... ... P ... P 22096 - ... ... - ... - 23120 - ... ... - ... - 23851 - ... ... - ... - 23911 - ... ... - ... - 23956 - ... ... - ... - 24142 - ... ... - ... - 24189 - ... ... - ... - 24226 - ... ... - ... - 24227 - ... ... - ... - 24958 - ... ... - ... - 25244 - ... ... - ... - 25845 - ... ... - ... - 25846 - ... ... - ... - 26005 - ... ... - ... - 27088 - ... ... - ... - 27155 - ... ... - ... - 27156 - ... ... - ... - 27689 - - ... - ... - 28018 - ... ... - ... - Total resultados positivos/amostras analisadas
2/23 1/1 1/1 2/23 1/1 2/23
1 CAD = número do cadastro individual dos animais na FPZSP, SP. 2 FeLV TaqMan® PCR (exo U3) = estes testes foram realizados para 109 felídeos de diversas espécies da FPZSP; apenas os jaguarundis apresentaram resultados positivos. 3 P = Resultados positivos. 4 - = Resultados negativos. 5 = Amostras que haviam sido descongeladas e recongeladas anteriormente à execução destes testes. 6 ... = Testes não realizados.
64
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1/10
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9 10
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109
0/10
90/
109
1/10
9
Perc
enta
gem
(%)
0,91
0
0 9,
17
0,91
0
0 0,
91
65
5 DISCUSSÃO
Há uma grande carência de conhecimento médico-veterinário acerca de felídeos
neotropicais no Brasil e em geral as causas de morbidade e mortalidade não são conhecidas,
seja para populações de vida livre ou mantidas em cativeiro. Abordagens genéricas e práticas
empíricas são rotineiramente adotadas para o tratamento clínico de animais doentes nos
zoológicos brasileiros e em boa parte do mundo. Apesar de ter havido expansão desta área do
conhecimento nos últimos 10 a 15 anos no País (observação pessoal), este conhecimento
encontra-se no estágio dos levantamentos epidemiológicos preliminares. Em poucos casos há
estudos verticalizados em direção à compreensão de fenômenos fisiológicos gerais e
fisiopatológicos subjacentes às doenças e infecções dos animais selvagens. O conhecimento
verticalizado é de extrema importância para a organização de medidas voltadas para a
conservação das espécies de felídeos, mas o conhecimento horizontal representado pelos
levantamentos epidemiológicos preliminares de avaliação de exposição a patógenos constitui
a base na qual estudos posteriores possam se fundar.
5.1 A AMOSTRAGEM
Não existem estimativas precisas com relação ao número de felídeos em situação de
vida livre no território nacional. Mas pode-se afirmar que todas as espécies de felídeos
encontram-se, em algum grau, ameaçadas de extinção, ainda que algumas espécies, as menos
selváticas e mais ruderais, como suçuaranas e jaguarundis, sejam mais resilientes à
depredação ambiental e seu status de ameaça menos acentuado. Os felídeos são bem
representados nos zoológicos brasileiros (observação pessoal), mas isto não traduz um bom
desempenho reprodutivo em cativeiro; antes, decorre do contínuo deslocamento de animais
de vida livre em direção ao cativeiro em decorrência de conflitos com humanos.
A iniciativa da formação de um Banco de Amostras Biológicas originárias de
carnívoros de vida livre pelo CENAP – IBAMA em 2002 foi um passo essencial para as
pesquisas em conservação, pois passou a permitir o necessário acúmulo de amostras
representativas das populações em datas e localidades conhecidas para a execução dos mais
diversos estudos genéticos e epidemiológicos. Igualmente, as populações mantidas em
66
cativeiro também têm sido beneficiadas com a crescente abertura e interesse dos zoológicos
em melhorar continuamente as condições de manutenção dos animais, ao estabelecer
parcerias com projetos de pesquisas fomentados em universidades e outras instituições. O
Programa de Identificação e Imunização do Plano de Manejo para Felinos Selvagens
Brasileiros, iniciado há mais de uma década sob a coordenação da AMC (BRASIL, 1995), foi
um exemplo destas parcerias. Cada indivíduo da população de felídeos neotropicais mantida
em cativeiro no País era identificado, avaliado e amostras de material biológico colhidas de
forma a constituir um banco disponível para pesquisas. A obtenção das amostras para o
presente estudo valeu-se destas inciativas, refletindo desta forma o grau de maturidade
organizacional das entidades ligadas à conservação dos felídeos selvagens.
A amostragem de felídeos de vida livre não foi estratificada em função de quaisquer
variáveis que não o fato de pertencerem à família Felidae e serem procedentes do Brasil. Não
é possível inferir que as amostras de material biológico originadas dos 22 espécimes de
felídeos neotropicais de vida livre utilizadas neste trabalho, oriundos de diversas localidades
do vasto território brasileiro, sejam representativas de suas populações de origem, dado o
pequeno número. De maneira similar, a amostragem procedente de felídeos cativos, embora
maior (n=210), não pôde ser tratada estatisticamente mediante variáveis como espécie, sexo,
idade, instituição de origem, nascimento em vida livre ou em cativeiro. Muitas informações
puderam ser recuperadas, conforme constam nos apêndices B e C, mas houve
tendenciosidade associada às oportunidades de aquisição. As instituições brasileiras que
mantêm felídeos em cativeiro não foram igualmente representadas.
A escassez de informações epidemiológicas prévias referentes às amostras e
respectivas populações de origem orientou a opção de estender o diagnóstico laboratorial para
uma ampla gama de patógenos, valendo-se igualmente de diversas técnicas laboratoriais, de
forma que este trabalho adquirisse um caráter de varredura. As análises laboratoriais adotadas
para diferentes sub-grupos amostrais (animais procedentes de vida livre, de cativeiro,
procedentes da FPZSP e de outros zôos em conjunto, grupo de jaguarundis da FPZSP)
tiveram o propósito de ampliar a caracterização dos achados otimizando os recursos
disponíveis.
67
5.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA FELÍDEOS DE VIDA LIVRE
Este estudo representou a primeira evidência sorológica de que FHV 1, FCV, FPV e a
bacteria intracellular obrigatória E. canis (ou agentes antigenicamente relacionados) estejam
presentes entre felídeos de vida livre no Brasil. Os resultados indicam que a co-infecção com
os patógenos virais estudados não é comum para felídeos neotropicais brasileiros de vida
livre: a maioria dos animais (76%) foram soropositivos para apenas um ou dois dos vírus
selecionados. A única exceção foi uma jaguatirica amazônica (animal 18, Fig. 1, Apêndice A)
que se apresentou soropositiva para quatro dos vírus pesquisados: FHV 1, FCV, FCoV, FPV
(Apêndice E).
A alta prevalência de anticorpos demonstrada para parvovírus (aproximadamente
48%), como pode ser observado na tabela 2, pode estar relacionada com a grande resistência
ambiental destes vírus não envelopados. Desta forma, animais de vida livre podem ser
expostos em áreas contaminadas por fezes, ainda que os felídeos sejam solitários,
esparsamente distribuídos e suas populações tenham baixa densidade (BARKER; PARISH,
2001). Em contraste, o FCoV não persiste no ambiente, o que pode explicar o único animal
soropositivo encontrado neste estudo.
Entretanto, os vírus respiratórios FHV 1 e FCV são lábeis no ambiente, requerem
contato direto para serem transmitidos, e ainda assim resultados positivos para ambos agentes
foram relativamente comuns neste estudo (aproximadamente 29%). Esta situação é similar à
de leões de vida livre na África, em que altas prevalências para FHV 1 e FCV são relatadas
(HOFMANN-LEHMANN et al., 1996). No caso dos leões, o comportamento grupal, que
permite a transmissão horizontal, pode explicar a alta soroprevalência. No presente caso, os
resultados para FHV 1 e FCV podem refletir a persistência de anticorpos em função de
infecção quando filhotes, durante acasalamento ou ainda devido a contato com gatos
domésticos.
O encontro de anticorpos para retrovirus (FeLV, FIV e PLV) chama a atenção para a
necessidade de monitoramento. Um total de três animais apresentaram anticorpos para FeLV
(um animal para a glicoproteína gp 70 do vírus no ELISA; outro animal apenas para a
proteína p27 do vírus no Western blot; e dois destes animais para gp 70 e p27), como pode
ser observado no apêndice E, para os animais identificados como 6, 9 e 10. Entretanto, o
antígeno p27 não foi detectado no ELISA direto para nenhum dos três animais, indicando que
não havia infecção ativa, com replicação viral e sugerindo que estes animais tenham
68
desenvolvido infecção regressiva, montando respostas imunes específicas. Todavia, o
encontro de animais soropositivos é preocupante. Não se sabe se felídeos neotropicais são
susceptíveis à doença; há relatos de felídeos filogeneticamente distantes dos gatos domésticos
susceptíveis às enfermidades (JESSUP et al., 1993; MARKER et al., 2003), ao passo que
para o gato-selvagem-europeu, tão filogeneticamente próximo do doméstico, o FeLV é
consistentemente encontrado em populações de vida livre e não apresenta alta
patogenicidade. A alta prevalência de infecções por FeLV em gatos-selvagens-europeus
sugere que o vírus seja mantido nestas populações. A possibilidade de que a infecção seja
constantemente adquirida através do contato com gatos domésticos nestas populações
selvagens européias não parece provável, uma vez que as prevalências são constantemente
mais altas que aquelas dos domésticos em todas as áreas estudadas de ocorrência natural da
espécie. (HOFMANN-LEHMANN, comunicação pessoal; DANIELS et al., 1999;
FROMONT et. al., 2000; LEUTENEGGER et. al. 1999a).
Uma única suçuarana apresentou-se soropositiva para FIV (animal 2, Apêndice E).
Este animal e um segundo animal também apresentou anticorpos para PLV (animal 8,
Apêndice E). A única forma de se determinar a natureza e origem destes virus seria uma
análise de seqüências gênicas; porém não houve material disponível para execução de tais
análises.
Anticorpos para E. canis mediante IFA foram detectados em amostra de soro de uma
única suçuarana (animal 19, Apêndice E). Embora o título tenha sido muito alto, a
interpretação deste resultado é difícil. Pode representar evidência de infecção por E. canis ou
os anticorpos detectados podem ter sido resultado de infecções por outras espécies
relacionadas de Ehrlichia, como E. chaffeensis ou E. ewingii. Carrapatos, potenciais vetores
na transmissão das erliquioses, são comuns na região (Barão de Melgaço, Mato Grosso) onde
este animal foi capturado e numerosas espécies, incluindo Amblyomma ovale, A. parvum, A.
cajennense, Boophilus microplus e Ixodes aragaoi foram relatadas parasitando suçuaranas
(LABRUNA et al., 2005). Pesquisas genômicas das diversas espécies de Ehrlichia em
carrapatos colhidos nos locais de captura seriam importantes para elucidar seu papel como
vetores. Análises moleculares em amostras de sangue desta suçuarana soropositiva poderiam
determinar as espécies de Ehrlichia envolvidas. Entretanto, não havia amostras de sangue
disponíveis para a execução destes testes. Estudos posteriores com amostragens maiores de
sangue de felídeos de vida livre poderiam eventualmente caracterizá-los como potenciais
reservatórios dos agentes, da mesma forma que recentemente cervídeos de vida livre foram
implicados como potenciais reservatórios de erlíquias (MACHADO et al., 2006). A
69
implicação zoonótica de tais agentes é evidente, uma vez que várias espécies dentro dos
gêneros Ehrlichia e Anaplasma têm sido associados com doenças emergentes transmitidas
por vetores em em humanos (PAROLA; DAVOUST; RAOULT, 2005).
Foi detectada uma prevalência muito alta de anticorpos para B. henselae (95%)
mediante IFA nas amostras de 20 animais analisadas, constituindo a mais alta prevalência já
relatada para qualquer espécie de felídeo (CHOMEL et al., 2004b). Estes resultados sugerem
que felídeos brasileiros de vida livre podem ser reservatórios do patógeno zoonótico B.
henselae, que causa a doença-da-arranhadura-do-gato em humanos (CHOMEL et al., 2004a).
Esta zoonose deve ser considerada nas capturas de felídeos devido ao risco representado
(ROTSTEIN et al., 2000). Diretrizes em zoológicos e programas de manejo de vida selvagem
devem enfatizar as recomendações para o manejo seguro de animais. O patógeno B. henselae
é transmitido principalmente através de pulgas (C. felis) em gatos domésticos (CHOMEL et.
al 1996) e é potencialmente transmissível entre felídeos domésticos e selvagens (CHOMEL et
al., 2004b). O contato entre felídeos de vida livre e gatos domésticos, todos hospedeiros para
C. felis (LINARDI; GUIMARÃES, 2000) deve ser previsto. O controle de pulgas em gatos
domésticos é recomendado pelo menos onde os territórios dos felídeos de vida livre se
sobrepõem aos assentamentos humanos. Além de pulgas, há indícios de que carrapatos do
gênero Ixodes sejam vetores para Bartonella sp (CHANG et al., 2001; CHOMEL et al.,
2004b; SCHOULS et al., 1999) e carrapatos da espécie Ixodes aragaoi foram identificados
parasitando uma suçuarana em Barão de Melgaço/ Mato Grosso (LABRUNA et al., 2005).
Nesta localidade, a maioria das suçuaranas ( Figura 1, Apêndices A e E) apresentou-se
soropositiva para B. henselae.
Os resultados dos testes TaqMan® PCR e RT-PCR realizados para amostras de soro
de seis felídeos de vida livre evidenciaram três suçuaranas soropositivas para FPV (Tabela 5),
que apresentavam viremia aguda por ocasião da contenção/colheita (animais 3, 4 e 5,
Apêndice E), enquanto uma amostra de soro analisada de um animal soronegativo
apresentou resultados negativos (animal 6, Apêndice E). Infelizmente, não havia amostras de
fezes disponíveis dos animais 3, 4 e 5 para pesquisa de eliminação viral. Os demais testes de
detecção viral realizados nas demais amostras disponíveis de sangue e fezes não detectaram a
presença de nenhum dos agentes investigados. Estes testes foram executados apenas para
amostras desta população que não haviam sofrido descongelamento prévio; do contrário a
previsível degradação dos ácidos nucléicos não traria resultados informativos.
De acordo com os exames físicos realizados no momento da colheita das amostras,
não houve sinais das infecções ou doenças relacionadas nos animais. O único animal
70
necropsiado, um gato-do-mato-pequeno (animal 20, Figura 1, Apêndice A), apresentava
excelente condição corporal, com exceção de intensa parasitose, incluindo Dirofilaria immitis
(FILONI et al., 2004; 2003b). Até o momento, o significado destes patógenos para a saúde
geral das populações destes felídeos selvagens é desconhecida. Para todos os agentes
infecciosos avaliados neste estudo, incluindo CDV e A. phagocytophilum, a importância
destas infecções podem ter sido subestimadas, pois é possível que muitos animais infectados
tenham desenvolvido sinais clínicos ou morrido sem serem notados, não permitindo a
detecção das infecções. Uma vez que os agentes infecciosos investigados no presente estudo
são patógenos comuns em carnívoros domésticos, não é possível determinar se estes agentes
são historicamente associados com populações de felídeos neotropicais ou foram introduzidos
através de interações com carnívoros domésticos. O isolamento e caracterização molecular
destes patógenos, tanto em carnívoros domésticos como selvagens, poderiam fornecer
respostas a estas questões.
A exposição de felídeos a agentes infecciosos na natureza, por um lado, pode
significar que a soltura ou reintrodução de animais procedentes de cativeiro, potencialmente
infectados, não representaria risco de se introduzir tais agentes (LEUTENEGGER et al.,
1999a). Por outro lado, o potencial patogênico destes agentes não está estabelecido e
translocações de animais soropositivos e/ou infectados pode apresentar efeitos deletérios na
regulação natural de populações que podem estar indenes; devendo ser avaliadas muito
cuidadosamente (HOFMANN-LEHMANN et al., 1996).
O bioma da Floresta Amazônica ainda é o mais preservado e com maior cobertura
vegetal e ocupa a maior área espacial. Apesar disso, tivemos acesso a amostras de apenas
duas localidades diferentes dentro deste bioma. Isto coincide com o fato de que projetos de
campo acerca de conservação de felídeos estão concentrados nas proximidades de áreas de
conflito entre humanos e grandes felídeos nas Regiões Centro-Oeste e Sudeste. Seria
importante a obtenção de mais incentivo econômico para que projetos de campo fossem
conduzidos na região amazônica. Além disso, seria recomendável promover a obtenção de
dados para o desenvolvimento de programas direcionados à prevenção e mitigação de
doenças infecciosas, seja em projetos de campo já em andamento ou futuros, de acordo com
recentes iniciativas governamentais e não-governamentais (BRASIL, 2004). Em todas as
áreas naturais amostradas, alterações nas paisagens devido a pressões antrópicas são um
importante ponto de preocupação, principalmente nos biomas do Cerrado e Floresta
Atlântica, onde o desmatamento, agricultura, industrialização e urbanização são
especialmente acentuados. Neste cenário, carnívoros domésticos, entre outros, estão
71
amplamente distribuídos como espécies exóticas introduzidas. Uma vez que os agentes
infecciosos investigados no presente estudo são patógenos comuns de carnívoros domésticos,
não é possível determinar se as infecções detectadas são originárias das populações de
felídeos neotropicais ou os carnívoros domésticos transmitiram estes agentes aos selvagens.
O isolamento e caracterização molecular dos patógenos, tanto nos carnívoros domésticos
como selvagens, seriam úteis em ajudar a encontrar uma resposta para esta questão.
5.3 ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA FELÍDEOS MANTIDOS EM
CATIVEIRO
Uma comparação entre as figuras 3 e 4 revela semelhanças entre os percentuais de
animais soropositivos para FHV 1, FPV, E. canis e B. henselae mediante IFA entre as
populações de vida livre e de cativeiro, mas sugere também que o patógeno FCoV esteja mais
disseminado nos ambientes de cativeiro que na natureza, uma vez que a soroprevalência na
população amostral referente a animais cativos foi maior que a seroprevalência na população
amostral de vida livre, aproximadamente 65% (135:209) e 5% (1:21), respectivamente.
Houve ocorrência maior de animais soropositivos para FCV nos zôos
(aproximadamente 65%) que em vida livre ( aproximadamente 5%). (Figuras 3 e 4). As
prevalências de anticorpos para os vírus respiratórios felinos FHV 1 e FCV foram diferentes
entre populações amostrais de cativeiro não vacinadas cedidos pela AMC (os animais
vacinados da FPZSP foram excluídos destes testes) e as populações amostrais de vida livre.
As soroprevalências para FHV 1 e FCV foram semelhantes para felídeos de vida livre, ao
passo que para os felídeos de cativeiro, a soroprevalência para FCV foi maior que para FHV
1. Uma vez que as formas de transmissão são semelhantes, tais resultados podem ser
decorrentes na maior resistência ambiental do FCV ao contaminar o ambiente e do
prolongado estado de carreador que se estabelece nos animais infectados por este vírus. O
FHV 1 estabelece latência com episódios intermitentes de reativação, e quando a infecção
está latente, não há progênie viral; de forma que animais com infecção latente para FHV 1
não são transmissores. (MAGGS, 2005). Desta forma, é possível o FCV esteja mais
disseminado devido à sua maior resistência ambiental e porque animais infectados com FCV
representem fontes de infecção por mais tempo. Análises prospectivas de detecção viral
nestas populações para ambos patógenos poderiam elucidar esta questão.
72
A observação das figuras 3 e 4 também demonstra que a soroprevalência para o FPV
é maior no ambiente de cativeiro que no de vida livre. Situação esperada, uma vez que a
contaminação ambiental do ambiente pelos vírus é favorecida com as altas densidades
populacionais nos zoológicos, ao contrário das populações dispersas na natureza.
Analisando-se as figuras 5 e 6, pode-se observar que os felídeos mantidos na FPSZP
apresentaram maior soroprevalência para FCoV. Os testes sorológicos são úteis para o
diagnóstico de FIP, mas apenas podem ser interpretados em correlação com sinais clínicos. O
diagnóstico conclusivo para FIP é classicamente obtido através de exames histopatológicos
em biópsias ou necrópsias. Foram desenvolvidas RT-PCRs direcionadas o RNA mensageiro
do FCoV em células mononucleares periféricas para o diagnóstico de FCoV em gatos
baseados nos princípios de que apenas vírus mutantes apresentem tropismo para monócitos e
macrófagos, o que estaria correlacionado com a virulência do agente em causar FIP
(SIMONS et al., 2005). Esta abordagem é proposta o monitoramento da população de
felídeos soropositivos para FCoV de felídeos mantidos em cativeiro, especialmente a
população da FPZSP, uma vez que estes animais correm o risco de desenvolver FIP.
No grupo de 23 jaguarundis mantidos pela FPZSP, foram evidenciados dois
espécimes (CAD 20761 e CAD 21810) em que foram detectadas tanto a presença de provírus
(DNA) de FeLV como de RNA viral em amostras de sangue; em um destes animais (CAD
20761) também foi detectado provírus e RNA viral de FeLV em soro e saliva (suabe oral)
(Tabela 6). Esta constituiu a primeira descrição de FeLV na espécie H. yagouarondi. Os dois
animais vieram a óbito posteriormente à realização do teste, sendo que um deles apresentou
desenvolvimento de massa tumoral abdominal compatível com as doenças proliferativas
associadas com infecção por FeLV em gatos domésticos. O prosseguimento da investigação,
com análises histopatológicas e e de hibridização in situ nos tecidos preservados está em
prosseguimento e poderá caracterizar definitivamente a espécie como susceptível às doenças
causadas pelo FeLV. Este tipo de estudo verticalizado só, assim como o estudo envolvendo
FCoV em felídeos mantidos na FPZSP somente poderá se tornar possível porque este
presente estudo horizontal foi realizado.
A análise dos resultados apresentados nas tabelas 2 e 3, Apêndices E e F, sugere
algumas considerações. A ausência de detecção sorológica de antígenos p27, que são
considerados marcadores de infecção viral, não exclui a possibilidade de existência de
infecções latentes e possíveis reativações virais em caso de estresse (GOMES-KELLER et al,
2006). Desta forma, os resultados negativos obtidos para p27 não excluem a possibilidade de
infecção pelo FeLV nas populações de vida livre e mantidas na FPZSP. A detecção de
73
anticorpos para FeLV (Western blot, ELISA indireto) indica exposição ao vírus e pode
significar que animais soropositivos responderam à infecção com uma resposta imune, que
talvez possa ser protetora. A investigação prospectiva no grupo de jaguarundis da FPZSP
poderá contribuir para o entendimento desta questão.
No caso de leões mantidos na FPZSP (Tabela 3, Apêndice F), foram detectados
anticorpos para lentivírus felinos em diversos animais (Apêndice D; CARVALHO et al.,
2004). A detecção de anticorpos direcionados para outras proteínas virais mediante Western
blot para este grupo de animais indicou semelhança entre resultados para determinados
animais, enquanto que para outros os resultados não foram concordantes ou foram
questionáveis, sugerindo que outros lentivírus felinos, além do FIV possam estar presentes
nas populações de leões mantidas em cativeiro nesta instituição e possivelmente em outros
zôos no País.
A Bartonella henselae está mais implicada com animais de vida livre, provavelmente
em função de maior exposição a vetores nos ambientes naturais que em cativeiro, onde a
sobrevivência pelo menos de carrapatos é dificultada nos recintos em que os animais vivem
nos zôos. As pulgas, incluindo C. felis, são freqüentemente encontradas parasitando felídeos
em cativeiro (TEIXEIRA, comunicação pessoal), que devem estar implicadas na
soropositividade observada para a população avaliada. Desta forma, o controle de pulgas é
de fundamental importância em instituições que mantêm felídeos em cativeiro. Além disso,
seria importante colher e preservar estes potenciais vetores para posteriores análises de
detecção direta Bartonella henselae mediante técnicas de PCR.
A Bartonella henselae é zoonótica, e as mesmas recomendações para felídeos de vida
livre devem ser adotadas durante o manejo de felídeos em zoológicos. Finalmente, a
Bartonella henselae foi implicada com insuficiências renais crônicas em gatos domésticos
(GLAUS et al., 1997) e outras condições, de forma que a bartonelose sugere um reexame na
interpretação etiológica das insuficiências renais e outras condições patológicas devido à
prolongada bacteremia que se verifica. Da mesma forma que a bartonelose pode estar
implicada em casos não elucidados de morbidade e mortalidade de felídeos em zoológicos, as
erlíquias, os hemoplasmas e os protozoários piroplasmas também sugerem uma
reinterpretação dos quadros clínicos.
74
5.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A expansão verificada nos últimos anos em relação a detecção e caracterização de
novos patógenos mediante o emprego de métodos moleculares, como por exemplo no caso
dos agentes etiológicos das erliquioses e piroplasmoses, sugere que a mesma expansão do
conhecimento deva se verificar com relação a outros agentes infecciosos. Os resultados
obtidos sinalizaram a exposição dos animais à maior parte dos patógenos investigados, sendo
indicativos de que muitos destes agentes circulam nas populações de felídeos selvagens de
vida livre e em situação de cativeiro no Brasil. O conhecimento sobre doenças infecciosas em
felídeos neotropicais é escasso, e freqüentemente os animais cativos são acometidos por
enfermidades de causa não elucidada (observação pessoal). Portanto, é de se supor que os
patógenos detectados direta ou indiretamente neste estudo, alguns pela primeira vez,
contribuam nos quadros não diagnosticados de morbidade e/ou mortalidade das populações
de felídeos selvagens no País.
Os agentes pesquisados para os felídeos de cativeiro também são mantidos em
espécies abundantes, representadas pelos carnívoros domésticos. Ao contrário dos demais
felídeos, a população mundial de gatos e cães domésticos tem aumentado, sendo encontrados
em todos os ambientes onde há ocupação humana. No Brasil, também estão ampla e
numerosamente distribuídos, presentes em ambientes urbanos, comunidades rurais, áreas
adjacentes a parques e reservas naturais. Zoológicos e outras instituições que mantêm animais
em cativeiro, além da presença gatos domésticos e, lidam com um fator de complicação
adicional: a coexistência de espécies provenientes das mais diversas localidades geográficas,
o que aumenta ainda mais o risco de transmissão interespecífica de patógenos.
Um ponto importante que requer consideração ao se interpretar os resultados são as
janelas de sensibilidade para cada uma das infecções estudadas e de acordo com os testes
utilizados. Um teste negativo não corresponde necessariamente à ausência de exposição aos
patógenos investigados. Os ensaios sorológicos podem fornecer resultados negativos se as
amostras forem colhidas em estágios muito iniciais da infecção, antes do desenvolvimento de
anticorpos específicos ou quando as cargas virais são muito baixas. Para ensaios diretos como
PCR, resultados negativos são esperados no caso da ausência de vírus no sangue ou nas fezes,
presença de vírus em um outro compartimento do corpo ou ainda após a completa
recuperação da infecção. A combinação entre exames físicos, sorologia e PCR para cada
animal amostrado, em um programa contínuo de monitoramento, seria a melhor solução para
75
maximizar estas janelas de sensibilidade em cada um dos animais amostrados e determinar a
existência ou ausência de cada um dos patógenos investigados em todas as regiões
geográficas e zoológicos avaliados.
O estabelecimento de laboratórios e de meios diagnósticos adequados abrirá
perspectivas para estudos de fisiopatologia das doenças e os patógenos específicos poderão
ser analisados sob o ponto de vista estrutural e funcional.
O monitoramento destas infecções constitui importante ferramenta de manejo para
populações ameaçadas (DASZAK et al., 2000; MUNSON, 2000; MURRAY et al., 1999), e a
conservação de felídeos selvagens requer uma abordagem integrada e multidisciplinar, em
que :
a) translocações natureza-natureza, natureza-zoológicos, zoológicos-
zoológicos, reintroduções zoológicos-natureza, que deveriam ter base
científica para acessar os riscos de se introduzir doenças em áreas
previamente indenes;
b) determinação das prevalências das infecções ao longo das áreas de
ocorrência das espécies de felídeos;
c) identificação dos patógenos, seus potenciais hospedeiros e vetores;
d) integração destes estudos com padrões de comportamento e ecológicos para
acessar os impactos destas infecções em populações de felídeos de vida
livre;
e) investigação da ocorrência de infecções em animais domésticos,
principalmente cães e gatos, incluindo os cães treinados utilizados nas
capturas;
f) sistematização das colheitas de amostras de material biológico, reduzindo
custos e otimizando esforços;
g) ênfase na importância das medidas preventivas tradicionais ao alojar e
manejar felídeos ou amostras biológicas de felídeos de forma a evitar a
disseminação iatrogênica e zoonótica de patógenos;
h) adoção de medidas de prevenção de disseminação de agentes infecciosos ao
lidar com felídeos infectados com os agentes pesquisados, controlando
vetores e adotando medidas de segregação.
76
6 CONCLUSÕES
1) populações de felídeos selvagens no Brasil estão expostas aos agentes virais: FHV 1,
FCV, FPV, FCoV, FeLV e lentivírus felinos; aos agentes bacterianos: Bartonella
henselae, Ehrlichia canis e os hemoplasmas Mycoplasma haemofelis, ‘Candidatus
Mycoplasma haemominutum’; assim como aos protozoários piroplasmas Cytauxzoon sp;
2) carnívoros domésticos representam risco de transmissão interespecífica dos patógenos
(agentes virais FHV 1, FCV, FPV, FCoV, FeLV, FIV; agentes bacterianos Bartonella
henselae, Ehrlichia canis, hemoplasmas Mycoplasma haemofelis e ‘Candidatus
Mycoplasma haemominutum’; assim como Cytauxzoon sp) para felídeos selvagens em
vida livre ou em situação de cativeiro; da mesma forma felídeos selvagens podem
constituir fontes de infecção de tais patógenos para carnívoros domésticos;
3) contribuem nos quadros não diagnosticados de morbidade e/ou mortalidade das
populações de felídeos selvagens no País: os agentes virais FHV 1, FCV, FPV, FCoV; os
agentes bacterianos: Bartonella henselae, hemoplasmas (Mycoplasma haemofelis e
‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’), Ehrlichia canis ou agentes antigenicamente
relacionados e o piroplasma Cytauxzoon sp;
4) as populações de felídeos selvagens no País podem ser reservatórios de Bartonella
henselae, constituindo risco para transmissão de zoonoses;
5) testes sorológicos indiretos e testes de detecção direta de patógenos TaqMan® são
adequados para compor o repertório de técnicas em laboratórios de referência no País,
para investigação de enfermidades infecciosas em animais selvagens, de maneira que:
a) agentes etiológicos sejam investigados laboratorialmente em tempo hábil para
tratamento e/ou segregação em casos de enfermidades em que sinais clínicos
compatíveis estejam presentes;
b) sejam adotados em protocolos preventivos para o manejo de felídeos selvagens no
País, em procedimentos/situações tais como translocações, quarentenas,
manutenção e monitoramento de felídeos selvagens;
77
c) Potenciais vetores, como pulgas e carrapatos, devem ser identificados e analisados
para a presença de agentes dos gêneros Bartonella, Ehrlichia e Anaplasma;
6) este é o primeiro relato de anticorpos para Ehrlichia canis ou agentes relacionados em
suçuaranas ou pumas (Puma concolor);
7) este é o primeiro relato de infecção por FeLV em jaguarundis (Herpailurus yaguarondi).
78
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92
APÊNDICE A – Descrição das amostras de felídeos de vida livre fornecidas pelo Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais (CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA). São Paulo, 2004
Identificação dos animais1
Data de colheita Sexo Faixa
etária Procedência dos animais Material biológico
Região/Bioma Município/UF2
Puma concolor n = 19
3 07/01/03 macho filhote Norte/ Floresta Amazônica Vilhena/ RO soro4 07/01/03 macho filhote Norte/ Floresta Amazônica Vilhena/ RO soro5 07/01/03 macho filhote Norte/ Floresta Amazônica Vilhena/ RO soro1 05/04/02 macho adulto Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro2 15/04/02 macho adulto Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro8 23/01/02 macho adulto Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro9 21/01/02 fêmea adulta Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro
11 21/01/02 fêmea filhote Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro19 21/01/02 macho filhote Centro-Oeste/Pantanal Barão de Melgaço/ MT soro15 06/09/02 fêmea jovem Centro-Oeste/ Cerrado Corumbá/ MS soro16 06/09/02 macho jovem Centro-Oeste/ Cerrado Corumbá/ MS soro7 07/06/98 fêmea adulta Centro-Oeste/ Cerrado Bataguassu/ MS soro
12 06/09/02 macho jovem Centro-Oeste/ Cerrado Jardim/ MS soro13 06/09/02 macho jovem Centro-Oeste/ Cerrado Jardim/ MS soro14 06/09/02 macho filhote Centro-Oeste/ Cerrado Ponta Porã/ MS soro
6 03/12/98 fêmea adulta Sul/Floresta Atlântica Parque Nacional do Iguaçu /PR soro
10 04/07/02 macho jovem Sudeste/ Floresta Atlântica Serra da Cantareira/ SP soro17 16/08/04 macho adulto Sudeste/ Floresta Atlântica Ilha Solteira/ SP soro
Leopardus pardalis n = 2
18 10/11/03 fêmea adulta Norte/ Floresta Amazônica Rio Branco/ AC soro22 ... ... ... Sul/Floresta Atlântica Balsa Nova/ PR sangue
Leopardus tigrinus n = 2
20 17/09/03 fêmea adulta Sudeste/ Floresta Atlântica Ubatuba/ SP soro, fezes21 08/03/04 fêmea adulta Sudeste/ Floresta Atlântica Nova Friburgo/ RJ soro
1 = Identificação das amostras segundo os números de registro no Banco de Amostras Biológicas do Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais (CENAP), Centro Especializado do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA): 1 = B61c1609; 2 = 061c6047; 3 = 061bc05f; 4 = 0610a655; 5 = 0610a16c; 6 = PNI Juliana; 7 = Totti 7/6/98; 8 = 061c6683; 9 = 0610d9a3; 10 = 0001f9adf1; 11 = 06110af3b; 12 = 000610d48f; 13 = 000610a00a; 14 = 000610aa3b; 15 = 00061c4d0f; 16 = 000610c60e; 17 = 1013; 18 = 004; 19 = 061bd88c; 20 = 003; 21 = 61431; 22 = 301. 2 UF = Unidade da Federação3 ... = dados não disponíveis.
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APÊNDICE B – Descrição das amostras de felídeos mantidos em cativeiro fornecidas pela Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP). São Paulo, 2001-2004
(continua)Identificação dos animais (CAD)1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material biológico
Tipo Localidade2
Felídeos neotropicais
Puma concolor n = 2
18687 macho adulto vida livre MS soro, papa de leucócitos 20421 fêmea adulta vida livre SP soro, papa de leucócitos
Herpailurus yagouarondi n = 23
20761 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos, suabe oral
20762 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 21566 fêmea adulta vida livre Limeira, SP soro, sangue em EDTA 21810 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 22096 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 23120 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 23851 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 23911 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 23956 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 24142 fêmea adulta vida livre Ribeirão Preto, SP soro, sangue em EDTA 24189 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos em PBS
24226 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, leucócitos extraídos com Ficoll®
24227 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 24958 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 25244 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA
25845 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, leucócitos extraídos com Ficoll®
25846 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos em PBS 26005 fêmea adulta vida livre Ilha Solteira, SP plasma, sangue em EDTA 27088 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 27155 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 27156 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 27689 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 28018 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP plasma, sangue em EDTA
Leopardus pardalis n = 6
17312 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 17973 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 18776 macho adulto vida livre ...3 papa de leucócitos 21635 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 22028 fêmea adulta vida livre provável litoral sul, SP soro, papa de leucócitos 22732 macho adulto vida livre Mairiporã, SP soro, papa de leucócitos
94
(continuação) Identificação dos animais (CAD)1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material biológico
Tipo Localidade2
Leopardus tigrinus n = 33
18781 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 19156 macho adulto vida livre provável SP soro, papa de leucócitos 19235 macho adulto vida livre provável GO soro, sangue em EDTA 19250 macho adulto vida livre Bauru, SP plasma, sangue em EDTA 20251 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 20287 fêmea adulta vida livre provável SC soro, sangue em EDTA 20913 fêmea adulta vida livre Dourado, SP plasma, papa de leucócitos 21292 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA 21500 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA 21537 macho adulto vida livre Brasília, DF soro, sangue em EDTA 21809 fêmea adulta vida livre provável SP soro, papa de leucócitos 22101 fêmea adulta vida livre … soro, sangue em EDTA 22111 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 22170 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 22347 fêmea adulta vida livre provável SP soro, papa de leucócitos 22641 fêmea adulta vida livre Belo Horizonte, MG soro, papa de leucócitos 22727 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 22728 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA 22729 macho adulto vida livre provável SP soro, papa de leucócitos 23275 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA 23608 macho adulto vida livre Belo Horizonte, MG soro, papa de leucócitos 23957 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 24069 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA 24348 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 25105 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 25246 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 26106 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 26107 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 26118 macho adulto vida livre … plasma, sangue em EDTA 26335 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 26435 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 27612 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 27670 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos Leopardus wiedii n = 10
17336 macho adulto vida livre provável SP soro, papa de leucócitos 19702 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 20766 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 20767 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos 21490 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 22102 macho adulto vida livre Belém, PA soro 22346 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 24566 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 24969 fêmea adulta vida livre … soro, papa de leucócitos 28257 macho adulto vida livre … soro, sangue em EDTA
95
(continuação) Identificação dos animais (CAD)1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material biológico
Tipo Localidade2
Oncifelisgeofffroyi n = 13
20769 macho adulto vida livre RS soro, sangue em EDTA 25617 macho adulto cativeiro Uruguai soro, papa de leucócitos 25618 fêmea adulto cativeiro Uruguai soro, papa de leucócitos 25619 fêmea adulta cativeiro Uruguai soro 25936 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP plasma, papa de leucócitos 25937 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 26432 macho adulto cativeiro FPZSP, SP plasma, papa de leucócitos 26433 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 26434 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 27982 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 28022 fêmea adulta cativeiro Uruguai soro 28154 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 28155 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro Oncifeliscolocolo n = 10
20034 macho adulto cativeiro Zôo de Goiânia, GO plasma 20245 macho adulto vida livre Rondonópolis, MT soro, papa de leucócitos
21866 macho adulto vida livre … soro, papa de leucócitos em meio MEM
23070 fêmea adulta vida livre RS soro, papa de leucócitos em meio MEM
23672 fêmea adulta vida livre Brasília, DF soro, papa de leucócitos em meio MEM
23879 fêmea adulta cativeiro RS soro, papa de leucócitos em meio MEM
26937 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 26938 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 27915 fêmea adulta cativeiro Zôo de Brasília, DF soro 28505 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos
Felídeos exóticos
Panthera leo n = 30 11716 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 13064 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 14126 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 15854 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 15856 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 17162 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 17163 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 17164 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 196964 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 20408 fêmea adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 20423 fêmea adulta cativeiro apreensão circo, SP soro
96
(continuação) Identificação dos animais (CAD)1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material biológico
Tipo Localidade2
20510 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 20737 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 20738 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro
20748 macho adulto cativeiro apreensão Santa Isabel, SP
soro
20833 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 24574 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 24575 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 24578 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 24579 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 24963 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 24964 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 24965 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro 26276 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 26281 macho adulto cativeiro apreensão circo, SP soro 26294 macho adulto cativeiro apreensão, SP soro 26301 macho adulto cativeiro apreensão circo, SP soro 26302 macho adulto cativeiro apreensão circo, SP soro 26303 macho adulto cativeiro apreensão circo, SP soro 26304 fêmea adulta cativeiro apreensão circo, SP soro
Panthera tigris altaica n = 13
19846 macho adulto cativeiro Holanda soro, papa de leucócitos 19849 macho adulto cativeiro Holanda soro, sangue em EDTA 19850 fêmea adulta cativeiro Holanda soro, papa de leucócitos 19851 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 21651 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 24915 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 25139 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 25140 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro 25141 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 25236 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 27090 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 27091 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA 27092 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, sangue em EDTA
Uncia uncia n = 2
23071 macho adulto cativeiro EUA soro, papa de leucócitos 23072 fêmea adulta cativeiro EUA soro, papa de leucócitos Panthera pardus n = 4 11729 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 14753 macho adulto cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 18603 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos 18604 fêmea adulta cativeiro FPZSP, SP soro, papa de leucócitos
97
(conclusão)Identificação dos animais (CAD)1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material biológico
Tipo Localidade2
Acinonyx jubatus n = 2
25514 fêmea adulta cativeiro SC soro, papa de leucócitos 22597 macho adulto cativeiro África do Sul soro, papa de leucócitos
1 CAD = número do cadastro individual dos animais na FPZSP, SP. 2 Localidade = instituições, municipíos, siglas referentes às respectivas Unidades da Federação do Brasil ou países de origem de animais importados. 3 ... = dados não disponíveis. 4 CAD 19696 = espécime de Panthera leo cujas amostras foram obtidas na necrópsia, em 2001.
98
APÊNDICE C – Descrição das amostras de felídeos neotropicais mantidos em cativeiro fornecidas pela Associação Mata Ciliar (AMC). São Paulo, 2004
(continua)
Identificação dos animais1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material
biológico
Tipo Localidade2
Puma concolor n = 12
SABIA macho AMC, Jundiaí/SP soro SB022 macho Zôo de Cuiabá /MT soro SB031 fêmea Zôo de Goiânia /GO soro SB050 fêmea Zôo de Recife /PE soro SB073 macho Criadouro Cariuá/AM soro SB077 macho 2° BIS Belém /PA soro SB083 fêmea Zôo de Carajás /PA soro SB098 macho Zôo de Brasília /DF soro SB126 fêmea Ilha Solteira Zôo/SP soro SB131 fêmea Zôo de Andradina /MG soro SB148 fêmea Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SHOGUN macho Criadouro Ozelot/MG soro
Herpailurus yagouarondi n = 10 SB006 macho Zôo de Mogi Mirim /SP soro SB007 fêmea Zôo de Maringá /PR soro SB010 macho Zôo de Campinas /SP soro SB027 macho Criadouro AMC, Jundiaí/SP soro SB028 fêmea Criadouro AMC/SP soro SB044 fêmea Zôo de Goiânia /GO soro SB046 fêmea Zôo de Cuiabá /MT soro SB063 fêmea Zôo de Cascavel /PR soro SB065 macho 1° BIS Manaus /AM soro SB082 macho CASIB, Foz do Iguaçu /PR soro
Leopardus pardalis n = 10
KIKO macho Criadouro Ozelot /MG soro LILLY fêmea Criadouro Ozelot /MG soro SB007 fêmea Zôo de São Bernardo do Campo /SP soro SB014 macho Zôo de Carajás /PA soro SB015 fêmea Zôo de Campinas /SP soro SB019 macho Zôo de Uberaba /MG soro SB053 macho Zôo de Curitiba /PR soro SB074 fêmea Zôo de Recife /PE soro SB086 fêmea CIGS Manaus /AM soro SB110 fêmea CASIB Foz do Iguaçu /PR soro SB111 macho CASIB Foz do Iguaçu /PR soro SB121 macho Zôo de Santa Maria /RS soro SB122 fêmea Zôo de Santa Maria /RS soro SB124 macho Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB125 fêmea Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB126 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro
99
(continuação)
Identificação dos animais1
Sexo Faixaetária Procedência dos animais Material
biológico
Tipo Localidade2
SB151 fêmea Zôo de Uberlândia /MG soro SB209 macho Zôo de Varginha /MG soro SB231 macho Criadouro AMC, Jundiaí /SP soro SB233 fêmea Criadouro AMC, Jundiaí /SP soro
Leopardus wiedii n = 10
SB041 fêmea Zôo de Curitiba /PR soro SB045 macho Zôo de Curitiba /PR soro SB050 fêmea Criadouro Klabin /PR soro SB051 fêmea Criadouro Klabin /PR soro SB052 macho Zôo de Maringá /PR soro SB054 fêmea CASIB Foz do Iguaçu /PR soro SB055 macho CASIB Foz do Iguaçu /PR soro SB057 macho Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB058 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro THUNGA fêmea Criadouro Ozelot /MG soro Oncifelisgeofffroyi n = 10
SB001 macho Criadouro AMC, Jundiaí /SP soro SB002 fêmea Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB003 macho Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB004 fêmea Zôo de Cachoeira do Sul /RS soro SB005 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SB006 fêmea Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SB007 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SB008 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SB009 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro SB010 macho Zôo de Sapucaia do Sul /RS soro
1 As amostras são identificadas com os números individuais e intransferíveis de registro de Studbook (SB) dos animais ou com apelidos provisórios. 2 Localidade = instituições ou municipíos e siglas referentes às respectivas Unidades da Federação do Brasil.
100
APÊNDICE D - CARVALHO, V. M.; COUTINHO, S. D.; FILONI, C.; PEREIRA, A. P. C.; CORRÊA, S. H.; TEIXEIRA, R. H.; CATÃO-DIAS, J. L. Serosurvey for the feline leukemia vírus and lentiviruses in captive felids at Fundação Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo state, Brazil. In: HEALTH AND CONSERVATION OF CAPTIVE AND FREE-RANGING WILDLIFE, 2004, San Diego, California, USA. Proceedings…SanDiego: American Association of zoo Veterinarians, American Association of Wildlife Veterinarians, Wildlife Disease Association, 2004. P. 538-539.
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111
APÊNDICE G – Resultados dos testes sorológicos realizados nas amostras de felídeos cedidas pela Associação Mata Ciliar (AMC), distribuídos em função dos métodos empregados e dos patógenos pesquisados. São Paulo, 2004
(continua)
IFA2 Westernblot ELISAEspécies/
Identificação das amostras1
FHV 1 FCV FCoV FPV Ehrlichia canis FeLV
indiretoFeLV gp70
Puma concolor n=12
SABIÁ P (40)3 -4 - P (160) - …5 -SB022 - - P (100) P (40) - … - SB031 - P (160) P (400) P (20) - … - SB050 - - - P (160) - … - SB073 - P (80) P (100) P (160) - … P SB077 - - - P (1280) - … - SB083 P (320)b - P (400) - - … - SB098 - P (20) P (100) P (80) - … - SB126 - - - - - … - SB131 - - - P (160) - … - SB148 - P (640) - - - … - SHOGUN - P (40) P (25) P (640) - … - Herpailurus yaguarondi n=10
SB006 P (160) P (80) P (1600) P (640) - - P SB007 - P (160) - - - … - SB010 - - P (400) P (160) - … - SB027 - P (40) P (100) P (80) - … - SB028 - - - - - … - SB044 - - - P (640) - … - SB046 - - - - - … P SB063 - - - P (640) - … - SB065 - - P (100) - - … - SB082 - - - - - … - Leopardus pardalis n=10
SB014 - P (40) P (100) - P (320) … P SB015 - P (160) P (100) P (320) - … - SB019 - P (80) P (100) P (160) - … - SB053 P (80) - P (400) P (320) - … P SB074 - - - P (320) - … - SB086 - P (20) P (400) - - … P SB151 - P (160) - P (5120) - … - SB209 - - P (100) P (320) - … - SB231 - P (231) P (400) P (640) - … - SB233 - - - - - … P
Leopardus tigrinus n=10
KIKO P (40) P (320) P (100) P (320) - … P LILLY P (160) P (320) P (100) P (640) - … - SB007 - - - P (640) - P SB110 - - - - - … P
112
(conclusão)
IFA2 Westernblot
ELISAEspécies/Identificação das amostras1
FHV 1 FCV FCoV FPV Ehrlichia canis FeLV
indiretoFeLV gp70
SB111 - - - - - … P SB121 - - P (25) P (640) - - P SB122 - - - P (640) - … P SB124 - P (40) P (25) P (320) - … - SB125 - P (80) P (100) P (160) - … P SB126 - P (800 - P (320) - … P Leopardus wiedii n=10
SB041 P (160) P (20) - P (40) - … - SB045 P (160) - - P (160) - … - SB050 - - P (25) P (160) - - P SB051 - - - P (80) - … - SB052 - - P (100) - - … - SB054 - - - - - … - SB055 - - - - - … - SB057 - P (40) P (400) P (160) - … - SB058 P (20) P (1280) - - - … P THUNGA P (320) P (320) P (25) P (320) - … - Oncifelisgeoffroyi n=10
SB001 P (20) - - P (80) - … - SB002 - P (160) - P (80) - … - SB003 - P (320) - P (160) - … - SB004 - P (320) - P (20) - … - SB005 - P (160) P (100) P (320) - … P SB006 - P (160) - - - … - SB007 P (20) P (80) - P (1280) - … - SB008 - P (160) - P (320) - … - SB009 - P (320) P (25) P (20) - … P SB010 - P (160) P (100) P (160) - … P Amplitude dos títulos IFA 20-320 20/1280 25-1600 20-5120 320 Total resultados positivos/ total de amostras analisadas
12/62 32/62 29/62 44/62 1/62 0/3 10/62
1 As amostras são identificadas com os números individuais e intransferíveis de registro de Studbook (SB) dos animais ou com apelidos provisórios. 2IFA = Imunofluorescência indireta. Os títulos de anticorpos são relatados como recíprocas das respectivas diluições de soro. Títulos negativos foram definidos como < 20 para FHV 1, FCV, FPV, FCoV, < 80 para E. canis e < 64 para B.henselae, respectivamente.4 P = Resultados positivos. Os números em parênteses após os resultados de IFA representam o título de anticorpos para a amostra considerada. 5 - = Resultados negativos. 6 ...= Testes não realizados.
113
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119
APÊNDICE I – FILONI, C.; CATÃO-DIAS, J. L.; BAY, G.; DURIGON, E. L.; JORGE, R. S. P.; LUTZ, H.; HOFMANN-LEHMANN, R. H. First Evidence of Feline Herpesvirus, Calicivirus, Parvovirus, and Ehrlichia Exposure in Brazilian Free-ranging Felids. Journal of Wildlife Diseases, v. 42, n.2, p. 000-000, 2006. (no prelo).
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