EXPRESIÓN EN E. coli DEL DOMINIO AMINO-TERMINAL DEL NEURORRECEPTOR GABAC-ρ1

Leija Izaguirre T. E. (1), Martínez Torres A. (2)

(1) Facultad de Química Universidad Autónoma de Querétaro

(2) Instituto de Neurobiología Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla

RESUMEN La inhibición del sistema nervioso central (SNC) durante la transmisión sináptica está mediada principalmente por el ácido γ-aminobutírico (GABA), responsable de la activación de receptores específicos que reducen la excitación neuronal. Los receptores GABAc están formados por tres subunidades distintas: ρ1, ρ2 y ρ3, las cuales se localizan en la membrana plasmática formando complejos homoméricos y heteroméricos. El presente trabajo pretende la expresión del dominio amino terminal de la subunidad ρ1 de H. sapiens en E.coli utilizando un plásmido diseñado para este fin (pET28b) el cual porta dicha región del gen GABA ρ1 bajo la regulación del promotor transcripcional del fago T7 (Mora Juárez y col., 2007). Se transformaron bacterias de la cepa ER2566 por medio de choque térmico y se verificó la identidad del plásmido por electroforesis en gel y análisis con enzimas de restricción. Las bacterias transformadas fueron expuestas a IPTG para la activación transcripcional del promotor y se colectaron 24h después para su análisis por PAGE. Los resultados mostraron que el plásmido es sumamente inestable en la cepa de expresión utilizada, ya que no se encontró en las bacterias inducidas. En contraste, en otras cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7 (tal como la cepa XL1-blue) el plásmido es estable. En conclusión, la aparente inestabilidad del DNA de pET28ρ1 en ER2566 ha impedido su expresión adecuada. Sin embargo, se deberá intentar su expresión en otras cepas de E. coli para optimizar su producción. INTRODUCCIÓN Los receptores a GABA se han clasificado según sus propiedades farmacológicas en GABAA, GABAB y GABAC (Kusama y col., 1993). Los receptores GABAA y GABAC son canales ionotrópicos selectivos a cloro pertenecientes a la familia de receptores nicotínicos; mientras que GABAB pertenece a la familia de receptores acoplados a la proteína G, cuya acción es mediada por la apertura/cierre de otros canales. Por otro lado, los GABAA son blanco para muchos fármacos que ayudan a modular la acción directa de GABA sobre el SNC, tales como benzodiacepinas o barbitúricos. Los receptores GABAC se expresan en gran cantidad en la retina de los vertebrados adultos en los axones terminales de las neuronas bipolares, sugiriendo un papel importante en los procesos de señalización en esta zona (McCall y col., 2002). Además, se cree que median respuestas lentas y sostenidas de inhibición y son insensibles a bicuculina, compuesto antagonista competente para los receptores GABAA (Kolb H., 1996). Actualmente, se han clonado tres subunidades distintas de GABAC: ρ1, ρ2 y ρ3 (Johnston G.A., 2002) de retina de mamífero. Algunos estudios farmacológicos (Kusama y col, 1993) sugieren que la subunidad ρ1 es responsable de la resistencia de GABAC ante la bicuculina, mientras que estudios moleculares sugieren que sea probablemente la responsable de la expresión adecuada del receptor completo en las neuronas bipolares de la retina (McCall y col., 2002). Poco es lo que se sabe de la estructura tridimensional de proteínas de membrana y particularmente de neurorreceptores. Esto se debe a la dificultad que se encuentran para producir a gran escala proteínas de membrana. Una estrategia para comenzar a comprender su estructura es la expresión de módulos funcionales de las proteínas. Por ejemplo, la región

1

aminoterminal del receptor GABA ρ1 contiene el sitio de unión al agonista así como otros sitios importantes de modulación. Por tanto el objetivo de este trabajo se centró en expresar en E. coli la región extracelular del receptor, a la cual corresponde el dominio amino-terminal del mismo. EXPERIMENTAL 1. Transformación bacteriana a partir del plásmido recombinante pET28ρ11

Se transformaron por shock térmico (Sambrook y col., 2001) 50μL de bacterias E. coli 2566 en estado competente con 0.5μL del plásmido pET28ρ1, sembrando 200μL en una placa de agar-LB con kanamicina [10mg/mL]. Como controles negativos se usaron células competentes transformadas con el plásmido pET28b y células competentes sin plásmido; ambas sembradas en placas LB con kanamicina. Todas las placas se incubaron por 14 horas a 37°C. 2. Inducción de la expresión de ρ1- NH2

La inducción de la expresión se realizó en medio LB, usando IPTG como promotor siguiendo el protocolo (Sambrook y col., 2001) y con Magic MediaTM (Invitrogen) un medio de expresión que no necesita adición de promotor ni monitoreo de densidad óptica. Se inoculó un tubo con 4mL de medio LB y kanamicina [10mg/mL] a partir de una colonia de las células transformadas con NH2-ρ1, repitiendo la operación para una colonia transformada con pET28b. Los tubos se incubaron por 12 horas a 37°C en agitación constante. Posteriormente se resuspendieron 2mL de cada cultivo en un matraz con 98mL de medio LB y kanamicina [10mg/mL] y se incubaron a 37°C en agitación constante hasta registrar una DO600 entre 0.4-0.5. Una vez alcanzado este rango, se añadió IPTG a una concentración final de 0.1mM incubando posteriormente por 24 horas a 37°C en agitación constante. Aparte, se tomó una colonia de la transformación de pET28ρ1 para inocular un matraz con 100mL de MagicMediaTM, dejando incubar en las condiciones mencionadas. 3. Precipitación de proteínas Una vez terminadas las 24 horas de incubación se registró la DO600 y se tomó un duplicado de muestras de 2mL de cada cultivo, que posteriormente se centrifugaron a 13krpm a 4°C por 2min y se congelaron a -20°C. Después de tomar las muestras, el contenido de cada matraz se centrifugó a 9500rpm a 4°C durante 20min. Las pastillas celulares obtenidas se resuspendieron en 10mL de agua destilada y se almacenaron a -80°C 4. Extracción de DNA plasmídico por lisis alcalina y electroforesis en gel de agarosa. Las pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como muestras se colocaron en hielo y se siguió el protocolo para Miniprep por lisis alcalina (Sambrook y col.,2001), resuspendiendo la pastilla obtenida en 20μL de agua miliQ estéril. Una vez obtenidas las muestras, se corrieron 2μL de cada una en un gel de agarosa al 0.8% durante 40min a 100V y 85mAmp usando como marcador de peso molecular λDNA/pst. 5. Análisis de proteínas con SDS-PAGE Se siguió el protocolo (Sambrook y col., 2001) para la elaboración de un gel Tris-Glicina de SDS- poliacrilamida al 15% para tinción con azul de Coomassie e identificación de proteínas. Una vez elaborado el gel, se cargaron 25μL de cada muestra procesadas como se indica a continuación: El segundo lote de pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como muestras de los cultivos fueron resuspendidas respectivamente en buffer de carga (Tris-HCl pH=6.8 60mM, Glicerol 25%, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 14.4mM, azul de bromofenol 0.1%, agua) de acuerdo a la DO600 registrada por cada cultivo al término de las 24horas de incubación. Una vez resuspendidas, se colocaron en baño maría a punto de ebullición durante

1 Nota: pET28ρ1 es el plásmido construido en pET28b que porta el dominio amino-terminal del gen GABAρ1 bajo la regulación del promotor transcripcional del fago T7 (Mora Juárez y col., 2007).

2

5min para finalmente cargarse en el gel. Como marcador de peso molecular se empleó Protein Ladder (Invitrogen). El gel se corrió durante dos horas a 100V y 40mAmp. Una vez terminada la electroforesis, se tiñó con Azul de Coomassie por una hora y después se destiñó con la solución correspondiente (metanol, agua, ácido acético) para observarlo en el transiluminador. 6. Caracterización del plásmido recombinante ρ1- NH2 en la cepa XL1-blue Debido a que en la primera inducción no se encontró la presencia de plásmido después de la inducción (Resultados, Fig.1) se realizó una transformación (siguiendo el protocolo mencionado en el paso 1) de la cepa de E.coli XL1-blue, para observar la estabilidad del plásmido pET28ρ1 en una cepa sin el gen de la RNA polimerasa T7. Posterior a la transformación se levantó una colonia para inocular un tubo de 4mL que se dejó incubar por 12hrs. Después se realizó una extracción de DNA plasmídico con miniprep por lisis alcalina (Sambrook y col.,2001) y se corrió un gel de agarosa al 0.8%. Finalmente, para la identificación total del plásmido (caracterización) se realizó una digestión (Sambrook y col.,2001), usando como enzimas de restricción NCoI y XhoI, obtenidas a partir del mapa de restricción (Fig. 1) La digestión se incubó 1hr a 37°C y se corrió en gel de agarosa al 1.2% usando como marcador de peso molecular λDNA/pst. RESULTADOS

• Después de 24hrs de inducción, se verificó la presencia del plásmido (Fig.2) en el cultivo, sin embargo no se obtuvo un resultado favorable ya que no apareció indicio alguno de DNA plasmídico después del miniprep.

• Por tanto, se realizó una transformación en la cepa XL1-Blue, para observar la estabilidad del plásmido en una cepa distinta. Después de realizar el miniprep, se puede observar que en la Fig.3, aparecen las bandas que señalan la presencia del plásmido después de la transformación, indicando la estabilidad del plásmido en esta la cepa.

• Para asegurar la identidad del plásmido y descartar problemas del mismo en futuras transformaciones, se realizó una digestión usando enzimas de restricción. La Fig. 4 muestra los fragmentos esperados para pET28ρ1 después de ser tratados.

6 ApoI (2)78 CfrI (2)78 MscI (1)

105 HpaII (2)138 Cac8I (2)

163 TatI (2)

164 RsaI (2)167 MslI (2)

245 XmnI (1)248 AlwNI (2)249 AluI (2)

287 BsiYI (2)291 MwoI (2)

359 HincII (1)388 Bsu36I (1)

456 BceAI (1)457 BsiEI (1)457 CfrI (2)457 EagI (1)459 Cac8I (2)459 Cfr10I (1)459 NaeI (1)459 NgoMIV (1)460 HpaII (2)474 BglII (1)474 XhoII (2)475 DpnI (2)480 PpuMI (1)480 SanDI (1)489 AflIII (1)489 BspLU11I (1)489 NspI (1)500 ApaLI (1)500 BseSI (1)

553 MwoI (2)559 BstXI (1)

580 BfmI (1)596 HpyCH4III (1)597 AlwNI (2)

636 StyI (1)645 MslI (2)645 OliI (1)

671 AluI (2)702 TatI (2)703 RsaI (2)

728 MseI (1)

)

742 TspGWI (1)744 XhoII (2)745 DpnI (2)

763 BsiYI (2)763 EcoNI (1)773 ApoI (2)773 EcoRI (1

AMINO TER Rho-1.ape from 1 to 779

Fig. 1: Mapa de restricción del plásmido ρ1- NH2 que indica elsitio donde cortan las distintas enzimas. Las seleccionadas para ladigestión fueron la NCoI y XhoI.

Fig. 2: Gel de agarosa al 0.8% quemuestra el DNA plasmídico obtenidodespués de 24hrs de inducción deE.coli 2566 transformadas.

3

• Una vez que se obtuvieron los resultados anteriores, se realizó nuevamente la transformación de la cepa ER2566 y se verificó la presencia del plásmido después de 24hrs de inducción. (Fig. 4) Una vez que se observaron las bandas esperadas, se analizó la presencia de la proteína de interés con electroforesis en gel de poliacrilamida (Fig. 5) en condiciones desnaturalizantes (SDS), en la cual se observan las bandas esperadas (~35KD) para am

Fig. 4: Digestión del plásmido pET28ρ1.Gel de agarosa al 1.2%. En otros carrilesaparecen como controles positivos losplásmidos ERW y Cwii.

Fig. 3: Gel de agarosa al 0.8% con muestras deDNA plasmídico obtenido de la transformación deE.coli XL1-Blue con el plásmido pET28ρ1. Elrectángulo muestra la aparición de las bandasesperadas (~1920pb), señalando la presencia delplásmido después de la transformación.

bos medios.

ONCLUSIONES var en los resultados, el plásmido es altamente inestable en la cepa de

EFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CONCLUSIONES

Fig. 5: Gel de agarosa al 0.8% con muestras de Fig. 6: SDS-PAGE al 15% que muestra la banda DNA plasmídico obtenido después de 24hrs deinducción. El recuadro marca las bandasesperadas de aprox. 1920pb para el plásmidopET28ρ1.

que indica la presencia de la proteína esperada de aproximadamente de 35KD.

CComo se pudo obserexpresión utilizada inicialmente pues no se encontró su presencia en las bacterias inducidas en un principio. En cambio, en cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7 (XL1-blue) se observa estabilidad del plásmido. En conclusión, la aparente inestabilidad del DNA del plásmido pET28ρ1 en ER2566 ha impedido su expresión adecuada, siendo necesario intentar su expresión en cepas de E. coli distintas a la ER2566 para optimizar su producción y mantener estabilidad. R

4

Artículos: Hanley J., Koulen P., Bedford F., Gordon-Weeks P., y Moss J.S. “The proteinMAP-1B links GABAC receptors to the cytoskeletonat retinal synapses” Nature 397 66-69, 1999. Johnston GA. “Medicinal chemistry and molecular pharmacology of GABA(C) receptors” Curr Top Med Chem. (8):903-1003, 2002 Kusama T., Spivak C.E., Whitingn T.P., Dawson V.L. y Schaeffer J.C. “Pharmacology of GABA ρl and GABA α/β receptors expressed in Xenopus oocytes and COS cells” Br. J. Pharmacol. 109, 200-206, 1993 McCall M., Lukasiewicz P.D., Gregg R. G., Peachey N.S., “Elimination of the ρ1 Subunit Abolishes GABAC receptor expression and alters visual processing in the mouse retina” The Journal of Neuroscience, 22(10):4163–4174, 2002. Libros:

J., Russel W.D. “Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrook 3rd Edition, Cold

Organization of the Retina and Visual Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 Kolb H., Fernandez E., Nelson R. Webvision: The System. The NCBI handbook [internet]. John Moran Eye Center, University of Utah. NCBSept 1996 [citado 28 julio 2008]. Disponible en:

I;

ebvisionhttp://web.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=w Otros:

árez, A., López Salas, E.; Martínez Torres, A., Miledi, R. “Expresión del dominio Mora Juamino terminal del receptor humano GABAc rho1 en E.coli” Memorias del Programa Verano de la Ciencia 2007, disponible en: http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2007/

5